Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat tutkimukset ovat tuoneet yhä enemmän todisteita, jotka tukevat oletusta, että miRNA on keskeinen rooli useissa prosesseissa Karsinogeneesin kuten solun kasvussa, apoptoosin, erilaistumista ja etäpesäke. Tässä tutkimuksessa selvitettiin mahdollista roolia miR-31 kolorektaalisyövässä (CRC) aggressiivisuus ja sen taustalla mekanismeja. Huomasimme, että miR-31 nousi CRC soluissa peräisin metastaasipesäkkeiden ja ihmisen ensisijainen CRC kudosten kanssa imusolmukemetastaaseja. Lisäksi korkean tason ilmentymisen miR-31 oli merkitsevästi yhteydessä aggressiivisempi ja huono prognostiset fenotyypin potilaalla on CRC (

p

0,05). Vakaa yli-ilmentyminen miR-31 CRC-soluissa oli riittävät edistämään solujen lisääntymistä, invaasiota, ja muuttoliike

in vitro

. Se helpotti kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

liikaa. Lisätutkimukset osoittivat, että miR-31 voi sitoutua suoraan 3’untranslated alue (3’UTR) ja SATB2 mRNA: ta ja sen jälkeen tukahduttaa sekä mRNA: n ja proteiinin ilmentymiä SATB2. Ektooppinen ilmentyminen SATB2 ohimenevästi transfektoitu pCAG-SATB2 koodaa koko SATB2 koodaava sekvenssi voitaisiin kääntää vaikutuksia miR-31 CRC kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Lisäksi ektooppinen yli-ilmentyminen miR-31 CRC-soluissa indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Tuloksemme havainnollistaa, että säätely ylöspäin miR-31 oli tärkeä rooli CRC soluproliferaatioon, invaasiota ja etäpesäkkeiden

in vitro

ja

in vivo

suorilla repressoiva SATB2, mikä viittaa mahdolliseen soveltaminen miR-31 ennusteen ennustaminen ja terapeuttinen sovellus CRC.

Citation: Yang MH, Yu J, Chen N, Wang XY, Liu XY, Wang S, et al. (2013) Kohonnut MicroRNA-31 Expression Säätelee peräsuolen syövän etenemistä mukaan tukahduttaa Sen Target Gene SATB2. PLoS ONE 8 (12): e85353. doi: 10,1371 /journal.pone.0085353

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 elokuu 2013; Hyväksytty 25 marraskuuta 2013 Julkaistu: 30 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81000953, 81172242, 81071735), huomattavat hankkeet National Natural Science Foundation of China ((nro. 81090422), valtion Key ohjelma National Natural Science Foundation of China (U1201226), National Basic Research Program of China (973 Program, No. 2010CB529402), Key ohjelma National Natural Science Foundation of Guangdong, Kiina (2010B031500012) ja National Natural Science Foundation of Guangdong, Kiina (+10451051501004710). rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu , tietojen kerääminen ja analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat lukenut paperin ja hyväksyi sen toimittamisesta PLoS One. kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa. Vaikka useita erilaisia ​​hoitoja on kehitetty viime aikoina, että potilailla, joilla on CRC, huono ennuste edelleen potilailla, joiden CRC [1]. Useimmat CRC kuolemantapauksia on liittynyt kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden. Joten, ymmärtäminen taustalla molekyylitason mekanismeja CRC etäpesäke on ratkaiseva merkitys kehitettäessä terapeuttisia strategioita kehittyneen CRC potilaille.

MikroRNA (miRNA) ovat runsas luokka hyvin säilyneitä, lyhyt, sääntelyyn (noin 22 nt) ei-koodaavat RNA: t, jotka ovat laajasti ilmaistu eläviin organismeihin. Ne sitoutuvat 3’UTR mRNA, mikä aiheuttaa joko mRNA-molekyylin hajoamista tai translaation inhibition [2]. miRNA on erilaisia ​​toimintoja, kuten sääntelyn solujen erilaistumisen, lisääntymistä, ja apoptoosin [3,4]. Siksi melkoisesti tutkimukset ovat keskeistä roolia miRNA on useita prosesseja syövän, mukaan lukien metastaasi [3,5,6]. Lisäksi ilmaisu analyysit ovat paljastaneet ominaisuus miRNA allekirjoitukset tietyillä ihmisen syövissä [7-9].

Useat tutkijat kertoi, että miR-31 säädellään ylöspäin CRC [10-12] ja levyepiteelisyövän kielen [13], mutta alassäädetty rintasyövässä [14], mahasyöpä [15], pahanlaatuinen mesoteliooma [16] ja haimasyövän [17] käyttäen qRT-PCR. Mutta, kliininen ennustetekijöiden merkitystä, toiminta ja sääntelyn aktiivisuutta miR-31 CRC ei ole täysin ymmärretty vielä. Tässä tutkimuksessa selvitimme yksiselitteinen rooli miR-31 CRC ja totesi, että säätely ylöspäin miR-31 liittyi aggressiivisen fenotyyppien CRC ja huonon ennusteen potilailla. Lisätutkimukset paljastivat, että yli-ilmentyminen miR-31 CRC johti lisätä kasvainsolujen proliferaatiota ja liikkuvuus

in vitro

ja

in vivo

. Tämä tutkimus määrittelee positiivinen rooli miR-31 karsinogeneesis-, invaasio, ja muuttoliike, kautta tukahduttaa SATB2 ilmaisun CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kudosten tätä tutkimusta varten on hyväksynyt eettinen komitea Nanfang Hospital, Southern Medical University. Kaikki potilaat allekirjoitti tietoisen suostumuksen ennen käyttöä näiden kliinisten materiaalien tutkimustarkoituksiin. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Etelä Medical University (Luvan numero: SYXK2011-0074). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Kudosten valmistelu ja soluviljelmissä

tuore ja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut, peräsuolen kasvain kudosnäytteet saatiin potilailta, joilla on diagnosoitu ensisijaisen CRC ja sitten tehtiin elektiivinen leikkaus Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, Kiina). Kudosten tätä tutkimusta varten on hyväksynyt eettinen komitea Nanfang Hospital, Southern Medical University. Yhteensä 31 tapauksessa tuoreen CRC kudoksen tuoreeltaan jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Ja 143 tapausta arkistoida CRC kudosnäytteiden kerättiin ja käytettiin kliinispatologiset sekä varoituksia tutkinta miR-31. Yksikään potilas ei saanut ennen leikkausta kemoterapiaa tai sädehoitoa. Kattava joukko kliinis tietoja hallussaan, kuten ikä, sukupuoli, koko primaarituumorin, kasvaimen erilaistumiseen, T vaiheessa imusolmuke etäpesäke ja etäinen etäpesäke. Täydellinen seurannan, jotka vaihtelevat 1-96 kuukautta, oli käytettävissä kohortin 143 potilasta, ja mediaani elinaika oli 56 kuukautta.

Ihmisen sikiön munuaisen soluista 293T ja ihmisen CRC solulinjoista DLD-1 HCT116, SW480, SW620, Lovo saatiin solusta pankki Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Aiemmissa tutkimuksissa olemme kuvanneet alaklooni nimeltä M5 tiiviimmän metastaattinen kykyjä maksassa. Olemme myös kuvattu alaklooni nimeltä SCP 51 korkea metastaattinen kykyjä maksassa ja imusolmukkeissa. Nämä jatkokloonit eristettiin

in vivo

valinnassa SW480-solujen avulla kuvatun prosessin aikaisemmissa tutkimuksissa [18-20]. Kaikki CRC solulinjoja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (HyClone, Logan, USA) ja 100 U /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco). Ne pidettiin kosteutetussa kammiossa 5% CO

2 37 ° C: ssa. 293T pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää.

RNA: n eristys ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA uutettiin TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA ). cDNA syntetisoitiin kanssa PrimeScript RT reagenssia Kit (Promega, Madison, WI, USA). Varsi-loop kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin havaitsemiseksi ilmentymisen kypsän miR-31 kanssa ABI TaqMan

® MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) ja geenispesifisiä alukkeita (Applied Biosystems, Foster City , USA) käyttäen ABI 7500 Real-Time PCR-järjestelmä. Määritys suoritettiin kolminkertaisesti kussakin tapauksessa mahdollistaa arvioida teknisten vaihtelua.

In situ -hybridisaatio ja arviointi värjäytymisen miR-31

In situ -hybridisaatio (ISH) suoritettiin valmistajan protokollan (Exiqon, Vedbaek, Tanska). Parafinoidut osat (4 pm paksu) poistettiin parafiini ksyleenillä ja nesteytyksestä on laimeaan etanoliin reagenssilaatua. Levyjä käsiteltiin proteinaasi K: lla 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan. Sitten ne esihybridisoitiin hybridisaatioliuoksessa 50 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Tämän jälkeen 40 nM lukittu nukleiinihapon-modifioitu, 5 ’digoksigeniini (DIG) -leimattuja oligonukleotidikoettimen HSA-miR-31 tai sekoitetun kontrollikoettimen (Exiqon) lisättiin hybridisaatioliuokseen ja hybridisoitiin lämpötilassa 50 ° C yön yli. Alkalinen fosfaatti konjugoitua anti-DIG-vasta-ainetta (Roche, Mannheim, Saksa) levitettiin. Sen jälkeen, kun on pesty värjäysliuoksena leikkeitä inkuboitiin NBT /BCIP kehittää liuosta (Roche), 37 ° C: ssa 15-30 minuuttia. Sitten ne vastavärjättiin ydin- nopea punainen.

arvioimiseksi potilaiden kliinisiä piirteitä, ISH värjätään kudosleikkeet tarkistetaan ja arvostellaan erikseen kahdella sokaissut patologia. Värjäys miR-31 arvioitiin käyttämällä suhteellisen yksinkertaista, toistettavissa pisteytys menetelmällä [21,22]. Asteikolla 0-3, värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin seuraavasti: negatiivinen (ei värjäystä, 0), heikko (vaaleansininen, 1), keskipitkän (sininen, 2) tai vahva (tummansininen, 3). Laajuus värjäytyminen on määritelty prosenttiosuutena positiivista värjäytymistä alueilla kasvainsolujen tai on normaalia koolonin epiteelisolujen suhteen koko kasvaimen alueella tai koko jakson normaaleissa näytteissä. Laajuus värjäys pisteytettiin asteikolla 0-4 seuraavalla tavalla: 0, 0%; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; ja 4, 76-100%. Summa värjäyksen intensiteetin ja värjäys-laajuus tulokset käytettiin lopullisessa värjäytymisen sijoituksen miR-31 (0-7). Tilastoanalyysiin lopullinen värjäys pistemäärä ≥ 3 pidettiin korkeana.

Vector valmistelu

184 ep DNA-fragmentti, joka vastaa ennalta miR-31 valittiin, ja reunustavien sekvenssi monistettiin ja kloonattiin pLVTHM lentivirusvektorilla (https://www.addgene.org/Didier_Trono) tuottaa pLV-miR-31 ekspressiovektoriin. pLVTHM lentivirusvektoriannos koodaa parannettua vihreää fluoresoivaa proteiinia (EGFP), joka on optimoitu kirkkaampi fluoresenssin ja suurempi nisäkässoluissa. Edellä kuvattu vektori pCAG-SATB2 [19] käytettiin säätää ylös SATB2 ilme.

täyspitkä 3’UTR SATB2 (2711bp) kloonattiin ja insertoitiin sitten alavirtaan lusiferaasireportterigeenin pGL3-kontrolli Vector (Promega, Madison, WI, USA). Tämä tehtiin pGL3-SATB2-3’UTR. Kahden mahdollisen miR-31 sitoutumiskohdat on 3’UTR SATB2 oli paikkaan kohdistettua ja mutatoitu, käyttäen vastaavasti GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen). Kaikki plasmidit varmistettiin sekvensoimalla. Kaikki alukesekvenssit toteamiseksi ja miRNA-sekvenssit on esitetty taulukossa S1.

lentivirustartunnat tuotanto ja infektio

Virus hiukkaset kerättiin 48 tunnin kuluttua pLV-miR-31 transfektion kirjekuoren plasmidilla pMD2.G ja pakkauksen vektori psPAX2 293T-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen ). CRC-solut infektoitiin rekombinantti lentivirus-transdusoivat yksiköt ja 8 mg /ml polybreeniä (Sigma, St Louis, Missouri, USA) ja sitten suoritettiin FACS-analyysi GFP: n ilmentymisen saada CRC-soluja, joilla on stabiili yli-ilmentyminen miR-31. Tyhjän lentivirusvektoriannos pLVTHM käytettiin kontrollina (miR-con).

Oligonukleotidi transfektion

miR-31 matkii ja antisense-inhibiittoreita, jotka sisältävät 2′-OMe (

O

metyyli) muutokset syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Oligonukleotidi transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen).

lusiferaasireporttiterilla määritys

läsnä joko miR-31 tai miR-con, tulikärpäsen lusiferaasi konstrukti transfektoitiin samanaikaisesti kontrollina

Renilla

sivektorissa pRL- CMV (Promega) osaksi SW480-soluihin. Dual Luciferase Assay (Promega) suoritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena itsenäisesti.

Soluproliferaatiomääritys ja solusyklin analyysi

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille 2 x 10

3 per kuoppa. Soluproliferaatiota arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä solusyklin analyysi, solut maljattiin 6-kuoppaisille maljoille 5 x 10

5 per kuoppa. Solu-sykli jakelun analysoitiin propidiumjodidia (Sigma-Aldrich) värjäystä ja virtaussytometria [23].

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille 2 x 10

2 kohti ja ylläpidetään RPMI1640, joka sisälsi 10% FBS: ää varten 2 viikkoa. 2 viikon kuluttua, solut pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Pesäkkeiden lukumäärä laskettiin mikroskoopilla [24].

Haavojen paraneminen ja invaasio määritykset

Solun muuttoliikettä arvioitiin mittaamalla liikkumista solujen osaksi kaavittu, soluton alue luoma 200 ui pipetin putki, ja leviäminen haavan jälkeen havaittiin 0 ja 48 tuntia, vastaavasti. Kuvat on otettu arvioimaan siirtymän tason kussakin ryhmässä transfektoitujen solujen. Migration kvantifioitiin laskemalla solujen kokonaismäärässä, jotka kulkeutuivat kohti alkuperäisen haavan alalla. Sillä invaasiomääritys, Matrigel päällystetty kammiot (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), joka sisältää 8 um huokosia käytettiin. Solut ympättiin yläkammioiden (päällystetty matrigeeliä) 2 x 10

5-pitoisuus seerumia. Alempaan kammioon Transvvell- täytettiin elatusaineet, joka sisälsi 10% FBS kuin chemo-houkutinta. Kun kammiot inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan, ei-hyökkäsi solujen päällä Transvvell- raaputettiin pois pumpulipuikolla. Onnistuneesti siirtämisellä solut kiinnitettiin 10% formaliinilla. Sitten ne värjättiin 0,1% kristallivioletilla 30 minuutin ajan ja laskettiin valomikroskoopilla.

In vivo

toimintoja määrityksiä

Balb /C-nu /nu kateenkorvattomia karvattomia hiiriä (4-6 viikkoa vanhoja) hankittiin laboratoriossa eläinkeskus Etelä Medical University. Hiiriä pidettiin alle taudinaiheuttajista vapaa olosuhteissa 12 tunnin pimeä /valo sykli ja

mielinmäärin

pääsy ruokaan ja suodatettua vettä. Eläimet käytetään tutkimukseen sai inhimillinen hoito. Tuumorikasvulle määrityksessä, yhteensä 2 x 10

6 solua SW480 vakaan yli-ilmentyminen miR-31, tai kontrolli soluja, injektoitiin ihon alle vasempaan ja oikeaan kylkeen hiiriä (n = 6 ryhmää kohti). Sitten fluoresenssin solut kerättiin ja kuvat analysoitiin läpi koko kehon GFP kuvantamisjärjestelmä (Lighttools, Encinitas, CA), jotka voivat visualisoida reaaliajassa kasvaimen kasvua. Kasvaimen koko mitattiin käyttämällä digitaalista jarrusatulat joka kolmas päivä. Sen jälkeen, kun 30 päivää seurannan, hiiret tapettiin katkaisemalla kaula ja kasvaimet leikeltiin. Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavasti: Volume = (S × d

2) /2, jossa D tarkoitti pisin halkaisija ja d tarkoitti lyhin halkaisija.

perustamisesta metastaattinen malli, hiiri umpisuoli oli exteriorized by laparotomiaa natrium- pentobarbitaalianestesiassa (6 mg /100 g ruumiinpainoa). Ihonalainen kasvaimet kuutioiksi jaetaan 1 mm

3 kuutiot ja istutetaan suolilieve klo cecum päätepisteestä hiirillä. Sitten suolistossa palautettiin vatsaonteloon ja suljetaan leikkausliinoissa. Lämpötyynyt käytettiin auttamaan leikkauksen jälkeisestä toipumisesta hiiriä jälkeen ksenograftit istutuksen. Eläinten terveydentilaa seurattiin leikkauksen jälkeen päivittäin, kuten liikuntaa, nesteytys, syöminen ja juominen tottumukset ja ambulation. Kehon paino ohjaus ja SW480 /miR-31 hiirillä oli myös kirjattiin joka kolmas päivä. Humane päätepisteet oli suunniteltu lopussa kokeen ja keinona kokea kipua tai tuskaa. Integroitu kriteeri tarvetta eutanasian toteutettiin Tutkimuksessamme lukien fyysinen vaje, sairaus, ahdistus, liikkumattomuus, laihtuminen ja maksimi kasvaimen kokoa. Kun he näyttivät ilmeinen fyysinen vaje, kuten kuiva tai tylsä ​​silmät, tahmea limakalvoja, kyyryssä, ambulation vähentäminen, huomiotta tarkkailija, hengenahdistus tai kakeksia, hiiret katsotaan täytä eutanasian ja uhrattiin minimoida tuskaa ja kärsimystä. Lopussa kokeen (8 viikkoa), vielä elossa hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat. Elimet poistettiin ja kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin. Myöhemmin peräkkäisen kudosleikkeiden saatiin ja värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla (H metastasoituneen kolorektaalisyövän merkitsee CRC kudoksiin imusolmukemetastaaseja. (C) Expression of miR-31 CRC solulinjoissa ja alakloonit. miRNA runsaus oli normalisoitu U6-RNA. (D) Expression analyysin miR-31 normaalissa peräsuolen limakalvolla ja CRC kudoksista

situ

hybridisaatio. (A) Negatiivinen ilmaus miR-31 normaalissa peräsuolen limakalvolla; (B) alhainen ilmentyminen miR-31 CRC kudoksissa; (C, d) korkea ilmentyminen miR-31 CRC kudoksissa; (E) negatiivinen kontrolli; (F) Kaplan-Meier-analyysi selviytymisen sairastavien potilaiden CRC mukaan miR-31 ilme. Log Rank = 6,682,

p

= 0.010.

Yli-ilmentyminen miR-31 liittyi aggressiivisen fenotyyppi ja huonon ennusteen potilaita, joilla CRC

jotta voitaisiin edelleen tutkia kliinis sekä varoituksia merkitys miR-31 tasoa, mittasimme miR-31 ilmentyminen suuressa kohortissa 143 arkistoitu parafinoidut CRC ja normaalin paksusuolen kudoksiin käyttämällä ISH. Havaitsimme, että 75/143 (52.45%) CRC oli korkean tason ilmentymisen miR-31, kun taas 11/55 (20%) normaali limakalvo kudokset oli korkean tason ilmentymisen miR-31 (

p

0,001). Korrelaatio analyysi välinen kliinis ominaisuuksien ja miR-31 tason osoitti korkean tason ilmentymisen miR-31 oli merkitsevästi yhteydessä T-vaiheessa (

p

= 0,045), imusolmuke etäpesäke (

p

= 0,001), ja kaukainen etäpesäke (

p

= 0,026) potilailla, joilla CRC ei kuitenkaan liittynyt ikä, sukupuoli, kasvaimen sivusto, kasvaimen koko ja kasvaimen erilaistumiseen aste (

p

0,05, taulukko 1).

Ominaisuudet

n

miR-31 ilmentyminen

alhainen (%) B korkea (%) B

P

arvo

Sukupuoli Male8739 (44.83) 48 (55,17) 0,416 Female5629 (51.79) 27 (48.21) Ikä (vuotta) 506535 (53,85) 30 (46.15) 0,169 ≥507833 (42,31) 45 (57,69) Kasvain site Proksimaalinen colon4220 (47.62) 22 (52,38) 0,369 Distaalinen colon3721 (56,76) 16 (43.24) Rectum6427 (42,19) 37 (57,81) Kasvaimen koko (cm) 54519 (42.22) 26 (57,78) 0,387 ≥59849 (50.00 ) 49 (50,00) Kasvaimen eriyttäminen Good136 (46.15) 7 (53,85) 0,979 Moderate10450 (48.08) 54 (51.92) Poor2612 (46,15) 14 (53,85) T-stage1-22316 (69,57) 7 (30,43) 0,045 38740 (45,98) 47 (54.02) 43312 (36,37) 21 (63,63) N-stage05938 (64,41) 21 (35.59) 0,001 1-28430 (35,71) 54 (64,29) Distant metastasis09451 (54,26) 43 (45.74) 0,026 14917 (34.69) 32 (65.31) Taulukko 1. Korrelaatio kliinis ja ilmentyminen miR-31.

CSV Lataa CSV

arvioimiseksi ennustetekijöiden arvo miR-31 CRC, olemme analysoineet yhdistyksen välillä miR-31 ilmentyminen ja eloonjäämisen kesto käyttämällä Kaplan -Meier analyysi log-rank-testi. Tulokset osoittavat, että korkean tason ilmentymisen miR-31 korreloi lyhyt elinaika potilailla, joilla on CRC (51,85 ± 3,78

vs

.76.64 ± 4,30,

p

= 0,010, Kuvio 1D ). Lisäksi Coxin monimuuttuja regressio analyysi osoitti, että korkean tason ilmentymisen miR-31 on itsenäinen ennustetekijä huonosta eloonjäämisen potilailla, joilla on CRC (taulukko 2).

Muuttujat

Univariate analyysi

Monimuuttuja-analyysi

P

arvo

HR

95%: n luottamusväli

P

arvo

HR

95%: n luottamusväli

Gender0.516 0,826 0.464-1.471Age0.391 0,785 0.451-1.366Tumor site0.915 0,982 0.707-1.365Tumor size0.581 1.190 0.642-2.207Tumor differentiation0.074 1,648 0.953-2.850T-stage0.001 2,262 1.419-3.6060.032 1,695 1.045-2.750 N-stage0.041 1,563 0.846-2.7280.604 0,847 0.453-1.586M vaiheen 0.0014.338 2,441-7,707 0.0013.563 1.940-6.545miR-31 expression0.012 2,145 1.182-3.8900.048 1,877 1.007-3.488Table 2. Kokonaiselossaoloaika analyyseja yhden ja usean COX regressioanalyysi.

CSV Lataa CSV

Exogenetic yli-ilmentyminen miR-31 edistänyt CRC solun kasvu, invaasio, ja muuttoliike

in vitro

tutkia mahdollisuuksia biologisen toiminnan miR-31 CRC kasvainten synnyssä ja etenemisessä, SW480 ja DLD-1-solut infektoitiin pLV-miR-31 tai pLV-con, vastaavasti. Tämä tehtiin perustaa kaksi vakaata miR-31-yliekspressiosolu- linjat ja kaksi mock solulinjoissa (miR-con). Lisääntynyt ilmentyminen miR-31 infektion jälkeen kaksi solulinjoissa vahvistettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä (kuvio 2A). Kuten kuvassa 2B-2D, yli-ilmentyminen miR-31 lisäsi syöpäsolujen lisääntymistä ja sen kyky muodostaa pesäkkeitä kuin että mock soluissa ja villin tyypin ei-infektoiduista soluista (

p

0,001 ). Virtaussytometria ja solusyklin analyysi paljasti merkittävän vähenemisen prosentuaalinen solujen G1 /G0 vaihe (

p

= 0,004 in SW480

, p

= 0,008 vuonna DLD1) ja kasvu S vaihe CRC soluja käsiteltiin miR-31 (

p

= 0,002 SW480

, p

= 0,001 DLD1, kuvio 2E).

(A) Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi miR-31 ekspressiotaso SW480 ja DLD-1-soluissa jälkeen kohdunulkoinen yli-ilmentyminen miR-31. (B, C) vaikutus miR-31 soluproliferaatioon mitattiin CCK-8-määrityksessä. (D) vertailu pesäkkeiden muodostumisen vaikutuksesta CRC solulinjoissa. (E) Cell syklin jakelu CRC infektoitujen solujen miR-31 havaittiin virtaussytometrialla analysointia. (F, G) vaikutukset miR-31 kohdunulkoinen over-ilmentyminen solun motilities ja invasiivisuus määritettiin haavan paranemista (F) ja matrigeelin invaasio (G) määritykset. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Tulokset olivat toistettavissa kolmessa riippumattomassa kokeessa. *

p

0,05, **

p

0,001.

Valvottuaan miR-31-välitteisen kasvun liioittelu, vaikutus miR-31 invasiivisen kapasiteetin CRC solujen leimasi haavan paranemista ja matrigeeliin invaasiomääritys. Tulokset osoittivat, että exogenetic ilmentyminen miR-31 CRC soluissa aiheutti merkittävän kasvun solujen vaeltamiseen käyttäen haavan paranemista mitattuna (

p

= 0,001 SW480

, s

0,001 DLD1, kuvio 2F). Matrigel invaasiomääritys myös osoitus siitä, että yli-ilmentyminen miR-31 selvästi aiheuttama invasiivisuus CRC solujen (

p

0,001 sekä SW480 ja DLD1, kuvio 2G). Nämä tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-31 riitti edistää sekä solujen proliferaatio ja migraatio

in vitro

.

miR-31 helpotti CRC solujen kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

Koska miR-31 edistää kasvua, muuttoliike, ja invaasion CRC solujen

in vitro

, me houkutus onko miR-31 voisi helpottaa kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

. Tätä tarkoitusta varten SW480-soluja, joilla on stabiili yli-ilmentyminen miR-31 (SW480 /miR-31) ja valvonta-soluja (SW480 /miR-con) inokuloitiin subkutaanisesti nude-hiiriin. Kuten kuviossa 3A, nopeus kasvaimen kasvu SW480 /miR-31 ryhmä oli merkittävä kuin SW480 /miR-con ryhmä (

p

0,05, kuvio 3A ja 3B). IHC värjäys osoitti, että kasvainten kontrolliryhmän näytetään paljon pienempi Ki-67-indeksi kuin miR-31 yli-ilmentymisen ryhmässä (kuvio 3B).

(A) Koko kehon ulkoinen fluoresenssi kuvia SW480 /miR -31 ja SW480 /miR-con hiiriä ja kasvaimet (ylempi) ja kuvia ihonalainen kasvain hiirten (alempi) saatiin. Nuolet osoittavat ihonalainen syöpiä. (B) edustaja valokuvia H 0,05, kuvio 3D ja 3E ). Lisäksi kävi ilmi, että miR-31 yli-ilmentyminen johti lyhyempi elinaika kertaa eläinten (

p

0,05, kuvio 3F).

inhibitio miR-31 vähensi kasvu, invaasio, ja migraatio CRC solujen

in vitro

vahvista vaikutusten miR-31 moduloimalla pahanlaatuinen fenotyypit CRC soluja, tutkimme myös muutoksen aggressiivinen fenotyypit CRC solut jälkeen pienentää ilmentymisen miR-31. miR-31-spesifinen estäjä transfektio käytettiin estävän miR-31 ilmentyminen M5 ja SW620-soluissa, jotka oli korkea endogeeninen miR-31 ilme. Kuten kuvassa 4A on esitetty, kun kontrolliin verrattuna soluihin, on huomattavasti hitaampi lisääntymisnopeus havaittiin miR-31-estäjä-transfektoiduissa soluissa (

p

0,001). Lisäksi matrigeeliä invaasion ja haavan paranemista määrityksissä vahvisti, että inhibitio miR-31 ilmentyminen vähensi invasiivisuus ja migraation M5 ja SW620-soluissa, verrattuna kontrollisoluihin (

p

0,05, kuvio 4B ja 4C ).

(A) esto miR-31 esti solujen lisääntymistä M5 ja SW620-soluissa CCK8 määrityksessä. (B, C) estäminen miR-31 vähensi solujen invasiivisuus ja muuttoliike määritettynä matrigeelin invaasio kammio (B) ja haavoja määritykset (C). Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Tulokset olivat toistettavissa kolmessa riippumattomassa kokeessa. *

p

β-aktiini käytettiin latauskontrollina.