PLoS ONE: MicroRNA-145 Tavoitteet YES ja STAT1 Colon Cancer Cells
tiivistelmä
Background
MikroRNA (miRNA) ovat nousseet tärkeiksi geeni sääntelyviranomaisten ja tunnustetaan avaintoimijoita kasvainten synnyssä. miR-145 on raportoitu alassäädetty useissa syövissä, mutta tieto tavoitteensa paksusuolensyöpä edelleen vähäistä.
Menetelmät /Principal Havainnot
roolin tutkimiseksi miR-145 paksusuolen syöpä, olemme palkanneet microarray perustuva lähestymistapa tunnistaa miR 145 tavoitteita. Perustuen siemen päällä rikastamiseen analyysit ja puolueeton sana analyysit, löysimme merkittävän rikastamisen miRNA sitoutumiskohdat 3′-alueet (UTR) selostukset alassäädetty upon miRNA yli-ilmentymisen. Gene ontologia analyysi osoitti yliedustus liittyvien geenien solukuoleman, solujen kasvun ja lisääntymisen, solusyklin, geenin ilmentymisen ja syövän. Useat tunnistettujen miRNA tavoitteet aikaisemmin liitetty syövän, kuten
YES
,
FSCN1
,
ADAM17
,
BIRC2
,
VANGL1
sekä transkriptiotekijä
STAT1
. Molemmat
YES
ja
STAT1
todennettiin suorana miR 145 tavoitteita.
Johtopäätökset /merkitys
Tutkimus tunnistaa ja vahvistaa uusia syöpää asianomaisen suoran tavoitteita miR-145 koolonkarsinoomasoluissa ja täten lisää tärkeitä mekanistinen käsitys kasvaimen esti toimintoja miR-145.
Citation: Gregersen LH, Jacobsen AB, Frankel LB, Wen J, Krogh A, Lund AH (2010) MicroRNA-145 tavoitteet
YES
ja
STAT1
vuonna koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 5 (1): e8836. doi: 10,1371 /journal.pone.0008836
Editor: Grzegorz Kudla, University of Edinburgh, Yhdistynyt Kuningaskunta
vastaanotettu: 28 lokakuu 2009; Hyväksytty: 31 joulukuu 2009; Julkaistu: 21. 2010
Copyright: © 2010 Gregersen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Work in kirjoittajien laboratoriossa tukee Euroopan komission (EY) FP7 rahoitus (ONCOMIRS, avustussopimuksessa määrä 201102. Tässä julkaisussa esitetyt vain kirjoittajien näkemyksiä. Toimikunta ei vastaa mahdollisesta käytöstä voidaan tehdä tiedon tässä), Novo Nordisk Foundation, The Lundbeck Foundation, Tanskan National Research Foundation, Tanskan Medical Research Council, Tanskan Cancer Society ja Tanskan kansallinen Advanced Technology Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
viime vuosina pienet ei-koodaavat RNA: t on tunnustettu tärkeäksi geeni sääntelyviranomaiset [1] – [4]. miRNA ovat runsas endogeenisiä pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka toimivat säätelijöinä proteiinia koodaavat geenit läpi translaation tukahduttamisen ja /tai hajoamista niiden kohde-mRNA: [1]. Laajat miRNA tutkimus on paljastanut, että miRNA osallistuvat säätelyyn useiden keskeisten solutoiminnoille kuten aineenvaihdunta, solujen lisääntymistä, tuumorigeneesiprosessin apoptoosin, kehitys ja erilaistuminen [1], [3], [4]. Säännellä kohde-mRNA: kypsä miRNA sidotaan AGO proteiineihin ja ohjata AGO liittyvän RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC) mRNA tavoitteiden kautta epätäydellisen emäspariutumisen välillä miRNA ja tavoite. Tähän liittyy usein täydellinen tukikohta kuoret välillä 5 ’päähän miRNA lohkon ja sen tavoite, jota kutsutaan myös siemen sivuston. Bioinformatiikan analyysit viittaavat siihen, että jokainen miRNA voi valvoa satoja kohdegeenien ihmisillä, ja se on viime aikoina raportoitu, että yli 60% proteiinia koodaavat geenit ovat alla valikoivan paineen synnyttämiseen pariksi miRNA, mikä osoittaa, että miRNA on potentiaalia säännellä suurin osa proteiinin koodaavat geenit [5].
Sopimaton ilmentymä miRNA, jotka säätelevät geenit toimivat joko kasvaimeen vaimentimet tai onkogeenien voi lopulta johtaa hankinnan tunnusmerkkejä syöpä, mikä määritellään miRNA kun sekä kasvain-vaimentimet ja onkogeenien [ ,,,0],3], [6], [7]. Erityisiä muutoksia miRNA ekspressiotasot on liitetty erilaisia syöpää [8], ja suuri määrä miRNA on lokalisoitu niin kutsuttuja syöpään liittyvän genomisen alueilla, jotka ovat usein alttiina muutoksille syöpäsoluja [9]. Kuitenkin toisin kuin suuri määrä miRNA jotka on löydetty viime vuosina, vain suhteellisen harvat miRNA tavoitteet on kokeellisesti vahvistettu. Koska ylivoimainen näyttöä siitä, että miRNA ovat tärkeitä säätelijöitä tumorigeneesin [3], [6], tunnistaminen miRNA tavoitteita on tarpeen ymmärtää mekanistinen perusta osallistumisen miRNA syövässä.
miR-145 on usein havaittu säädellä vähentävästi syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä [10], [11], virtsarakon syöpä [12], paksusuolen syöpä [13] – [18], munasarjasyöpä [19], [20] sekä B -solujen maligniteetteja [21], [22], ja se on raportoitu, että genominen alue, joka koodaa miR-145 sijaitsee hauras sivuston usein poistettu syöpää [23]. Näin ollen, miR-145 yli-ilmentyminen on osoitettu olevan kasvua estävä vaikutus [16], [17], [24], [25] ja tukahduttaa ankkurointi riippumattomaan kasvuun [16]. Se on lisäksi osoitettu, että miR-145 ilmentyminen indusoi p53 [16]. Täällä todettiin, että miR 145 tavoitteet c-Myc kautta epätäydellinen siemen emäspariutumisen [16] ja ehdotettiin, että p53-välitteinen downregulation c-Myc on, ainakin osittain johtuen p53-välitteistä säätelyä miR 145 . Toisessa tutkimuksessa todettiin myös tehostettuun miR-145 aiheuttama doksorubisiini [26]. Sen sijaan, transkriptionaalisen aktivaation miR 145 havaittiin, että p53: n aktivoi käsittelyä ensisijaisen miR 145 transkriptit miR-145 lähtöaineista [26]. Tämä ilmiö ei rajoitu vain miR-145, vaan myös useissa muissa miRNA joilla tiedetään kasvua tukahduttava toimintoja, mikä osoittaa p53-välitteinen säätely miRNA käsittelyn keinona aiheuttaa sitä kautta kasvaimeen tukahduttava toiminto [26]. Sen lisäksi, että c-Myc, miR-145 on myös ehdotettu kohdentamaan ihmisen insuliinin reseptori substraatti-1 (IRS-1) ja tyyppi I insuliinin kaltainen kasvutekijä-reseptori (IGF-IR) paksusuolen syöpä [25], [ ,,,0],27]. Kuitenkin spesifisyys tavoitetta vuorovaikutus ei ole vahvistettu mutaatioanalyysiin siementen sivustoja kummassakin näistä tapauksista.
Ilmaisu taso miR 145 indusoituu erilaistumisen aikana ihmisalkion kantasoluja ja miR-145 yli-ilmentyminen on osoitettu heikentävän pluripotenttisuuden ihmisen alkion kantasoluja kohdentamalla on
Oct4
,
Sox2
ja
Klf4
jotka ovat mukana säilyttäen itseuudistuvien kapasiteetti ihmisalkioiden kantasolujen [28]. Tämä rooli miR-145 indusoi erilaistumisen alkion kantasolujen hyväksyy roolin miR 145 repressorina kasvun syöpäsoluja. Hiiren malli on suunniteltu tutkimaan ekspressiokuviota miR 145 paljasti ilmentymisen miR-145 multipotenteista sydämen progenitorisolujen ja sileän lihaksen soluissa [29], ja ehdotti, että miR-145 edistää erilaistumista sileät lihassolut [29]. Kuitenkin toinen tutkimus osoitti, että hiirillä puuttuu miR-145 olivat elinkelpoisia ilman avointa poikkeavuuksia sileän lihaksen solujen erilaistumista [30], mikä osoittaa, että on olemassa muita edistäjiä erilaistumista.
Yhdessä miR-145 näyttää olevan kasvain-vaimennin toimintoja, kun yli-ilmennetään syöpäsoluissa ja voi yleensä olla rooli erilaistumisprosesseissa. Tässä olemme keskittyneet tavoite tunnistamista miR 145 paksusuolen syövän, joka perustuu microarray ilmaisun profiilit solujen yli-ilmentävät miR-145. Gene ontologia analyysit miR 145 reagoiva geenien vahvistaa sääntelyä liittyvien geenien solukuolemaan, solusyklin säätelyssä ja syövän. Olemme tunnistaneet useita miR 145 tavoitteita, jotka voisivat olla mielenkiintoista syöpä yhteydessä ja todennut miR 145 tavoitteet YES ja STAT1 paksusuolen syöpäsoluissa.
Tulokset
aiheuttaneet ne lukuisat raportit miR 145 downregulation syövän yritimme tunnistaa miR 145 tavoitteita, jotka voisivat selittää rooli miR 145 syövässä. Saadakseen käsityksen ekspressiotasot miR 145 vakiintuneissa solulinjoissa, me profiloitu ekspressiotasot useissa syöpäsolun linjat sekä ei-tuumorigeeniset solulinjoissa (kuvio S1). Ilmaisu profiilit miR-145 osoitti, että lukuun ottamatta MCF10A kaikissa testatuissa ei-tuumorigeenisiä solulinjoja ilmaistuna miR-145, kun taas ekspressiotasot miR-145 oli erittäin alhainen kaikissa testatuissa syöpäsolulinjoissa, tukee aiempia havaintoja, joissa miR-145 on alassäädetty tai kadonnut syövän. Koska sen vaikutuksia paksusuolensyöpä [13] – [18], päätimme tutkia roolia miR 145 on koolonisyöpäsolulinja DLD-1. Kotransfektion miR 145 duplex lusiferaasireport-, joka sisältää täydellisen komplementaarinen sivuston kypsä miRNA johti merkittävään downregulation lusiferaasiaktiivisuus, mikä osoittaa erittäin tehokas yli-ilmentyminen (kuvio S2A). Kuten on osoitettu sekä kristalliviolettia ja MTT kasvun määrityksissä, yliekspressio miR 145 johti vähentyneeseen soluproliferaation (kuvio 1 ja kuvio S3).
DLD-1-solut transfektoitiin 50 nM miR-145 duplex omaavat vähennetään soluproliferaatiota mitattuna kristalliviolettimäärityksellä kasvun määrityksessä. Data on esitetty keskiarvona ± S.D. neljä rinnakkaisnäytettä.
tunnistaminen miR 145 Tavoitteet
Koska viitteitä siitä, että miR-145 on rooli syövän yhdessä vähän tietoa sen tavoitteet paksusuolensyöpä, tavoitteena oli tunnistaa toiminnallisesti asiaankuuluvat tavoitteet, jotka voisivat auttaa selittämään rooli miR 145 syövässä. Tämän saavuttamiseksi, käytimme microarray perustuva strategia samanlainen kuin aiemmin käytetty tunnistamaan miR-21 tavoitteet [31]. DLD-1-solut transfektoitiin 50 nM miR-145 duplex tai valetransfektoiduissa. Kokonais-RNA kerättiin 24 tuntia transfektion ja analysoitiin Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 ihmisen taulukot. Yhteensä kahdeksan paneelit analysoitiin. Suodatukseen, epäinformatiivisia geenejä samalla ilmentymistaso kaikissa paneelit (myös ei-ilmaistuna geenejä) poistettiin ja ilmennetty eri geenit, niiden vastaavat p-arvoja ja vääriä löytö laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa.
Voit selvittää geenien säädellään miR 145 yliekspressio liittyi tiettyihin solujen toimintoihin, haku sisällä toiminnalliset huomautuksesi Ingenuity tietokannassa (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) tehtiin kaikille miR-145 reagoiva geenejä. Viisi parasta rikastettua toiminnallista luokkaa Gene ontologia analyysi luetellaan taulukossa 1. Näistä luokat ovat solukuoleman, solujen kasvun ja lisääntymisen, solusyklin säätelyssä ja syövän. Vastaavat analyysit käyttämällä satunnaisia geeniä sarjaa tuotetaan Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 merkintöjä, joissakin tapauksissa johtaneet rikastuminen samoihin luokkiin, jotka löysimme rikastettu miR 145 aineisto, mutta p-arvot 10 kertaluokkaa suurempi kuin miR-145 aineisto (tuloksia ei ole esitetty).
Seed site rikastamiseen analyysi esiintymisten miR 145 siemen sivustoja 3’UTRs osoitti erittäin merkittävä rikastamiseen joukossa alassäädetty selostukset (KUVA 2A). P-arvot rikastamista miR 145 siemen sivustoja (kuten 7mer, 7mer-1A ja 8mer sivustot) olivat 1,4 · 10
-21 ja 7,6 · 10
-8 harkittaessa alassäädetty transkriptien vs . sääteli transkriptien ja alassäädetty transkriptien vs. mitään muutosta selostukset, vastaavasti. Kaksi vaihtoehtoista laskentamenetelmiä siemen sivuston rikastamiseen, joko siementen päällä tapahtumien korjaamisen jälkeen ylös, alas ja mitään muutoksia asettaa samaan koon tai siemeninä sivuston tapahtumien per kb, oli samanlainen rikastumista alassäädetty 3’UTRs ( KUVA S4). Yhdessä tämä tarkistaa, että microarray lähestymistapaa voidaan käyttää tunnistamaan miRNA tavoitteita. Kun koko cDNA-sekvenssin transkriptien käytettiin siementen päällä rikastamiseen analyysi (ilmoitetaan prosenttiosuutena selostukset siemeniä sivustoja), meillä on vielä löytää merkittävän rikastamisen siementen sivustoja, vaikka rikastaminen on vähäisempää verrattuna vain harkitsee 3 ”UTR-sekvenssit (kuvio S5a). Samanlainen analyysi koodaussekvenssit ja 5’UTR sekvenssit eivät paljastaneet merkittävää siementen päällä rikastus (KUVA S5B ja S5c).
, Prosenttiosuudet geenien ylös, alas (DN) ja ei-muutosta (nc ) asettaa siemenistä sivustoja niiden 3’UTRs. Vain ne 6mers, jotka eivät ole osa 7mer tai 8mer ilmoitetaan 6mers ja vain ne 7mers, jotka eivät ole sisällytettynä 8mer lasketaan 7mers. Log taitettava muutokset olivat 0,36, 0,02 ja -0,40 varten ylös, alas ja no-muutosta asetetaan vastaavasti. P-arvot lasketaan testaa hypoteesia, että osa geeneistä siemeniä sivustot ovat samat alassäädetty ja ylös-geenien (dn vs. ylös) tai alas geenien verrattuna ei-muutosta geenit (dn vs. nc). P-arvot 7mer siemen sivuston rikastamiseen olivat 1,7 · 10
-33 (dn vs. ylös) ja 2,9 · 10
-11 (dn vs. nc). P-arvot 7mer-1A siemen site rikastamiseen olivat 3,7 · 10
-18 (dn vs. ylös) ja 7,8 · 10
-7 (dn vs. nc). B, Puolueettomat sana analyysi osoittaa käynnissä summa yliedustukseksi sijoituksen miR 145 7mer siemenet sivusto sijoittui listan 3’UTR sekvenssit (musta viiva) verrattuna permutaatiot sijoittui geenin listan (punaiset viivat). Alas- ja ylöspäin geenien (määritellään geenejä FC -1.1 tai FC 1,1) on sijalla geenissä luetteloon merkinnällä kaaviossa. C, kvantitatiivinen RT-PCR validointi microarray data. Solut transfektoitiin 50 nM miR 145 duplex tai valetransfektoidut ja kokonais-RNA kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen. 3’UTRs on
IQGAP1
ja
STAT1
eivät sisällä miR 145 siemenen ottelut, mutta molemmat geenit sisältävät 7mer siemen ottelun niiden koodaavan alueen. Kaikki muut miR 145 reagoiva geenit sisältävät ainakin yhden 7mer siemen sivusto niiden 3’UTR. Ilmentymisen taso kunkin transkriptin on esitetty suhteessa tason mock transfektoiduissa soluissa. Data on esitetty keskiarvona ± S.D. on kolme toistoa.
Puolueettomat sana analyysit 3’UTR sekvenssit tunnistettu 7mer siemen sivuston miR 145 kaikkein merkittävästi rikastettu 7mer sana 3’UTRs on alassäädetty selostukset (TAULUKKO 2). Useat muut korkeasti rikastetun sanat olivat muunnelmia miR 145 siemenen päällä ja neljänneksi eniten rikastettu sana oli 7mer-1A siemeniä ottelun (taulukko 2). Vastaava 6mer sana-analyyseihin myös tunnistettu miR 145 siemenen ottelut kaikkein merkittävästi rikastettu sanat (FDR 0,005) (kuvio S6). Piirtämällä käynnissä summa yliedustus tulokset on 7mer siemen sivuston selostukset paremmuusjärjestykseen logFC osoitti selvästi, että 3’UTRs on alassäädetty transkriptien oli korkea rikastuminen miR 145 7mer siemenet (musta viiva), jota ei havaittu varten permutaatiot sijoittui geenin listan (punaiset viivat) (kuvio 2B).
Mahdolliset miR 145 tavoitteet
Koska miR-145 säätyy alas tai kadonnut syövän, re -introduction Mir-145 voidaan olettaa aiheuttavan suoraan downregulation onkogeenin tavoitteita. Itse asiassa useita geenejä onkogeenisella toimintoon alassäädetty upon miR 145 yli-ilmentyminen, mukaan lukien Src perheenjäsen
YES
ja aktiini ristisidoksia proteiini
FSCN1
, joka löytyy solussa pintaulkonemia osallisena solun liikkuvuus [32]. Metalloproteinaasi
ADAM17
ja jäsen apoptoosi-inhibiittori (IAP) -perheen
BIRC2
(tunnetaan myös nimellä
cIAP1
), jotka molemmat sisältävät 8mer miR-145 siementen sivustoja niiden 3’UTRs, havaittiin myös niin alassäädetty upon miR 145 yli-ilmentymisen. Lisäksi,
VANGL1
, joka on mukana haavan paranemista vasteena suolen epiteelisolujen linjojen edistämällä solumigraation määriteltiin myös otaksutun miR-145 tavoite [33].
Jotkut alassäädetty geenit eivät ole miR 145 siemenen päällä heidän 3’UTR, mutta sen sijaan oli yksi tai useampi siemen sivustoja koodaavan alueen. STAT1, tunnettu transkriptiotekijä [34], [35] ja IQGAP1 negatiivinen säätelijä solu-solu kiinnikkeistä ja kiihotusaineena soluliikkuvuus ja invaasiota [36], molemmilla oli miR 145 siemen sivustoja koodausalueissa niiden selostukset. Kun kyseessä on
STAT1
, MIR-145 siemenen sivusto sijaitsee toisessa viimeisen eksonin transkriptin. Koska
STAT1
oli kaikkein alassäädetty transkriptien mikrosiruanalyysi, se pidettiin myös mahdollisena kohteena ja sisällytetään myöhemmän tutkinnan. Aikaisemmin tunnistetut miR 145 tavoitteet
Oct4
,
Sox2
ja
Klf4
ihmisen alkion kantasoluja ei ole ilmaistu DLD-1-soluissa (tuloksia ei ole esitetty).
MYC
,
ISR-1
ja
IGF-1 R
, ehdotti toiset miR 145 tavoitteet [16], [25], [27], ei osoittanut muutos ilmentymistaso upon miR 145 yliekspressio meidän aineisto (tuloksia ei ole esitetty). Täydellinen luettelo tunnistettu potentiaalisia miR 145 tavoitteita sisältäviä siemeniä sivustoja niiden 3’UTR on esitetty taulukossa S1.
Target Validation
vieressä vahvisti microarray data kvantitatiivisen RT-PCR seitsemän valittua selostukset löytyneiden alassäädetty että mikrosiruanalyysi (kuvio 2C). Erityisesti
STAT1
ja
YES
, joilla on miR 145 siemen sivustoja koodaavan alueen ja 3’UTR vastaavasti näkyi selvä alassäätöä tran- upon miR-145 yli-ilmentymisen. Sen määrittämiseksi, onko miR 145 suoraan säätelee
YES
ja
STAT1
, lusiferaasireportterista konstruktit kloonattiin. Pohjan välisen pariutumisen miRNA siementen sivustoja ja mahdollinen mRNA: n tavoitteet on esitetty kuviossa 3A. Molemmissa tapauksissa yli-ilmentyminen miR 145 alensivat lusiferaasiaktiivisuuden, mikä osoittaa, että miRNA voi sitoa sekä
YES
3’UTR ja
STAT1
cDNA, ja sitä välittävät tukahduttamisen (kuvio 3B ). Näin ei ollut asianlaita reportterirakenteet jos siemenet sivustot oli mutatoitunut (kuvio 3B). Edelleen varmistamiseksi miRNA välittämä säätely alaspäin STAT1 ja YES proteiini tasolla, western blot analyysit tehtiin sekä DLD-1-soluissa ja HCT116 koolonkarsinoomasoluissa. Yli-ilmentyminen tehokkuus miR-145 HCT116 mitattuna lusiferaasireportterista konstruktioita oli samanlainen kuin havaittiin DLD-1-soluissa (kuvio S2B). Huomattavaan vähenemiseen KYLLÄ proteiinin tason välittyy miR 145 havaittiin 48 tuntia transfektion sekä DLD-1 ja HCT116-soluissa (kuvio 3C). Hienovaraisempi, mutta silti selvä downregulation STAT1 välittämien miR 145 havaittiin myös (kuvio 3D). Erityisesti aste STAT1 tukahduttamisen vaihteli DLD-1 ja HCT116-solut, joissa vahvin tukahduttaminen STAT1 havaittiin DLD-1-soluissa.
, Sekvenssiryhmittely on miR 145 siemenen alueen ja mRNA tavoitteita. Sijainnin koordinaatit tarkoitettu transkriptio isoformeja alla.
YES1
3’UTR: ENSG00000176105: ENST0000035983
STAT1
cDNA: ENSG00000115415: ENST00000361099. B, Firefly lusiferaasianalyysissä kanssa pGL3 + konstruktioita tilalla 3’UTR fragmentti
YES
tai cDNA fragmentti
STAT1
, alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geeni. Solut ko-transfektoitiin tulikärpäsen lusiferaasi toimittajat yhdessä
Renilla
lusiferaasi transfektion ohjaus plasmidi joko yksin tai yhdessä 50 nM miR-145 duplex ja 50 nM AllStar duplex negatiivisena kontrollina. Vuonna pGL3 + mut vektoreita kaksi emäsparin miR 145 siemenen päällä on mutatoitu. Luminenssi mitattiin 24 tuntia transfektion ja suhde Firefly on
Renillaa
toiminta todistettavasti suhteessa transfektio ilman RNA duplex ja tyhjän vektorin. Data on esitetty keskiarvona ± S.D. neljä rinnakkaisnäytettä. *, P 0,05 käyttämällä kaksisuuntaista t-testiä, ***, p 0,01 käyttämällä kaksisuuntaista t-testiä. C ja D, Western blot-analyysi DLD-1 ja HCT116-solut transfektoitu miR 145 duplexes tai valetransfektoidut soluja blotted YES (C) ja STAT1 (D). Vinkuliini tai tubuliinin käytettiin lastaus valvontaa. Bändit kvantitoitiin suhteessa lastipiirroksesta ohjauksista lähtien TotalLab ohjelmisto ja näytetään suhteessa proteiinin tason valetransfektoiduissa soluissa. Esitetyt tiedot edustavat kahden kokeen.
Toissijainen Effects Koska STAT1 vapauttaminen
STAT1 on hyvin tunnettu transkriptiotekijä parhaiten tunnustettu transkriptioaktivaattorina, mutta esimerkkejä negatiivinen transkription säätelyyn on myös kuvattu [34]. STAT1 sitova motiivi on määritelty JasPar CORE tietokannan [37] on esitetty kuviossa S7A. Sen määrittämiseksi, miR 145 välittämää downregulation STAT1 myös aiheutti muutoksen ilmentymistason STAT1 kohdegeenien on mikrosiruanalyysi, etsiä STAT1 sitoutumiskohdat promoottorit alassäädetty, säädelty ja transkriptien ilman muutos ilmaisun tasolla toteutettiin. Kaikista Jaspar ydin transkriptiotekijöitä, STAT1 oli kaikkein merkittävästi rikastettu sitoutumiskohta sekä silloin, kun alassäädetty (p-arvo = 4,18 · 10
-4) ja ylös-geenien (p-arvo = 1,34 · 10
-4) olivat verrattuna geenejä ilman muutosta ilmaisun (TAULUKKO 3). Tämä ei ollut varten vuorotella STAT1 sitova matriisi verrattaessa jopa geenien geeneihin ilman muutosta ekspressiotason (KUVA S7b). Kuitenkin, kun otetaan huomioon alas geenien verrattuna ei-muutosta geenien oli myös hieman rikastumista STAT1 ionivaihdettua sitoutumiskohtien, mikä osoittaa, että jotkin havaitut vaikutukset voivat olla epäspesifisiä (KUVA S7C).
keskustelu
miRNA ovat nousemassa tärkeitä geenin sääntelyviranomaisten ja intensiivisen tutkimuksen niiden tehtävät ja tavoitteet ovat paljastaneet roolia miRNA useilla keskeisillä solutoiminnoille. Vaikka käsityksemme toiminnallisten roolien miRNA syövät kasvaa tasaisesti, tietoa miR-145 ja sen tavoitteet paksusuolen syöpä on edelleen suurelta osin puuttuu. Olemme siis keskittyneet tunnistamiseen miR 145 tavoitteet koolonkarsinoomasoluissa. Tukeminen aikaisempia havaintoja, miR-145 on alassäädetty kasvaimissa [10] – [13], [15], [16], [18] – [21], [38] – [42], profiilin asennuspalveli- 145 ilmentyminen vakiintuneet solulinjat osoittivat, että ekspressiotasot miR 145 oli rajusti syöpäsolulinjoissa suhteessa ei-tuumorigeenisiä solulinjoja. Suostumuksella raportit osoittavat kasvua estävä vaikutus miR-145 [16], [17], [41], myös havaita kasvua väheneminen DLD-1-solujen upon ohimeneviä miR 145 transfektiota, mikä tarkoittaa, että miR 145 hallussaan kasvain-vaimennin toiminto
in vitro
.
Tässä käytimme mikrosiru profilointiin upon miR 145 yliekspressio keinona tunnistaminen mahdollisia kohteita. Microarray ekspressioprofiileja yhdistettynä siemen sivuston rikastamiseen analyysi on vakiintunut lähestymistapa tunnistaa mahdolliset miRNA tavoitteet [31], [43], [44]. Sen etuna yli tiukasti laskennallinen tavoite ennustus, että se ei perustu pelkästään läsnä ollessa siemen sivuston ja sekvenssin ominaisuudet mahdollinen kohde, mutta otetaan huomioon, onko tavoite on ilmaistu pidetään solulinjassa ja onko kohde säädellään otteelle tasolla. Koska tämä lähestymistapa perustuu pelkästään muutoksia havaittu transkriptio tasolla, tavoitteet yksinomaan säännellään translationaalinen tukahduttaminen ei voida tunnistaa.
Seed päällä rikastamiseen analyysi ja puolueetonta sana analyysi osoitti selvästi rikastuminen miR 145 siemen sivustoja 3’UTRs of alassäädetty selostukset, vahvistaa lähestymistapamme tunnistaa miR 145 tavoitteita. Emme havainneet mitään rikastumista miR 145 siemen sivustoja koodausalueen alassäädetty selostukset. Koska jotkut geenit sisältävän siemenen sivustojen koodausalue aikaisemmin oli osallisena syövän, me arveltu, että nämä tavoite ehdokkaat voivat myös olla toiminnallista roolia alavirran miR-145. Puolueeton sana-analyyseihin, tässä käytetty arvioimaan rikastumista sanojen 3’UTRs mukaan logFC transkriptin upon miR 145 yliekspressio, esittelee erittäin käyttökelpoinen menetelmä visualisointiin vaikutusten miRNA yli-ilmentymisen tekemättä ennakkoluuloinen olettamukset sulku arvot. Muoto käynnissä summan käyrä osoittaa terävän huipun miR 145 7mer siemen sivustoja kaikkein alas geenien viittaa siihen, että kohde transkriptio alassäätöä suurelta osa johtuu suorat vaikutukset miR 145 kohdistamista. Puolueeton Sana analyysi vahvisti aiemmissa raporteissa, jotka osoittavat A asemassa 1 siemen sivusto on hyödyllinen riippumatta sen mahdollisuuksia emäsparin kanssa miRNA [2], [45].
Monet kohteet tunnistettu täällä on aikaisemmin liitetty syöpään. Rikastettu toimintakategorioihin kaikista miRNA reagoivat tavoitteet edelleen tukenut seuraus miR 145 syövän ja merkitse, että sekä suorat vaikutukset miR 145 sekä toissijaisia vaikutuksia voidaan selittää rooli miR 145 syövässä. Useita geenejä onkogeenisella funktio, joista monet ovat myös liitetty paksusuolen syöpä, tunnistettiin mahdollisiksi miR-145, jotka perustuvat microarray-analyysi. Näitä ovat
ADAM17
,
BIRC2
ja
VANGL1
. ADAM17 on raportoitu säädellään ylöspäin paksusuolikarsinoomat ja on osoitettu edistävän vapautumista epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ligandeja solukalvon, jolloin aktivoimalla EGFR [46]. BIRC2 on osoitettu olevan tärkeää säilyttää endoteelisolujen selviytymisen ja verisuonten eheyden zebrafish aktivoimalla muodostumista TNF-reseptori kompleksi I sekä edistää hajoamista IKB, johon NF-KB vapautetaan ja translokoituu tumaan, jossa se aktivoi pro-eloonjäämisen geenien endoteelisoluissa [47]. Solukalvon liittyvä osa VANGL1 kasvaa erilaistumista ja osoitettiin yhteistyöhön lokalisoida E-kadheriinin ihmisen paksusuolen soluissa [33]. Lisäksi osoitettiin, että yli-ilmentyminen
VANGL1
stimuloidut haavan suolen epiteelisolujen linjoja, kun vastaan suunnattu siRNA Vangl1 esti vaeltavien vastausta [33]. Aiemmin raportoitu miR 145 tavoitteita kuten
Oct4
,
Sox2
ja
Klf4
mukana edistämiseen kantasolujen lisääntymistä ei ilmaistu DLD-1-soluissa, mikä tarkoittaa, että kasvua estävä vaikutus miR 145 yliekspressio DLD-1-soluissa ei johdu downregulation näistä geeneistä. Toinen keskeinen säätelijä solujen lisääntymistä,
MYC
, aiemmin raportoitu miR 145 tavoite ei osoittanut muutosta ilmentymistaso upon miR 145 yliekspressio meidän ympäristössä.
Kokeellinen validointi
KYLLÄ
ja
STAT1
kuin miR 145 tavoitteet osoitti merkitty alassäädetty mRNA ja proteiini tasolla, jotka osoittavat biologisen vaikutuksen miR-145 endogeenisen tavoitteista. Alas-asetuksen 3’UTR /cDNA Lusiferaasimäärityksiä lisäksi vahvistaa, että tämä on seurausta suora vuorovaikutus, koska mutaatiot miR 145 siemenen sivustojen poistaa tämän alassäätöä. Syynä eri vaikutuksista miR 145 eri määrityksissä johtuu todennäköisesti puutteesta suoraan vertailukelpoisia näiden analyysien välillä. Tämä ero voi johtua myös muista sitovia tekijöitä säätelyssä endogeenisen transkriptin, koska nämä sitoutumiskohdat eivät ole läsnä 3’UTR tai cDNA-fragmentit käytetty kloonatun lusiferaasireportteri- konstruktioita.
Useat tutkimukset ovat yhdistäneet lisääntyneen ilmentymisen KYLLÄ syövän lisääntyneeseen solun liikkuvuus ja kasvainten invaasio [48], [49]. KYLLÄ on osa Scr kinaasiryhmän [50] ja sen tyrösiinikinaasiaktiivisuuden on osoitettu olevan koholla paksusuolen adenoomia verrattuna sen toimintaa viereisissä normaalin limakalvon [51]. Lisäksi KYLLÄ aktiivisuuden havaittiin korreloivan ennustettu syöpäriskiä koon perusteella, histologia, ja aste dysplasia [51]. Yhdessä esillä tiedot viittaavat siihen, että säätelyä KYLLÄ on tärkeä kasvulle ja transformaatio suoliston soluista.
STAT proteiinit toimivat myötävirtaan Jaks ja MAPK, joista aiheutuvat dimeroitumisesta STAT proteiinien, jolloin translokaatiota STAT proteiinit tumaan [34], [35]. STAT1 on parhaiten tunnettu pro-apoptoottisen roolin vastauksena interferonit, mutta STAT1 on myös raportoitu olevan pro-selviytymisen rooli joidenkin syöpien [35]. Havaitsimme downregulation
STAT1
transkriptin tasolla ja proteiinin taso upon miR 145 yli-ilmentymisen. Lisäksi osoitamme, että tämä downregulation STAT1 kääntyy vaikutusta ilmentymisen potentiaalista STAT1 tavoitteita. Tämä pätee geenien sekä positiivisesti että negatiivisesti säännellään STAT1, mutta vaikutus on suurin geenejä säätelee negatiivisesti STAT1. Vaikka STAT1 on raportoitu sekä transkriptioaktivaattorina ja repressori, tärkein mekanismi STAT1 transkription säätelyyn on aktivoitumisen sen kohdegeenien [34]. Tulosten perusteella näyttää, että transkription tukahduttaminen on yleisempää kuin aikaisemmin kirjattuihin. Yhteenvetona voidaan todeta, transkriptiotekijän analyysit promoottorit vapautettu geenien tarjoaa keinon luonnehtia sivuvaikutuksia kuin aiemmin julkaistu Mir-34a [52]. Tunnistetut rikastaminen STAT1 sitoutumiskohdista promoottorit säänneltyjen geenien osoittaa, että sivuvaikutusten miRNA yli-ilmentymisen lausutaan jo 24 tuntia transfektion jälkeen. Siksi on tärkeää tarkastella toissijaisia vaikutuksia analysoitaessa miRNA yli-ilmentymisen aineistoja.
Yhteenvetona käyttäen microarray lähestymistapaa olemme tunnistaneet uusia tavoitteita syöpään liittyvän miRNA miR-145 koolonkarsinoomasoluissa. Mirna tavoitteet tunnistettu tässä tutkimuksessa voi selventävät roolia miR 145 paksusuolen syövät sekä muita syöpätyyppeihin.
Materiaalit ja menetelmät
Soluviljelmät
DLD-1-soluja viljeltiin DMEM: ssä, GlutaMAX ™ -I runsaasti glukoosia väliaineessa (31966, Gibco Invitrogen), jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS, CH30160.03, Hyclone), 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä (P /S, 15140 Gibco Invitrogen) ja inkuboitiin 5% CO
2 plus 20% happea. HCT116-soluja viljeltiin McCoyn 5A-L-glutamiini elatusaineessa (22330, Gibco Invitrogen), jota oli täydennetty 10% (v /v) FBS: ää ja P /S. Yliekspressio miR-145 saatiin aikaan transfektoimalla miR 145 duplex, joka jäljittelee kypsän miR-145 (PM11480; Ambion). Transfektio
Caenorhabditis elegans
lin-4 duplex (PM10768, Ambion) tai AllStar negatiivinen kontrolli siRNA (1027281, Qiagen) käytettiin kontrollina. Kaikki transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent (11668-019, Invitrogen) mukaisesti valmistaa protokollaa.