Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on erittäin aggressiivinen ja on ominaista pahanlaatuisia etäpesäkkeiden. Noin 90% potilaista kuolee laajaa etäpesäkkeiden. Soluväliaineen (ECM) on luonnollinen este, joka voi estää solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden. Siksi hajoaminen ECM on tapahduttava, jotta laajoja etäpesäke esiintyy. Disintegriini- ja metalloproteaasi (ADAM) on monen verkkotunnuksen proteaasi, jolla on tärkeä rooli kasvainten synnyssä, sekä kasvainten kehittymiseen, ja metastaasit. Kuitenkin on ollut muutamia raportteja ilmaisun ja roolia Adams SCLC. Nykyisessä tutkimuksessa, ilmaisu ja roolia Adams SCLC leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden tutkittiin. Kaikkiaan 150 SCLC kudosnäytteiden tutkittiin immunohistokemiallisesti Adams ilme. ADAM-12: n havaittiin ilmentyy runsaana 72,67% näytteet ja muut ADAM havaittiin ilmentyvän 10%: sta 40% näytteistä. ADAM-12 tasoa seerumissa ja virtsassa, 70 SCLC potilaista ja 40 normaali valvonta, mitattiin myös käyttämällä ELISA. ADAM-12 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi SCLC potilailla kuin terveillä verrokeilla ja potilailla, joilla on laaja tauti verrattuna niihin, joilla suppeampi sairaus. Hiljentäminen ilmaus ADAM-12 H1688-soluissa käyttämällä erityisiä siRNA vähentää merkittävästi solujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden. Täydentäminen ilmaus ADAM-12-L tai -S H345-soluissa, merkittävästi parannettu soluproliferaation, invaasio ja metastaasi. Eläinmalleissa metastasoitunutta SCLC myös ilmeni kohonneita ilmentymistä ADAM-12 sekä lisätä ja metastaasit. Lyhyesti, ADAM-12 on itsenäinen ennustetekijä ja diagnostisen markkerin, ja on mukana leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden SCLC.

Citation: Shao S, Li Z, Gao W, Yu G, Liu D Pan F (2014) ADAM-12 diagnostisena merkkiaineena leviämisen, Migration and Invasion potilailla, joilla pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (1): e85936. doi: 10,1371 /journal.pone.0085936

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan

vastaanotettu: 20 syyskuu 2013; Hyväksytty 3 joulukuuta 2013 mennessä; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Shao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (81302017). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on kaikkein pahanlaatuinen kaikista keuhkosyövässä. Viiden vuoden eloonjäämisaste on vain 3-8% johtuen laajasta etäpesäkkeiden aikana varhaisessa vaiheessa ja pahenemisvaiheiden joka syntyy, kun vastustuskyky hoitoja kehittyy [1]. Aiemmin hajoaminen soluväliaineen (ECM) on ollut pääpaino tutkimuksia hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden SCLC [2], [3]. Matrix (MMP) on havaittu SCLC, ja korkeat ekspressiotasot MMP-11 ja -14 on tunnistettu itsenäisiksi negatiivinen ennustettaessa SCLC [4]. Estäjiä MMP on käytetty kliinisesti SCLC potilaille, mutta osoittautunut tehottomaksi eikä parantunut viiden vuoden eloonjäämisaste potilaiden [5]. Tämä viittaa siihen, että hajoaminen ECM on monimutkainen prosessi ja että proteaasit, muut kuin MMP, pitäisi tutkia, onko muut tekijät osansa SCLC.

disintegriini- ja metalloproteaasi (ADAM) kuuluu proteaasin perhe. ADAM voi hajota ECM ja vuodattanut kalvoon sitoutuneiden esiasteita, jotka moduloivat solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutuksia [6]. ADAM jaetaan kahteen ryhmään: kalvo-ankkuroitu ADAM ja erittävät tyyppi ADAM. Eritettyä tyyppi ADAM sisältää thrombospondin motiiveja ja kutsutaan myös disintegriini- ja metalloproteaasi kanssa Trombospondiinin Motiivit (ADAMTS). ADAM ja ADAMTS voi hajota ECM ja irtoa esiasteita, mikä edistää ja metastaasit. Lisääntynyt ilmentyminen ADAM ja ADAMTS on havaittu useissa kasvaimissa. ADAM-8, -12, -15 ja -28 ovat erittäin ilmaistaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [7], [8], [9], [10], ADAM-9, -12, -17 ja -23 ovat erittäin ilmaistaan ​​rintasyövän [11], [12], [13], [14] ja ADAM-9, -12 ja -17 ovat erittäin ilmaistaan ​​maksasyövän [15], [16], [17]. ADAMTS4 ja ADAMTS5 on raportoitu olevan mukana metastaattisen prosessin pilkkomalla brevican vuonna glioblastomas [18]. Mielenkiintoista on, että full-length ADAMTS1 havaittiin invaasiota ja etäpesäkkeiden vuodattamalla hepariinia sitovat epidermaalinen kasvutekijä (HB-EGF) ja amfireguliini, mutta ADAMTS1 fragmentti näytetään anti-metastaattinen toiminto [19]. SCLC on voimakkaasti aggressiivinen kasvain. Noin 90% potilaista kuolee laajojen etäpesäke. Siksi on tärkeää, että diagnostinen markkeri tunnistetaan ja ennustetekijä arvioitava SCLC potilaille. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokasta diagnostinen merkkiaine SCLC. On ollut muutamia tutkimuksia tarkastelemalla roolia ADAM ilmaisun SCLC, lukuun ottamatta ADAM-15 [8]. Perustuu mahdollisesta merkityksestä roolin ADAM edistämisessä leviämisen, etäpesäke ja angiogeneesiä, pyrimme arvioimaan ekspressiotasoja ADAM ja niiden suhdetta kliinisen ennusteen SCLC tunnistamiseksi tehokas diagnostinen markkeri.

nykyisessä tutkimuksessa, huomasimme, että ilmentyminen ADAM-12 oli korkeampi SCLC kuin muissa ADAM kautta immunohistokemia (IHC). Yhden ja usean eloonjääminen analyysi osoitti, että ADAM-12 oli itsenäinen ennustetekijä varten SCLC potilaille. Ilmaisu taso ADAM-12 seerumin ja virtsan oli suurempi SCLC potilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin, sekä potilailla, joilla on laaja tauti verrattuna niihin, joilla rajallinen sairaus. Eläinmalleissa osoittavat korkea etäpesäke SCLC myös kasvanut ilmentyminen ADAM-12 ja tehostettu ja metastaasit. Tuloksemme tukevat päätelmää, että korkeasti esitteli ADAM-12 itsenäisenä ennuste tekijä ja diagnostisen markkerin oli mukana leviämisen, invaasiota ja etäpesäkkeiden potilailla, joilla on SCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja solujen linjat

Formaliinifiksoidusta kasvain kudosnäytteitä 150 sairastavat SCLC saatiin Binzhou Medical University Hospital, Kiina, välillä tammikuussa 2008 ja joulukuun 2011 Niistä kudosnäytteet, 140 saatiin kautta biopsia ja 10 saatiin leikkauksen aikana. Basic potilaan tiedot on saatu potilaasta tiedostoja ja on esitetty taulukossa 1.

tuore seerumi ja virtsanäytteet saatiin 70 potilasta, joilla SCLC alkaen onkologian osastolla Binzhoussa Medical University Hospital, Kiina (48 urosta ja 22 naisilla, joiden keski-ikä on 52,3 ± 11,3 vuotta). Kaikkiaan 45 potilasta oli laaja sairaus määritellään sairaus, joka on levinnyt contralateral keuhko- tai joka on etäispesäkkeitä) ja 25 potilasta oli rajoitettu tauti määritellään sairaus, joka rajoittuu yhteen keuhko, välikarsina ja /tai alueellisten imusolmukkeiden . Kaikki potilaat vapaaehtoisesti allekirjoittaneet tietoisen suostumuksen. Kaikki potilaat diagnosoitiin SCLC patologisen biopsianäytteissä ja olivat saaneet kemoterapiaa ja sädehoitoa. Yhteensä 40 tervettä vapaaehtoista (20 urosta ja 20 naarasta, joiden keski-ikä on 38,7 ± 12,1 vuotta) jälkeen on tutkittu. Terveillä verrokeilla ei ollut epänormaaleja muutoksia veren, maksan, sydämen, keuhkojen tai munuaisten vajaatoiminnan. Tutkimus hyväksyi Medical Ethics komitean Binzhoun Medical University, Kiina (Luvan numero: BY2010008).

Ihmisen SCLC solulinjat, mukaan lukien H1688, H446 ja H345, ostettiin Shanghai Cell kirjasto Kiinan Academy of Science. Soluja viljeltiin 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

immunohistokemia

parafinoidut näytteet poistettiin vaha on dimetyylibentseenissä ja sammutettua kaltevuus alkoholia. Leikkeitä käsiteltiin seuraavien protokollien: Endogeeninen peroksidaasi poistettu (inkubaatio 3% H

2O

2 30 min), antigeeni haettu (noin 95 ° C: ssa 45 min), esto 10% vuohen seerumia (huoneen lämpötilassa 30 min), primaarisen vasta-aineen inkubointi yön yli 4 ° C: ssa, HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita inkuboimalla 30 min 37 ° C: ssa, DAB värireaktion, hematoksyliinillä värjäys, erilaistumista, nestehukka ja läpinäkyvyys. Laimennus ensisijaisen vasta oli 1:50 ADAM-8, ADAM-10, ADAM-11 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 1:200 ADAM-12 (Abgent, Suzhou, Kiina), ADAM- 15 ja ADAM-17 (R

F: 5′-TCCTGTGTCTTCTTGCTGCC-3 ’,

R: 5′- GCGCACACACCTTAGTTTTTC-3′ ADAM-12-L;

F: 5′-CCACCCATTCCATCTCCATC-3 ’

R: 5′- TTCTGCAAACCCTCAAACC-3’for ADAM-12-S

F: 5′-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3 ’

R: 5′- CGCGGCGATATCATCATCCA-3′ beeta-aktiini.

Western blotting

Solut hajotettiin SDS-hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittori seos. Määrälliset proteiinit erotettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla ja proteiinit siirrettiin NC jäsentä. Jäsen blokattiin 5% rasvattomalla maidolla 1 tunti hieman ravistellen ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa (1:500 ADAM-12, Abgent, Suzhou, Kiina, 1: 3000 beeta-aktiini, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA), sitten inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Immunoblot bändit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL-järjestelmää (Millipore, Billerica, MA, USA) ja röntgenfilmin.

TranswellTM kokeita

TranswellTM kokeet suoritettiin mukaan valmistajan oppaassa (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Matrigel laimennettiin tiedotusvälineiden vapaan seerumin (1: 2). Tilavuus 60 ui geeli levitettiin ylempään kammioon ja jähmettynyt inkuboimalla 37 ° C: ssa 3 h. 1 x 10

4 solut levytettiin kammioon, suodatettu alempaan kammioon ja tuotu seerumia. Sitten solut värjättiin käyttämällä Giemsa Dye, ja solujen määrä 3 kenttää laskettiin valomikroskoopilla.

Solusyklianalyysiä

Soluja ilman ravintoa 24 tuntia seerumin peruuttamisesta. H1688 ja H345-soluja käsiteltiin. Solut kerättiin, kiinteitä ja niitä inkuboitiin RNaasi A: lla (Thermo Scientific) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten soluja inkuboitiin sitten propidiumjodidilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 30 minuutin ajan. DNA-pitoisuus havaittiin kautta virtaussytometrillä [23].

Eläinkokeet

H1688-soluja (klassinen pienisoluinen keuhkosyöpä solulinja) viljeltiin 1640-väliaineessa ja 10

6-soluja annettuna ihon alle nude-hiiriin. Tuumorin koko tarkkailtiin joka viikko. Kun kasvaimen halkaisija saavutti noin 1 cm, hiiret lopetettiin anestesiassa ja kasvaimet leikattiin irti. Leikattiin kasvain (kutsutaan vanhempien solut) leikattiin kahtia. Yksi puoli säilytettiin -80 ° C: ssa, ja toinen oli leikattu paloiksi, digestoituun (0,25% trypsiiniä inkuboitu 15 min) ja suodatetaan. Suodatettu soluja viljeltiin jälleen normaalissa väliaineessa. Kolme päivää myöhemmin solut injektoitiin immuunivajaisiin hiirille häntälaskimoon. Kymmenen viikon kuluttua hiiret lopetettiin anestesiassa. Ja 10 hiirtä, jotka injisoitiin, 5 hiirtä oli näkyvissä kasvaimia (halkaisija 0,5 cm) vatsan keuhkoissa ja maksassa ja muut 5 hiirtä ei ollut näkyviä kasvaimia. Verrattuna kasvaimia, jotka johtuvat ihonalainen injektio, kasvaimia, jotka johtuvat häntälaskimoinjektio oli korkeampi tunkeutumisen ja invaasion [24]. Siten erittäin metastaattinen eläinmallissa simuloimalla tuumorietäpesäke potilailla onnistuneesti rakennettu. Lääketieteellinen eettinen komitea Binzhou Medical University hyväksynyt tämän tutkimuksen (Luvan numero: BY2013001).

Tilastollinen

Kaikki tiedot analysoitiin SPSS 17.0 ohjelmistolla. Kaplan-Meier menetelmä ja Log-Rank testi arviointiin käytettiin yksiulotteista eloonjäämisaste. Coxin regressiota käytetään suorittamaan monimuuttuja selviytyminen analyysi. Vastaanotin käyttöominaisuudet (ROC) käyrä analyysi suoritettiin arvioimiseksi raja-seerumin ja virtsan tasoa ADAM-12 potilailla, joilla on SCLC ja terveillä vapaaehtoisilla. Pinta-ala (AUC) ja p-arvot arvioitiin. Ilmaisu erot eri ryhmien analysoitiin pariksi

t

testiä.

P

0,05

pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentyminen Adams SCLC näytteistä IHC

ilmentyminen ADAM-8, – 10, -11, -12, -15 ja -17 arvioitiin IHC 150 SCLC näytteissä. Taso positiivinen lauseke (tulokset laadut 2 ja 3) ja ADAM-8, -10, -11, -15 ja -17 oli 31,33% (47/150), 34.66% (52/150), 19,33% (29 /150), 39,33% (59/150) ja 10% (15/150), vastaavasti (kuvio S1). Positiivinen ilmaus ADAM-12 oli korkeimmillaan 72,67% (109/150) ja vahva positiivinen lauseke (luokka 3) ja ADAM-12 oli merkitsevästi suurempi verrattuna muihin ADAM (

P

0,001 ). Kuten kuviossa 1 on esitetty, olemme huomanneet, että ADAM-12 ilmennettiin SCLC ja sijaitsi sytoplasmassa, mutta ei nucleus. HE värjäämällä osoitti, että kasvain kudoksen tyyppi oli tyypillinen SCLC kliinis ominaisuudet (suurempi ytimet ja lähes solulimassa). Kudosnäytteet, jotka inkuboitiin yön yli PBS: llä, sen sijaan, että ensisijainen vasta-aine, käytettiin negatiivisina kontrolleina. ADAM-12 ilmentyi merkitsevästi enemmän SCLC kudosnäytteistä verrattuna ilmaus muiden ADAM (

P

0,001), mikä osoittaa, että ADAM-12 voi olla tärkeä rooli prosessissa leviämisen, invaasion ja etäpesäkkeiden SCLC.

ADAM-12 havaittiin pienisoluinen keuhkosyöpä kudoksen immunohistokemiallisesti värjäämällä. Laimennussuhde ensiarvoisen aine oli 1: 200 ADAM-12. (A) Normaali keuhkokudoksen; (B) HE värjäämällä SCLC kudoksessa; (C) Negatiivinen kontrolli (inkuboitiin PBS sijaan primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa); (D) Värjäys ADAM-12 SCLC kudoksessa.

ADAM-12 on itsenäinen ennustetekijä SCLC potilailla

Koska ADAM-12 oli erittäin ilmaistu SCLC, tutkimme suhde ADAM-12 ja taudin ennusteen. Kaikki potilaat olivat hyväksyneet systeemistä hoitoa ja 15 150 potilasta oli elossa vuonna tammikuu 2013 (määräaika tutkimuksen). Keskimääräinen elinaika potilailla oli 12,59 kuukautta ja 2 vuoden pysyvyys oli 16%. Mukaan IHC värjäys tulokset, joilla laadut 0 ja 1 katsottiin olevan negatiivinen ryhmässä ja ne, joilla laadut 2 ja 3 pidettiin positiivisessa ryhmässä. Univariate selviytyminen analyysi osoitti, että merkittäviä kliinisiä tekijöitä, jotka vaikuttivat selviytyminen oli laaja tauti (

P

0,001). Kumpikaan tupakointi (

P

= 0,882), sukupuoli (

P

= 0,396) oli merkittävä ennustetekijä eikä olivat tasoja ADAM-8 (

P

= 0,903), ADAM-10 (

P

= 0,075), ADAM-11 (

P

= 0,317), ADAM-15 (

P

= 0,349) tai ADAM-17 (

P

= 0,427). Kuitenkin ADAM-12 (

P

= 0.022) oli merkittävä negatiivinen ennustetekijä (kuva 2). Monimuuttuja eloonjääminen analyysi tehtiin arvioimaan ennustetekijöiden useiden tekijöiden. Tulokset olivat yhdenmukaisia ​​yhden muuttujan selviytymisen analyysin. Kliininen vaihe (

P

= 0,001, HR = 2.003, 95% CI: 1,330-3,015) ja taso ADAM-12 lauseke (

P

= 0,049, HR = 0,443, 95% CI : 0,197-0,995) olivat merkittäviä itsenäisiä ennustetekijöitä (taulukko 2) ja ADAM-12 oli tiiviisti kliinisessä vaiheessa (

P

0,001). Kliiniset ominaisuudet potilailla, jotka olivat positiivisia ADAM-12 verrattiin niihin, jotka olivat negatiivisia ADAM-12, jotta edelleen selkeyttää roolia ADAM-12 itsenäisenä ennustetekijä SCLC. Tulokset osoittivat, että patologinen vaiheessa oli tilastollisesti merkitsevä (

P

= 0,037), kun taas muut tekijät, kuten ikä ( 65 verrattuna ≥ 65,

P

= 0,325), sukupuolen (

P

= 0,975), tupakointi (

P

= 0,743) ja kasvaimen kokoa (

P

= 0,511) eivät olleet merkittäviä.

Patient elinaika oli saadaan seurantaa. Univariate eloonjääminen analyysi suoritettiin sen arvioimiseksi, ADAM-8, -10, -11, -12, -15 ja -17 voidaan pitää riippumattomina ennustavat tekijät. Tulos osoitti, ADAM-12 olevan itsenäistä ja haitallinen tekijä (

P

= 0.022).

Seerumin ja virtsan ADAM-12 tasoja SCLC potilailla

IHC värjäys osoitti, ADAM-12 on erittäin ilmaistaan ​​limaeritteiden, paitsi SCLC-soluja (kuvio 3A). Sitten päätellä, että ADAM-12 oli todennäköisesti erittyvät vereen ja erittyy kautta virtsaan. Näin ollen tutkimme tasot ADAM-12 seerumissa ja virtsassa SCLC potilailla. Seerumissa ja virtsassa 70 SCLC potilaista ja 40 tervettä vapaaehtoista otettiin talteen, sentrifugoitiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. ELISA kit käytettiin ekspression havaitsemiseksi ADAM-12. ROC käyrät saatiin suurempi AUC 0,899 (

P

0,001, 95% CI: 0,842-0,956) ja 346 pg /ml seerumissa ADAM-12 taso SCLC potilaista (kuvio 3B) kuin terveillä (a AUC 0,847 105 pg /ml), ja suurempi AUC 0,979 (

P

0,001, 95% CI: 0,959-0,999) ja 258 pg /ml virtsassa ADAM-12 tasolla SCLC potilailla (kuvio 3C) kuin normaaleilla verrokeilla (a AUC 0,869 92 pg /ml). Seerumin ADAM-12 taso oli merkitsevästi suurempi SCLC potilailla kuin terveillä vapaaehtoisilla (502 ± 234

vs

180 ± 92 pg /ml,

P

0,001) ja niissä on laaja tauti verrattuna rajoitettu sairaus (586 ± 205

vs

317 ± 185 pg /ml) (kuvio 3D). Virtsa ADAM 12 taso oli yhdenmukainen seerumin taso ja oli suurempi SCLC potilailla kuin terveillä vapaaehtoisilla (404 ± 247

vs

128 ± 50 pg /ml) ja potilailla, joilla on laaja tauti verrattuna potilaisiin, joiden rajallinen sairaus (477 ± 201

vs

303 ± 152 pg /ml) (kuvio 3E). Tämä osoittaa, että ADAM-12 seerumissa ja virtsassa korreloivat SCLC etenemistä ja ADAM-12 voidaan pitää diagnostinen markkeri SCLC taudin, koska ilmentymisen ADAM-12 lisäsi kehittämiseen ja sairauden etenemisen.

(A) ADAM-12-värjäys oli vahvasti positiivinen limaeritteiden (alue on esitetty nuolella). (B, C) ROC-käyrä tehtiin arvioimiseksi raja-potilailla, joilla on SCLC ja terveiden vapaaehtoisten; ROC = vastaanotin käyttöominaisuuksia. (D, E) Ilmaisulla tasot ADAM-12 seerumin ja virtsan SCLC potilaiden ja normaalien verrokkien havaittiin ELISA-kittiä. **

P

0,01, SCLC potilaat

vs.

Terveillä, SCLC potilaat, joilla on laaja tauti

vs.

Rajoitettu sairaus.

ADAM-12 vaikuttaa etäpesäke ja leviämisen H1688 soluissa

Kuten kuvioissa. 1, 2 ja 3, ADAM-12 on riippumaton prognostinen tekijä, joka voi olla käyttökelpoinen diagnostinen markkeri SCLC. Tämän jälkeen olemme tutkineet rooli ADAM-12 leviämisen, invaasiota ja etäpesäkkeiden in SCLC. Ensin havaittiin ekspressiota ADAM-12 SCLC-solulinjat (H1688, H446 ja H345), ja havaitsivat, että ADAM-12 lisää suuresti ilmaistu H1688 ja H446-soluja verrattiin H345 solulinja (kuvio 4A). Eräässä tutkimuksessa rintasyöpää, ADAM-12 oli raportoitu olevan kaksi transkription muotoja (kalvo-ankkuroitu ADAM-12-L ja erittävät tyyppi ADAM-12-S), joka soittaa eri rooleissa [22]. Koska sekvenssin samankaltaisuus, eri siRNA että kohdennettu ADAM-12-L ja ADAM-12-S, vastaavasti ei voitu suunnitella siten siRNA käytettiin kohdistamaan ADAM-12. Ilmentyminen ADAM-12 oli merkittävästi vähentynyt tietyn siRNA ryhmässä verrattuna käsittelemättömään ja salattu siRNA ryhmät (kuva 4B). Kun oli häiriöitä ilmaus ADAM-12 H1688, solut aiheuttama seerumin suodattamalla kammiossa kalvon vähensi merkittävästi (kuvio 4C) ja solukierron pidätettiin G0-G1 vaiheessa (kuvio 4D). Roy

et al

raportoitu että ADAM-12-L edistänyt solujen lisääntymistä ja että ADAM-12-S edistetään solumigraatiota rintasyövässä [22]. Tutkimuksessamme, solujen lisääntymistä ja muuttoliike merkittävästi estivät jälkeen hiljentäminen ilmentymistä ADAM-12 erityisten siRNA on H1688 solulinjassa, mikä osoittaa, että ADAM-12 liittyy solujen lisääntymisen, invaasio ja metastaasi. Selkeyttää rooleja ADAM-12-L ja -S solu- proliferaatio ja migraatio, kokeilu suunniteltiin ja toteutettiin joka on kuvattu alla.

(A) ilmentyminen ADAM-12 oli korkeampi H1688 ja H446-soluissa verrattuna H345-solujen Western-blottauksella. (B) mRNA ja proteiini ilmentymistä ADAM-12 väheni merkittävästi, kun ADAM-12 ilmentyminen hiljennettiin erityisellä siRNA kohdistaminen ADAM-12 (ADAM-12i) verrattuna käsittelemättömiin (Mock) ja salattu siRNA (NCI) in H1688 soluissa , **

P

0,01. (C) Solut aiheuttama seerumin suodatuskammioon kalvo vähensi merkittävästi ADAM-12i ryhmässä verrattuna vale ja NCI ryhmien H1688 soluissa, **

P

0,01. (D) Solusykli merkittävästi pidätettiin G0-G1 vaiheeseen ADAM-12i ryhmä. Mock: käsittelemättömät solut; NCI: solut käsiteltiin salattu siRNA. ADAM-12i: solut käsiteltiin siRNA kohdistaminen ADAM-12.

ADAM-12-L edistää proliferaatiota ja ADAM-12-S edistää invaasio

Kuten on esitetty kuviossa 4, kun ADAM-12 ilmentyminen hiljennettiin, solujen lisääntymistä ja muuttoliike estyi merkittävästi H1688 soluissa. ADAM-12: n ilmentyminen oli alempi H345-soluissa verrattuna H1688 ja H446-soluja (kuvio 3A). H345 solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ilmentämisvektorilla ja ADAM-12-L (H345-L) tai -S (H345-S). Transfektiotehokkuus arvioitiin reaaliaikaisella PCR koska ei ollut mitään erityistä vasta-ainetta kohdistamista ADAM-12-L tai -S. MRNA: n ilmentyminen ADAM-12-L ja -S lisääntyivät merkitsevästi transfektion jälkeen (kuvio 5A). Ei ollut merkitsevää eroa H345-L-solujen aiheuttama suodattamalla kammion läpi kalvon ja mock (normaali kontrolli) tai negatiivisten kontrollien (pcDNA3.1). Kuitenkin ristiriitaisia ​​tuloksia löytyivät H345-S soluissa. Jälkeen transfektoimalla ADAM-12-S, H345-soluissa indusoiman seerumin suodattamalla kammion läpi kalvon lisääntyivät merkitsevästi, mikä osoittaa, että ADAM-12-S, ei ADAM-12-L, on tärkeä rooli SCLC ja metastaasit (kuvio 5B ). Samaan aikaan solusyklin analyysi osoitti, että H345-L-solut tulivat S vaiheisiin, mutta H345-S-solut eivät olleet merkittävästi erilaiset verrattuna negatiivisen kontrollin soluissa (kuvio 5C). Tämä osoitti, että ADAM-12-L voisi edistää solujen lisääntymistä ja ADAM-12-S voisi edistää solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden, joka on yhdenmukainen Roopali tulokseen [22].

(A) mRNA ilmaukset ADAM- 12-L ja -S havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä H345-soluissa, jotka on transfektoitu ekspressiovektorilla ADAM-12-L ja -S, **

P

0,01. Mock: käsittelemätön ryhmä; pcDNA3.1: negatiivinen ryhmä. 12-L: transfektoitu pcDNA3.1-ADAM-12-L; 12-S: transfektoitu pcDNA3.1-ADAM-12-S. (B) Soluja aiheuttama suodatuskammioon kalvo ei ollut merkittävästi erilainen H345-soluissa, jotka on transfektoitu pcDNA3.1-ADAM-12-L (nimeltään H345-L), mutta solut lisääntyneet huomattavasti H345-soluissa, jotka on transfektoitu pcDNA3: lla. 1-ADAM-12-S (nimeltään H345-S), *

P

0,05. (C) ADAM-12-L aiheuttama solujen menevät G0-G1 vaiheessa osaksi S-vaiheeseen, mutta ADAM-12-S ei vaikuttanut solujen lisääntymistä H345-soluissa.

ilmentymistä ADAM-12 lisääntyi, kun invaasion ja -metastaasin tehostettiin

Edellinen tutkimus [22] oli ilmoittanut, että ADAM-12-L edistänyt solujen lisääntymistä ja ADAM-12-S edistänyt soluinvaasiota ja etäpesäkkeiden eläinmallissa; me vahvisti tämän päätelmän solutasolla. Kuitenkin on ollut raportteja siitä, onko ilmentymisen ADAM-12 kasvaa, kun kasvaimen invaasion ja metastaasin on parannettu. Kuten kuviossa 3 on esitetty, seerumissa ja virtsassa ADAM-12 tasot olivat huomattavasti potilailla, joilla on laaja tauti verrattuna niihin rajoitettu tauti, viittaa siihen, että ekspression ADAM-12 on lisääntynyt taudin kehittymistä. Jotta voitaisiin vahvistaa tämän päätelmän, erittäin metastaattinen eläinmalli simuloi tuumorietäpesäke rakennettiin kuvatulla tavalla Methods (kuvio 6A). Oli suurempi muutos morfologiassa metastaattisen solujen verrattuna emo-solujen tässä mallissa. Metastaattinen solun koko oli pienempi, sytoplasmaan tahra on shoaled, ydin- tahra on syvennetty, solutiheys ohennettu ja solun kompakti heikentynyt (kuvio 6B). Ilmentyminen ADAM-12 havaittiin vanhempien ja metastaattisen soluja. MRNA: n ilmentyminen ADAM-12-L ei ollut eroa vanhempien ja metastaattinen soluja, mutta ADAM-12-S-mRNA oli merkittävästi suurempi metastaattisen soluissa (kuvio 6C). Tämä osoittaa, että ADAM-12-S, ei ADAM-12-L, on tärkeä rooli invaasiossa ja etäpesäkkeiden. ADAM-12-proteiinin havaittiin IHC ja Western blot. Tulos osoitti, että ADAM-12 oli ilmeisesti suurempi metastaattisen soluissa verrattuna vanhempien soluihin (kuvio 6D).

(A) erittäin metastaattinen eläinmalli rakennettiin, 1 x 10

6 solua ihonalaisesti ja ihonalainen kasvaimet (vanhempien solua) injektoitiin paljaisiin hiiriin häntälaskimon kautta muodostamaan etäpesäkkeitä (metastaattinen solut). (B) Morfologiset erot havaittiin emo solujen ja metastasoituneen solujen kautta hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys. Verrattuna vanhempien solujen metastaattista solut olivat pienempiä, oli shoaled solulimassa värjäystä, syvempi tumavärjäystä, ohuempi solutiheys ja heikompia solujen kompakti. (C) ei ollut eroa ADAM-12-L-mRNA ilmaisun emo ja metastaattinen soluja, mutta ADAM-12-S-mRNA oli merkittävästi suurempi metastaattisen soluissa, *

P

0,05. (D) ADAM-12-proteiinin ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt metastaattisessa soluissa IHC ja western-blottauksella. P1-P5 osoittaa viisi ihonalainen kasvaimia ja M1-M5 osoittaa viisi etäpesäkkeitä.

Keskustelu

On yli 30 ADAM jotka kuuluvat metallo- perheelle. Ne ovat vuorovaikutuksessa integriinien välittävät solu-solu- ja solu-soluväliainevuorovaikutuksia [25], irtoa suuri määrä transmembraaniproteiineja, heikentää ECM ja aktivoida Notch ja EGFR väyliä, jotka edistävät solujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden [6].

pääpiirteet SCLC ovat nopea kasvu ja laaja etäpesäke alkuvaiheessa. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokasta diagnostinen markkeri auttamaan diagnoosin SCLC, varsinkin alkuvaiheessa. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida ilmaus Adams SCLC ja jotta löydettäisiin käyttökelpoinen diagnostinen markkeri. Tähän asti vain ilmaus ADAM-15 oli havaittu ja ilmaisu muiden ADAM oli vain harvoin raportoitu SCLC [8]. Tutkimuksessamme havaitsimme ADAM-8, -10, -11, -12 ja -17 ja totesi, että ADAM-12 oli korkeasti ilmaisi verrattuna muihin Adams SCLC kliinisissä näytteissä.

ADAM-12 on erittäin ilmaistu lukuisissa syövissä kuten rintasyövän [12], [14], [26], maksasyöpä [16], mahasyöpä [26], [27], paksusuolen syöpä [26] ja hermoston syöpä [28]. Nykyisessä tutkimuksessa, yhden ja usean eloonjääminen analyysi osoitti, että ADAM-12 todennäköisesti itsenäinen ennustetekijä osoittaa huonompi selviytymisen SCLC potilailla. Vaikka ADAM-12 yli-ilmennetään lukuisissa kasvaimissa, ADAM-12 erityisenä diagnostinen markkeri on käytetty vain rintasyövän [22].