Krooninen sairaus

tiivistelmä

syövän hoitoon kuten oligonukleotidit tai peptidit edellyttää tehokasta jakelujärjestelmiä. Romaani peptidi, TMTP1, aiemmin saatu ja tunnistettu laboratoriossamme osoitti huomattavaa mahdollisuuden kohdistaa erittäin etäpesäkkeitä sekä

in vitro ja in vivo

, vaikka alkuvaiheessa okkulttisten etäpesäke pesäkkeitä. TMTP1 kohtalaisen ehkäisi kasvainsolujen elinkelpoisuuden, vaikka ei riitä pitävät sitä tehokas tappaja syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet parantamaan kasvaimen vastainen aktiivisuus TMTP1. Tätä varten meidän fuusioitunut sen antimikrobisen peptidin,

D (KLAKLAK)

2, ja kutsutaan tuloksena peptidi TMTP1 DKK. Huomasimme, että TMTP1 DKK voi laukaista nopean apoptoosin ihmisen eturauhasen ja mahasyövän solujen kautta sekä mitokondrioiden aiheuttama apoptoosireitin ja kuoleman reseptorin kautta. Lisäksi suora injektio TMTP1 DKK hiiriin eturauhasen ja mahalaukun ksenograftin syöpiä johti vähentäminen kasvainten ja merkittävä viivästyminen kasvainprogression ja etäpesäkkeiden

in vivo

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TMTP1 DKK voi toimia voimakkaana hoitava aine etäpesäkkeitä.

Citation: Ma X, Xi L, Luo D, Liu R, Li S, Liu Y, et al. (2012) antituumorivaikutuksia peptidin TMTP1-gg-

D (KLAKLAK)

2 Erittäin Metastasoitunut Syöpä. PLoS ONE 7 (9): e42685. doi: 10,1371 /journal.pone.0042685

Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 helmikuu 2012; Hyväksytty: 11 heinäkuu 2012; Julkaistu: 11 syyskuu 2012

Copyright: © Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia National Science Foundation of China (No.30973472, 81001006, 30973148), Major Innovation Medicine ohjelma (2009ZX09103-738; 2009ZX09103-739, 2009ZX09103-740), ja ”973” Program of China (nro 2009CB521808). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suurin osa kuolleisuudesta, jotka liittyvät syöpään johtuu etäpesäke alkuperäinen kasvainsolujen sivustoja kaukana alkuperäisestä tai primaarikasvaimen. Tällä hetkellä käytettävissä olevat hoitovaihtoehdot ovat harvoin voidaan parantaa metastaattinen syöpä, kuten arised eturauhasen ja mahasyövässä. Maailmanlaajuisesti eturauhassyöpä on yleisin maligniteetti miesten ja toinen johtava syy syöpään liittyvien kuolemien. Mahasyöpä edelleen yksi tavallisimmista kasvaimet, joka aiheuttaa 12% kaikista syöpään liittyvien kuolemien vuodessa [1], [2], [3]. Lisäksi kliinisessä hoidossa näiden kiinteiden kasvainten edelleen suhteellisen tehottomia. Siksi havaitsemiseen ja hoitoon kasvaimen etäpesäke, erityisesti okkultismin etäpesäkkeitä, on ollut tärkein lähestymistapa äskettäin kehitetty syövän hoitomuotoja. Viimeisten vuosien aikana syövän tutkimus on tarjonnut oivalluksia prosesseihin vastuussa syövän kasvua ja tunnistettu lukuisia molekyylikohteista mahdollisia syövän hoidossa [4], [5]. Kuitenkin hyväksymismenettelystä uusia syövän hoitomuotoja on pitkä. Toiveena on, että kohdistamalla erityisiä muutoksia syöpäsoluja alkuvaiheessa etäpesäkkeiden, hoitoja voidaan kehittää tehokkaammin tuumorisolujen tappamisessa

in situ

ja etäpesäkkeiden pesäkkeitä, kun taas vähemmän haitallista normaaleille soluille. Tämän seurauksena näitä innovatiivisia hoitoja tekisi merkittävä myönteinen vaikutus eloonjäämiseen ja elämänlaatua syöpäpotilaiden.

Kuluneen vuosikymmenen aikana, alalla syöpälääkkeen kehittäminen on transformoitu kartoittaa erityisiä molekyyli tavoitteet [6], [7], [8]. Kohdennettu geeniterapia voidaan saavuttaa erilaisilla tekniikoilla, mukaan lukien geeniterapian ja geenin transkription. Viimeaikaiset etuja täsmäannostelujärjestelmiä kuuluu menestyksekäs käyttö pienimolekyylisten estäjien, monoklonaalisia vasta-aineita, ja lyhyet kohdistaminen peptidit [9], [10]. Kehittäminen Lyhyen kohdistaminen peptidien näyttää olevan lupaavalta onnistuneen kohdennettuja geeniterapiaan. Lyhyt kohdistaminen peptidit ovat erinomaisia ​​kudoksen läpäisevyys ja minimaalinen myrkyllisyys ja immunogeenisyys, joten ne apt hyväksymistä varten potilaat ja lääkärit.

Viime aikoina olemme tunnistaneet 5-aminohapon peptidi, TMTP1, joka sidottu joukko erittäin metastaattinen syöpäsolun linjat

in vitro

ja

in vivo

, etenkin niillä, epätyypillinen maksan micrometasteses joka sisälsi pieniä määriä neoplastisten solujen [11]. Kuitenkin, TMTP1 ei tunnista normaali ja ei-metastasoitunut solulinjoissa. Huomasimme myös, että korkeat pitoisuudet TMTP1 voisi välittää kasvainsolujen apoptoosin. Koska TMTP1 sidottu metastaattisen syövät suurella spesifisyydellä, se voisi olla hyödyllinen diagnostinen työkalu ja /tai ovat sytotoksisia toiminto. Erityisesti TMTP1 voitaisiin käyttää rakentamiseen muokattavissa

de novo

peptidikonjugaatit. Nämä peptidit voidaan räätälöidä eri diagnostisia ja terapeuttisia sovellutuksia läpi yhdessä monenlaisia ​​kohdentaa aineita, kuten viruksia, proteiinit, ja antimikrobiset peptidit. Tässä tutkimuksessa olemme kytketty TMTP1 kationista antimikrobista peptidi tunnetaan vahvasta sytotoksinen aktiivisuus parantamiseksi sen antituumorivaikutuksia.

On yli 100 luonnossa esiintyvä antibiootti peptidejä ja niiden

de novo

muotoilu on saanut paljon huomiota [12], [13], [14], [15], [16]. Ellerby et

al

[17] havaitsivat, että kun ne konjugoidaan kationinen antimikrobinen peptidi,

D (KLAKLAK)

2, on CNGRC itseohjautuva verkkotunnuksen, saatu peptidi oli tuumorin vastaista aktiivisuutta kautta kyky kohdistaa mitokondrioita ja aiheuttaa apoptoosin. Nämä ja muut rakenteellisesti samanlaisia ​​proapoptoottisten antibiootti peptidit pysyvät suhteellisen myrkytön ulkopuolella eukaryoottisolut. Kuitenkin, kun tarttunut kasvainsolut, ne aiheuttama mitokondrioiden turpoaminen ja mitokondrioiden riippuvaista apoptoosia [18], [19], [20]. Kuitenkin suuri ongelma näillä peptideillä on varmistaa niiden viemistä soluihin. Näin ollen nämä peptidit on kytketty kasvaimeen kohdistaminen peptidejä, jotka sallivat reseptorin välittämän internalisaation. Tämä varmistaa sen, että kimeeristä peptidi tulee sytosoliin suunnattu soluihin, joissa se voi aiheuttaa mitokondrio-riippuvaista apoptoosia.

Tässä tutkimuksessa me fuusioida

D (KLAKLAK)

2 TMTP1 kiinteän faasin peptidisynteesi automaattisella Applied Biosystems malli ja nimettiin tuloksena peptidi TMTP1 DKK [11]. Oletimme, että TMTP1 peptidi mahdollistaisi kohdistamisen samalla

D (KLAKLAK)

2 edistäisi mitokondrioiden aiheuttamaa apoptoosia. Tässä tutkimuksessa arvioimme merkittävä spesifisyyttä ja kasvaimen kykyä TMTP1 DKK on etäpesäkkeitä

in vitro

ja

in vivo

.

Tulokset

TMTP1 DKK kodeissa erittäin metastaattinen kasvain-solujen in vitro ja in vivo

Olemme aiemmin osoittaneet, että TMTP1 sitoutuu spesifisesti etäpesäkekasvainten soluihin [11]. Sen määrittämiseksi, juuri syntetisoidun TMTP1 DKK peptidi säilyttää sitoutumisspesifisyydessä sen kohdistaminen domain, TMTP1, Konjugoimme TMTP1 DKK FITC. Sitten tutkittiin sitoutumisen FITC-konjugoidun TMTP1 DKK useita syöpäsolun linjat ja normaalien solujen

in vitro

ja

in vivo

. FITC-konjugoitua TMTP1 DKK sitoutuu spesifisesti erittäin metastaattinen eturauhassyöpä-solulinjaa PC-3M-1E8 ja mahasyövän solulinja MKN-45sci (kuvio 1A, a ja c,). Kuitenkin TMTP1 DKK ei kohdistaa ei-metastasoitunut solulinja PC-3M-2B4-soluissa, hiiren fibroblastisolulinjaa NIH /3T3, normaali rintarauhasen epiteelisolujen MCF-10A, normaali maksan solujen LO2 ja HEK293-soluissa (kuvio 1A, b , d ja B).

Fluoresenssikuvia kasvainsolujen käsiteltiin TMTP1 DKK tutkittiin CLSM. (A) PC-3M-1E8-soluja (b) PC-3M-2B4-soluissa (c) MKN-45sci soluja (d) NIH /3T3-soluilla. FITC-TMTP1 DKK (vihreä) ja kontrollipeptidi tutkittiin ksenograftikasvaimissa, mukaan lukien PC-3M-1E8 (e) TMTP1 DKK, (f) svTMTP1 DKK, MKN-45sci (g) TMTP1 DKK, (h) svTMTP1 -DKK. Tumat yhteistyössä värjättiin DAPI (sininen). B Fluoresenssikuvia of nomal solujen (normaali rintarauhasen epiteelisolujen MCF-10A, normaali maksan solujen LO2 ja HEK293-solut), joita hoidettiin TMTP1 DKK tutkittiin CLSM. Morfologiset muutokset nomal solujen tehtiin näkyväksi käyttämällä käännettyä mikroskooppia.

vieressä pyrittiin määrittämään onko TMTP1 DKK sitoutuneen nämä erittäin metastaattinen tuumorisolujen

in vivo

. Tätä tarkoitusta varten, PC-3M-1E8 ja MKN-45sci solut ihon alle ruiskutettiin BALB /c-nude-hiirissä. Hiiret kasvaimia 1-1,5 cm halkaisijaltaan ruiskutettiin 300 ug FITC-TMTP1 DKK peptidi häntälaskimoon. 24 tunnin kuluttua kasvaimet ja ohjaus- elimet irrotettiin ja jalostettu jäädytettyä leikkuu. Havaitsimme Dynamic biologista jakaantumista FITC konjugoitua TMTP1 DKK alkaen 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, ja 48 h hiirimalleissa MKN-45sci potilaalle tehdä mahasyövän ja PC-3M-1E8 ihonalainen eturauhassyövän konfokaali mikroskopia. TMTP1 DKK havaittiin erittäin metastaattinen PC-3M-1E8 ja MKN-45sci ksenograftin kasvaimen kudokset (kuvio 1A, e ja g). Konfokaalimikroskopiaa osoitti, että TMTP1 DKK jatkuu todennäköisesti korkeammalla tasolla 48 h hiirimalleissa MKN-45sci potilaalle tehdä mahasyövän ja PC-3M-1E8 ihonalainen eturauhassyöpä (kuva S1). Joka saattaa osoittivat, että peptidi voisi vakaa kasvainkudoksessa. Kuitenkin fluoresenssi ei havaittu kontrolli elimissä ja kudoksissa. Homing-kokeessa kontrollipeptidillä, svTMTP1 DKK, ei osoittanut selvää fluoresenssivärjäyksellä PC-3M-1E8 ja MKN-45sci ksenografti kasvainkudoksessa tai normaaleissa kudoksissa (kuvio 1A, f ja h, kuvio S2,).

TMTP1 DKK estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia erittäin metastaattinen syöpäsolujen

vieressä pyrittiin määrittämään jos TMTP1 DKK voi estää leviämisen erittäin metastaattinen syöpäsolujen. Tämän testaamiseksi, PC-3M-1E8, MKN-45sci, ja NIH /3T3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (1-20 uM) TMTP1 DKK ja kontrollipeptidit 24 tuntia. Määrien solujen kasvua mitattiin MTT: llä. TMTP1 DKK inhiboi soluproliferaatiota PC-3M-1E8 ja MKN-45sci solujen annoksesta riippuvaisella tavalla suurin inhibitio tapahtuvat annoksella 15-20 uM TMTP1 DKK (kuvio 2A ja B

P

0,01. Lisäksi esto mukaan TMTP1 oli paljon pienempi kuin TMTP1 DKK (kuvio 2A ja B,

P

0,01). inhibitio proliferaatioon hiiren fibroblasti NIH /3T3-solut ei havaittu (kuvio 2C). ja svTMTP1 DKK ei ollut vaikutusta eturauhasen ja mahasyövän soluja (kuvio 2D, F).

Cell eloonjäämisluvut määritettiin MTT-määrityksiä suoritettiin kolmena rinnakkaisena (

virhepalkkien

, ± SD). Esitetyt tiedot edustavat solujen prosenttiosuus eloonjääneelle verrattuna käsittelemättömiin soluihin. edustavat tulokset on esitetty. erot selviytymisasteet välillä 10pM ja 20 uM TMTP1 DKK ovat merkittävämpiä joko PC- 3M-1E8 tai MKN-45sci solut (

P

0,01). kuitenkin vain vähän tai ei lainkaan vaikutusta ei nähty hiiren fibroblasti NIH /3T3-solujen lisääntymisen, kun niitä käsiteltiin TMTP1 DKK. D solut elinkelpoisuus MKN-45 ja PC-3M-1E8 syöpäsoluja käsitellään eri pitoisuuksia (0-20 uM) svTMTP1 DKK 24 tunnin mitattiin MTT-määrityksellä. E Morfologiset kvantifiointiin solujen apoptoosin käänteismikroskooppi PC-3M-1E8 ja MKN-45sci soluja käsitellään 10 uM TMTP1 DKK. Sen jälkeen käsitelty DKK, solut osoittivat solun kutistuminen, kalvo hajoaminen, ja ydin- tiivistyminen /pirstoutumista. F Pieni elimellisen muutoksen havaittiin käänteinen mikroskoopilla PC-3M-1E8 ja MKN-45sci käsitelty 10pM svTMTP1 DKK 24 tunnin ajan.

On mahdollista, että TMTP1 DKK rajoitettu leviämisen indusoimalla apoptoosin erittäin metastaattinen syöpäsoluja. Tämän testaamiseksi PC-3M-1E8, MKN-45sci solujen normaalin rintarauhasen epiteelisolujen MCF-10A, normaali maksan solujen LO2 ja HEK293-soluja käsiteltiin 10 uM TMTP1 DKK ja svTMTP1 DKK 24 tuntia. Mahdolliset morfologisia muutoksia soluissa havaittiin alle faasikontrastimikroskoopissa. Hinnat apoptoosin hinnat määritettiin FACS käyttämällä FITC-anneksiini V: n ja propidiumjodidivärjäys. PC-3M-1E8 ja MKN-45sci soluissa, joita käsiteltiin TMTP1 DKK osoitti solun kutistuminen, kalvon hajoamista, ja ydin- tiivistyminen /pirstoutuminen (kuvio 2E), jotka kaikki ovat ominaisia ​​morfologisia muutoksia solujen apoptoosin. Vaikka TMTP1 DKK ei vaikuttanut näiden normaalien solujen elinkelpoisuuden ja morfologian alle faasikontrastimikroskoopissa (kuvio 1 B). FACS-analyysi osoitti myös, että TMTP1 DKK indusoi apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla annoksilla 10 uM tai enemmän, verrattuna kontrolli (kuvio 3A ja C).

Soluja käsiteltiin yön yli 10 uM TMTP1- DKK peptidiä ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä 12 h, 24 h, ja 48 h. Lisääntyvät PC-3M-1E8 solua ja MKN-45sci soluja käsiteltiin TMTP1 DKK peptidi (täydet pylväät) väheni elinkelpoisuutta apoptoosin kautta ajan myötä (

P

0,01). Kuitenkin hiiren fibroblasti NIH /3T3-solut eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia. B signalointimolekyylit mukana apoptoottisen vaikutuksen TMTP1 DKK peptidi käsitelty. Viljellyt solut käsitellään 10 uM TMTP1 DKK peptidi 24 tuntia kerättiin ja rikottiin. Yhteensä solujen proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE-geelistä elctrophoresis ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle. Kun oli salvattu 5% rasvaton maito, kalvoja inkuboitiin 1 tunnin ajan 1 ug /ml ensisijaisen vasta-aineita (kaspaasi 9 (35 KD, 17 KD), kaspaasi 8 (20 KD) ja kaspaasi 3 (19 KD)), jota seurasi piparjuuri peroksidaasiin konjugoitua anti-kani-vasta-aineita. Blotteja altistettiin kemiluminesenssin alustaan ​​ja kehitetään Hyperfilm MP. C PC-3M-1E8-soluja ja MKN-45sci solut altistettiin 10 uM TMTP1 DKK: n läsnä (+) 40 uM Z-VAD-fmk: ssa 24 tuntia. 24 tunnin jälkeen solujen elinkykyisyys analysoitiin. Laaja valikoima kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk vähensivät apoptoosin määrä PC-3 M-1E8 ja MKN-45sci soluissa.

TMTP1 DKK aktivoi sekä mitokondrioiden ja Fas-riippuvaisen apoptoosin reittien

D (KLAKLAK)

2 on amfipaattinen D-aminohapon peptidi, joka sitoutuu selektiivisesti bakteerien, mutta ei eukaryoottinen, solukalvojen [9]. Eukaryooteissa, se käynnistää apoptoosin kautta häiriöitä mitokondriot, oletettavasti koska kalvot mitokondrioiden muistuttavat bakteerien [10]. On olemassa kaksi suurta signalointi väyliä apoptoosin: solunulkoisen Fas kuolema reseptorin reitin ja solunsisäisen mitokondrioiden kautta. Tunnistaa apoptoottisen reitin laukaisee TMTP1 DKK hoito PC-3M-1E8 ja MKN-45sci soluissa, tutkimme ilmaus kaspaasi-3, 8, ja 9 western blottauksella. Vyöhykettä, jotka vastasivat aktiivisia kaspaasi 3 (19 kDa), kaspaasi 8 (20 kDa), ja kaspaasi 9 (kaksi nauhaa: 17 kDa ja 35 kDa) havaittiin. Siten TMTP1 DKK käsiteltyjen syöpäsolujen, pilkkominen kaspaasien 3, 8, ja 9 kaikki havaitut. Tämä osoitti, että sekä Fas kuoleman reseptori reitti ja mitokondrioiden reitti aktivoitiin TMTP1 DKK (kuvio 3B).

edelleen vahvistaa, että TMTP1 DKK edistää apoptoosia, testasimme onko kaspaasin estäjät voivat vähentää TMTP1- DKK aiheuttaman apoptoosin kurssi PC-3M-1E8 ja MKN-45sci solujen linjat. Laaja valikoima kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK saattaa vähentää apoptoottista nopeudella TMTP1 DKK saaneilla PC-3 M-1E8 ja MKN-45sci solut 45,2 ± 2,3%: sta 22,1 ± 1,3% ja 53,7 ± 2,6%: sta 25 ± 0,8 % (kuvio 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TMTP1 DKK aiheuttaman apoptoosin kautta sekä solunsisäisen mitokondrioiden reitti ja Fas kuolema reseptorin kautta.

TMTP1 DKK estää hyökkäys kasvain

in vitro

ovatko TMTP1 DKK vaikuttaa solujen invaasio, PC-3M-1E8 ja MKN-45sci soluja käsiteltiin joko TMTP1 DKK tai suodatin-steriiliä vettä 12 tuntia, jälkeenpäin joka soluinvaasiota määritettiin Matrigel invaasiomääritys (kuvio 4A) . Solu maahanmuuttoluku PC-3M-1E8 solua laski 52,38 ± 3,3%, kun soluja käsiteltiin 2 uM TMTP1 DKK peptidi. Vastaavasti, solun migraation MKN-45sci soluissa laski 46,16 ± 2,7% samoissa olosuhteissa (kuvio 4B).

Soluja inkuboitiin 2 uM TMTP1 DKK peptidi 12 tuntia. TranswellTM muuttoliike määrityksiä PC-3M-1E8 solua ja MKN-45sci solut tehtiin. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut yläpuolelta suodattimen poistettiin ja soluja alapinnan suodattimen kiinnitettiin ja värjättiin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SE kolmen riippumattoman kokeen; kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. B Cellular muuttoliikettä väheni 52,38 ± 3,3% PC-3M-1E8 solua ja 46.16 ± 2,7% MKN-45sci solujen verrattuna asianmukaista valvontaa.

TMTP1 DKK estää kasvaimen kasvua ja kehitystä

in vivo

vieressä pyrittiin tutkimaan jos TMTP1 DKK peptidi voisi edustaa mahdollista terapeuttinen strategia tukahduttaa kasvaimen kasvua

in vivo

. Tämän testaamiseksi analysoimme vaikutus TMTP1 DKK ihonalaisen kasvaimen kasvua hiirissä. MKN-45sci potilaalle tehdä mahasyövän ja PC-3M-1E8 eturauhassyövän solut injektoitiin subkutaanisesti hiiriin, jotka käsiteltiin sitten 50 uM TMTP1 DKK, TMTP1 tai suodatin-steriiliä vettä läpi vatsaonteloon (IP) injektiona joka toinen päivä. PC-3M-1E8 kasvain hiirillä, joita hoidettiin TMTP1 DKK osoitti kasvua eloonjäämisaste 55 vrk (vaihteluväli 49-58 päivää) 65 päivän (vaihteluväli 60-69 päivää) verrattuna kontrolliryhmiin. Samaan aikaan elinaika MKN-45sci kasvainta kantavien hiirten kasvoi 35 vrk (vaihteluväli 29-39 päivää) 42 vrk (vaihteluväli 35-44 päivää), kun käsitellään TMTP1 DKK.

TMTP1 -DKK hoito myös selvästi esti kasvaimen kasvua in PC-3M-1E8 ihonalainen eturauhassyöpä ja MKN-45sci potilaalle tehdä mahasyövässä hiirille. Keskimääräinen tilavuus molempien ksenograftikasvaimissa kutistettu TMTP1 DKK: lla käsitellyssä ryhmässä suhteessa kontrolliin (kuvio 5B, C). Neljäkymmentä päivää injektion jälkeen, PC-3M-1E8 ihonalainen eturauhassyöpäksenograftista kasvaimen tilavuus oli keskimäärin 18%, kun valvonta TMTP1 DKK hoidetut hiiret (kuvio 5D). Lisäksi tutkimme onko TMTP1 DKK peptidi indusoi apoptoosin ksenograftissa eturauhaskasvaimissa

in vivo

TUNEL määrityksessä. Lukumäärä havaittu apoptoottisten solujen lisääntynyt TMTP1 DKK peptidi hoidetussa ryhmässä suhteessa kontrolliin. Näin ollen, nämä tulokset osoittavat voimakasta anti-kasvain vaikutus TMTP1 DKK peptidi

in vivo

.

Hiiret käsiteltiin TMTP1 DKK peptidi elivät pidempään kuin kontrolli käsitellyissä hiirissä ekvimolaarinen TMTP1 peptidi tai suodatin-steriiliä vettä, mikä näkyy Kaplan-Meier selviytymisen juoni. B, C PC-3M-1E8 eturauhassyöpä ja MKN-45sci potilaalle tehdä mahasyövän käsitelty TMTP1 DKK peptidi olivat pienempiä kuin hoidettu kontrollipeptidiä. D Kasvaimen kasvu PC-3M-1E8 kasvain hiirillä, joille TMTP1 DKK peptidi hoito. Hiiriä käsiteltiin ajan 40 päivää (

n

= 9). Hoitojakson aikana, kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa. Kasvaimen tilavuus hoidetuilla hiirillä TMTP1 DKK peptidi oli keskimäärin 18% koko valvonnan. Kasvaintilavuudet arvioitiin päivänä 1 (○) ja päivä 40 (•). P 0,05, t-testi. E Eläimet lopetettiin kuuden päivän kuluttua TMTP1 DKK hoitoa. Kasvain otettiin talteen ja kuvattiin välittömästi sen jälkeen analyysi apoptoottisen solukuoleman TUNEL-määrityksellä. Määrä apoptoottisten solujen lisääntynyt erityisesti TMTP1 DKK peptidillä käsitellyissä kasvaimissa. a, Suurennus: x 100. b Suurennus: × 200.

TMTP1 DKK tukahduttaa kasvaimen etäpesäke ja etenemisen MKN-45sci potilaalle tehdä ksenograftien kateenkorvattomissa hiirissä

Voit testata TMTP1 DKK voi pienentää etäpesäke

in vivo

selvitimme vaikutuksia tämän peptidin etäpesäke malli. Orthotopic istutuksen ihmisen mahasyövän MKN-45sci fragmentit vatsaan kuusi nude-hiiriin aiheutti merkittävän määrän lisääntyminen metastaattisen kudoksissa, mukaan lukien neljä maksan etäpesäkkeiden kaksi perna etäpesäke, kolme vatsan etäpesäke, yksi munuainen etäpesäkkeitä, ja kaksi suoliliepeen imusolmukkeiden etäpesäke (yksi ohjaus hiiret kuolivat viimeistään 16 päivän kuluessa implantaatiosta). Kuitenkin IP anto TMTP1 DKK joka toinen päivä 20 päivän ajan aiheutti dramaattisen ja annoksesta riippuvaa väheneminen metastaattisen kudoksia, ilman etäpesäkkeitä havaitaan kuudessa TMTP1 DKK käsiteltyjen nude-hiiriin (kuvio 6A, C). Lisäksi, H virhepalkkien, SD. *, P 0,001 Studentin t-testillä verrattuna kontrolliryhmään.

TMTP1-DKK-käsitellyistä hiiristä selviytyi hyvin eikä osoittanut merkkejä toksisuudesta tai kehon painon koko kokeiluja. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että TMTP1 DKK voi estää kasvaimen etäpesäkkeiden ja kasvaimen kasvu

in vivo

.

Keskustelu

syövän hoitoon käytetään pienimolekyyliset terapeuttisten kuten oligonukleotidit tai peptidit vaatii tehokkaita jakelujärjestelmiä kykenevät tunkeutumista solun sisään. Äskettäin sarjan uusia peptidejä tunnistettiin, jotka sitoutuvat spesifisesti solukalvon sekä syövän ja kasvaimeen liittyvien endoteelisolujen. Tunnistetut peptidit ovat lupaavia vaihtoehtoja nykyisin käytössä biomolekyylien kohdistamiseen metastaattisen soluja johtuen niiden nopeasta verestä, lisääntynyt diffuusio ja kudospenetraatio, immunogeenisiä luonto, ja synteesin helppous [21], [22], [23], [24], [25]. Olemme aiemmin osoittaneet, että okkulttinen etäpesäkkeitä tai piilevästä micrometastases oli leimallisesti havaita TMTP1 [11]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutki tarkemmin sitä TMTP1 voisi antaa terapeuttisia aineita tehokkaasti. Tutkimme kyky TMTP1 toimittaa proapoptoottiset peptidi erittäin metastaattinen syöpäsolujen kytkemällä se proapoptoottiseen

D (KLAKLAK)

2 verkkotunnuksia. Valitsimme synteettinen 14-aminohapon peptidi KLAKLAKKLAKLAK, koska se oli inertti ulkopuolella soluissa, mutta tuli myrkyllisiä sisäistetään aiheuttaa häiriöitä mitokondrion kalvon, mikä johtaa ohjelmoidun solukuoleman.

tiedot osoittavat, että TMTP1-gg-

D (KLAKLAK)

2 sitoutui spesifisesti erittäin etäpesäkekasvainten solulinjoissa, eturauhasen syöpäsolu PC-3M-1E8 ja mahasyövän solu MKN-45sci

in vitro

ja

in vivo

. Kuitenkin TMPT1-gg-

D (KLAKLAK)

2 ei sitoudu nometastatic eturauhasen syöpäsolu PC-3M-2B4 ja hiiren fibroblastisolulinjaa NIH /3T3 normaalin rintarauhasen epiteelisolujen MCF-10A, normaali maksasolujen LO2 ja HEK293-solut (kuvio 1). Tulokset osoittivat, että TMTP1 DKK ei vaikuttanut näiden normaalien solujen elinkelpoisuus ja morfologia. Koska havaitsimme, FITC-TMTP1-gg-

D (KLAKLAK)

2: n sitoutumista sekä solulinjoja ja ksenograftikasvaimina nude-hiirissä, päättelimme, että TMTP1 kohdistaisi toimituksen pro-apoptoottinen peptidin erittäin etäpesäkkeitä.

tutki lisäksi anti-kasvain vaikutuksia TMTP1 DKK fuusiopeptidin. Tuloksemme osoittavat, että TMTP1 DKK välittämä merkittävää tuumorin vastaista toimintaa sekä i

n vitro

ja

in vivo

, verrattuna joko TMTP1 tai DKK yksin. Fuusiopeptidin TMTP1 DKK aiheuttaman apoptoosin nopeasti ja voimakkaasti. Pieninä pitoisuuksina TMTP1 DKK voi aiheuttaa syöpää solukuoleman sillä on vain vähän vaikutusta hiiren fibroblastisolut NIH /3T3. TMTP1 DKK osoittivat voimakas anti-kasvain vaikutuksia erittäin metastaattinen MKN-45sci ja PC-3M-1E8 solua verrattuna TMTP1. DKK ei yksinään voi laukaista apoptoosin, koska se ei transduktoida sytoplasmaan kasvainsolujen. Kun liittyy kohdistaminen peptidi TMTP1, mikromolaarinen tasot DKK johti vähintään 100-kertainen tappaminen tehokkuuden syöpäsoluissa. Mielenkiintoista, lisääntynyt tappaminen tehokkuutta ei havaittu hiiren fibroblastisolulinjaa NIH /3T3. Lisäksi TMTP1 DKK estivät merkittävästi invasiivisuus syöpäsoluja

in vitro

on transwell määrityksessä. Nämä tiedot osoittavat myös modulaarisen luonteen kohdistamisen /transduktiodomeeni ja pro-apoptoosi toimialueen TMTP1 DKK. Kukin domeeni antaa sen ominaisuuksia, kun kytketyn peptidin tuottaa biologisesti aktiivista ainetta.

D (KLAKLAK)

2 on antibakteerinen aktiivisuus, mutta on suhteellisen myrkyttömiä eukaryoottisolut. Kuitenkin, on osoitettu, että jos

D (KLAKLAK)

2 viemisen nisäkässolujen, se häiritsee mitokondrioita, johtuen samankaltaisuudesta mitochonrdrial ja bakteerien kalvoja, ja käynnistää apoptoosin [26]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että kun

D (KLAKLAK)

2 konjugoitiin homing peptidin kautta GG linkkeri, että kodeissa kasvaimen verisuonistoon ja selektiivisesti sytotoksinen angiogeenisten endoteelisolujen ja oli tuumorin vastaista aktiivisuutta

vuonna vivo

[26]. Sen jälkeen sisäistämisen, The proapoptoottiset

D (KLAKLAK)

2 peptidi toiminut hajottamalla mitokondrion kalvon, joka aiheuttaa sytokromi c ulosvirtaus sytoplasmaan johtaen apoptoosin. Sytoplasmassa, sytokromi c muodostaa kompleksin Rahastolla-1 ja prokaspaasi-9. Vuorovaikutus prokaspaasi-9 tuloksia sen pilkkominen ja aktivointia, aloittamista lohkaisu alavirtavaikuttajainhibiittorit kaspaasien. Tutkimuksessamme havaitsimme aktivoitu kaspaasi 9 western blot TMTP1 DKK kasvaimen soluihin, mikä viittaa siihen, osallistuminen mitokondrion reitin (kuvio 3). Havaitsimme myös kaspaasi 8, joka ehdotti Fas-ligandin ekstrasellulaarinen solukuolemareittiin oli mukana TMTP1 DKK aiheuttama apoptoosin samoin. Tehokkuutta TMTP1 DKK: n indusoiman apoptoosin estyi laaja kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk PC-3M-1E8 ja MKN-45sci soluja. Siksi meidän tutkimus osoitti, että TMTP1 DKK laukaisi apoptoosia sekä mitokondrioiden polku ja kuoleman reseptori reitin.

TMTP1 DKK näytti selektiivisesti estää kasvaimen kasvua ja vain vähäinen vaikutus muihin kudoksiin ihonalainen ksenograftissa ja potilaalle tehdä elinsiirrot hiiriä malleja. Sekä ihonalainen ksenograftikasvaimissa PC-3M-1E8 ja hiiren MKN-45sci potilaalle tehdä mahalaukun kasvaimet estää huomattavasti TMTP1 DKK. Elinaika kasvaimen omaavien nude-hiirten molemmissa malleissa merkittävästi pidentää TMTP1 DKK hoitoa. Lopettaminen terapeuttisen peptidin annon johti nopeaan kasvaimen kasvua ja kuolemaa koe-eläimillä. Lisäksi toimitimme suoraan kokeellista näyttöä on prekliinisissä mallin tehoa häiriön ortotooppisten kasvua ihmisen mahasyövän solut nude-hiiriin molemmissa ensisijainen sivuston ja etäpesäkkeitä. Havaitsimme kasvainetäispesäkkeiden kaikissa verrokkeihin, mutta vain muutama TMTP1 DKK hoidettujen eläinten. Näin ollen tulokset ortotooppisten MKN-45sci ksenografteissa paljasti, että TMTP1 DKK estää tehokkaasti kasvaimen etäpesäke hiirillä. Terapeuttisia vaikutuksia TMTP1 DKK peptidi

in vivo

osoitettiin myös johtua tuumorisolujen apoptoosin, minkä osoitti TUNEL-määrityksellä (kuvio 5, 6).

Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että TMTP1 DKK on tehokas syöpälääkkeen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Se laukaisi apoptoosin sarjassa erittäin metastaattinen syöpäsolujen kautta sekä mitokondrioiden polku ja kuoleman reseptorin kautta. Tuloksemme viittaavat siihen, että TMTP1 DKK voi olla tehokas ehdokas hoitava aine etäpesäkkeitä perustuu sen kohdistamisesta ja tehokas kasvaimen tappaminen aktiivisuutta. Edelleen tutkimus TMTP1 DKK ja sen analogit voivat johtaa löytämään uusia anti-kasvain ja etäpesäke aineita.

Materiaalit ja menetelmät

peptidi suunnittelu ja synteesi

TMTP1- DKK (NVVRQ -GG-

D (KLAKLAK)

2) ja svTMTP1 DKK (VNQRV -GG-

D (KLAKLAK)

2), joka on ohjattu peptidi TMTP1 (NVVRQ) , luotiin kytkemällä kohdistaminen verkkotunnus (TMTP1) ja pro-apoptoottinen

D (KLAKLAK)

2 domain kautta glycinylglycine silta kuvatulla [11]. Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) kytkettiin peptidin kautta ylimääräinen glysiini N-päähän. TMTP1 DKK ja ohjaus peptidejä (DKK, TMTP1 ja svTMTP1 DKK) syntetisoitiin käyttämällä Fmoc-kemiaa on kiinteän faasin syntetisaattori ja puhdistettiin HPLC: Xi’an Huachen Bio-Tech Ltd (Xi’an, Kiina). Sekvenssi ja rakenne peptidien vahvistettiin massaspektrometrialla. Peptidejä liuotettiin suodattimen steriiliin veteen konsentraatioon 1 mM.

Solulinjat ja reagenssit

erittäin metastaattinen ja nonmetastatic ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3M-1E8 ja PC-3M -2B4 vastaavasti ystävällisesti Dr. Jie Zheng (Peking University, Peking, Kiina) [27], [28]. Ihmisen mahalaukun syöpäsolu lineMKN-45sci, hiiren fibroblasti NIH /3T3-solut, normaali rintarauhasen epiteelisolujen MCF-10A, normaali maksan solujen LO2 ja HEK293-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Kaikki soluja ylläpidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Z-VAD-FMK saatiin Bachemilta (Heidelberg, Saksa).

rakentaminen hiirimalleissa

neljä viikkoa vanhoja BALB /c

nu /nu

hiiret olivat saatu SLAC Laboratory Animal Co Ltd (Shanghai, Kiina). Suorassa intratekaalisen (IT) injektion tutkimukset, 3 x 10

6 PC3M-1E8 solut suspendoitiin 100 ui: aan normaalia suolaliuosta ja injektoitiin ihon alle (SC) oikeaan kylkiin hiiriä (4-6 viikkoa vanhoja). Tuumorien annettiin kasvaa 4-6 mm halkaisijaltaan ennen hoitoa. Tuore tuumorifragmentteja (2 mm

3) implantoitiin sitten SC posterioriseen runko nukutetuissa hiirillä.

hiirimallissa MKN-45sci potilaalle tehdä mahalaukun syöpä, joka on potentiaalia maksaspesifinen etäpesäke , luovutti ystävällisesti Dr. Jinjun Li (Shanghai Cancer Institute, Medical College of Shanghai Jiao Tong-yliopiston, Shanghai, Kiina) [29], [30], [31]. Tuore kasvaimen palaset saatiin edellä kuvatulla tavalla. Sen jälkeen hiiri anesthetization, vatsa oli paljaana ja osa seröösisiä kalvo kaavittu pihdeillä. Yksi 1 mm

3 kasvain pala sitten vahvistettu kaavittu paikalle seröösisiä pinta 5-0 imukykyinen ommelta.