Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurimmat haasteiden syövän hoidossa paklitakselin kanssa (PTX) ovat lääkeresistenssin ja vakavia sivuvaikutuksia. Massiivinen on pyritty voittaa nämä kliiniset haasteisiin yhdistämällä PTX muiden lääkkeiden kanssa. Tässä tutkimuksessa raportoimme ensimmäistä prekliiniset tiedot, jotka pratsikvantelia (PZQ), anti-loinen aineena, voisi parantaa huomattavasti syövän vastaisen tehoa PTX erilaisissa syöpäsolulinjoissa, kuten PTX-resistentti solulinjoissa. Yhdistelmän perusteella indeksin arvo, olemme osoittaneet, että PZQ synergistisesti PTX-indusoidun solujen kasvun esto. Yhteistyössä kohtelu PZQ ja PTX myös indusoi merkittäviä mitoosi pidätystä ja aktivoida apoptoottisen reaktion. Lisäksi PZQ yhdistettynä PTX johti selvempi tuumorikasvun estoon verrattuna kummallakaan lääkkeellä yksin hiiren ksenograftimallissa. Yritimme tutkia mahdollisia mekanismeja tämän synergistisen tehon aiheuttama PZQ ja PTX, ja huomasimme, että co-hoitoon kahden lääkitys saattaa huomattavasti vähentää ilmentymistä X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin proteiinia (XIAP), antiapoptoottisena proteiini . Tuloksemme osoittivat lisäksi, että alas-säätely XIAP tarvittiin synergistisen vuorovaikutuksen PZQ ja PTX. Yhdessä tämä tutkimus ehdotti, että yhdistelmä PZQ ja PTX voi edustaa uusia ja tehokkaita syövän vastaisia ​​strategia optimoimiseksi PTX terapiassa.

Citation: Wu ZH, Lu Mk, Hu LY, Li X (2012) pratsikvantelia parantaa synergisesti paklitakseli teho on syöpäsolun kasvun estoon. PLoS ONE 7 (12): e51721. doi: 10,1371 /journal.pone.0051721

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2012 Julkaistu: 12 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Foundation for edistäminen Talents of Basic Science, Kiina (J1030626) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm); Avain projekti Fujian ohjelmat Science and Technology (2011Y0050); ja The Technology Innovation Foundation of Science and Technology Bureau of Xiamen, Kiina (2011S0567). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Se tuli uusi trendi, joka kääntää vanhan huumeiden uusia käyttötapoja erityisesti syövän hoidossa, koska ne rutiininomaisesti käyttää vanhoja lääkkeitä voi olla piilotettu kykyjä tai hyvät mahdollisuudet käsiteltäessä syöpä. Tosiasia on, että kaikki jatkokäsittely on tehty jo, jonka avulla voimme siirtää lääkeaineen kliinisen nopeammin ja vähentämään kustannuksia lääkekehityksen [1], [2]. Käsite ”uusia käyttötapoja vanhoja lääke” tarjoaa tehokkaan tavan löytää uudelleen uusia käyttökohteita olemassa olevien lääkkeiden kanssa tunnettujen farmakokinetiikkaa ja turvallisuusprofiilit. Joitakin onnistuneita esimerkkejä tästä syöpä lääkekehityksen raportoitiin aiemmin kuten talidomidi [3], C-vitamiini [4] – [6], NSAID (steroidiset tulehduskipulääkkeet) [7] – [11]. Viime aikoina on raportoitu, että Artemisiinipohjaisten, anti-loinen ainetta, ja sen johdannaiset, oli syvä sytotoksisuutta sellaisia ​​syöpäsoluja vastaan, eri kasvaimissa [12] – [16], joka tarjoaa sysäyksen kehittää anti-parasiitti huumeita syöpälääkkeiden. Pratsikvanteli (PZQ), toinen anti-loinen aine, on laajalti käytetty hoitoon eri skistosomiaasia kanssa hyvää tehokkuutta [17], [18]. Mielenkiintoista on, että on raportoitu, että PZQ voidaan tehostaa humoraalista ja soluvälitteistä immuunivastetta isännän sairauksia vastaan ​​[19], [20]. Olisi kiinnostavaa tutkia, onko PZQ on syövän vastaista aktiivisuutta, joka on vielä epäselvä toistaiseksi.

Tässä tutkimuksessa tappaminen aktiivisuus PZQ syöpäsoluihin arvioitiin eri määrityksiä. Tutkimme myös vaikutukset ja hoidon PZQ ja yleisesti käytetty kemoterapeuttisen lääkeaineen paklitakselin (PTX). PTX on mikrotubulia stabilointiainetta, joka voi edistää mikrotubulusten vakauttamiseen, jolloin pidätys solut G2 /M vaiheessa solusyklin ja johtaa apoptoosin [21], [22]. Kuten yksi yleisimmin käytetty syöpälääkkeet, PTX on osoittanut voimakasta tehoa vastaan ​​monenlaisia ​​maligniteetteja, mukaan lukien rinta-, pään ja kaulan alueen, munasarja- ja ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä, samoin kuin Kaposin sarkooma [23]. Kuitenkin syntyminen kliinisen resistenssin ja laajan vakavia sivuvaikutuksia ovat edelleen merkittäviä ongelmia PTX hoito [24] – [26]. Näin ollen lukuisat viimeaikaiset tutkimukset keskittyivät PTX synergististä hoitoa, jonka tavoitteena on löytää tehokas ratkaisu voittamiseksi PTX-resistentti ongelma ja vähentää aiheuttama myrkyllisyys PTX vaarantamatta lääkkeen tehokkuus [27], [28].

Täällä me raportoitu, että PZQ voi synergisesti parantaa kasvua estävää vaikutusta PTX eri syöpäsolulinjojen, mukaan lukien PTX-resistentti solulinjoja, kuten DLD1 ja H1299, vaikka PZQ hoito yksinään ei aiheuttanut sytotoksisuutta näitä syöpäsoluja. PZQ voisi myös parantaa huomattavasti PTX aiheuttama mitoottisia pysähtymiseen ja apoptoosiin. Lisätutkimuksissa, osoitimme, että tämä sytotoksiset synergia PZQ ja PTX mukana alas-säätely XIAP. Kyky PZQ voimistavan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on PTX vahvistettiin myöhemmin hiiren ksenograftimallissa. Nämä tulokset tarjotaan merkittäviä vaikutuksia optimoimiseksi PTX hoitoa. Yhdistämällä PZQ kanssa PTX voi edustaa uusia ja tehokkaita syövän vastaista strategiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines and Cell Culture

Ihmisen paksusuolen syövän solulinja DLD-1, rintasyöpä ZR-7530, keuhkosyövän solulinjat SPC-A-1 ja LTEP-a-2 viljeltiin RPMI 1640 ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjassa H1299, kohdunkaulan syövän solulinja HeLa- ja ihmisen rintasyöpäsolulinja Bcap37 pidettiin DMEM. Kaikki alustat täydennettiin 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (GIBCO, Carlsbad, CA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Kaikki solulinjat saatiin Cell Bank of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Solulinjat olivat vapaita mykoplasmasta, kun testataan PCR-pohjainen mykoplasman testi [29], [30].

Reagenssit ja vasta-aineet

Paklitakseli (PTX), roskovitiini, kani polyklonaalinen vasta-aine Bim, Puma, ja hiiren monoklonaalisen vasta-aineen (mAb) vastaan, β-aktiini saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Pratsikvanteli (PZQ) luovutti ystävällisesti Dr. kesäkuu Lu (Nanjing Pharmaceutical tehdas co., LTD, Nanjing, Kiina). MG132 oli Calbiochem (Darmstadt, Saksa). Kani polyklonaalinen vasta-aine pilkotaan poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP, P89) ja fosfo-histoni H3 (Ser-10) (P-H3) ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Kani polyklonaalinen vasta-aine Noxa, bax, bak, kaspaasi-3, surviviinia, Bcl-2 ja Bcl-X

L olivat Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Hiiren mAb vastaan ​​XIAP oli BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). Vuohen anti-kani-ja vuohen anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Pierce Biotechnology (Rockford, IL).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus määritettiin 3- (4 , 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT). Solut levytettiin 96 kuopan levyille inkuboitiin merkitty lääkkeiden 37 ° C: ssa eri aikoja. Sitten elatusaine poistettiin ja elatusainetta, joka sisälsi MTT: tä (0,5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin vielä 2-4 tunnin ajan CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Formatsaanikitei- Kiteet liuotettiin 100% DMSO: hon ja absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen. Jokainen näyte mitattiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa. Suhteellinen osuus selviytymisen laskettiin jakamalla absorbanssi käsiteltyjen solujen kuin kunkin kokeen kontrolli. PTX ja PZQ yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä korkeimmat pitoisuudet käytettiin kokeissa eivät häiritse MTT määritysreagenssit meidän ohjaus kokeet (tuloksia ei ole esitetty).

Cell CycleAnalysis

analyysiä varten DNA-pitoisuus ja solukierron virtaussytometrialla, solut kerättiin talteen, pestiin kerran PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Tuolloin virtaussytometriaa analyysiä varten solut pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen värjäystä liuokseen (100 ug /ml RNaasi ja 100 ug /ml propidiumjodidia PBS: ssä). Sen jälkeen soluja inkuboitiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa pimeässä, solusyklin jakautumisen analysoitiin Coulter EPICS XL-virtaussytometrillä (Beckman Coulter, Miami, FL).

Western blot -analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, solut kerättiin ja lyysattiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, 1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia, 10 ug /ml leupeptiiniä, 2 ug /ml aprotiniinia, 10 mM NaF, 1 mM Na

3Vo

4, ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä bikinkoniini- happoa (BCA) määritys. Solun proteiinien tehtiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Millipore, Bedford, MA). Membraanit blokattiin TBS-Tween 20 (0,5%), joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa 2 h ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Kolmen pesun jälkeen TBS-Tween 20, kalvoja inkuboitiin vuohen anti-kani tai vuohen anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Membraanit pestiin TBS Tween-20 uudelleen ja kehittää parannettu kemiluminesenssin (Pierce, Rockford, IL). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin klo 1:1000 laimennus, lukuun ottamatta anti-β-aktiini, joka käytettiin klo 1:5000 laimennus. Anti-kani-tai anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita käytettiin laimennoksena 1:5000.

DAPI Värjäys

jälkeen lääkehoitoa, soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä oli pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, sitten inkuboitiin värjäysliuos (0,3% Triton-X 100 ja 1 ug /ml DAPI PBS: ssä) 5 minuutin välttäen valoa huoneenlämpötilassa. Solut tutkittiin fluoresenssimikroskopialla (Nikon). Solut, joilla on hajanainen ja tasaisesti kondensoitu tumat pitää apoptoottisia soluja, ja apoptoosin ilmaistiin prosentteina laskettuna solujen lukumäärän apoptoottinen ydin- morfologia jaettuna solujen määrä tutkittiin.

pesäkemuodostusta

solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 1,5 x 10

3 solua per kuoppa ja altistuvat lääkehoitoa. 10 päivän jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla (0,5% kristalliviolettia, ja 20% metanoli) 30 minuuttia. Sitten levyt pestiin tislatulla vedellä ja valokuvataan. Pesäkkeet, jotka sisälsivät enemmän kuin 50 solusta, laskettiin. Arvot kullekin kunnossa ilmaistiin prosentteina suhteessa ajoneuvon-käsiteltyihin kontrolleihin. Kukin määritys ehto suoritettiin vähintään kolmen erillisen kokeen.

Immunofluoresenssivärjäys

Solut coverslip fiksoitiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, pestiin PBS: llä, läpäiseviksi 0,2% Triton-X100 PBS: ssä 10 minuutin ajan, ja sitten blokattiin 3% naudan seerumin albumiinia PBS: ssä huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Anti-Phospho-histoni H3 (Ser-10) (P-H3) vasta-aine (laimennus 1:100) lisättiin ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen, joka sisälsi 0,02% Triton X-100 ja 1,5% BSA: ta, peitelasit inkuboitiin Alexa Fluor 647-konjugoitu vuohen anti-kani-IgG (laimennus 1:200) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi soluja inkuboitiin 1 ug /ml DAPI PBS: ssä 5 minuuttia ennen asennettu 90% glyserolia ja sinetöity kynsilakka. Mitoosi-indeksi ilmaistiin prosentteina P-H3-positiiviset-solujen suhteessa solujen kokonaislukumäärään tutkittiin.

Plasmidit, Cell transfektio ja RNA häiriöt

XIAP-ilmentävät plasmidin pcDNA3- myc-XIAP oli lahja Dr. John C. Reed (Burnham Institute, La Jolla, USA) ja tyhjän pcDNA3 käytettiin negatiivisena kontrollina. Cell transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

pudotus XIAP, shRNA kohdistaminen XIAP sekvenssi (GTGGTAGTCCTGTTTCAGC) kloonattiin lentivirusvektori Lenti-Lox3.7 (PLL3 0,7). Sekvenssi, jolla ei ole vastaavaa osaa ihmisen genomissa (GATCATGTAGATACGCTCA) käytettiin kontrollina. Tuotantoon tarttuvaa shRNA ilmentävien lentiviruksista, 293-T-soluja transfektoitiin pLL3.7 lentivirusvektorilla yhdessä pakkauksessa vektoreilla VSV-G, pRSV-Rev ja pMDL gag /pol RRE. 48 h transfektion jälkeen, virus sisältävä supernatantti media kerättiin, johdettiin 0,45 um: n suodattimen ja käytettiin infektoituja soluja lisäyksen jälkeen 10 ug /ml polybreeniä.

Reaaliaikainen Reverse Transcription-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin totaali-RNA: sta käyttäen oligo-dT-aluketta ja Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (TaKaRa, Shiga, Japani). Reaaliaikainen PCR suoritettiin Roottorin Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) ja SYBR green (BIO-V, Xiamen, Kiina) käytettiin detektioreagenssia. Aluke sekvenssit XIAP ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) olivat: XIAP (eteenpäin: 5′-GACAGTATGCAAGATGAGTCAAGTCA-3 ’; taaksepäin: 5′-GCAAAGCTTCTCCTCTTGCAG-3′), GAPDH (eteenpäin: 5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ”reverse: 5’-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3 ’). Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena. Tietojen analysointi suoritettiin Roottorin Gene 6000 -sarjan ohjelmisto 1.7 (Corbett Research, Mortlake, Australia). Suhteellinen RNA määrät normalisoitiin GAPDH mRNA.

Vieraslajisiirteen hoitoihin

Kaikki eläin menettelyt hyväksymiä Animal Care ja käyttö komitean Xiamen University. Kasvainsolujen (DLD-1, 2 x 10

6) injektoitiin subkutaanisesti kateenkorvattomiin nude-hiiriin (BALB /c 4-5 viikkoa). Kun kasvaimen tilavuus saavutti 25-35 mm

3, eläimet satunnaistettiin ja osoitettu eri hoitoryhmään (n = 6 kussakin ryhmässä). Eläimet injektoitiin intraperitoneaalisesti PZQ yksinään (100 mg /kg), PTX yksin (30 mg /kg), tai näiden yhdistelmä PZQ (100 mg /kg) ja PTX (30 mg /kg). PTX liuotettiin yhtä suuriin tilavuuksiin Cremophor EL ja etanolia, ja laimennettiin edelleen PBS: llä ennen injektiota. PTX annettiin päivinä 5, 9, ja 13 tuumorisoluinjektion jälkeen. PZQ liuotetaan maissiöljyyn annettiin päivinä 5, 7, 9, 11, ja 13 kasvainsolujen injektion jälkeen. Yhden-aineella, ajoneuvo annettiin sijasta PZQ tai PTX kanssa samassa aikataulussa. Kasvaimen koko määritettiin käyttämällä jarrusatulat. Kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin kaavalla: (a) x (b

2) × 0,5, kun on kasvain pituus ja b on kasvaimen leveys mm.

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistiin keskiarvona ± SEM. Määrittämään merkittäviä eroja tietoja, kaksihäntäinen parittomia Studentin

t

testiä sovellettiin. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä P 0,05. Lääkkeiden yhteisvaikutukset tutkittiin synergiasta tai estävää käyttämällä mediaaniannos Effect analyysi (CalcuSyn-; Biosoft, Ferguson, MO).

Tulokset

PZQ ei aiheuta mitään kasvainsolusytotoksisuuden

sytotoksisuus PZQ eri kasvainsolujen tutkittiin ensin kasvaimen solulinjojen keuhkosyövän soluja (SPC-A-1, LTEP-a-2 ja H1299), rinta- syöpäsolujen (Bcap37 ja ZR7530), kohdunkaulan karsinooma (HeLa ) ja paksusuolen syövän soluja (DLD-1). Kuitenkin PZQ indusoi ole kasvun estymistä eikä apoptoosin jopa niinkin suuriin pitoisuuksiin kuin 100 uM (kuvio. S1), joka osoittaa, että PZQ ei aiheuttanut mitään kasvainsolusytotoksisuuden.

Co-hoito PZQ ja PTX synergistisesti inhiboi kasvainsolujen kasvua

seuraavan arvioidaan, onko PZQ voi vaikuttaa herkkyyteen kasvainsolujen kemoterapeuttisten aineiden, kuten paklitakseli (PTX) MTT: llä. Huomasimme, että PZQ suuresti parannettu kasvun esto PTX erilaisissa kasvainsolulinjoissa lukien kaksi PTX-resistentti solulinjoissa, DLD-1 ja H1299 (Fig. 1A, Fig. S2). Teimme suurin osa Seuraavat kokeet näiden kahden PTX-resistentti solulinjoissa. Päästääkseen paremmin tähän yhdistelmä vaikutus, annos-vaste tutkimukset suoritettiin kuten osoitti kuvassa. 1B. PZQ voisi parantaa herkkyyttä DLD-1 soluja PTX eri pitoisuuksilla PTX ja PZQ. Pesäkemuodostusta osoitti myös, että yhdistelmä PZQ ja PTX merkittävästi tukahdutti pesäkkeiden muodostumista verrattuna joko aineella yksinään (Fig. 1 C). Mediaani Annos Effect analyysiä käytettiin luonnehtimaan vuorovaikutuksia PZQ ja PTX osalta laskuun solujen elinkelpoisuutta. Yhdistelmä indeksin arvot 1,0 johdettu vaikutus erilaisia ​​PZQ ja PTX pitoisuudet DLD-1 ja H1299 solulinjoista, osoitti synergistisen vaikutuksen välillä PZQ ja PTX (Fig. 1 D).

(A ) solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysi sen jälkeen, kun eri syöpäsolulinjoissa käsiteltiin PZQ yksin, PTX joko yksinään tai yhdessä molempien lääkkeiden konsentraatioilla ja ajankohtina kuten seuraavat: HeLa, ZR7530, DLD-1 ja H1299-soluja käsiteltiin 20 uM PZQ yksin, 10 nM PTX yksin tai yhdistää molemmat 48 tuntia; Bcap37 ja SPC-A-1-soluja käsiteltiin 30 uM PZQ, 5 nM PTX yksin, tai molemmat 48 h; LTEP-a-2-soluja käsiteltiin 30 uM PZQ yksin, 5 nM PTX yksin, tai molemmat 60 tuntia. (B) DLD-1 hoidettiin konsentraatiot PTX puuttuessa tai läsnä ollessa 20 tai 40 uM PZQ 48 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin sitten MTT-määrityksellä. (C) DLD-1 ja H1299-soluja käsiteltiin 20 uM PZQ yksin, 10 nM PTX yksin, tai yhdistelmä 10 päivää. Pesäkkeet värjättiin kristalli- violetilla ja laskettiin. (D) DLD-1 ja H1299-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla PZQ ja PTX kiinteällä suhteella (2000:1) 48 tuntia. Sen jälkeen solujen elinkelpoisuus määritettiin kussakin kunnossa, yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. CI-arvot 1,0 viittaavat synergistisen vuorovaikutuksen kahden lääkkeen. Kaikki arvot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

vaikutus Yhdistelmä PZQ ja PTX on apoptoosin

varmistamiseksi edelleen voimistaa PTX aiheuttaman solukuoleman PZQ, analysoitiin solu-uutteita ilmentämiseen apoptoottisten markkereita, kuten poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkominen. Yhdistelmä johti merkittävästi pilkkominen PARP erilaisia ​​solulinjoja, kun taas anto PZQ tai PTX yksin eivät (kuvio. 2A), mikä osoittaa merkittävää aktivoitumista apoptoottisen kaskadin tällä yhdistelmällä. Lisäksi prosenttiosuus sub-G1 väestön määritettiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, verrattuna hoitoon kumpaakin annettaisiin erikseen, co-hoito PZQ kanssa PTX selvästi lisääntynyt kertyminen solujen sub-G1 vaiheeseen. Olemme myös vahvisti nämä tulokset tumavärjäystä DAPI, vaihtoehtoinen apoptoosin määritystä. Prosenttiosuus solujen apoptoottisen ytimet oli merkittävästi suurempi yhdistelmän ryhmässä kuin yhden hoitoryhmässä (tuloksia ei ole esitetty). Olemme ensi tutkinut osuus caspases indusoimaa apoptoosia yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen esti laajakirjoinen kaspaasiestäjä zVAD-fmk. Hoito zVAD-fmk myös suuresti estänyt aiheuttamaa apoptoosia yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX (Fig. 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, solu aiheuttamaa apoptoosia yhteistyössä hoitoon PTX ja PZQ riippui kaspaasiaktiivisuus.

(A) Ilmoitettu solulinjat käsiteltiin kuten kuvassa. 1A, ja apoptoosin tutkittiin Western analyysi pilkotun PARP (lan-PARP) tasolla. (B) DLD-1 ja H1299-soluja käsiteltiin 20 uM PZQ yksin, 10 nM PTX yksin tai yhdistelmänä 48 tuntia. Sitten sub-G1 fraktio määritettiin virtaussytometrialla. (C) DLD-1-soluja käsiteltiin 20 uM PZQ ja 10 nM PTX puuttuessa tai läsnä oli 20 uM kaspaasiestäjä zVAD-fmk 48 tuntia, ja ilmaisu kaspaasi 3 ja lan-PARP tutkittiin Western blot. (D) jälkeen DLD-1-solut käsiteltiin kuten C, prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin DAPI-värjäyksellä. Kaikki Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

Co-hoito PZQ ja PTX voivat aiheuttaa Mitoottista pidätys Kasvainsoluissa

Virtaussytometria käytettiin vaikutusten tutkimiseksi PZQ ja PTX on solusyklin jakautumisen kasvainsolujen. Yhteistyössä kohtelu PZQ ja PTX annosriippuvaisesti lisäsi G2 /M väestö verrattuna PTX hoito yksinään DLD-1-solut (Fig. 3A). Selventää profiilia G2 /M-kertynyt solujen aiheuttama yhdistelmä, tutkimme mitoosi-indeksi DLD-1-soluja käsiteltiin PTX puuttuessa tai läsnä PZQ. Kuten odotettua, PTX hoito yksinään annosriippuvaisesti lisäsi mitoosi-indeksin (Fig. 3B). PTX yhdistettynä PZQ edelleen lisännyt mitoosi-indeksi (Fig. 3B). Olemme myös havainneet, että PZQ voi merkittävästi edistää PTX-välitteisen ekspression lisääntymisen taso fosforyloidun histoni H3 (Ser-10) (P-H3), mitoottisen merkki (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PZQ parannettu PTX aiheuttama mitoottista pidätys tuumorisoluissa.

(A) DLD-1-soluja käsiteltiin 10 nM tai 20 nM PTX puuttuessa tai läsnä oli 20 uM PZQ 12 tuntia, ja solukierron analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. Sen jälkeen DLD-1-solut käsiteltiin kuten edellä, mitoosi-indeksi määritettiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät” (B), ja ilmentymistaso fosfo-histoni H3 (Ser-10) (P-H3) seurattiin Western blot ( C). Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

Aika tietysti koe perustuu virtaussytometria osoitti, että kasvu G2 /M väestö edeltäneen osa-G1 väestön DLD-1-soluissa hoidettiin yhdistelmällä PZQ ja PTX (Fig. 4A), mikä osoittaa pysyviä G2 /M pidätys luultavasti johti apoptoosin. Sitten tutkittiin, oliko korrelaatio mitoosi pidätyksen ja indusoiman apoptoosin yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX. Estäjä CDK, roskovitiini, on käytetty. Roskovitiinilla voisi estää selektiivisesti CDK1, CDK2 ja CDK5 ja lohko solusyklin etenemisen estämällä solujen pääsyn S ja M vaiheet [32]. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, roskovitiinilla lähes kokonaan esti G2 /M pidätyksen aiheuttama yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX DLD-1-soluissa. Lisäys mitoosi-indeksi johtui yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX myös palasi ohjaus tason lisäämisen jälkeen roskovitiinilla (Fig. 4C), mikä osoittaa, että roskovitiinilla esti mitoosi pidätyksen aiheuttama tätä yhdistelmää. Silmiinpistävän, roskovitiinilla esti myös PZQ tehostetun PTX-välitteisen apoptoosin lähes kokonaan, määritettynä apoptoottiset sub-G1 väestön ja Western-analyysi pilkotun PARP (Fig. 4D ja E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin H1299-soluja (tietoja ei esitetty). Nämä tiedot osoittivat, että lisääntynyt aiheuttamaa apoptoosia yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX todennäköisesti seurausta tuotannon mitoosi pidätyksen aiheuttama tätä yhteistyötä hoitoa.

(A) jälkeen DLD-1 solut ko-käsiteltiin 20 uM PZQ ja 10 nM PTX varten ilmoitettuina ajankohtina, G2 /M ja Sub-G1 fraktiot määritettiin virtaussytometrialla. (B) DLD-1-soluja käsiteltiin yhdistelmällä PZQ (20 uM) ja PTX (10 nM) kanssa tai ilman 12,5 uM roskovitiini 12 tuntia, ja sitten solukierron analysoitiin virtaussytometrialla. (C) DLD-1-soluja käsiteltiin, kuten (B), ja mitoosi-indeksi määritettiin. Jälkeen DLD-1 käsiteltiin yhdistelmällä PZQ (20 uM) ja PTX (10 nM) läsnä ollessa tai poissa ollessa 12,5 pM roskovitiini 48 tuntia, Apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla analyysi Sub-G1 väestöstä (D) ja Western-analyysi cle-PARP tason (E). Kaikki arvot näytetään keskimääräisenä ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

Co-hoito PZQ ja PTX voisi Down-säännellä XIAP Protein

arvioimiseksi oleva mekanismi synergistisiä sytotoksisuuden välillä PZQ ja PTX, arvioimme vaikutukset kahden aineen, joko yksin tai yhdistelmänä, eri apoptoosin säätelyproteiineja DLD-1-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, hoito PZQ tai PTX yksin ei muuttanut ilmaus XIAP. Kuitenkin altistuminen solujen yhdistelmän PZQ ja PTX aiheutti huomattavan laskun tason XIAP. Ei merkittäviä muutoksia ilmaisua muiden proteiinien, kuten Bcl-X

L, elossa, Puma, Bim, Noxa, Bax ja Bak, havaittiin soluissa altistuvat PTX yksin, PZQ yksin tai yhdistelmän.

(A) DLD-1-soluja käsiteltiin 20 uM PZQ yksin, 10 nM PTX yksin tai yhdistelmänä 24 tuntia. Sitten ekspressio Bcl-XL, Bcl-2, surviviinia, XIAP, Bim, Puma, Noxa, Bax ja Bak tarkkailtiin Western blotilla. (B) Kun altistuminen DLD-1-solujen yhdistelmä 20 uM PZQ ja 10 nM PTX läsnä ollessa tai poissa ollessa 20 uM zVAD-fmk: ssa 24 tuntia, mikä on osoitus XIAP määritettiin Western blot. (C) H1299-soluja käsiteltiin 20 uM PZQ yksin, 10 nM PTX yksin tai yhdistelmänä 24 tuntia, minkä jälkeen ilmentyminen XIAP tutkittiin. (D) jälkeen DLD-1-solut käsiteltiin kuten kohdassa (A), kokonais-RNA eristettiin ja XIAP mRNA kvantifioitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Seuraavat normalisoinnin GAPDH mRNA: n, The XIAP mRNA: n ekspressio arvot kullekin ehto oli suhteessa apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään soluissa. (E) DLD-1-soluja käsiteltiin yhdistelmällä 20 uM PZQ ja 10 nM PTX puuttuessa tai läsnä on 10 uM MG132: ssa 24 tuntia, ja sitten ilmentyminen XIAP seurattiin Western blot. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

Sen määrittämiseksi, onko ilmentymisen muutosten XIAP olivat riippuvaisia ​​kaspaasin aktivaatio, käsittelimme DLD-1-solujen kanssa lääkkeen yhdistelmän läsnä ollessa tai poissa ollessa kaspaasi-inhibiittori zVAD-fmk. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, zVAD-fmk oli vähän vaikutusta alas-säätely XIAP aiheuttama yhdistelmä PZQ ja PTX, mikä osoittaa, että muutokset ilmentyminen XIAP olivat kaspaasi riippumattomia. Down-regulation XIAP havaittiin myös H1299 soluissa yhteistyössä käsitelty PZQ ja PTX (Fig. 5C), mikä viittaa siihen, että modulaatio tämä proteiini voi olla solulinjan erityinen.

Yritimme tunnistaa mekanismia joka XIAP oli alassäädetty vastauksena yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX. Tutkia, onko yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX voisi säädellä XIAP ilmentymistä transkriptiotasolla, käytimme käänteistranskriptio-PCR. Verrattuna kontrolliryhmään, yhdistettynä hoidon PZQ ja PTX ei johtanut merkittäviä muutoksia mRNA tasot XIAP (Fig. 5D).

Toinen mahdollinen selitys XIAP alassäätöä voisi olla hajoaminen XIAP by proteasomia. Tämän hypoteesin testaamiseksi käsittelimme DLD-1-solujen kanssa lääkkeen yhdistelmän läsnä ollessa proteasomin inhibiittoria, MG132. Tukahduttaminen XIAP DLD-1-solut käsiteltiin yhdistelmällä PZQ ja PTX lähes kokonaan poistettiin MG132 (Fig. 5E). Nämä tulokset osoittivat, että PZQ ja PTX saattaa aiheuttaa XIAP hajoamisen kautta proteasomireitillä välittämän reitin.

XIAP on tärkeä rooli siinä Synergistinen sytotoksisuus PZQ ja PTX

Edellä olevien tulosten saavuttamiseksi tutkitaan onko downregulation XIAP todella välittyvät indusoimaa solukuolemaa yhdistelmä PZQ ja PTX. Olemme transfektoitu tilapäisesti DLD-1-soluja plasmidilla, joka sisälsi epitooppimerkittyjen XIAP (myc-XIAP) ja tyhjällä plasmidilla, joka toimi kontrollina. Transfektio varmistettiin Western blot (kuvio. 6A). Yliekspressio XIAP DLD-1-soluissa merkittävästi heikennetty PZQ-avusteinen PTX-indusoitua sytotoksisuutta, kuten määritettiin analysoimalla solujen elinkelpoisuuden ja osa-G1 väestöstä (Fig. 6B ja C).

(A) Western blot osoitti XIAP ilmentyminen DLD-1-soluissa 24 tunnin kuluttua transfektion pcDNA3-myc-XIAP tai valvontaa vektori. (B) 24 h transfektion jälkeen pcDNA3-myc-XIAP ja ohjaus vektori, DLD-1-soluja käsiteltiin 20 uM PZQ yksin, 10 nM PTX yksinään tai yhdistelmänä 48 tuntia, ja sitten solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. (C) 24 h transfektion jälkeen pcDNA3-myc-XIAP ja ohjaus vektori, DLD-1-soluja käsiteltiin yhdistelmällä 20 uM PZQ ja 10 nM PTX. Sitten osa-G1 fraktio määritettiin virtaussytometrialla. (D) DLD-1-solut infektoitiin lentiviruksesta koodauksen ohjaus shRNA tai XIAP shRNA 48 tuntia, ja ilmentyminen XIAP analysoitiin Western blot. (E) DLD-1-solut infektoitiin lentiviruksesta koodauksen ohjaus shRNA tai XIAP shRNA 48 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin 20 uM PZQ yksin, 10 nM PTX yksinään tai yhdistelmänä 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Kaikki arvot näytetään keskimääräisenä ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

lisätutkimuksia roolin XIAP että synergiaa PZQ ja PTX, käytimme lentivirus välittämää lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) ja pudotus XIAP DLD-1-soluissa. Solut kerättiin 48 tuntia infektion jälkeen, ja XIAP ilmentyminen analysoitiin Western blot. Verrattuna DLD-1-soluissa, jotka oli infektoitu kontrolli shRNA, infektoidut solut XIAP shRNA näytetä dramaattisesti tukahdutetaan XIAP ilmentymistä (Fig. 6D). Seuraavaksi me arvioitiin vaikutusta XIAP Knockdown solujen elinkelpoisuuden. Kuten on esitetty kuviossa. 6E, estää ilmentyminen XIAP ei ollut vaikutusta herkkyyteen DLD-1-solujen PZQ hoitoon. Kuitenkin XIAP knockdown huomattavasti herkistynyt DLD-1 soluja PTX aiheuttama sytotoksisuuden (Fig. 6E). Lisäksi sytotoksisuus aiheuttama yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX myös parannettu XIAP-Knockdown DLD-1-soluissa (kuvio. 6E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että XIAP on merkittävä rooli välittämisessä synergistisen sytotoksisuus aiheuttama yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX.

Yhdistäminen PZQ ja PTX vaimentaa tuumorikasvun

in vivo

Voit testata, jos yhteistyössä hoitoon PZQ ja PTX on mitään vaikutusta kasvaimen kasvuun

in vivo

perustimme ksenograftimallia nude-hiirissä kanssa PTX-resistentti DLD-1-soluissa. Injektoidaan subkutaanisesti DLD-1-soluissa johti eksponentiaalisesti kasvavia kasvaimia atyymisissä nude-hiirissä (Fig. 7A). Yhdistettynä hoidon PZQ ja PTX suuresti esti tuumorin kasvun suhteen PTX hoito yksinään, kun taas PZQ antaa yksinään ei kyennyt estämään kasvaimen kasvua DLD-1-ksenografti-kantavissa hiirissä (Fig. 7A ja B). Verrattuna kontrolliryhmään, hoidon PZQ ja PTX yhdistelmä johti 50% vähennys kasvaimen paino (Fig. 7C).