Krooninen sairaus

tiivistelmä

Proteiini eristettiin kuori

Crataeva tapia

(CrataBL) on sekä Kunitz-tyyppinen kasvi proteaasinestäjä ja lektiini. Olemme määrittäneet aminohapposekvenssi ja kolmiulotteinen rakenne CrataBL, sekä tunnettu valituilla biokemialliset ja biologiset ominaisuudet. Löysimme kaksi erilaista isoformia CrataBL eristetty alkuperäisestä lähteestä, eroavat asemissa 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) ja 97 (Leu /Ser). CrataBL osoitti suhteellisen heikko estävä vaikutus trypsiiniä (K

IAPP = 43 uM) ja oli tehokkaampi vastaan ​​tekijä Xa (K

IAPP = 8,6 uM), mutta ei ollut aktiivinen joukko muita proteaaseja. Olemme varmistaneet, että CrataBL sisältää kaksi glykosylaatiokohtaa ja muodostaa dimeerin suurina pitoisuuksina. Korkean resoluution kiderakenteet kahden eri kidemuodot isoformin II tarkastanut β-apila kertainen CrataBL ja ovat osoittaneet dimeerien läsnäoloa koostuu kaksi lähes identtistä molekyylien tehdä laajat yhteydet (~645 Å

2). Rakenne poikkeaa eniten läheisesti liittyvien proteiinien puuttumisesta N-terminaalista β-hiusneula. Kokeissa, joiden tarkoituksena on tutkia biologisten ominaisuuksien CrataBL, olemme osoittaneet, että lisättiin 40 uM proteiinin 48 tuntia aiheutti suurimman kasvun estäminen in MTT-määrityksellä (47% DU145-solujen ja 43% PC3-soluja). Apoptoosin DU145 ja PC3 solulinjoissa vahvistettiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V /FITC ja propidiumjodidivärjäys. Hoito CrataBL johti vapautumisen mitokondrion sytokromi

c

ja kaspaasi-3 DU145 ja PC3-soluissa.

Citation: Ferreira RDS, Zhou D, Ferreira JG, Silva MCC , Silva-Lucca RA, Mentele R, et al. (2013) Crystal Structure of

Crataeva tapia

Bark Protein (CrataBL) ja sen vaikutus Human eturauhassyöpäsolulinjoissa. PLoS ONE 8 (6): e64426. doi: 10,1371 /journal.pone.0064426

Editor: Enrique Pérez-Payálle Centro de Investigacion Principe Felipe ja IBV-CSIC, Espanja

vastaanotettu: 17 joulukuu 2012; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Ferreira et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: käyttö APS tukivat US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences alle sopimuksessa nro W-31-109-Eng-38. Kirjoittajat ovat kiitollisia CAPES, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ja São Paulo Research Foundation (FAPESP) (prosessi 09 /53766-5) ja annetaan taloudellista tukea. Hanke tukee myös osittain Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health (NIH), National Cancer Institute, Center for Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suuri määrä proteiineja, on tunnusomaista niiden β-apila kertainen [1]. Jäsenet superperheen osuus rakenteellisia ominaisuuksia, mutta ei välttämättä muita ominaisuuksia ja niiden biologinen rooli voi olla hyvin erilainen [2]. Huomattava heistä ovat kasvien proteaasi-inhibiittoreita Kunitz tyyppiä, jota kutsutaan Kunitz-P tai Kunitz-STI-inhibiittorit [2], [3]. Nämä proteiinit ensisijaisesti estävät seriiniproteaaseja, vaikka jotkut estävät myös kysteiiniä ja asparagiiniproteaasien [4]. Kunitz-P-inhibiittoreita on tunnusomaista molekyylipaino on noin 20000 Da (koko proteiinin tai domeenin), alhainen pitoisuus kysteiinitähteiden, ja yksi tai kaksi reaktiivista kohtaa, jotka ovat perustana niiden estävää vaikutusta. Kuitenkin jotkut rakenteellisesti läheisiä β-apilaproteiinien ei proteaasinestäjille ollenkaan, mutta niillä on monipuolinen muita ominaisuuksia, esimerkiksi klorofylli sitovan [5], maku muutos (mirakuliini) [6], sitoutumisen sytokiinireseptorit (IL-1β) [7 ], ribosomi myrkytys (risiini) [8], tai hiilihydraattia sitovan, esimerkkinä

härmämalikka

lektiini, CNL [9].

Plant lektiinit ovat proteiineja, joilla on vähintään yksi ei-katalyyttinen verkkotunnuksen joka sitoo palautuvasti ja erityisesti mono- tai oligosakkarideja [10], [11]. Koska nämä ominaisuudet, kuten proteiinit hyödynnetään luonnehdinta glykokonjugaattien ja solun pinnalla tai solu-solu-arkkitehtuuri tutkimuksia [12], [13]. Muutama proteaasinestäjät osoittavat myös lektiinin aktiivisuutta, esimerkkinä antamat inhibiittori, eristetty orvaskeden ankerias, nimeltään Eel-CPI-1 [14]. Troncoso et ai. [15] eristetty estäjä, jossa lektiinin ominaisuuksia

Peltophorum dubium

siemeniä, joka vähentää elinkelpoisuus Nb2 rotan lymfooma-soluja.

Crataeva tapia

(tunnetaan myös nimellä

Crateva Tapia

) kuuluu kapriskasvit perhe, joka löytyy Koillis Brasiliassa. Proteiini päässä

Crataeva tapia

kuori on puhdistettu käyttäen päinvastaiseksi misellejä: een [16] ja kromatografisilla prosessien [17]. Nimetty CrataBL (

Crataeva tapia

Bark lektiini), tämä proteiini osoitettiin omaavan joitakin spesifisiä sitovia glukoosista ja galaktoosista [17]. Useita biologisia ominaisuuksia on ominaista, mukaan lukien viive hyytymän muodostumisen huonontamalla sisäisen reaktiotien hyytymisjärjestelmän [18]. Lisäksi, CrataBL on osoitettu olevan anti-inflammatorisia, analgeettisia [19], ja hyönteisiä [17], ja kasvaimen [19] toimintaa.

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä [20], jossa DU145 ja PC3 on laajimmin tutkittu eturauhassyövän solulinjoissa, jotka toimivat

in vitro

malleja syövän hoitoon tutkimuksia [21], [22], [23]. Eturauhassyöpä liittyy korkeatasoisen ilmentymisen proteaasien [24] ja glykoproteiinien [25], joten CrataBL mahdollisesti hyödyllinen väline tutkimuksia eturauhassyöpäsolulinjoissa, koska se yhdistelmä ominaisuuksia, jotka sisältävät sekä proteaasin esto ja hiilihydraattia sitova.

tässä työssä me määritelty aminohapposekvenssi ja kolmiulotteinen rakenne CrataBL ja myös tutkittu erilaisia ​​biokemiallisia toimintaa, verrataan niitä ominaisuuksia muut tämän superperheen. Sen jälkeen, olemme tunnettu vaikutus CrataBL kasvuun ja vakauteen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

eristäminen CrataBL

proteiinin eristäminen suoritettiin menetelmän Araújo et al. [17]. Lyhyesti, 10% (w /v) poimii

Crataeva tapia

kuori fraktioitiin 30-60% ammoniumsulfaattia. Osa, joka sisältää proteiinia dialysoitiin 10 mM fosfaatti sitraattipuskuria, pH 5,5, ja lisättiin pylvääseen, CM-selluloosaa, joka oli tasapainotettu samalla puskurilla. Adsorboitunut proteiini eluoitiin tasapainotuspuskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl: a ja sisällön yhden piikin toimitettiin kokoekskluusiokromatografiaa Superdex 75 sarakkeen, joka oli tasapainotettu 0,15 M NaCl käyttäen ΔKTA Purifier (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi). Tämän jälkeen korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC) C18 vahvistaa homogeenisuuden näytteen. Eluutiot seurattiin 280 nm: ssä.

Proteiinipitoisuus ja hiilihydraattien määritykset

Protein määritys suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Lowry et ai. [26] käyttämällä naudan seerumialbumiinia (BSA) standardina. Sokeripitoisuus CrataBL määritettiin fenoli-rikkihappo-menetelmällä Masuko et al. [27], jossa mannoosia pitoisuuksina 2, 4, 6, 8, ja 10 ug vakiona.

MALDI-TOF /MS-analyysi

molekyylimassa CrataBL analysoitiin MALDI-TOF /MS: llä. 1 ui CrataBL (2 mg /ml) lisättiin 1 ui α-syano-4-hydroksikanelihappoa (10 mg /ml) matriisi liuokseen, täpläksi ruostumattomasta teräksestä MALDI tähyslevyä ja kuivattiin huoneenlämpötilassa ennen analyysiä. Massaspektrit saatiin Bruker Daltonics Microflex LT väline (Billerica, USA) toimiva lineaarinen, positiivinen ioni-tilassa aiemmin kalibroitu insuliinin, ubikitiinipromoottori, sytokromi C, ja myoglobiinin. Analysoitaessa proteiinia, massaspektrit hankittiin käyttäen seuraavaa väline parametrit: pulssi ioniekstraktio- viiveen 30 ns, ionilähteen jännite yksi, 20 kV, ionilähteen jännite kahden 18,65 kV ja ionilähteen linssi jännite 7,1 kV. Kunkin näytteen, massaspektrit hankittiin keräämällä 50 laser laukausta 50% laser valtaa m /z välillä 8000-25000 Da.

Ensisijainen rakenne CrataBL

sekvensointi natiivi proteiini suoritettiin Edman-hajotuksella [28]. Näyte alennettu, alkyloidut, minkä jälkeen ne toimitettiin pilkkomalla trypsiini, kymotrypsiini, Asp-N, ja Lys-C endopeptidaasit (sekvenssointilaatua, Roche, Saksa). Fragmentit, jotka johtuvat hoidon endopeptidaasit puhdistettiin 1 x 150 mm Jupiter Proteo 90A-kolonnia (Phenomenex, Aschaffenburg, Saksa) virtausnopeudella 0,1 ml /min, käyttämällä asetonitriili-gradientilla (0-60%), jossa oli 0,1% ( v /v) trifluorietikkahapossa 40 min ajan. Sekvensointi suoritettiin automaattisella kaasufaasissa sekvensseri (492cLC; Applied Biosystems, Foster City, USA). Glykosyloidun peptidit analysoitiin massaspektrometrialla määrittämiseksi molekyylimassa hiilihydraattiosien. Sekvenssisamankaltaisuuksia arvioitiin ohjelman BLAST vastaan ​​NCBI proteiini tietokantaan [29]. Sekvenssit rinnastettiin käyttämällä ohjelmaa Multalin [30].

Entsyymi inhibitioanalyyseissä

estoaktiivisuus CrataBL vastaan ​​proteaasien mitattiin käyttämällä spesifisiä kromogeenisia tai fluorogeenisia substraatteja 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä 37 ° C. Entsyymit (ihmisen tekijä Xa, naudan trypsiini, naudan kymotrypsiinin, ihmisen plasman kallikreiini (HuPK), sian haiman kallikreiinin (POPk), ihmisen neutrofiilielastaasi (HNE), ihmisen plasmiini, ja papaiini) esi-inkuboitiin joko CrataBL tai liuotinta 10 min. Reaktiot aloitettiin lisäämällä substraattien, ja värin tai fluoresenssin seurattiin jatkuvasti 405 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä (Packard, SpectraCount), tai 380/460 nm: ssä käyttäen Hitachi F-2000 spektrofluorimetrillä (Tokio, Japani), vastaavasti 30 min, ja pysäytettiin lisäämällä 50 ui 30% (v /v) etikkahappoa. Entsymaattisia aktiivisuuksia analysoitiin seuraavia puskureita (lopulliset konsentraatiot): ihmisen tekijä Xa (21 nM 0,02 M Tris-HCl, pH 7,4, joka sisältää 0,14 M NaCl: a, 5,0 mM CaCl

2 ja 0,1% naudan seerumin albumiinia, 0,57 mM Boc -lle-Glu-Gly-Arg-AMC); naudan trypsiini (40 nM 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, joka sisälsi 0,02% (v /v) CaCl

2; 0,8 mM Bz-Arg-pNan); naudan kymotrypsiini (88 nM 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0; 0,8 mM Suc-Phe-pNan); HuPK (14,7 nM 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, joka sisälsi 0,5 M NaCl: a; 0,4 mM H-D-Pro-Phe-Arg-pNan); POPk (2,6 nM 0,1 M Tris-HCl, pH 9,0; 0,16 mM HD-Val-Leu-Arg-pNan); HNE (1,3 nM 0,05 M Tris-HCl, pH 7,0, joka sisälsi 0,5 M NaCl: a, 0,88 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNan); ihmisen plasmiini (3,5 nM 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, joka sisältää 0,2 M NaCl: a; 0,9 mM HD-Val-Leu-Lys-pNan) ja papaiinilla (87 nM 0,1 M Na

2HPO

4, pH 6,3, joka sisälsi 0,4 M NaCl, 0,01 M EDTA, 0,4 mM Z-Phe-Arg-pNan). Näennäinen K

IAPP arvot määritettiin sovittamalla kokeellinen viittaa yhtälö hitaasti tiukan sitoutumisen [31] avulla Grafit ohjelman versio 4.0 (Erithacus Software, Staines, UK) [32].

reaktiivisen määritys affiniteettikromatografialla trypsiini-Sepharose

näyte, joka sisältää 1,8 mg proteiinia 0,1 M Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, laitettiin 1,0 ml trypsiini-Sepharose-pylvääseen, joka on tasapainotettu samalla puskuri. Inhibiittori eluoitiin 0,5 M KCI /HCI, pH 2,0 ja pidetään tässä pH: ssa, kunnes N-pään määritys vaiheessa.

Protein kiteytys

erittäin hyvin puhdistettua proteiinia, näyte yhdistettiin Superdex 75 pylväs dialysoitiin puskurissa, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl: a, ja 3% glyserolia, ja sitten väkevöitiin 8,5 mg /ml käyttäen Centrifugal Filter yksikköä (Millipore, Billerica, MA). Alustavat kiteytyskokeisiin tehtiin käyttämällä Phoenix robottia (Art Robbins Instruments, Mountain View, CA). Useita osumia saatiin useilta eri kiteytys näyttöjä [JCSG (Qiagen, Valencia, CA), Crystal Screen HT, Index (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), ja Wizard1-2 (Emerald Biosystems, Bedford, MA)]. Diffraktio laatu kiteitä saatiin näyttöjä JCSG-CORE-II D12 (0,2 M Li

2SO

4, 30% PEG3350) ja G8 (0,16 M ammoniumsulfaatti, 0,08 M ​​natriumasetaatti, pH 4,6, 20% PEG4000, 20 % glyserolia). Kiteitä ilmestyi toisena päivänä ja kasvoi täysikokoinen useiden päivien ajan 20 ° C: ssa.

X-ray tietojen keräämiseen ja käsittelyyn

Diffraktiotiedot kerättiin Kaakkois Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) beamline 22-ID on Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory. Yhden kiteet siirrettiin estoaine (emäliuoksen extra 10-20% glyserolia) noin 2 minuuttia ja sitten tehtiin flash jäädytettiin 100 K juoksevan nestemäisen typen. Kide mistä JCSG-CORE-II ehto G8 (nimeltään muoto I) heijastuneet röntgensäteet resoluutioon 1,5 Å. Diffraktiotiedoista sidottaisiin, integroitu, ja skaalata ohjelman XDS [33]. Kide kuuluu avaruusryhmää

C

2 yksikön solu parametrit a = 114,9 Ä, b = 46,2 Å, c = 71,5 Å, β = 103,4 ° ja sisältää dimeeri CrataBL epäsymmetrisessä yksikössä. Arvioitu Matthews kerroin on 2,26 Å

3 Da

-1, mikä vastaa 45,5%: liuotinpitoisuus. Kide mistä JCSG-CORE-II ehto D12 (nimeltään muoto II) taipuneen röntgenkuvat resoluutiota 1,75 Å. Diffraktiotiedoista myös käsitelty ohjelman XDS. Kide kuuluu myös avaruusryhmää

C

2, mutta eri yksikön solu parametrit, a = 95,6 Å, b = 76,3 Å, c = 62,3 Å, β = 120,1 °, yhdellä CrataBL dimeeriä epäsymmetrinen yksikkö. Arvioitu Matthews kerroin on 2,66 Å

3 Da

-1, mikä vastaa 53,9%: liuotinpitoisuus. Tietojenkäsittely tilastot sekä kidemuotojen on esitetty taulukossa 1.

Rakenne määrittäminen ja hienosäätö

rakenne CrataBL alun perin määritettiin käyttäen diffraktiotuloksille kidemuodon I ja tuloksena koordinaatit myöhemmin käytetään aloituspisteenä mallina molekyyli korvaaminen kerättyjen tietojen kidemuodon II. Rakenne CrataBL ratkaistiin molekyylien korvauksella ohjelman Phaser [34], [35], käyttämällä rakennetta vesiliukoisten klorofylli-proteiinin (PDB ID: 2DRE) aloituspisteenä malli. Jälkimmäinen proteiini valittiin, koska sen korkein kantavaan rakenteeseen identiteetin CrataBL ( 30%). Ainutlaatuinen ratkaisu edustavat kahta molekyylien epäsymmetrisen yksikkö todettiin tietojen välillä 20,0 ja 2,5 Å, jolla on Log-todennäköisyys voitto 122,3. Tuloksena elektronitiheyskartan oli täysin tulkittavissa, tarkastaa oikeellisuuden ratkaisu. Yksityiskohtaisempi jaottelu suoritettiin REFMAC5 [36] ja PHENIX [34], käyttäen kaikkia dataa 20 ja 1,5 Å, kun pitäisi 2% satunnaisesti valittujen heijastukset (1172 yhteensä) laskemisessa R

vapaa [37]. Isotrooppinen yksittäiset lämpötila tekijät olivat hienostunut, jossa TLS parametrit lisätään loppuvaiheessa tarkentamiseen. Usean jatkoneuvottelukierrosten automatisoitu hienosäätö ja manuaalinen korjaus käyttäen nokikana [38], rakennemallin lopulta puhdistettu R-tekijä 17,3% ja R

vapaa 20,8%. Rakenne kidemuoto II ratkaistiin Phaser ja muodon I koordinaatteja lähtö- mallia; tarkennettu suoritettiin käyttäen protokollaa samanlainen kuin raportoitu kidemuodon I viimeinen muoto oli puhdistettu 1,75 päätöslauselman, tuloksena on R-tekijä on 18,5% ja R

vapaa 23,2%. Tarkentaminen tilastot rakenteiden CrataBL kahden kidemuodon on esitetty taulukossa 1. Rakenteet verrattiin käyttäen Dali palvelin [39] kanssa joukon Protein Data Bank rakenteita, joissa on vähemmän kuin 90% sekvenssi-identiteetti.

solujen elinkelpoisuus määritys

Cell Lines.

solulinjat DU145 (HTB-81 ™) ja PC3 (CRL-1435 ™) ostettiin ATCC®. Soluja ylläpidetään Roswell Park Memorial Institute (RPMI) johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 IU /ml penisilliiniä, 37 ° C: ssa ilmapiirissä 5% CO

2. Solujen elinkyky määritettiin modifioidulla kolorimetristä määritystä käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA). DU145 tai PC3 maljattiin 96-kuoppaisille levyille (TPP, Trasadingen, Sveitsi) tiheydellä 5,0 x 10

3 solua per kuoppa 24 tuntia. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CrataBL (5, 10, 20, ja 40 uM) tai soijapavun trypsiini-inhibiittori (SBTI) (5, 25, 50, 100 uM) valmistettiin RPMI-elatusaineeseen 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. 24, 48, ja 72 tunnin viljelyn, 10 ui MTT: tä (5 mg /ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, PBS) lisättiin kuoppiin (2 h, 37 ° C), minkä jälkeen poistettiin väliaineen ja lisäksi 100 ul /kuoppa dimetyylisulfoksidia (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) liuottamaan kiteet formatsaanituotteen. Absorbanssi mitattiin 540 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä (Packard, SpectraCount). Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solukuolema analyysi virtaussytometrialla

DU145 ja PC3-solut (1 x 10

5 solua) ympättiin 6-kuoppaisille levyille (TPP, Trasadingen , Sveitsi) 24 tunnin täydellinen tartunta. Kuopat pestiin sen jälkeen kolme kertaa RPMI-elatusaineeseen ilman FBS: ää (at itämisaikojen 15 min 37 ° C: ssa ja 5% CO

2). Soluja inkuboitiin 24 tuntia RPMI-elatusaineessa ilman FBS: ää synkronoida solusyklin. Sen jälkeen soluja käsiteltiin CrataBL (40 uM) 24 ja 48 h RPMI ilman FBS: ää 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Lopussa kunkin inkuboinnin jälkeen solut poistettiin levyltä käyttämällä trypsiini-EDTA-liuosta (Cultilab, Campinas, Brasilia) [40], siirretään Cytometry putkiin, pestiin 500 ui sitomispuskuria (BD PharMingen kit), sentrifugoitiin, ja suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan samaa puskuria, joka sisälsi myös 3 ui anneksiini V-FITC ja 5 ui propidiumjodidia (PI). Reaktioseosta inkuboitiin 30 minuutin ajan pimeässä, ja sitten 300 ui samaa sitovaa puskuria lisättiin kuhunkin putkeen, ja analysoitiin virtaussytometrialla (FACSCalibur, BD, San Diego, USA) [41], [42].

Analyysi mitokondrion sytokromi c release

DU145 ja PC3-solut ympättiin 13 mm lasipeitinlevyille (5 x 10

4 solua /kuoppa), sijoitettiin 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 täyttä sitoutumista. Solut sen jälkeen inkuboitiin RPMI-elatusaineeseen ilman FBS: ää 24 tuntia, minkä jälkeen käsittelemällä 40 uM CrataBL RPMI media ilman FBS: ää, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa 12 h. Lopussa hoidon, solut pestiin PBS: llä ja mitokondriot leimattiin Mitotracker Deep Red 633 (1:500) (Molecular Probes) 20 minuutin ajan pimeässä ja kiinnitettiin 2% (v /v) paraformaldehydillä PBS: ssä 15 min. Solut pestiin uudelleen kolme kertaa PBS: llä, joka sisälsi 0,01 M glysiiniä ja sitten läpäiseviksi 0,01% saponiinia 15 min. Seuraavaksi solut värjättiin 2 h: n primaarisen vasta-aineen, hiiren anti-sytokromi c: n (1:400) (R 0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001.

Data deposition

atomi- koordinaatit ja rakenne tekijät on talletettu Protein Data Bank, www.rcsb.org (ATE liittymistä koodit 4IHZ ja 4II0 varten kidemuodot I ja II, vastaavasti). Proteiinisekvenssin ilmoitetaan tässä näkyy UniProt tietämyskannan talletusnumeroilla B8WI86 ja C0HJA4.

Tulokset ja keskustelu

puhdistaminen CrataBL ja arvioimalla sen toimintaa

CrataBL on emäksinen proteiini (pl 10), joka voidaan puhdistaa suhteellisen yksinkertaisella tavalla [17]. Ensimmäinen vaiheita uuttamalla 0,15 M NaCl: a ja ioninvaihtokromatografian CM-selluloosa (kuvio 1A). Kokoekskluusiokromatografia Superdex 75 -pylvääseen (kuvio 1 B) saa proteiinin puhdistusta homogeeniseksi sopivassa muodossa rakenteelliset tutkimukset, joissa on vain yksi suuri huippu, joka näkyvissä jälkeen käänteisfaasi-kromatografialla C

18 HPLC-pylvääseen (kuvio 1C ). Natiivi proteiini kulkeutuu useimmiten homodimeerinä käytetyn pitoisuuden kiteytys tutkimuksissa (katso jäljempänä).

(A) fraktio 30-60% toimitettiin ioninvaihtokromatografialle CM selluloosa tasapainotettu 10 mM fosfaatti sitraattipuskuria (PCB), pH 5,5. Kahden ml: n fraktioita kerättiin virtausnopeudella 0,3 ml /min. Nuoli osoittaa, eluoimalla 10 mM fosfaattia sitraattipuskuria, pH 5,5, joka sisälsi 0,5 M NaCl; (B) Kokoekskluusiokromatografia Superdex 75, joka oli tasapainotettu 0,15 M NaCl virtausnopeudella 0,5 ml /min. (C) proteiini eluoitiin lineaarisella gradientilla (5-100%), 90% asetonitriiliä 0,1% TFA: ta Milli-Q-vedessä (liuotin B) virtausnopeudella 0,7 ml /min (

t

= 0,1 min, 5% B;

t

= 5 min, 5% B;

t

= 30 min, 40% B;

t

= 50 min , 50% B;

t

= 60 min, 100% B;

t

= 65-68 min, 0% B).

lektiini ja hemagglutinoivat toiminta CrataBL havaittu aiemmin [17] ja näitä ominaisuuksia ole analysoitu tarkemmin. Olemme kuitenkin arvioida kykyä CrataBL toimia proteaasi-inhibiittori. Olemme havainneet, että se voisi estää naudan trypsiiniä ja tekijä Xa, mutta ei muita seriini peptidaasit, kuten kymotrypsiini, plasmiini, ihmisen neutrofiilielastaasi, ihmisen plasman kallikreiini, sian haiman kallikreiinin, tai kysteiiniproteaasi papaiini (taulukko 2). K

IAPP, laskea käyttäen yhtälöä kuvanneet Morrison et al. [32], oli 43 uM trypsiiniä ja 8,6 uM tekijä Xa, joka osoittaa, että CrataBL on suhteellisen heikko estäjä, paljon vähemmän tehokas kuin jotkin muut inhibiittoreita, jotka kuuluvat samaan perheeseen, jotka ovat usein nanomolaarisella jopa pikomolaarinen [43], [ ,,,0],44].

ensisijainen rakenne, glykosylaatio, ja biokemialliset ominaisuudet CrataBL

ensisijainen rakenne kypsä CrataBL koostuu yhdestä polypeptidin 164 tai 165 aminohappoa pitkiä, on läsnä ainakin kaksi erillistä isoformia, jotka eroavat toisistaan ​​asemissa 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) ja 97 (Leu /Ser) (kuva 2). C-terminaalinen Gly165 voi olla läsnä vain osa molekyylejä. Kun läsnä on viisi kysteiinitähdettä, osoittivat mahdollisuuden muodostaa kahden molekyylin sisäisiä disulfidisidoksia, joiden läsnäolo varmistettiin kiderakenteet (katso alla).

vertailu aminohapposekvenssin isoformin I CrataBL kanssa sekvenssit rakenteellisesti samanlaisia ​​proteiineja, määritetty ohjelman Dali [39]. Kysteiinitähteet näkyvät mustat laatikot ja hyvin säilyneitä aminohappoja on korostettu harmaalla. Jäännös kannat P1 ja P1 ’, joiden välillä proteolyyttisen tapahtuu, on merkitty kohtaan. Tähdet osoittavat glykosylaatiokohtia CrataBL. Sekvenssi isoformi II eroaa asemissa 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) ja 97 (Leu /Ser).

Araújo et al. [17] arvioitu molekyylimassa CrataBL noin 21 kDa SDS-PAGE: lla ja ovat osoittaneet Schiff värjäys, että proteiini on glykosyloitu. Edelleen analyysi glykosylaation massaspektrometrialla ja proteiinisekvenssi määritys on osoittanut, että läsnä on N-sitoutuneiden oligosakkaridien on Asn27 ja Asn57. MALDI-TOF MS-analyysi molekyylimassa natiivin proteiinin antoi piikki m /z 20388, jossa olkapää noin 19700 (M + H)

+, että niissä on isoformi. Ylimääräinen huippu 10229 johtuu molekyyli-ioni (M + 2H)

+ (kuvio 3). Fenoli-rikkihappo-menetelmällä [27] käytettiin pitoisuuden määrittämiseksi hiilihydraatin proteiinin, joka osoittaa ~6% hiilihydraattipitoisuus.

molekyylimassa hiilihydraattiosien arvioitiin väliset erot massaspektrometria glykosyloidun peptidien ja niiden aminohapposekvenssien. Siinä tapauksessa, että Asn57, molekyylipaino on osoitettu olevan 1170 Da taas Asn27, lisää signaaleja 162 Da tai enemmän havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

sekvenssit sekä isoformien CrataBL osoittavat korkea samankaltaisuus eri proteiinien β-apila kertaiseksi (kuvio 2), mukaan lukien Kunitz-tyypin estäjät STI (soijapavun trypsiini-inhibiittori) perhe [45]. Tällaiset inhibiittorit toiminto tiukasti sitoutumalla niiden kohdeproteaasin ja lisäämällä niiden reaktiivinen silmukka sen aktiivisen, joskus myös toimii hitaasti substraatteina [2].

sijainti reaktiivisen sivuston CrataBL määritettiin kromatografialla trypsiini -Sepharose 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0. Sitoutumisen jälkeen tukea, inhibiittorin pidettiin 30 min pylvääseen ja eluoitiin sitten 0,5 M KCI /HCI, pH 2,0, ja sitä pidettiin tässä pH: ssa. Trypsiini sidottu Sepharose hydrolysoi erityisesti estäjää reaktiivinen kohta, ja näyte pidettiin olosuhteissa valitaan, jotta vältetään uudelleen ligaatio peptidisidoksen. Saatu modifioitu proteiini sekvensoitiin ja kaksi N-terminaalista aminohappoa havaittiin eluaatissa, joista yksi vastaa N-terminaalista Ala1 ehjän inhibiittori, kun taas toinen voidaan tunnistaa Ser59. Tämä tulos osoittaa, että tämä tähde on läsnä P1 ”asentoon, kuten on määritelty Schechter ja Berger [46], mikä Ser58 on miehittää P1-asemassa. Voimakkaimmat trypsiini-inhibiittorit sisältävät yleensä emäksinen (Lys tai Arg, kuten Arg63 keskittymät [44], [45]) P1 asentoon. Vain muutama tunnettu Kunitz-P-inhibiittoreilla on Ser P1 kannasta [47], mutta on havaittu, että seriinin läsnäollessa P1 ”parantaa vuorovaikutusta trypsiinillä [48]. Havaittu katkaisukohta on CrataBL vastaa reaktiivisen silmukan pääosa tunnetusta Kunitz-P-tyypin estäjät, kuten STI [44] (kuvio 4).

vertailu aminohapposekvenssin isoformin I ja CrataBL sekvenssien kanssa BvTI – trypsiini-inhibiittoria puhdistettiin

Bauhinia kirjava

; Buxi – tekijän Xa inhibiittorilla alkaen

Bauhinia ungulata

; EcTI – trypsiini-inhibiittori puhdistettiin

Enterolobium contortisiliquum trypsiini-inhibiittori

[42], [43]. Kysteiinitähteet näytetään harmaina ja hyvin säilyneitä aminohappoja on korostettu mustalla. Jäännös kannat P1 ja P1 ’, joiden välillä proteolyyttisen tapahtuu, on merkitty laatikoihin. Asteriskit osoittavat glykosylaatiokohtia CrataBL.

Kiderakenne CrataBL

kolmiulotteisen rakenteen CrataBL määritettiin kaksi kidemuotoa. Molemmat olivat avaruudessa ryhmä

C

2 ja sisälsi kaksi molekyylien epäsymmetrisen yksikkö, mutta yksikkö solu parametrit ja kristalli pakkaus olivat erilaiset. Rakenteet puhdistettu verrattain korkean resoluution, 1,5 Å kidemuodon I ja 1,75 Å kidemuodon II hyväksyttävien geometriset parametrit (taulukko 1). Lopulliset mallit olivat täydellisiä kaikille neljä itsenäistä molekyylien tähteitä 1-164 jäljittää. Läsnäolo erittäin hyvin määritelty C-terminaalinen karboksylaatti on molekyyli A kidemuoto I viittaavat siihen, että viimeinen jäännös Ser164 ja Gly165, vaikka selityksin primaarirakenteessa, ei ollut läsnä kiteistä proteiinia (kuvio 5). Vaikka, kuten edellä on mainittu, CrataBL eristetty luonnollisesta lähteestä on seoksen isoformeja, näyttää siltä, ​​että pääasiassa molekyylejä isoformin minä kiteyttämällä, koska elektronitiheys, joka vastaa tähteitä, jotka poikkeavat toisistaan ​​välillä kaksi isoformia oli aivan selvä. Laaja glykosylaatio Asn27 Todettiin, jopa neljän Hiilihydraattiyksiköt kiinnitetty että jäännös on näkyvissä. Paras tiheys oli läsnä molekyylissä A kidemuoto I, jossa tyypillinen kasvi-tyyppinen glykosylaatiokuvio [Manβ1-4GlcNAcβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAcβ-Asn] [49] voitiin havaita. Hiilihydraatit ovat huonommin tilattiin muiden molekyylien molempien kidemuotoa. Heikko tiheys, joka voisi vastata hiilihydraatti- sidottu Asn57 kristallisokereita En voi asianmukaisesti mallinnuksen. Kidemuodossa II, mutta tiheys vieressä Asn57 oli aivan selvä ja annettiin mallinnus kovalenttisesti sitoutuneelle GlcNAc: lle. Kaksi disulfidisidokset tehtiin Cys33-Cys80 ja Cys126-133, kun taas Cys74 oli läsnä kaikissa molekyylit muodossa sulfenic happoa.

2F

on

c kartta oli muotoiltu 1,2 σ taso. Muodon tiheys, joka vastaa C-terminaalinen karboksylaatti osoittaa selvästi, että Gly165, vaikka löytyy sekvenssin, ei ole läsnä isoformin, jotka muodostavat kiteen. Kuva valmistettu PyMol [69].

kertainen CrataBL koostuu β-symboleille, tyypillistä tämän proteiinin perheen. Zhang et ai.