Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime vuosikymmenen aikana, useat tutkimukset ovat laajasti raportoitu, että aktivoidut luonnon tappaja (NK) solut voivat tappaa autologisia epäkypsiä dendriittisoluja (DC) in vitro, kun taas ne säästää täysin aktiivinen DC. Tämä johti ehdotukseen, joka aktivoituu NK-solujen voisi valita immunogeenisemmiksi osajoukko DC aikana suojaavan immuunivasteen. Ei ole kuitenkaan mitään osoitusta siitä autologiset DC tappamista NK solujen tapahtumaan

in vivo

ja näin ollen toiminnallista merkitystä tämän tappamisen edelleen heikko. Kirjoittajat raportoivat, että merkittävä lasku CD11 c

+ DC havaittiin tyhjennys hiirten imusolmukkeista ympätty MHC-vailla soluja NK-solujen tavoitteita pystyy aiheuttamaan NK-solujen aktivoitumisen. Tämä

in vivo

DC muokkausta NK-solut oli perforiini riippuvaa ja se oli toiminnallisesti merkitystä, koska jäljellä imusolmuke DC näkyy parannettu kyky indusoida T-solujen lisääntymistä. Lisäksi malli syövän rokotuksen antamisen MHC-puuttuu soluja yhdessä kasvainsolujen lisäsi kasvaimen-spesifisten CTL: ien ja johti merkittävään kasvuun hiirten eloonjääntiin haasteen jälkeen tappavalla annoksella kasvainsolujen . Ehtyminen NK-solujen tai käyttää Perforiinin hiirten väheni voimakkaasti kasvain-spesifisen CTL-laajennus ja sen suojaava rooli vastaan ​​kasvainsolujen haastetta. Kokonaisuutena meidän tiedot tukevat hypoteesia, että NK-solun välittämä DC lopettaminen tapahtuu

in vivo

ja pystyy edistää laajentumista syöpää spesifisten CTL: ien. Tuloksemme osoittavat myös, että syövän rokotteita voitaisiin parantaa, joilla pyritään aktivoimaan NK-soluja.

Citation: Morandi B, Mortara L, Chiossone L, Accolla RS, Mingari MC, Moretta L, et ai. (2012) dendriittisolujen Leikkaus Aktivoidut Natural Killer Cells seuraa entistä Suojaava Cancer-immuunivasteen. PLoS ONE 7 (6): e39170. doi: 10,1371 /journal.pone.0039170

Editor: Francesco Dieli, University of Palermo, Italia

vastaanotettu: 19 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 16 toukokuu 2012; Julkaistu: 19 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Morandi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut Associazione Italiana Ricerca sul Cancro https://www.airc.it) IG5624 ja IG11650 GF ja IG 8862 RSA; by Ministero Italiano della Salute – Programma Strategico Ricerca Oncoloaica (https://www.ministerosalute.it/) GF; by Fondazione Cariplo 2008-2230 (www.fondazionecariplo.it) ja Ministero Italiano dell ’Istruzione, Universita ”, Ricerca, – Progetto Rilevanza Nazionale (https://prin.miur.it/) 2008-WXF7KK RSA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Natural Killer (NK-soluja), jotka on alun perin tunnistettiin imusoluja, jotka kykenevät hajottamaan useita tuumorisolulinjoja puuttuessa edellisen stimulaation

in vivo

tai

in vitro

[1] – [3], on nyt arvostetaan monitoiminen synnynnäisen immuunijärjestelmän solut [4] – [6]. Niiden aktivointi ohjaa tasapaino antamia signaaleja eri ryhmät aktivoivat [7] ja estävä reseptorit [8] – [11], jälkimmäinen tunnustetaan MHC-luokan I molekyylien kohdesoluihin.

Äskettäin avain rooli osuuskunta vuoropuhelua DC ja luonnollisten tappaja (NK) solujen laukaisee immuunivasteen on syntynyt [12] – [17]. On osoitettu, että niiden vuorovaikutus johtaa kaksisuuntainen aktivointi ja kehittämiseen Th1 ja CTL-välitteisen vasteen [18] – [21]. Ihmisillä vähintään

in vitro

, tämä cross-talk myös johtaa hajoamiseen epäkypsien DC: iden, kun taas kypsät DC: suojataan [13], [15]. Aktivoivan reseptorin NKp30 ja DNAM-1 ovat kriittisiä reseptoreita DC hajoamista, kun taas vastustuskyky hajoamista välittävät säätely ylöspäin MHC-luokan I molekyylien aikana DC-kypsymisen [15], [22] – [24].

perusteella nämä in vitro löydökset, on ehdotettu, että tappaminen epäkypsiä DC NK-solujen tulisi edistää selviytymistä kaikkein immunogeenisten DC (eli kypsä DC), joka suosii aloittamisesta tehokkaan ja suojaavan immuunivasteen [25] – [27].

in vivo

, DC /NK-solu-vuorovaikutuksia voisi tapahtua imukudoselimissä sekä non imukudoksissa [28]. Siirrettiin adoptiivisesti,

ex vivo

syntyy, epäkypsien DC: iden on raportoitu poistetaan nopeasti, NK-solujen välityksellä TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) [29], [30]. Samoin on osoitettu, että transplantaation alloreaktiivisten NK-solut voivat estää T-solun välittämä Käänteishyljintä poistamalla vastaanottavan DC [31], [32]. Aikana krooniset virusinfektiot, poikkeava DC herkkyys NK-solujen lyysin johti kertymistä heikosti immunogeenisiä DC imusolmukkeissa, mikä aiheuttaa progressiivinen immuunijärjestelmän toimintahäiriö [33]. Toisaalta, DC lyysi NK solut voitaisiin myös säädellä negatiivisesti kesto virus-spesifisten T-soluvasteiden

in vivo

rajoittamalla altistumista T-solujen tartunnan antigeeniä esitteleviä soluja [34].

kuitenkin DC tappaminen autologiset NK-solujen

in vivo

ei ole suoraan osoitettu päivämäärä ja Ilmiön merkitystä lysis aikana fysiologinen immuunivasteen vielä arvioida.

useita

in vivo

malleissa ovat osoittaneet, että NK-solu tunnistaa MHC-luokan I-puutosta kohdesoluja johtaa tehostetun sukupolven CTL: ien kasvaimia vastaan ​​[21], [35]. Näissä kokeellisissa malleissa, aktivoitu NK solut tuottavat sytokiineja, jotka puolestaan ​​näyttävät ensin edistää DC aktivointi ja sen jälkeen suojaava CTL vastaan ​​vanhempien kasvaimia. Tämä sai meidät tutkimaan, onko aikana suojaavan immuunivasteen kasvaimia, aktivoitu NK-solujen voi myös valita immunogeenisemmiksi osajoukko DC. Osoitamme tässä, että DC editointi tapahtuu

in vivo

ja että tämä ilmiö on avainasemassa kasvainten CTL kehitystä ja hiiret eloonjäämisen hiirimallissa kasvaimen rokotuksen.

Tulokset ja keskustelu

aktivointi NK solut perifeerisissä kudoksissa Seurauksena perforiinin riippuva vähennys DC sisältö imusolmukkeet

Hiiret rokotettiin sc YAC-1, joka on MHC-puuttuu solulinja, kuin NK-solujen kohde kykenee indusoimaan NK-solujen aktivoitumisen. 36 tunnin kuluttua DC: itä, jotka ovat peräisin sekä viemäröinti ja controlateral LN analysoitiin. Kuten kuviossa 1, sekä prosenttiosuus ja absoluuttinen määrä CD11 c

+ DC dramaattisesti vähentynyt tyhjennys LNS verrattuna controlateral LNS (p = 0,0029 prosenttiosuuden ja p = 0,007 varten absoluuttinen määrä).

In vivo

ehtyminen NK-solujen ruiskuttamalla anti-asialo-GM1 monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) palautuneet tätä ilmiötä, mikä vahvistaa merkittävä rooli NK-solut. Vuonna tyhjennys LNS NK solujen köyhdytettyä hiiret, sekä prosenttiosuus ja absoluuttinen määrä CD11 c

+ DC olivat verrattavissa controlateral LNS, mikä osoittaa, että NK-solut on mukana lasku DC. Anti-asialo-GM1-mAb hoito vähensi vähintään 80% NK-solujen (kuvio 1, B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että lasku DC määrän havaittu tyhjennys LN oli NK-solun riippuvia ja ilmeisesti seurauksena NK-solujen aktivaation tunnistaessaan MHC-vailla soluissa.

V: edustaja analyysit mononukleaarisolut eristettiin joko tyhjennys tai controlateral (kontrolli LN) hiirten imusolmukkeista köyhdytettyä tai NK-solujen (tyhjennys LN + anti-asialo-GM1). B: NK-soluja tehokkaasti köyhdytetty hiirissä annettaessa anti-siaalihappoa GM1 mAb: t. C: prosenttiosuus (vasemmalla) ja absoluuttinen määrä (oikea) DC: iden joukossa mononukleaaristen solujen eristetty imusolmukkeista. Bars edustaa keskiarvot ja SD viiden itsenäisen kokeen (kolme hiirtä ryhmää kohti). ** = P 0001; * = P 0005.

Yksi mahdollinen selitys havaittu vähentämiseksi DC solujen määrä upon NK-solujen aktivaation on vapauttaa tiettyjen sytokiinien, NK-solut, pystyvät vaikuttamaan selviytymisen DC tai niiden kykyä siirtyä reunoilta LN. Vaihtoehtoisesti NK-solut voivat vaikuttaa määrää DC in tyhjennys LN suoralla hajoamiseen.

Valaistaan ​​taustalla oleva mekanismi lasku DC numeroita, me toisti saman kokeen Perforiinin knockout (pFN

– /- ) hiirillä, koska Perforiinin on keskeinen molekyyli NK-solujen sytotoksisuutta. Vuonna pFN

– /- hiirillä ei ollut eroja määrä ja prosenttiosuus CD11 c

+ DC löytyy tyhjennys ja controlateral LNS (ei kuvassa). Nämä tiedot viittaavat siihen, että perforiini riippuva sytotoksisuus saattaa merkitä väylän NK-solun riippuvainen lasku LN DC.

NK Cell Activation valitsi imusolmukemääritysmenetelmä DC Higher T Cell aktivointi Capability

NK-solut on osoitettu tappavan epäkypsiä DC:

in vitro

[13], [15]. Yksi tulkinta on nimenomaisesti tappamista terveitä autologisia soluja NK-solujen oli NK-soluissa saattaa toimia valvoa laatua DC meneillään kypsymisen [26]. Tämä hypoteesi merkitsee sitä, että NK-solut estäisi eloonjäämisen vähemmän immunogeenisiä epäkypsien DC: iden, joka aiheuttaa sopimatonta, alhaisen affiniteetin T-solun esikäsittely, mikä lopuksi johtaa tilassa tolerisaation. Lopputuloksena tästä DC muokkausta välittyy NK-solujen voisi siten olla valinnan immunogeenisempiä DC, koska poistaminen DC jotka eivät välittävän optimaalinen T-solujen esikäsittely.

Sen tarkistamiseksi, onko tämä mekanismi on toiminnallisesti merkityksellisiä in vivo, testasimme DC pysyviä tyhjennys LN jälkeen NK-solujen muokkauksen olivat phenotipically ja toiminnallisesti immunogeenisemmiksi. Hiiriryhmät, jotka olivat joko NK-solujen köyhdytettyä tai inokuloitiin s.c. YAC-1-soluissa. 36 tunnin kuluttua DC: iden tyhjennys- ja controlateral imusolmukkeet analysoitiin ilmentymisen kostimuloivien molekyylien ja kypsymisen markkereita, kuten CD40, CD80, CD83, CD86 virtaussytometrialla ja IL12p35, IL-12p40 ja IL23p19 mRNA reaaliaikaisella PCR: llä . Lisäksi olemme arvioineet DC pysyviä tyhjennys LN upon NK-solujen muokkaus esitetään korkeampia T-solu aktivoimalla ominaisuus. Pernasoluja C57BL /6-hiiristä stimuloitiin DC: iden järjestetty imusolmukkeista BALB /c-hiiriä, joihin injektoitiin YAC-1-soluja 24 h ennen imusolmuke poisto. Kuusi päivää myöhemmin, määrä proliferaatiota arvioitiin menetys CFSE väriainetta. Vaikka merkittäviä eroja varten analysoitiin pinnan molekyylejä tai sytokiinien ei ollut havaittavissa (ei esitetty), allogeenisiä T-solujen lisääntyminen väheni merkittävästi, kun DC: iden NK-solujen vähennetty hiiriä käytettiin ärsykkeen (kuvio 2). Nämä tulokset osoittavat, että NK-solun välittämää lasku DC numero edustaa toiminnallisesti merkitykselliset

in vivo

mekanismi, jonka avulla enemmän immunogeeninen DC tehokkaasti valittu. Todellakin, seuraavien reunaehtojen NK-solujen aktivoitumisen, DC sisältämät tyhjennys LNS niiden määrä oli vähäinen, mutta jolla on voimakkaampi T-solujen aktivoivat vaikutukset.

imusolmukkeiden DC hiirten ihon alle MHC

negcells lajiteltiin ja viljeltiin allogeenisten pernasolujen aiemmin merkitty CFSE. V: pernasoluja viljeltiin yksinään (ei ärsyke) tai 10% hyvin puhdistettua imusolmuke DC hiiristä NK soluköyhiä (10% DC tyhjennys LN + anti-siaalihappoa GM1) tai ohjaus (10% DC tyhjennys LN) ennen antamista MHC -negatiivinen kohdesoluja. CFSE laimennus pernasolujen 6 päivän viljelyn on esitetty. NK soluvajeeseen vaarantaa induktion lisääntymistä LN DC. Tiedot edustavat neljää itsenäistä koetta yhteenveto paneeli B: ▪ = 10% DC tyhjennys LN; ▴ = 10% DC tyhjennys LN + anti-asialo GM1. * = P 0,02.

editointi DCitä NK solut Edistää antigeenispesifisiä T Cell laajeneminen että suojaavan immuunivasteen aikana Cancer Cell Rokotus

Tuloksemme osoittavat, että

in vivo

NK-solujen aktivaation johtaa perforiini riippuva väheneminen LN dendriittisolujen, joka liittyy läsnäolo immunogeenisemmiksi DC tyhjentämiseen LN. Siksi siitä, oliko se johtaa enemmän suojaava adaptiivista immuunivastetta syöpäsolun rokotuksen malli. Ryhmät hiiriä, jotka olivat joko läpikäynyt NK-solujen poistamista tai mock hoitoa, injektoitiin s.c. MHC-vailla solujen (eli YAC-1-solut) ja TS /A-soluja, NK-solujen kestävä nisärauhassyöpä kasvainsolulinja. Kontrolleina, ryhmää hiiriä injektoitiin joko TS /A tai YAC-1-soluja yksinään. Kolmen viikon kuluttua pernat otettiin talteen ja solut stimuloitiin uudelleen viljelmässä TS /A-tuumorisolujen tai AH1-peptidi, joka on immunodominantti MHC-luokan I rajoitettu epitoopin TS /A gp70env antigeeni [36], [37]. Pernasoluja hiiristä, jotka oli injektoitu TS /A plus YAC-1-solut osoittivat merkittävästi suurempi määrä IFN-γ tuottavat solut stimuloitaessa verrattuna NK-solut oli poistettu hiiriä tai verrokkihiiriin (p 0,05 ja 0,01) (kuvio 3 A). Nämä tiedot osoittavat, että hajoamista DC aktivoitujen NK-solujen tukee laajentamista antigeenispesifisten T-lymfosyyttien

in vivo

. Ei lisätä IFN-γ tuottavien solujen havaittiin, kun viljelmiä stimuloitiin uudelleen YAC-1-soluissa, mikä osoittaa, että kasvu IFN-γ tuottavien solujen ei liittynyt NK-solujen aktivoitumisen. Lisäksi, -uudelleenstimulaation joko TS /A: n tai niiden immunodominantin MHC-luokan I-rajoitettu epitoopin AH1 indusoi Samanlainen nousu IFN-γ tuottavien pernasolujen, mikä osoittaa, että ne olivat pääasiallisesti edustaa MHC-luokan I-rajoitettuja sytotoksisia T-lymfosyyttejä (CTL).

: Hiiret inokuloitiin immunogeenisten TS /A-solut, TS /A-solut sekoitettiin MHC puuttuu soluja (YAC-1) tai YAC-1-soluja yksinään. Ryhmässä hiiriä, anti-asialo-GM1-mAb: t annettiin i.p. 48 h ennen antoa solurokotteet heikentävistä NK-solujen. Jälkeen 21 päivää, pernasoluja stimuloitiin uudelleen joko TS /A-solut, TS /A MHC-luokka I-rajoitettuja immunodominantin peptidin AH1 tai YAC-1-soluja ja taajuudet IFNy-tuottavien solujen määritettiin ELISPOT-määrityksellä. Merkittävä lisäys antigeenispesifisen IFNy-tuottavia soluja ei ollut havaittavissa rokotetut hiiret TS /A sekoitettiin YAC-1-soluja (TS /A + YAC-1). Kasvu antigeenispesifisten CTL kumottiin, kun hiiret oli köyhdytetty NK-solujen ennen rokotusta (TS /A + YAC-1 + anti asialo-GM1). B: Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin Perforiinin KO hiirillä (pFN

– /-) ja rinnakkain villityypin (WT) hiirillä. Merkittävä pienempi määrä TS /A kasvain-spesifisen CTL: indusoitiin rokotuksen perforiini KO-hiirissä verrattuna villityypin hiiriin. Pylväät edustavat keskiarvoja ja SEM saatujen tulosten kolmen erillisen kokeen (kolme hiirtä ryhmää kohti). ** = P 0001; * = P 0005.

Valaistaan ​​onko NK-solujen apua CTL laajeneminen oli itse asiassa liittyvät NK soluvälitteinen DC hajoamiseen, asetamme samassa kokeessa käyttäen ryhmiä pFN

– /- hiirissä, jotka puute NK-solujen sytolyyttinen aktiivisuus. Pernasolut pFN

– /- hiiret injektoitiin TS /A sekä MHC-negatiivisia soluja YAC-1 sisälsi huomattavasti pienempi määrä IFN-γ tuottavien T-solujen verrattuna villityypin hiiriä, jotka injektoitiin myös TS /plus YAC-1 (kuvio 3, B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että NK-solun välittämää perforiini-riippuvainen, hajoamista DC: iden on rooli optimaalisen sukupolven antigeenispesifisten T-solujen. Kuitenkin esillä olevat tulokset tarjoavat myös, ainakin osittain, vaihtoehtoinen tulkinta, eli että NK-solut voivat suoraan edistää DC kypsymistä, todennäköisesti vapauttamalla pro-inflammatoristen sytokiinien (esim TNF-α), kuten aiemmin on osoitettu [21], [ ,,,0],35]. Itse asiassa perforiini-hiirillä, aktivointi anti-kasvain T-soluja ei ollut yhtä alhainen kuin havaittu NK-solujen, köyhdytettyä hiirillä käyttäen anti-asialo hoitoon (kuvio 3, A). Näin ollen parannettu antigeenispesifisen T-soluvasteen, havaittavissa, kun NK-solun välittämä DC editointi voisi edustaa tuloksista sekä DC tappamisen ja sytokiini-välitteisen DC aktivaation.

Lopuksi havaittiin myös, että rokotus säteilytetyillä TS /A solut ja YAC-1-soluissa johti merkittävään kasvuun selviytymisen hiirten haasteen jälkeen tappavalla annoksella TS /A-solut (kuva 4). 60% hiiristä ennalta ruiskutettiin säteilytettyjen TS /A plus YAC-1 selvisi jo 8 viikon kuluessa kasvain haaste ottaa huomioon, että saman aikavälin, vain 20% joko NK cell-köyhdytettyä hiirillä tai hiirillä ennalta ruiskutettiin säteilytettyjen TS /A pelkät solut selvisivät kasvain haaste. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat käsitystä, että NK-solujen aktivaation indusoiman MHC-negatiiviset solut voivat edistää enemmän suojaavan immuunivasteen aikana syöpäsolun rokotus.

Hiiret rokotettiin immunogeenisen kasvainsolujen yksinään (TS /A) kasvainsolut sekoitettiin MHC-negatiivinen ells (TS /A + YAC-1) tai MHC-negatiiviset solut yksinään (YAC-1) (viisi hiirtä per ryhmä). Ryhmässä hiiriä, anti-asialo-GM1-mAb: t annettiin i.p. 48 h ennen antoa solurokotteet heikentävistä NK-solujen. Jälkeen 21 päivää, hiiret altistettiin tappavan annoksen kasvainsolujen ja seurattiin kasvaimen kasvua kaksi kertaa viikossa kahden kuukauden ajan. Hiiret, jotka rokotettiin kasvainsolujen sekoitettiin MHC-negatiiviset solut (TS /A + YAC-1) osoitti viivästymistä kasvaimen kasvun ja silmiinpistävä selviytymisen TS /A syöpäsolun haaste. Tämä suojaava vaikutus kumoutui, kun hiiret köyhdytettyä NK-solujen (TS /A + YAC-1 + anti-siaalihappoa GM1).

loppuhuomautuksista

Olemme täällä osoittaneet, että NK solut voivat saada DC muokkaus

in vivo

. NK-solujen aktivoinnin yhteydessä MHC-luokan I vailla soluja, hankkia kyky valita kaikkein immunogeeninen myelooisen DC tyhjentämiseen LNS kautta perforiini riippuvaisen mekanismin. Vaikka nykyinen tiedot eivät muodosta virallisia todisteita suoraan NK soluvälitteisen sytotoksisuuden DC, kumoamisen ilmiön pFN

– /- hiirillä saattaisi merkitä suoraan DC hajoamiselle NK-solujen.

Yllättävää kyllä, tämä otaksuttu tappaminen johtaa valintaan immunogeenisempiä DC, jolle on ominaista suurempi kyky indusoida proliferaatiota allogeenisten T-solujen. Niinpä sen lisäksi, että suora stimulaatio DC välittämien NK solujen julkaissut sytokiinien, NK solut voivat edistää T-solujen aktivaation valitsemalla kaikkein immunogeeninen DC.

tyypin tunnistamisen NK-solujen vastuussa muokkausta, sekä sivustot, joissa DC tappaminen väitetään tapahtuu, on vielä tunnistettu. Tässä yhteydessä on mahdollista, että tämä tapahtuma voi tapahtua kehän, jossa NK-solut, joissa on suurempi sytolyyttinen aktiivisuus kuin niillä, jotka havaitaan imusolmukkeissa. Toisaalta, emme voi sulkea pois, että tietyissä olosuhteissa (esimerkiksi sytokiini myrsky), imusolmukkeesta NK-soluja voisi siirtyä niiden toiminnallinen fenotyyppi ja hankkia korkeamman sytolyyttinen potentiaali, kuten aiemmin ehdottanut [38]. Vaihtoehtoinen mahdollisuus on, että reuna-NK-solujen näyttämällä korkea sytolyyttinen aktiivisuus voisi siirtyä imusolmukkeisiin aktivoinnin jälkeen ja hankkiminen asianmukaisia ​​kemokiinireseptoreita, ehdottivat viimeaikaiset raportit [39] – [41].

Vuorovaikutus aktivoidun NK soluja ja DC on merkitystä myös luoda suojaavan immuunivasteen. Mallissa syövän rokotuksen antamisen kasvainsolujen kanssa NK aktivoivan MHC-puuttuu soluja, kasvattivat laajennus kasvain-spesifisten CTL: ien, jotka johtavat parempaan hiirten eloonjääntiin haasteen jälkeen tappavan annoksen syöpäsoluja. Ehtyminen NK-solujen alentunut tämä kasvain-spesifisen T-soluvasteen sekä sen suojaava rooli vastaan ​​kasvaimen haaste. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että

in vivo

, NK-solut voivat muokata DC optimaalista sukupolven adaptiivista immuunivastetta tehokkaan valinnan immunogeenisemmiksi DC. Lopuksi, meidän tiedot viittaavat myös siihen, että syöpäsolujen rokotteita voidaan parantaa, joilla pyritään NK-solujen aktivaation, kuten käyttö NK-herkkien syöpäsolujen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines, eläinmallissa ja koeolosuhteet

TS /A nisärauhassyöpä hiiren solulinjassa [36] (ystävällisesti PL Lollini, University of Bologna, Bologna, Italia) viljeltiin DMEM /10% FCS (Cambrex, Charles city, IA, USA). YAC-1 (ATCC TIB-160) [42] oli sen sijaan viljeltiin RPMI 1640/10% FCS (Cambrex, Charles City, IA, USA). 5-8 viikkoa vanhat naaraspuoliset villityyppi BALB /c (H-2K

d) hiiriä ja villityypin C57BL /6 (H-2

b) hiiret hankittiin Harlan (Udine, Italia). Perforiinin

– /- hiirillä (CByJ.B6-Prf1

tm1Sdz /J) hankittiin The Jackson Laboratory (Bar Harbour, ME).

Hiiret ihonalaisesti (sc) ruiskutettiin 2 x 10

6 säteilytetty (20,000 rad) YAC-1-soluissa tai, jos merkitty, joko säteilytettyjen TS /A kasvainsoluja yksinään (5 x 10

5) tai säteilytettyä TS /A kasvainsoluja (5 x 10

5) sekoitettiin säteilytettyjen YAC-1-soluja (2 x 10

6). Eläimet, joille

in vivo

NK soluvajeeseen sai kolme intraperitoneaalisen (ip) injektioita anti-asialo-GM1-vasta-aineita (anti-NK kanin seerumi, 200 ul /hiiri 1:10 laimennettua kantaliuosta, Wako) päivinä -2 /0 /+ 1, kuten aiemmin on kuvattu [43] (päivä 0 oli päivä solujen rokotusta. kasvaimen haaste tehtiin kolme viikkoa rokotuksen jälkeen kasvaimia annoksella 5 x 10

4 TS /A kasvainsoluja. kasvaimen kasvu ja koko mitattiin kaksi kertaa viikossa käyttämällä paksuus. Injection YAC-1 BALB /c on allogeeninen järjestelmä, mutta ei ole niin MHC-luokan I ja luokan II ilmentymistä YAC-1-soluissa minimoi mahdolliset alloresponse. eläimiä majoitettiin patogeenittomassa siirtomaa ja kokeet suoritettiin mukaan National asetus eläinten Tutkimus Resurssit ja hyväksynyt Review Board Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova.

imujärjestelmäelinten Cell eristäminen

nivusimusolmukkeista (LNS) kirurgisesti irrotettiin ja kerättiin RPMI 1640/10% FCS. Ne leikattiin pieniksi paloiksi käyttäen partakoneen teriä ja pilkottiin 2 mg /ml kollagenaasia D ja 30 ug /ml DNaasi I (Roche, Mannheim, Saksa) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Yhden solun suspensiot valmistettiin suodattamalla 70 um: n solusiivilän (BD Labware, San Jose, CA, USA). CD11 c

+ solut eristettiin positiivinen valinta käyttäen anti-CD11 c mikrohelmiä ja magneettinen erotin (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa). Pernasoluja erotettiin mekaanisesti dissosiaation ja suodos läpi 70 um solusiivilän (BD Labware). Erytrosyyttien spleenic valmisteissa poistettiin hypotoninen lyysissä NH

4cl /KHCO

3 /EDTA.

Vasta-aineet ja virtaussytometria

Eläimet, joille

in vivo

NK soluvajeeseen sai kaksi ip injektiot anti-asilao GM1 päivänä -2/0 (anti-NK kanin seerumi, 200 ul /hiiri 1:10 laimennettua varastoliuosta, Wako Neuss, Saksa). 36 tunnin välillä injektion, imusolmukkeet LNS otettiin talteen ja solususpensiot saadut leimattiin anti-CD11 c, anti-DX5, anti-CD40, anti-CD80, anti-CD86 ja anti-MHC-luokan II (kaikki eBioscience, San Diego , CA), ja analysoitiin virtaussytometrialla (FACS Canto II, BD).

proliferaatiotestillä

proliferaatiomäärityksessä, pernasolut B6-hiiret leimattiin 5 uM karboksifluoreseiini sukkinimidyyliesteri (CFSE ) PBS: ssä plus 0,1% BSA 10 min 37 ° C: ssa. Sen jälkeen kun oli pesty PBS: llä plus 0,1% BSA, soluja inkuboitiin allogeenisten CD11 c DC lajiteltu valumisen LN injektoitujen hiirten kanssa YAC-1-solut, jotka oli tai ei ollut tehty NK soluvajeeseen. DC: eitä pestiin perusteellisesti PBS ennen kulttuuri T-solujen kanssa. 6 päivän jälkeen, CFSE fluoresenssi arvioitiin CD3

+ solujen virtaussytometrialla.

Entsyymi immunospot määritykset

taajuudet IFN-γ-tuottavien pernasolujen rokotetuista eläimistä oli määritetään sen jälkeen kolmen viikon entsyymi immunospot (ELISPOT) määritys suoritettiin pernasolua. Multiscreen-IP-levyt (Millipore, Bedford, MA ja BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) päällystettiin yön yli 10 ug /ml anti-IFN-γ mAb PBS: ssä (Endogen, Woburn, MA ja BD Pharmingen, San Jose , CA, USA). Sitten levyt pestiin RPMI 1640: llä ja blokattiin 3 tuntia PBS-2% naudan seerumin albumiinia. Pernasolut laskettiin täydellisessä RPMI 1640 ja ympättiin sitten 2-kertaista sarjalaimennosta alkaen 4 x 10

5 solua kuoppaa kohti kahtena kappaleena, läsnä ollessa tai poissa ollessa: (i) säteilytetty (20000 rad) TS /A kasvainsoluja; (Ii) YAC-1-soluja (molemmat 10:01 efektori /stimulaattori solu-suhde); (Iii) endogeenisen retroviruksen gp70-peräisen AH1 peptidi, 9-aminohappo H-2L

d-rajoitettu peptidi (SPSYVYHQF, syntetisoida INBIOS S.r.l., Napoli, Italia) loppupitoisuudessa 10 ug /ml. AH1 on immunodominantille CD8-antigeeni ilmentyy pinnalla TS /A syöpäsolulinjoissa [37]. Milloin on osoitettu, solujen stimulaatio saatiin myös PMA: lla ja ionomysiinillä loppupitoisuudessa 50 ng /ml ja 500 ng /ml, vastaavasti (SIGMA). 40 tunnin inkuboinnin jälkeen levyt pestiin PBS-0,05% Tween 20 ja inkuboitiin 1 ug /ml biotinyloitua toissijainen mAb IFN-γ (Endogen ja BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) PBS-1% naudan seerumin albumiini 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua streptavidiinia (1:5,000) lisättiin sitten 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen levyjä värjättiin AEC-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (Sigma ja BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) ja täplät laskettiin käyttämällä stereomikroskooppia. A 2-kertainen nousu määrän paikkoja valvomisessa (splenosyytit viljelty ilman ärsyke) katsottiin myönteisen vastauksen. Tiedot ilmaistiin useita pilkkuja muodostavien solujen miljoonasosaa pernasolujen.

Tilastollinen analyysi

tilastollista merkitystä erojen arvioitiin Studentin t-testiä tai Mann Whitneyn testi käyttäen Prism Graphpad ohjelmistoa ( GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Kaikki virhepalkit edustavat SEM.