Krooninen sairaus

tiivistelmä

samanaikaisesti analysoida mutaatioita ja ekspressiotasot useiden geenien yhdelle havaitseminen alustan ehdotimme menetelmä kutsutaan ”multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus-digitaalinen vahvistus yhdistettynä hydrogeelin helmi-array” (MLPA-Daba) ja soveltanut sitä diagnosoimaan peräsuolen syöpä (CRC). CRC-solut ja kudokset otettiin näytteet poimia nukleiinihapon, suorittaa MLPA jolla on sekvenssi-varustetun koettimen, suorittaa digitaalinen emulsio polymeraasiketjureaktio (PCR), ja tuottaa hydrogeeliä helmi-array immobilisoimiseksi helmiä ja muodostavat yhden helmi kerros array. Hybridisaation jälkeen fluoresoivilla koettimilla, määrä helmiä, joka heijastaa runsaasti ilmentyvien geenien ja mutaationopeus, laskettiin diagnoosin. Vain punainen tai vihreä helmiä tapahtunut pelimerkit sekoitettu näytteistä, mikä osoittaa onnistumisen yhden molekyylin PCR. Kun yhden lähteen Näyte analysoitiin käyttäen sekoitettua MLPA koettimia, helmiä vain yksi väri on tapahtunut, mikä viittaa korkean spesifisyyden menetelmän analysoida CRC mutaatio ja geenin ilmentymistä. Geeniekspressioanalyysissä CRC kudoksen yhden CRC potilaan mutantti osuus oli 3,1%, ja ekspressiotasot CRC liittyviä geenejä olivat paljon korkeammat kuin normaalin kudoksen. Erittäin herkkä MLPA-Daba onnistuu suhteellisen kvantifioinnin mutaatioiden ja geeniekspressioiden kuorituista solujen ulosteesta näytteitä CRC potilaiden samalle sirulle alustalla. MLPA-Daba yhdistettynä hydrogeelin helmi-array on lupaava menetelmä ei-invasiivisia diagnoosi CRC.

Citation: Huang H, Li S, Sun L, Zhou G (2015) Digitaalinen havaitseminen Multiple Vähem- Mutants ja ekspressiotasot Multiple peräsuolen syöpään liittyvien geenien Digitaalisten-PCR Yhdessä Helmi-Array. PLoS ONE 10 (4): e0123420. doi: 10,1371 /journal.pone.0123420

Academic Editor: Ken Mills, Belfastin yliopisto, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 17 joulukuu 2014; Hyväksytty: 23 helmikuu 2015; Julkaistu: 16 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: National Science Foundation of China (Grant nro 21305069 ja 21275161) rahoittanut päätöstä julkaista ja valmistelu käsikirjoituksen. Training hanke Nuoria kykyjä Jiangsun maakunnassa äidin ja lapsen terveys sairaala (FRC201302) rahoitti tietojen keruun ja analysoinnin. Jiangsun maakunnassa Clinical Science Teknologia Special Project (SBL2012061) rahoitti tutkimuksen suunnittelu.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja toiseksi yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti [1]. Kiinassa CRC on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten syöpien ja on korkea kuolleisuus. Perinteisesti CRC diagnoosi käyttää Dukes luokitusjärjestelmä, joka luokittelee syöpä vaiheisiin A, B, C tai D. liittyvät tiedot osoittavat, että 5-vuoden eloonjäämisluvut postoperatiivisten CRC potilaat ovat 81-85% vaiheessa A, 64- 78% vaiheessa B, 27-33% vaiheessa C, ja 5-14% vaiheessa D; Siksi, varhainen diagnoosi CRC ja jälkikäsitellään voi tehokkaasti lisätä selviytymismahdollisuuksia. Varhainen seulontatestit ovat avainasemassa varhainen diagnosointi CRC ja parantaminen eloonjäämisluvut [2]. CRC seulontatestit sisältävät menettelyjä, kuten kolonoskopia, ulosteen piilevän veren testi, ja fibersigmoidoscopy [3]. Vaikka nämä menetelmät ovat hyviä kliinisiä tuloksia, niillä on myös haittoja. Esimerkiksi invasiivisia saattaa helposti aiheuttaa verenvuotoa ja rei’itys ja herkkyys ja spesifisyys jotkut menetelmät ovat riittämättömiä; siksi, kehittäminen yksinkertainen, noninvasive lähestymistapaa korkea herkkyys ja spesifisyys on tarpeen varhaiseen diagnosointiin CRC.

Viimeaikainen nopea kehitys molekyylibiologian mahdollistavat suorittaa varhaisen invasiivisen diagnosointi CRC by herkästi analysoimalla kuorinnan solujen ulostenäytteissä CRC potilaista. Koska oncogenesis CRC, johon liittyy vuorovaikutus useiden geenien, on monivaiheinen prosessi [4], kuten aktivointi esikasvaintekijöiden ja inaktivointi tuumorisuppressorigeeneille, yhden geenin havaitseminen menetelmä usein misdiagnoses tauti; Näin ollen yhdistetty havaitseminen useiden geenien on hyödyllistä lisätä määrä positiivisia diagnooseja taudin. Esiintyminen ja kehittäminen CRC usein liittyy geenimutaatio ja muutoksia geenien ilmentyminen [5]; siksi, CRC diagnoosi edellyttää havaitsemista näiden toimien [6-11]. Vaikka DNA: n sekvensointi tekniikka on klassinen menetelmä, jolla geenin mutaatiot havaitaan, se ei voi analysoida näytteet, joissa useita mutaatioita on 20% [12]. Havaitsemiseksi geenimutaatioita matalalla tasolla alkuvaiheessa syöpien, joka on EndoV /ligaasia perustuva mutaatio skannaus menetelmä kehitettiin toteamisraja 1,0% [13]; kuitenkin, menetelmä ei kykene havaitsemaan mutantteja (müts) at paljon vähemmän, koska sen kvantitatiivisen analyysin perusteella analoginen signaali. Vaikka digitaalinen analyysi, jota kutsutaan säteilevä [14,15], on kehitetty havaitsemaan müts on erittäin alhaiselle tasolle (0,1% MutS), virtaussytometri käytetty prosessi on kallis ja vain yksi geeni on havaittu yhdessä oikeudenkäyntiä. Koska sen korkea herkkyys ja korkea spesifisyys, kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) pidetään paras menetelmä, jolla geenin ilmentymistä voidaan analysoida; kuitenkin, koska rajallinen määrä fluoresoivia markkereita, qPCR ei sovellu analysoida useita geenejä saman reaktion. Vaikka DNA-siru voi samanaikaisesti analysoida useita geenejä, ongelma on edelleen alhaisen toteamisrajan ja huono määrällisiä suoritusten analysointiin syöpään liittyvien geenien ilmaisi alhaisilla tasoilla varhaista diagnosointia CRC. Lisäksi, vaikka yhdistetty analyysi mutaatioiden ja syöpään liittyvien geenien ilmentyminen voi lisätä tarkkuutta ja herkkyyttä CRC diagnoosin, lähes kaikki raportoitu tekniikoita sovelletaan vain yksi kenttä havaita joko mutaatioista tai geenin ilmentymistä.

Tässä ehdotimme menetelmä kutsutaan ”multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus-digitaalinen vahvistus yhdistettynä hydrogeelin helmi-array” (MLPA-Daba), jonka mutaatiot ja ekspressiotasoja useiden geenien alhaisilla tasoilla voidaan samanaikaisesti analysoida yhdellä havaitsemiseen alustalla. Perustuen aiempaan työhön [3,16,17], tekninen alusta MLPA-Daba kehitettiin parantamalla seuraavat kolme näkökohtaa: ensinnäkin MLPA sijasta tavanomaisia ​​PCR tai kohde rikastettu multiplex PCR (Tem-PCR), käytettiin valmistella malleja yhteisiä päät; Toinen, mutaatiot ja ilmaisujen useiden geenien, sen sijaan, että vain yksi tai muut, lisättiin samanaikaisesti mitataan teknisen alustan muuttamalla suunnittelu erityisten MLPA koettimia; kolmanneksi, väriaine-vapaa ja geenispesifiseen MLPA antureista, eikä kalliiden ja geenispesifiseen fluoresoivia koettimia, käytettiin merkitse useita müts ja syöpään liittyvien geenien. Ongelmat epävarmojen määrä väriaine-leimattua deoksinukleotiditrifosfaattien (dNTP) sisällyttää DNA-juosteen ja välinen kilpailu Ekstensioreaktion ja hybridisaatioreaktio tarkoitetut aikaisempien töiden ratkaistiin; Näin ollen, korkea spesifisyys, alhaiset kustannukset ja korkea stabiilisuus menetelmän saavutettiin. Menetelmää sovellettiin onnistuneesti CRC diagnoosin analysoimalla ilmentymistä viisi geeniä (

β-aktiini

,

C-myc

,

H-ras

,

CD44v6

,

Cox-2

, ja

N-ras

) ja kolme mutaatio loci APC geenejä (kodonit 1406, 1338, ja 1356) CRC kudoksiin, CRC soluja, ja uloste näytteitä CRC potilaista. Tulokset osoittavat, että menetelmä voi olla tehokas väline varhaisessa diagnosoinnissa CRC.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

N-hydroksisukkinimidiesteri (NHS) aktivoitujen sepharose HP affiniteettipylvääseen ja dNTP: t ostettiin Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Taq

DNA-polymeraasi oli Promega (Madison, WI). DC 5225C Formulointi Aid ja DC 749 Fluid hankittiin Dow Chemical Co. (Midland, MI). Ar20 Silicone Oil saatiin Sigma (St. Louis, MO). SuperScript III käänteiskopioijaentsyymi- ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Amplicase ostettiin Epicenter (Madison, WI). Muut kemikaalit olivat kaupallisesti extra-puhdaslaatuista. Kaikki liuokset valmistettiin deionisoitua ja steriloitua vettä.

sekvenssit alukkeiden ja koettimien

Amiini modifioitua aluketta (5′-NH

2-TTT TTT TTT TCC ATC TGT TGC GTG CGT GTC-3 ’) syntetisoitiin Takara Biotechnology Co., Ltd (Dalian, Kiina). Kaikki muut alukkeet syntetisoitiin Invitrogen Inc (Shanghai, Kiina). Pari yhteisten alukkeiden, yhteinen-1 (5’-CCA TCT GTT GCG TGC GTG TC-3 ’) ja yhteiset-2 (5′-CCT TGG CAA TCA GGC GAA TC-3′) käytettiin monistamaan MLPA tuotteita. Geenispesifisillä MLPA koettimien tunnistamiseksi mutantit on lueteltu taulukossa 1. geenispesifisillä MLPA koettimien analysoimiseksi geeniekspression lueteltu taulukossa 2. Fluoresenssikoettimet osasten-koodauksen olivat 5’-Cy3-TGC CTT GTC ATT CGG- 3 ’ja 5′-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3’. Käänteisen transkription aluketta oli oligo (dT) 15.

malli valmistelu

yksilöitä CRC kudosten ja CRC-solut saatiin Jiangsu Cancer Hospital (Nanjing, Kiina) . Korjuu kudosten, solujen ja uloste osallistujilta hyväksyi eettinen komitea ensimmäisen Affiliated sairaala Nanjing Medical University ja osallistujien kirjallisia tietoon perustuva suostumus. Yhteensä RNA: t uutettiin kudoksista CRC potilaiden ja CRC-soluista käyttämällä RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Uutettu RNA määritettiin geelielektroforeesilla suoritettiin 2% agaroosigeelillä ja UV-vis spektrofotometrillä (Naka Instruments, Japani). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin oligo (dT) 15-alukkeita käyttämällä SuperScript III käänteistranskriptaasia, mukaan valmistajan ohjeiden.

Genominen DNA uutettiin kudoksista ja soluista fenoli-kloroformiuutolla. Ennen uuttoa, solut pestiin kahdesti normaalilla suolaliuoksella ja kudokset leikattiin ja homogenisoitiin 1 ml: ssa normaalia suolaliuosta. Uutettu DNA laimennettiin TE-puskuriin ja määritettiin UV-vis spektrofotometrillä.

jakkara peräisin CRC potilaan Jiangsu Cancer Hospital (Nanjing, Kiina) homogenisoitiin ASL puskuriin ja uutetaan QIAamp DNA jakkara Mini (Qiagen, Saksa).

Multiplex ligaation riippuvainen koettimen monistamisen-digitaalinen vahvistin

lisäämisen jälkeen koetinparien (100 fmol kutakin) ja 1,0 U Ampligase, reaktioseos, joka sisältää DNA: n tai cDNA: n näytteitä inkuboitiin 94 ° C: ssa 1,0 min, jota seurasi 60 ° C: ssa 4,0 min; tämä sykli toistettiin 10 kertaa.

Digital emulsion PCR (emPCR) B

pakattu-helmiä (10 umol NHS sites /ml) 1 ml NHS-aktivoitua Sepharose HP affiniteettipylvääseen poistettiin sarakkeen ja hajallaan isopropanolissa. Sen jälkeen pestään 1 mM HCl: ää perusteellisesti poistaa isopropanoli, helmet aktivoitiin 1 mM jääkylmällä HCI: ää 4 ° C: ssa 1 h. Sitten aktivoidut helmet ja amiini-modifioitu alukkeita (10 mM) inkuboitiin sitoutumispuskurissa (0,5 M NaCl, 0,2 M NaHCO

3, pH 7,5) 20 ° C: ssa 5 h. Helmet pidettiin poissa sedimentaatiota inkubointia. Inkuboinnin jälkeen aluke-immobilisoitu helmiä säilytettiin 4 ° C: ssa käyttöä varten.

järjestelmä emPCR seos sisältää öljyfaasin ja vesifaasin. Vesifaasi on jaettu kahteen osaan, Mock vahvistus sekoitetaan ja PCR-reaktioseokseen. Ligaatiotuotteet käytettiin templaatteina PCR: ssä. Ensinnäkin, jotta emulsio vakaampi, 225 ui mock vahvistus mix (1 x Promega

Taq

puskuri, 2 mM MgCI

2, 0,1% BSA ja 0,01% Tween-80) homogenisoitiin 375 ul emulsion öljyä (40% (w /w) DC 5225C Formulaatio Aid, 30% (w /w) DC 749 Fluid ja 30% (w /w) AR20 Silicone Oil), jonka magneettinen microstir-bar 1200 rpm 5 minuutin 5 ml: n pulloon. Toinen, 200 ui PCR-reaktioseos (1 x Promega

Taq

puskuri, 2 mM MgCI

2, 0,5 mM dNTP: tä seokseen, 0,125 U /ml

Taq

DNA-polymeraasia, 0,1 % BSA, 0,01% Tween-80, 0,06 mM yhteinen-2-aluketta ja 0,6 mM kutakin yhteistä-1-alukkeet), aluke-päällystettyjä helmiä ja malleja lisättiin pulloon ja sitten pullo sekoitettiin 1500 rpm: llä 3 min sekoittaa emulsioita hyvin. Emulsiot alikvootit 100 gl, 8 PCR-putkiin. Kolmanneksi, lämpösyklitys suoritettiin PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Inc.). Klo alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 3 min, sitten 40 sykliä (94 ° C, 58 ° C ja 68 ° C: ssa 30 s , 60 s, 90 s kukin) monistamiseen ja 13 sykliä (94 ° C ja 58 ° C: ssa 30 s, 360 s kukin) hybridisaatioon ja laajennus.

Digital helmi luotan itse tuotettu hydrogeeli helmi- array

Kun vahvistus, emulsiot jaoteltuina lisäämällä isopropanolia. Emulsiot isopropanolilla suodatettiin läpi 25 mm halkaisijaltaan Micropore kalvo ja helmet loukkuun kalvolle. Sen jälkeen, kun helmiä kalvon toivottiin isopropanolilla, 80% etanolia liuokseen (4,0 mM Tris, pH = 7,5) ja 0,1% Tween 20, ne otettiin talteen 1,0 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA). DNA (dsDNA) immobilisoitu helmiä käsiteltiin 0,1 mM NaOH: a 5,0 min valmistamiseksi yksijuosteisen DNA: n (ssDNA) immobilisoitu helmiin. Kun supernatantti oli poistettu, helmet pestiin kaksi kertaa DDH

2O ja varastoidaan liuoksessa.

akryylimodifioidut objektilasit valmistettiin Xiao et ai [18]. Objektilasit (Shanghai Jinglun Industrial Glass Co Ltd, Shanghai, Kiina) puhdistettiin liottamalla 10%: ista typpihappoa 2,0 h.

hydrogeelin helmi-array valmistettiin lisäämällä helmien akryyliamidimonomeeriliuosta ja päälle akryylimodifioidut dioja ja heti kattaa peitelasilla (20 x 20 mm) pitämään yhden helmi kerros. Jälkeen kopolymerointi, joka suoritettiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, kansi Liete poistetaan varovasti hydrogeeliä. Fluoresenssikoettimet (1,0 pmol /ui) hybridisoitiin ssDNA on helmien polyakryyliamidigeelissä 40 ° C: ssa 1,0 h. Voit poistaa vapaan ja ristiriitaiset koettimet geelistä siru, koetin hybridisoitiin dioja tehtiin elektroforeesi 4,0 ° C: ssa 50 V 5,0 min 1 x Tris /boraatti /EDTA-puskuria. Vedellä pesun, kuvien dioja tehtiin käyttämällä LuxScanner (CapitalBio Corporation, Peking, Kiina). Lopuksi skannaus kuva helmi-array oli syötetty Genepix Pro 4.0 laskea väriä helmiä jono.

Tulokset ja keskustelu

Periaate

suunnattu samanaikaisesti analysoimalla useita mutaatioita ja useiden geenien ekspressiota, kohde-rikastettu MLPA yhdistettiin helmi-pohjainen emPCR multiplex yhden molekyylin vahvistusta. Protokollat ​​määrityksen on esitetty kuvassa 1 ja käsittää seuraavat vaiheet: mallin valmistelu, emulgoituminen, single-molekyyli vahvistus, demulsification valmistelu hydrogeelin helmi-array, koetin hybridisaatio, ja helmi laskenta.

määritys käsittää seuraavat kolme vaihetta: (1) MLPA valmistelusta malleja koodattu universal sekvenssit; (2) emulsio (em) PCR valmistelusta helmiä päällystetty amplikoneihin syntyy yhdestä molekyylistä MLPA tuotteet; ja (3) helmi koodauksen hybridisoimalla universal Cy5-leimattujen koettimien ja universaali Cy3-leimattuja koettimia. Jos helmi näkyy vihreänä, amplikoneista päällystetty helmi on monistettu MUT malleja tai tavoitteiden CRC liittyviä geenejä, kun taas punainen helmi tarkoittaa villityypin malleja tai tavoitteiden taloudenhoito geenien.

Ensimmäinen, DNA: n ja cDNA: ta käytettiin tavoitteet MLPA valmistaa malleja pätevä emPCR, joka on erittäin tarkka digitaalinen PCR-tekniikalla, jossa on yksi reaktio vahvistamiseksi yhden molekyylin toteuttaa yhden molekyylin vahvistusta. Vuonna mutaation havaitseminen, ligaation tarvitsee kolme koettimet yhdelle loci eli ”vasen anturi”, ”oikea anturi 1”, ja ”oikea anturi 2”. On kaksi osaa vasemman koettimen ja kolme osaa kummankin oikean koettimia. Kaksi osaa vasemmalla koetin ovat yhteinen häntä 5′-päähän, joka syöttää yhteisen pohjustus sivuston tarvitaan myöhemmissä PCR-monistus ja geenin-spesifisen sekvenssin 3′-päähän ja hehkutus kohde. Oikeus koettimet sisältävät geenin-spesifinen sekvenssi, jossa on mutaatio sivuston kiinnostava ensimmäisessä juuressa 5′-pää, lähde-spesifinen sekvenssi hybridisoitumaan fluoresoivia koettimia keskellä, ja yhteinen pohjustus päällä joko 3′-päähän. Oikea antureista 1 ja 2 vastaavat MUT ja villi tyypit (WTS), tässä järjestyksessä. Geeniekspressioanalyysissä, kaksi koetinta, vasemmalle koetin ja oikea koetin, käytettiin ligaatioreaktiossa. Vasemmassa koetin on yhteinen pohjustus päällä ja geenispesifisiin järjestyksessä. Oikeus koetin sisältää geenispesifiseen sekvenssin 5′-pää, lähde-spesifinen sekvenssi keskellä, ja yhteinen pohjustus päällä joko 3′-päähän. Sen jälkeen, yhden molekyylin monistus suoritettiin vesi-öljyssä-emulsio. Koska sekä helmet ja malleja MLPA laimennetaan siten, että ei enempää kuin yksi kohdemolekyyli ja yksi helmi on läsnä kussakin osastossa, helmillä amplikoneihin tuotettu emPCR peräisin täsmälleen yksi kohdemolekyyli. Sen jälkeen demulsification, helmet kerätään ja kiinnitetään yhtenä-helmi kerros (40 pm paksu) on hydrogeelin helmi-array. Helmet monistettiin taloudenhoito geenistä (tai WT amplikoneihin) on dekoodata hybridisoimalla 3′-Cy5-leimattuja koettimia, kun helmet monistettu CRC liittyviä geenejä (tai müts) on dekoodata hybridisoimalla 3′-Cy3-leimatut koettimet; Näin ollen, määrä punaista (Cy5 väriaine) helmet ja lukumäärä vihreän (Cy3 väriaine) helmiä heijastuu ekspressiotasot housekeeping-geenin (tai WT amplikonien) ja CRC-liittyviä geenejä (tai MutS), vastaavasti. Kustannukset määritys dramaattisesti vähentää käyttämällä yhteisiä fluoresoivia koettimia dekoodaamiseksi, jotka on päällystetty amplikonien ja MutS, WT amplikoneja, housekeeping-geeni, ja CRC-liittyviä geenejä.

erityisyys helmi-array

spesifisyys hydrogeelin sirun alustan analysoidaan tavoitteiden eri lähteistä tutkittiin. CDNA:

β-aktiini

ligoitiin geenispesifisillä MLPA koettimia, jotka sisältävät tag-sekvenssin koodaavan Cy5-leimattua koetinta tuottaa MLPA tuotteita

β-aktiini

. MLPA tuotteet monistettiin sitten käyttämällä kaksi yhteistä alukkeita ja 5′-päässä yksi aluke oli modifioitu biotiini. Kun biotiinimodifioituja PCR-tuotteet immobilisoitiin streptavidiinilla modifioitu helmiä, helmi-array valmisteltiin ja peitettiin Cy5 ja Cy3-leimattua koettimia analysoitavaksi. Kuten on esitetty kuviossa 2A, on vain punainen helmiä kuvia. Vastaavasti, kun cDNA: n CRC-liittyvien geenien ligoitiin geenispesifisillä MLPA koettimia, jotka sisältävät tunnisteen sekvenssin koodaavan Cy3-leimattua koettimia, vain vihreä helmiä voidaan skannata (kuvio 2B). Tulokset osoittivat, että elektroforeesi poistaa tehokkaasti ristiriitaiset koettimista helmien ”pintaa tai jäljellä antureista sisällä hydrogeeliä. Hybridisaatio välinen fluoresoivat koettimet ja tavoitteiden sisällä hydrogeeli on erityinen. Alustan Helmen-array voidaan erottaa tarkasti toisistaan ​​tavoitteet eri lähteistä MLPA-daba.

Sekä Cy5-leimattu ja Cy3-leimatut koettimet lisättiin helmi-array hybridisaatioon, ja elektroforeesi suoritettiin poistamaan ristiriitaiset ja vapaa antureista. Lopuksi kolme valokuvaa paneeli A tai paneeli B tehdään käyttäen kolmea erilaista fluoresenssikanavan, sekä Cy3 ja Cy5-kanavien, vain Cy3 kanava, ja vain Cy5 kanava, vastaavasti.

erityisyys MLPA -DABA analysointiin mutanttien ja geeniekspressioiden

analysoimiseksi geeniekspressiota, osa CRC helmiä väärin sai 100%: n cDNA

β-aktiini

ja osa taloudenhoito helmiä väärin sijoitettiin 100 % cDNA CRC geenien määritettiin. Hybridisaation jälkeen ja elektroforeesi, kuvat otettiin helmiä päällystettiin 100% fragmenttien

β-aktiini

ja 100% fragmentit CRC liittyviä geenejä; tulokset on esitetty kuviossa 3A ja 3B. Oli lähes mitään väärin sai helmiä löytyy joko testissä; Näin ollen, MLPA-daba käyttö on erittäin spesifinen analysoida ekspression CRC liittyvien geenien CRC.

Näytteet olivat 100% tavoitteet

β-aktiini

(A); 100% tavoitteet CRC liittyvien geenien (B); 100% WT DNA kodonin 1338 normaalissa kudoksessa (C); ja 100% MUT DNA kodonin 1338 in SW480-soluissa (D). Seitsemän koetinparia CRC liittyvien geenien ja

β-aktiini

lisättiin MLPA reaktioseokseen (A ja B), ja kaikki koettimet kodonien 1406, 1338 ja 1356 käytettiin sen MLPA reaktioita (C ja D). Sen jälkeen, kun emulsio PCR, sekä Cy5-leimattu ja Cy3-leimatut koettimet lisättiin helmi-array hybridisaatioon.

SW480-soluja (ihmisen CRC-solut), joilla on homotsygoottinen kodonissa 1338 (4012 C T) on valittu MUT tavoite. Normaalia kudosta käytettiin WT tavoitetta samanaikaisesti analysoitiin. Osa virheellisesti sijoitettiin helmiä 100% MUT DNA: n tai 100%: WT DNA havaittiin. Tulokset esitetään kuviossa 3C ja 3D osoittavat, että prosenttiosuus väärin sai helmien (myös epäpuhtaudet) kummassakin on lähes 0, mikä viittaa siihen, että menetelmä on myös erityinen mutaation havaitsemiseksi CRC.

kvantifiointi kaksi geeniä käyttäen MLPA-Daba

Voit tarkistaa mahdollisuutta käyttää MLPA-Daba analysoimaan erilaisia ​​geenejä, kaksi siivous geenejä käytettiin esimerkkinä. Putkeen, tavoitteita

β-aktiini

ligatoitiin MLPA koettimet, jotka voivat hybridisoitua Cy5-leimattua koettimet, kun taas tavoitteet

GAPDH

ligatoitiin MLPA koettimia, jotka voisivat hybridisoituvat Cy3-leimattua antureista. Sen jälkeen, kun digitaalinen monistamisen ligatointituotteiden ja koettimen hybridisaatio helmiä, punainen ja vihreä helmiä laskettiin. Tulokset on esitetty kuviossa 4. määrä punainen helmiä ja vihreä helmiä heijastavat ekspressiotasot

β-aktiini

ja

GAPDH

, vastaavasti. Laskemalla helmiä siru, todettiin, että suhde ilmentymisen

β-aktiini

kuin

GAPDH

oli lähes 1: 1, mikä viittaa siihen, että nämä kaksi housekeeping geenejä onnistuneesti havaittu. Ei ollut keltainen helmiä, mikä osoittaa, että yhden molekyyli monistus saavutettiin pitämällä enintään yhden kohdemolekyylin kussakin osastossa, ja että on mahdollista, että MLPA-daba voi analysoida geenejä eri lähteistä.

punainen helmi alkunsa yhden molekyylin

β-aktiini

ja vihreä helmi alkunsa yhden molekyylin

GAPDH

.

Application

Osoittaakseen soveltaminen MLPA-daba havaitsemiseen kliinisistä näytteistä, suhteellinen ekspressiotasot viiden CRC liittyvien geenien ja MutS sekä kasvainkudoksissa ja viereisten normaaleissa kudoksissa CRC potilaista havaittiin. Tyypillinen skannattuja kuvia yksi potilas on esitetty kuviossa 5. suhteelliset ekspressiotasot yhteensä viisi CRC liittyviä geenejä

β-aktiini

kasvainkudoksessa ovat paljon korkeammat kuin viereisen normaalin kudoksen (kuvio 5A ja 5B). Kaikki helmet olivat punainen DNA-analyysi viereisen normaalin kudoksen (kuvio 5C) osoittaen, että ne olivat MUT negatiivisia, kun vihreä helmiä (kuvio 5D) osoittavat, että ne olivat MUT positiivinen kasvainkudoksessa. Mut oli 3,1%, lasketaan suhde vihreä helmiä punainen helmiä. Merkittävät erot mutaatio ja geenien ilmentymisen välillä kasvainkudoksen ja viereisen normaali kudos osoitti, että MLPA-Daba voidaan soveltaa varhaiseen toteamiseen CRC matalan tason mutaatioita ja alhainen runsaasti geenien ilmentymisen.

( A) Expression analyysi CRC liittyvien geenien viereiseen normaaliin kudokseen; (B) ilmentymisen analyysi CRC liittyvien geenien kasvainkudoksessa; (C) mutaation havaitsemisen vierekkäisen normaalia kudosta; (D) mutaation havaitseminen kasvainkudoksen. Punainen helmiä peräisin cDNA:

β-aktiini

ja villin tyypin DNA; vihreä helmiä peräisin cDNA CRC liittyvien geenien (

C-myc

,

H-ras

,

N-ras

,

CD44v6

, ja

Cox-2

) ja mutantti-DNA.

arvioimaan mahdollisuuksia MLPA-Daba että invasiivisen taudin kliinisten näytteiden, ulosteista kuusi CRC potilasta käytettiin. Kuten on esitetty S1 taulukossa, vain 50%: n kuuden CRC potilasta (3/6) oli MUT positiivisia ja 83% kuuden CRC potilasta (5/6) testattiin, joilla on korkea ilmentymisen CRC liittyvien geenien invasiivisen analyysit ulostenäytteissä. Yhteenlaskettu paljastumisaste MLPA-Daba on 83%. Tunnistustuloksen perusteella tuloksista ja Dukes ”vaiheessa potilaita, päätellään, että menetelmä on lupaava varhaisessa diagnosoinnissa paksusuolen syövän koska havaitsemismäärä potilaiden alkuvaiheessa (Dukes vaiheissa A ja B) on yhtä suuri kuin 75% (3/4). Uskomme, että havaittava voitaisiin edelleen lisätä kasvattamalla paneelin mutaation loci ja CRC liittyviä geenejä. Tyypilliset tulokset MLPA-daba jollakin uloste CRC potilaiden ja että tästä terveen vapaaehtoisen on esitetty kuviossa 6. ulosteesta peräisin CRC potilaan havaittiin olevan MUT positiivinen, joilla on korkea ilmentymisen CRC liittyviä geenejä, kun taas ulosteesta peräisin terveillä vapaaehtoisilla havaittiin olevan MUT negatiivinen alhaisella ilmaus CRC liittyviä geenejä.

(A) mutaatio havaitseminen ulosteessa näytteen CRC potilas; (B) analyysi CRC liittyvän geenin ilmentymistä ulosteen näyte CRC potilaasta; (C) mutaatio havaitseminen ulosteessa näytteen terveillä vapaaehtoisilla; (D) analyysi CRC liittyvän geenin ilmentymistä ulosteesta näytteen terveillä vapaaehtoisilla.

Johtopäätös

Tässä tutkimuksessa, joka on herkkä ja spesifinen määritys digitaalisesti havaitsemiseksi müts ja ilme tasot useiden geenien hydrogeeliä helmi-array kehitettiin. Yhdistämällä MLPA ja helmi-pohjainen emPCR, yhden molekyylin vahvistus yhteisiä alukkeita käytettiin kaikki tavoitteet saavutettiin. MLPA sovellettiin valmistettaessa malleja universal päät DNA ja cDNA näytteitä eri lähteistä, joka suosii multiplex vahvistusta. Toisin kuin analogiset vahvistus tavanomaisissa PCR-reaktioissa, 10

6 erillistä vahvistusta reaktiot voidaan suorittaa samanaikaisesti yhdessä putkessa helmi-pohjainen emPCR.

Helmet immobilisoidaan yhtenä kerroksena hydrogeelin siru täydellinen suuren suoritustehon tunnistus. Verrattuna yhteisten menetelmiä akryyliamidin elektroforeesin erottamaan proteiinien ja nukleiinihappojen, MLPA-Daba käyttää polyakryyliamidigeelillä upottaa helmiä. Esipolymeerin akryyliamidimonomeeri helmiä on täynnä akryyli-modifioitu lasi ja polymerointi suoritetaan upottaa helmiä lasin pintaan siru ammoniumpersulfaattia ja tetrametyylietyleenidiamiinia. Koska korkea läpäisevyys geelien kanssa 3-dimentional huokoinen rakenne, ristiriitaiset koettimet ja muut epäpuhtaudet upotettu huokoiseen rakenteeseen voi vapaasti kulkea rakenteen läpi; siksi, koettimet ja epäpuhtaudet voidaan tehokkaasti poistaa elektroforeesilla. Korkea suorituskyky hydrogeeliä voittaa ongelmat muilla menetelmillä, kuten korkean taustan häiriöitä riittämättömästä pesusta jäljellä antureista. In MLPA-Daba, taustalla väheni huomattavasti; myöhemmin, herkkyys ja spesifisyys MLPA-Daba oli parantunut huomattavasti. Lisäksi koska polyakryyliamidigeelillä on amfifiilinen ja varauksettomat ominaisuudet, biologisen yhteensopivuuden on omiaan hybridisaatio koettimien ja tavoitteiden ratkaisu kaltaisessa ympäristössä.

Koska diagnostiikasta tehdään perustuu yleistä tietoa useiden geenien, ei ole tarpeen mitata geneettinen MUT tai ilmaisema erityinen syöpään liittyvien geenin. Paneeli useiden geenien yhtenä diagnostinen biomarkkeri osoittaa selvempi ero kuin yksittäisten geenien. In MLPA-Daba, yksi tyyppi fluoresoivan signaalin yhdellä värillä on sovellettu vastaamaan useita MutS ja ilmaisuja useita CRC-liittyviä geenejä. Sekä yleistä tietoa koko ilmaus syöpään liittyvien geenien ja yleinen MUT korko saavutetaan laskemalla suhde kokonaismäärästä vihreitä helmiä eri lähteistä lukumäärään punainen helmiä. On huomionarvoista, että tärkeimmät vaiheet prosessissa MUT havaitsemisen ja prosessi-geenin ilmentymisen analyysi ovat samat; Näin ollen, MLPA-daba pystyy analysoimalla sekä samanaikaisesti samalle sirulle alustan, joka on erittäin toivottavaa syövän diagnoosi. Käyttö MLPA-Daba, jolla on edut ovat kasvainspesifisen; Kun halutaan helppoa näytteenotto, on suuri tarkkuus; on noninvasive runkoon; ja vaadi ravintovalmisteesta ennen testiä verrattuna muihin ei-invasiivisia menetelmiä, kuten kolonoskopia ja ulosteen piilevän veren testi, on lupaava analysointiin paisutettu solujen ulostenäytteissä CRC potilaiden ja tulee tehokas työkalu ei-invasiivisia ja varhainen diagnoosi CRC.

tukeminen Information

S1 Taulukko. Tiedot ja havaitseminen tulokset 6 potilasta käyttäen jakkara lähtöaineena.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123420.s001

(PDF) B