Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tässä raportoidaan eristämistä ja karakterisointia uuden yhdisteen Ailanthus excelsa kloroformiuutetta-1 (AECHL-1) (C

29H

36o

10; molekyylipaino 543,8) juuresta kuori

Ailanthus excelsa

Roxb. Yhdiste hallussaan syövän vastaista aktiivisuutta monia syöpäsolulinjojen eri alkuperää.

Keskeiset havainnot

AECHL-1 hoito 12-48 tunnin esti solujen lisääntymistä ja indusoi kuoleman B16F10, MDA-MB-231, MCF-7, ja PC3-soluja, joilla on vähintään kasvun estäminen normaalissa HEK 293. kasvainten vastainen vaikutus AECHL-1 oli verrattavissa tavanomaisen syöpälääkkeiden paklitakselia ja sisplatiinia. AECHL-1 aiheuttama kasvun esto oli yhteydessä S /G

2-M pidätyksistä MDA-MB-231, MCF-7, ja PC3-solut ja G

1 pidätys B16F10 soluissa. Havaitsimme mikrotubulusten häiriöitä MCF-7-solut käsiteltiin AECHL-1 in vitro. Verrattuna kontrolli, ihonalaisen AECHL-1 sivustoille kasvain hiiren melanooma B16F10 istutettu C57BL /6-hiirten ja ihmisen rintasyövän MCF-7-solujen atyymisissä nude-hiirissä aiheutti merkittävän laskun kasvaimen tilavuuden. Vuonna B16F10 kasvaimia, AECHL-1 50 ug /hiiri /vrk 15 vuorokauden ajan aiheutti lisääntyneen ilmentymisen tuumorisuppressorin proteiinien P53 /p21, ilmentyminen vähenee onkogeenin c-Myc, ja downregulation sykliini D1 ja cdk4. Lisäksi AECHL-1-hoito johti fosforylaation p53 seriinin 15 B16F10 kasvaimissa, mikä näyttää osoittavan p53-riippuvaista kasvua estävän vasteita.

Päätelmät

Esillä oleva tulokset osoittavat aktiivisuutta triterpenoidi AECHL-1, joilla on laaja aktiivisuuden kirjo syöpäsoluja vastaan. Ehdotamme tässä, että AECHL-1 on futuristinen syöpälääkettä, jonka terapeuttista potentiaalia on laajalti tutkittu kemoterapiaa syövän.

Citation: Lavhale MS, Kumar S, Mishra SH, Sitasawad SL (2009) Novel triterpenoid eristetty Root Bark on

Ailanthus excelsa

Roxb (Tree of Heaven), AECHL-1 mahdollisena syöpälääkkeen. PLoS ONE 4 (4): e5365. doi: 10,1371 /journal.pone.0005365

Editor: Joseph Alan Bauer, Cleveland Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 helmikuu 2009; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2009; Julkaistu: 28 huhtikuu 2009

Copyright: © 2009 Lavhale et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli tukea Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Intian hallitukselle, New Delhi. Santosh Kumar sai tutkimuksen apurahan Intian neuvoston Medical Research ja Manish Lavhale yliopistosta myöntää komissiolle. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mukaan Maailman terveysjärjestön perustuu sairastuvuuteen ja kuolleisuuteen, taloudellinen taakka, ja emotionaalisia vaikeuksia, syöpä voidaan pitää kaikkein työläs terveysongelma vaivaa ihmistä maailmassa [1]. Tällä hetkellä yli 22,4 miljoonaa ihmistä maailmassa kärsii syöpään. Noin 10,1 miljoonaa uutta tapausta diagnosoidaan syöpä vuosittain, ja yli 6,2 miljoonaa kuolee tautiin vuonna 2000 [2]. Tämä merkitsee lisäystä noin 19% ilmaantuvuus ja 18% kuolleisuus vuodesta 1990. tärkeä tavoite syöpätutkimuksessa on löytää terapeuttisia yhdisteitä, joilla on suuri spesifisyys syöpäsoluja /kasvain ja vähemmän sivuvaikutuksia kuin nykyisin käytetyt sytostaatit /sytotoksisten aineiden.

Lukuisat kasviperäisiä yhdisteitä, joita käytetään syövän kemoterapiassa ovat vinblastiini, vinkristiini, kamptotekiinijohdannaisten, etoposidi, jotka ovat peräisin epipodofyllotoksiini, ja paklitakseli (Taxol®) [3]. Kuitenkin useimmat näillä yhdisteillä solu- myrkyllisyys ja voivat aiheuttaa syöpää aiheuttavia genotoksisia ja teratogeenisia vaikutuksia ei-tuumorisoluissa, ja jotkut niistä eivät aiemmissa kliinisissä tutkimuksissa [4], [5]. Toinen eniten käytetty metalli-pohjainen lääke tällä hetkellä vastaan ​​valittujen syöpien on sisplatiini [6], mutta käyttö sisplatiinin parantavaa hoitoa liittyi joitakin vakavia kliinisiä ongelmia, kuten vaikea normaalia kudosta myrkyllisyys ja kestävyys hoitoon [7] . Nämä haittavaikutukset rajoittavat niiden käyttöä kemoterapia-aineiden huolimatta suuri tehokkuus hoidettaessa kohde- pahanlaatuisia soluja. Näin ollen uusien hoitomuotojen ja hoitostrategioita tähän sairauteen ovat tarpeen hoidettaessa potilaita, joilla on tämä tauti. Näin ollen, etsiä vaihtoehtoisia lääkkeitä, jotka ovat sekä tehokkaita syöpien sekä myrkyttömiä normaali kudos on tärkeä tutkimuksen linja [8].

terpenoids käytetään laajasti niiden aromaattisia ominaisuuksia. Niillä on rooli perinteinen rohdosvalmisteet ja tutkitaan parhaillaan antibakteerinen, antineoplastisten, ja muut farmaseuttiset toiminnot. Natural triterpenoids, kuten oleanolihapon ja ursolic, ovat yhdisteitä, joilla on anti-tuumorigeeniset ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia [9]. Synteettiset triterpenoid johdannaiset, kuten 2-syaani-3, 13 dioxooleana-1,9 (11) -dien-28-happo (CDDO) [10], ja sen johdannainen 1- [2-syaani-3-, 12-dioxooleana- 1,9 (11) -dien-28-oyyli] imidatsoli (CDDO-Im) [11], on myös anti-kasvain aktiivisuutta. Root kuori

Ailanthus excelsa

Roxb (Tree of Heaven), puu kuuluu perheeseen

kvassiakasvit

käytetään laajalti Ayurveda osoituksena fytoterapia [12]. Muut lajit Tämän perheen ovat tunnettuja niiden anti-syöpä [13]. Kemialliset aineosat

. excelsa

sisältävät joitakin triterpenes ja alkaloideja [14]. Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet

in vitro

ja

in vivo

syövän vastaista aktiivisuutta romaanin triterpenoid, AECHL-1 eristettiin juuri kuori kasvin ja todettu olevan erittäin tehokkaasti syöpäsoluja eri linjaa.

Materiaalit ja menetelmät

eristäminen ja karakterisointi AECHL-1

Juuri kuori

. excelsa

oli botanically varmistettiin professori Shrihari Mishra (yksi kirjoittajista esillä käsikirjoitus) ja louhinta ja fraktiointi ilmakuivattua jauhettu juuri kuori tehtiin käyttäen kloroformia. Eristäminen AECHL-1 tehtiin käyttämällä silikageelipylväskromatografialla ja tunnettu siitä, että ultravioletti (Shimadzu 1700), infrapuna (Perkin Elmer Spectrum RX1), ydinmagneettinen resonanssi (Bruker Avance I NMR spektrometri) ja massaspektroskopia (JEOL SX 102 massa spektrometri). Puhtaus AECHL-1 arvioitiin HPLC: llä RP C-18 Phenomenex-kolonnissa käyttäen metanoli-vesi (90:10, tilavuus tilavuus) liikkuvana faasina. Puhdistettu yhdiste, AECHL-1 liuotettiin DMSO: kantaliuoksina.

Solulinjat

Normaali ihmisen alkion munuaissolulinja (HEK 293), hiiren melanooma B16F10-soluja (B16F10), ihmisen rinta- karsinooma (MDA-MB-231), ihmisen rinta- adeno-karsinooma (MCF-7) ja ihmisen eturauhasen (PC3) solut saatiin ATCC: stä (Manassas, VA). HEK 293, MCF-7 ja B16F10-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa ja PC3 Hamin F-12 Media (Gibco) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. MDA-MB-231-soluja viljeltiin Leibovitzin L-15 (Gibco), jota oli täydennetty 10% FCS: ää (Gibco), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa.

solujen elinkelpoisuus määritys

Direct häiriöitä eri pitoisuuksia AECHL-1 (0-200 uM) ja MTT solussa-free järjestelmä ei havaittu, siis, MTT-määritystä käytettiin testaamaan solujen elinkelpoisuuden nykyisessä järjestelmään. HEK 293, B16F10, PC3, MCF 7 ja MDA-MB-231-soluja (4 x 10

3 /kolo) viljeltiin 96-kuoppaisille levyille ja sen jälkeen 24 h, käsiteltiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 (0-200 uM), sisplatiini (0-100 uM) tai paklitakselia (0-50 uM) 12, 24, ja 48 tuntia 37 ° C: ssa. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT: tä (0,5 mg /ml) muuntaminen kuten aiemmin on kuvattu [15].

Soluproliferaatiomääritys

leviämisen MCF-7-soluissa määritettiin mittaamalla (

3H ) tymidiinin. Lyhyesti, alikvootit täydellistä alustaa, joka sisälsi 4 x 10

3-solut jaettiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille. 24 tunnin kuluttua alustat korvattiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 (0-100 uM), sisplatiini (0-100 uM) tai paklitakselia (0-50 uM). Kuusi tuntia hoidon jälkeen 1 pCi /kuoppa (

3H) tymidiiniä (hallituksen Säteilyturvakeskus Isotooppi Technology, Mumbai, Intia) lisättiin ja viljelmiä inkuboitiin vielä 42 tuntia 37 ° C: ssa. Solut huuhdeltiin ja talteen tuikelaskenta seokseen, ja radioaktiivisuus sisällytetty DNA määritettiin nestetuikelaskurilla (Canberra Packard).

anneksiini V-FITC-sitoutumismäärityksessä

B16F10, MDA-MB -231 ja MCF-7-soluja (3 x 10

5 /ml), käsiteltiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 (0-40 uM) 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua, apoptoosin havaittiin käyttämällä anneksiini V-FITC apoptoosin havaitsemiseen Kit (Calbiochem, USA) virtaussytometrillä (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Aineisto analysoitiin käyttäen Cell Quest ohjelmiston määrittämiseksi prosenttia apoptoottisia soluja.

Solusyklianalyysiä

B16F10, PC3, MDA-MB-231 ja MCF-7-soluja (3 x 10

5 /ml), käsiteltiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 (0-100 uM), tai paklitakselia (0-10 uM) 24 tunnin ajan. Solusyklin analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16], virtaussytometrillä (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Aineisto analysoitiin käyttämällä Cell Quest ohjelmistoa.

Immunosytokemia

MCF-7 solut kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä, ja sitten inkuboitiin anti-α-tubuliinin aineita (1:10000; Sigma, St. Louis, MO). Sen jälkeen, kun vasta-aineet pestiin pois, soluja inkuboitiin Alexa-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:200; Sigma, St. Louis, MO). Kuvat otettiin konfokaalisella laserskannaus (Zeiss LSM510).

Animal kasvainmuodoista

Male C57BL /6 (6-8 viikon iässä) ja naisten kateenkorvattomiin nude-hiirten, NIH, nu /nu Swiss (10 viikkoa) pidettiin mukaisesti Keski eläinten eettisen lautakunnan menettelytapoja ja ohjeita. B16F10 melanooma solut otettiin talteen, suspendoitiin PBS: ään, ja injektoidaan subkutaanisesti oikeaan kylkeen (2 x 10

6 solua /kylki) C57BL /6-hiirten ja MCF-7-solut (5 x 10

6 solua /kylki ) naaraspuolisiin kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Kukin kateenkorvattomiin hiiren istutettiin ihon alle, jossa on 0,72 mg 17-β-estradioli pelletit, 2 viikkoa ennen siirrostuksen MCF-7-soluja [17], [18]. Kasvaimen koko mitattiin 3-4 päivän välein, jonka paksuus ja kasvainten pituudesta (

L

) ja leveys (

W

):

V

= (

LW

2) /2 [19]. Kahden viikon jälkeen, AECHL-1 (50 ug), AECHL-1 (100 ug), sisplatiini (100 ug) ja PBS vehikkelikontrollina injektoitiin ihonalaisesti Tuumorin varten 15 päivää C57BL /6-hiiriä (n = 6 ) ja AECHL-1 (5 ug), AECHL-1 (10 ug), paklitakseli (20 ug) ja PBS vehikkelikontrollina injektoitiin ihon alle paikalle kasvaimen päivässä 10 päivän ajan naisten atyymisissä nude-hiiriin (n = 6 ). Kasvaimen tilavuus mitattiin säännöllisin väliajoin tutkimuksen aikana. Lopussa kokeen kasvain ja muut elimet irrotettiin histologista analyysejä ja Western blot.

immunohistokemia

Kudokset ja elimet C57BL /6 ja nude-hiiriä kiinnitettiin alkoholiin formaliiniin 24 h ja upotettiin parafiiniin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Kudosleikkeet (5 um) värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Santa Cruz, CA), hiiren monoklonaalinen anti-CDK4, anti-sykliini D1-vasta-aineita (1:1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) , hiiren monoklonaalista anti-c-Myc-vasta-aineen ja hiiren monoklonaalinen anti-p53-vasta-ainetta (1:1000; Abcam, USA), mitä seurasi HRP-konjugoitua sopivan sekundäärisen vasta-aineilla ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (Pierce) havaitsemisjärjestelmä. Kalvot riisuttu ja uudelleen koetettiin β-aktiini primaarista vasta-ainetta (1:10000; MP Biomedicals, Ohio, USA) proteiini latauskontrollina.

Tilastot

Tiedot raportoidaan kasvainten ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Tilastolliset erot määritettiin ANOVA testiä ja sen jälkeen soveltaa oli Tukey-Kramer monivertailutestillä.

Tulokset

Chemistry: Ultraviolet, infrapuna, ydinmagneettinen resonanssi, ja massa luonnehdinta AECHL-1

IR (KBr): 3425, 3419 (hydroksyyliryhmä), 2972, 2966, 2923, 2873 (alkyyli CH stretch), 1733 (δ laktoni), 1718 (Bi asetyyli), 1680 (C = O konjugointi alkeeni), 1652 (-C = C venytys), 1600 (aromaattinen), 1492, 1454, 1394 (metyyli venytys), 1222 (δ laktoni), 1184, 1110, 1051, 1031 (asetaalit), 1018 nm (alkaanit).

1H-NMR (DMSO, 400 Hz) δ: 0,95 (3H,

t

, 4′-CH

3), δ: 1,15 (3H, d, H-24), δ : 1,235 (3H, d, 5′-CH

3), δ 1,5 (2H, ddd, 5′-CH

2), δ: 1,73 (3H, ddd, H-21), δ: 1,83 (1 H, s, H-9), δ: 1,87 (1 H, s, H-14), δ: 1,9 (2H, s, H-18), δ: 2,16 (3H, s, H-18), δ: 2,3 (3H, d, H-19) δ: 2,71 (2H, s, H-20), δ: 3,45 (2H, dd, H-23), δ: 3,65 (2H, d, H-22) , δ: 3,95 (1 H, t, H-12), δ: 4,05 (2H, s, H-22), δ: 5,30 (1 H, s, H-15), δ: 5,46 (1 H, s, OH -2), δ: 5,73 (1 H, d, OH-2 ’), δ: 6,89 (1 H, s, H-3), δ: 8,82 (1 H, s, OH-11).

nopea atomipommitus massaspektroskopia:

m /z:

1068 johtuen himmennin muodostumiseen. Varsinainen (M

+) pidettiin 543,8, 463,3 (MC

4H

1O

2), 461,4 (MC

4H

2O

2), 459,4 (MC

4H

4O

2), 361,2 (MC

9H

11 o

4) (kuvio 1 B) ja massaspektrit (kuva S1). AECHL-1 on kiinteänä aineena, sp. 248-250 ° C hallussaan molekyylikaava C

29 H

36o

10 osoittamalla tavalla EI ja ES massaspektrit. IR-spektri osoitti, että läsnä on hydroksyyli (t) (3425 nm, 3419 nm), δ laktoni (1733 nm), ja aromaattinen osa (1600 nm). UV-spektri tunnusomainen absorptiomaksimi 235 nm: ssä, että niissä on auxochromic ryhmien kuten hydroksyyli- ja ketoni. Olevaa

1 H-NMR-spektri AECHL-1 paljasti, että läsnä on aromaattisen protonin δ 6,89 ja singletti δ 5,30, joka on luonteenomainen esterin funktion C-15. H-22 esiintyi AB-järjestelmän kuin singletti δ 4,05 ja dubletti δ 3,65 ja H-12 esiintyi tripletin arvossa δ 3,95. Metyyliryhmä H-19 aromaattisen renkaan esiintyi singletti δ 2,3. Dubletti δ 1,235 kuusi protonien annetaan klo H-5 ’. H-4 ’esiintyi tripletin arvossa δ 0,95. Metyyliryhmän, H-18 esiintyi singletti δ 2,16 (kuva 2).

Yhden huippu osoitti, että valmiste on 99%.

esto solujen elinkykyä, proliferaatiota ja apoptoosia AECHL-1

Effect of AECHL-1 elinkelpoisuudesta B16F10, PC3, MDA-MB-231 ja MCF-7-soluissa arvioitiin. AECHL-1 inhiboi solukasvua MCF-7-solujen pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla MTT: llä (kuvio 3A). AECHL-1 inhiboi solukasvua eri syöpäsolulinjoissa vähintään kasvun inhibitio HEK 293 48 h (kuvio 3B). HEK 293 hoidettiin 200 uM AECHL-1 näytteillä korkea eloonjäämisaste ( 90%) verrattuna syöpäsoluja. AECHL-1 havaittiin olevan tehokkaampi MCF-7 verrattuna B16F10, PC3 ja MDA-MB-231-solujen lisääntymisen eston havaitsemaa (

3H) tymidiinin 48 tunnin kuluttua (kuvio 3C). Lisäksi AECHL-1 havaittiin olevan tehokkaampi kuin paklitakseli tai sisplatiinin soluproliferaation inhibitio MCF-7-soluissa 48 tunnin kuluttua (kuvio 3D).

(A) Cell kasvua MTT-määrityksellä MCF-7 -soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 (10, 20, 40 ja 100 uM) 12, 24 ja 48 tuntia ja solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä; (B) Solujen kasvua MTT määritys B16F10, PC3, MDA-MB-231 MCF-7 ja HEK-293-soluja. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 (10, 20, 40 100 ja 200 uM) 48 tunnin ajan, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä; (C) Cell lisääntymistä (

3H) tymidiinin sisäänottoa B16F10, PC3, MDA-MB-231 ja MCF-7-soluissa. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 (10, 20, 40 ja 100 uM) 48 tunnin ajan, ja solujen lisääntyminen määritettiin (

3H) tymidiinin liittyminen; (D) vertailu AECHL-1 muiden kemoterapia huumeita. MCF-7-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (5, 10, 20, ja 50 uM) paklitakselin, sisplatiinin ja AECHL-1 48 tuntia, ja solujen lisääntyminen määritettiin (

3H) tymidiinin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

anneksiini V-konjugoitu FITC ja propidiumjodidilla (PI) tahra käytettiin analysoimaan kokonaisprosenttiosuus apoptoottisten solujen indusoima AECHL-1. Tutkijan tunnistaa varhain apoptoottiset solut (anneksiini V-FITC positiivinen, PI negatiivinen), solut, jotka ovat myöhässä apoptoosin (anneksiini V-FITC ja PI positiivinen), nekroottisen solut (PI positiivinen vain) ja solut, jotka ovat elinkelpoisia (anneksiini V: -FITC ja PI negatiivinen). Kokonaisprosenttiosuus apoptoottisten solujen kasvoi jopa 36,25% ja 37.18% 20 uM B16F10, MDA-MB-231-soluissa ja 60.66% 5 uM MCF-7-solut (kuva 4).

Detection of apoptoosi tekemä anneksiini V-FITC apoptoosin havaitsemiseen mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla: UR osoittaa prosenttiosuuden myöhään apoptoottisten solujen (anneksiini V ja PI-positiivisia soluja), ja LR osoittaa prosenttiosuuden alussa apoptoottisten solujen (anneksiini V-positiivisia soluja) tiedot esitetään pisteblotit kuvaa anneksiini /fluoreseiini (

x

akseli) vs. PI-värjäys (

y

akseli). Solujen prosenttiosuus kussakin kvadrantissa on esitetty. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

AECHL-1 indusoi solusyklin pysähtymisen syöpäsoluissa

määrittämiseksi vaiheen solusyklin jossa AECHL-1 kykenee sen kasvua -inhibitory vaikutus, eksponentiaalisesti kasvavia B16F10, PC3, MDA-MB-231 ja MCF-7-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla AECHL-1 24 tuntia, ja analysoitiin virtaussytometrialla (taulukko 1). Havaitsimme, että B16F10 solut käsitelty AECHL-1 kasvoi väestössä G

1 vaihe (52,18-72,08%) ja samanaikainen väheneminen prosenttiosuus solujen S-G2 /M vaiheessa (47,98-26,16% ), mikä viittaa G

1 pidätykseen. Sen sijaan, useita PC3, MDA-MB-231 ja MCF-7-solujen S-G2 /M-vaiheen kasvoi 42,91%: sta 57,62%, 49,40% ja 77,16% ja 45,13%: sta 70,97%: lla vasteena hoidon AECHL-1 ja laski G1 vaiheessa välillä 55.65%: sta 39.02%, 49.54%: sta 22,82%, 53,67% ja 27,85% vastaavasti viittaa kasvun pysähtymisen S-G2 /M vaiheessa PC3, MDA-MB-231 ja MCF- 7-soluissa. Paklitakselihoidolla osoitti kasvua väestöstä MCF-7 solut G2 /M vaiheessa (29,30%: sta 72,55%), jossa on laskua solujen prosenttiosuus G1 vaiheessa (48.30%: sta 4,62%), mikä viittaa kasvua pidätyksen G2 /M vaiheessa (taulukko 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio solusyklin etenemistä voisi olla yksi molekyyli liittyviä tapahtumia selektiivinen syövän tehoa AECHL-1 syöpäsoluissa.

vaikutus AECHL-1 solun mikrotubulusten

mikrotubuluksen värjäytyminen ohjaus ja soluissa, joita käsiteltiin AECHL-1 ja paklitakseli, osoitti, että sekä AECHL-1 ja paklitakselin johti mikrotubulusten häiriöitä kasvun kanssa tiheys solun mikrotubulusten ja muodostumista paksu mikrotubulusten nippujen ympäröivä ydin verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin (kuvio 5).

MCF-7-soluja käsiteltiin ajoneuvon kontrollina, AECHL-1 (5 uM) ja paklitakselin (5 uM) positiivisena kontrollina 24 tuntia, ja mikrotubulusten (punainen) visualisoitiin epäsuoralla immunofluoresenssilla. DAPI käytettiin värjäämään solutumien (sininen). Edustavia 25-30 solujen kunkin 3 erillisestä kokeesta.

vaikutus AECHL-1 primäärikasvain tilavuuden allograftin ja ksenograftin

tutki myös vaikutukset AECHL-1 in vivo kasvun primaarikasvainten. Alustavat tutkimukset osoittivat, että eri annosten AECHL-1 (0,5-5 mg /kg) injektoitiin vatsaonteloon C57BL /6-hiirissä, suurin siedetty annos oli kerta-annoksena 0,5 mg /kg, joka ei osoittanut mitään selvää merkkiä toksisuudesta kun havaitaan yhden kuukauden. Tämän perusteella, annos, joka oli valittu oli 50 ja 100 ug /kg /vrk (annos, joka on 10-20% tästä suurin siedetty annos). Päivänä 18 merkittävää kasvaimen tilavuus kontrolliryhmässä (p 0,001) ja regression kasvaimen tilavuus oli ilmeinen hiirillä, joita käsiteltiin 50 ug AECHL-1 (44,303 ± 5,20% (p 0,001)) ja 100 ug AECHL- 1 (51,014 ± 1,27% (p 0,001)). Kasvaimet käsiteltiin 100 ug sisplatiinin vähensi kasvaimen tilavuuden (93,13 ± 0,539% (p 0,001)). Kuitenkin AECHL-1 (50 ug) verrattuna AECHL-1 (100 ug), havaittiin olevan ei merkittävästi (P ​​ 0,05). Päivänä 24 ohjaus, AECHL-1 (50 ug) ja AECHL-1 (100 ug) käsitellyistä hiiristä osoittivat edelleen kasvaimen tilavuus (p 0,001), mutta hiiret sisplatiinia osoitti väheneminen kasvaimen tilavuus (p 0,001). Vaikka sisplatiinin osoitti edelleen vähentämään kasvaimen tilavuus, aiheuttamat vahingot muihin elimiin oli enemmän kuin että AECHL-1 (50 100 ug) hoidetussa ryhmässä C57BL /6-hiirissä (kuvio 6A ja 6B).

(A) Valokuvia C57BL /6-hiirten, joka esittää 4-viikon ikäisiä allograftin kasvaimen kasvua B16F10-solut;

alla,

irrotettiin kasvaimista vastaaviin hiirillä; (B) Kasvaimen tilavuus määritettiin ajoitettu välein, kuten kappaleessa ”Materiaalit ja menetelmät”. Kasvaimen koe-eläinten hoidon jälkeen 50, 100 ug AECHL-1 ja 100 ug sisplatiinin verrattiin kasvaimen verrokkieläimestä; (C) Valokuvia kateenkorvattomia nude-hiirten esittää 4-viikon ikäisiä ksenografti kasvaimen kasvua MCF-7-solut;

alla,

irrotettiin kasvaimista vastaaviin hiirillä; (D) Kasvaimen tilavuus koe-eläinten hoidon jälkeen 5, 10 ug AECHL-1 ja 20 ug paklitakselia verrattuna kasvaimen tilavuuteen kontrollieläimiin. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SE kuuden alkaa kunkin ryhmän eläinten. Merkittävät erot

* konsernin sisäiset kunakin ajankohtana ovat edustettuina:

ns p 0,05,

* p 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,001 ja

#Inter ryhmän eri annoksia edustettuina

ns P 0,05,

# 0,05,

## P 0,01,

### P 0,001.

Koska sytotoksisen annoksia AECHL-1 MCF-7-solujen in vitro oli hyvin pieni, annokset valitaan tuumoriksenografteja naisten kateenkorvattomissa nude-hiiriä, joihin injektoitiin MCF-7-solut olivat 5 ja 10 ug. Nämä annokset osoittivat taantumista kasvaimen tilavuuden kuin: 35,72 ± 0,05% 5 mikrog (p 0,001) ja 28.55 ± 0,06% 10 ug (p 0,001), kun taas kasvaimet käsiteltiin 20 ug paklitakselin osoittivat taantumista kasvaimen tilavuus (14,19 ± 0,32% (p 0,05)), mikä oli vähemmän kuin AECHL-1 hoidetussa ryhmässä (kuvio 6C ja 6D).

Effects of AECHL-1 käsittely tuumorisuppressoriproteiinia ja solusyklin sääntelyn proteiinien kasvain siirteen of C57BL /6-hiiret

arvioitiin vaikutus AECHL-1-hoidon ilmentymisen tuumorisuppressoriproteiinia p53, solusyklin säätelyproteiini sykliini D ja cDK4: n ja onkogeeni c-Myc. Kuten on esitetty kuviossa 4E, AECHL-1 50 ug /hiiri /vrk annettuna B16F10-istutetaan kasvaimia C57BL /6-hiirillä johti lisääntymiseen ekspression villityypin p53-proteiinin ja laski sitten suurempina pitoisuuksina (100 ug /hiiri /päivä). Taso p53 oli suurempi AECHL-1-käsitellyssä ryhmässä kuin sisplatiinin hoidetussa ryhmässä, mikä osoittaa, että kasvainten vastainen toiminta AECHL-1 oli erilainen kuin sisplatiinin. Koska fosforylaatio on Ser-15 tähteen p53 on kriittinen p53-riippuvaista aktivoitumista solusykliä säätelevien proteiinien G1 pidätys, päätimme fosforylaatiota tilan p53 ja sykliini D1 ja cdk4. AECHL-1-hoito johti lisääntymiseen fosforylaation p53 seriinin 15 tähteen kasvaimissa 50 ug /hiiri /päivä samanaikaisen kohoavan p21 ja laski 100 ug /hiiri /vrk. Western blot-analyysi osoitti, että hoito 50 ja 100 ug /hiiri /vrk AECHL-1 aiheutti merkittävä väheneminen syklin säätelyproteiineihin sykliini D1 ja cdk4. Käsittely 50 ja 100 ug /hiiri /vrk AECHL-1 aiheutti myös merkittävä väheneminen onkogeenin c-Myc mikä osoittaa, että inhibitio solusyklin voi olla vastuussa antituumorivaikutukset AECHL-1 (kuvio 7).

Tuumorikudos lysaatit altistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western immunoblottaus. Kalvot tutkittiin anti-p53, pp53, p21, c-myc, sykliini D1, cdk4, ja β-aktiini vasta sen jälkeen peroksidaasikonjugoiduilla sopivan sekundäärisen vasta-aineita ja visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssidetektiolla järjestelmään. Kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin ja edustava blot on esitetty kullekin proteiinille.

histologinen analyysi kasvainkudoksen ja muiden elinten C57BL /6-hiirissä

histologinen tutkimus tuumorin C57BL /6-ohjaus hiiret osoittivat hyvin kehittynyt verisuonia, lisääntynyt uudissuonittuminen, solutiheys ja läsnäolo aivoverenvuotoon alueilla todennäköinen merkkejä angiogeneesin lisääntynyt mahdollisuus etäpesäkkeiden (Kuva 8.1a). Kasvaimien 50 ug AECHL-1 ei näytä paljon vaikutusta kasvaimen verisuonittumista, mutta osoitti vähemmän esiintyminen hemorraginen alueilla, vähentää kasvainsolun tiheys ja esiintyminen picnotic /nekroottisten solujen keskellä kasvaimen (kuvio 8.1b). Hoito 100 ug AECHL-1 osoittivat kasvua nekroottisia soluja, katoaminen uudissuonittumisen, aivoverenvuotoon alueiden ja alhaisen solutiheyden kontrolliin verrattuna (kuvio 8.1c), mikä osoittaa, että AECHL-1 esti etenemistä angiogeneesin ja etäpesäkkeiden riski estämällä uudissuonittumisen . Sisplatiini hoidettu ryhmä osoitti merkittävän kasvun nekroottisia soluja, lasku kasvainsolun tiheys ja tilavuus (kuvio 8.1D).

(1) edustaja H & E-värjätyt leikkeet päässä B16F10 siirteen kasvaimia ja ominaisuuksista näistä kasvaimista oli analysoidaan (1A-1D). Morfologiset ominaisuudet sydämen (1E-1H), munuaisen (1I-1L), maksa (1M-1P) ja pernassa (1Q-1T), kuusi hiirtä käytettiin jokaisen sarjan kokeita. (2) edustaja H & E-värjätyt leikkeet MCF-7 ksenograftikasvaimissa ja ominaisuudet näiden kasvainten analysoitiin (2A-2D). Morfologiset ominaisuudet sydämen (2E-2H), munuaisen (2I-2L) ja maksan (2M-2P), perna (2Q-2T), kolme hiirtä käytettiin jokaisen sarjan kokeita.

verrattuna kontrolli, sydänkudoksen hiirten käsiteltiin 50 ug AECHL-1 näytti normaalia rakennetta, kun 100 ug osoittivat laajaa sydänlihaksen kuituja kuolion ja supistuminen bändejä. Hajanaisuus ja tahroja lihassyiden ominaisuus coagulative kuolion nähtiin (kuvio 8.1E-8,1 g). Sisplatiini käsitellyt hiiret osoittivat myös, nekroosia sydänlihaksen kuitua, hieman lymfosyyttitunkeutumisella ja myös pirstoutumista ja tahroja lihassyiden (kuvio 8.1H).

Verrattuna kontrolli, munuaisten hiiret käsiteltiin 50 ug: AECHL-1 lieviä putkimainen vakuolisaatiota ja putkimainen laajentumista kanssa aivoverenvuotoon alueilla normaalien glomerulusten ilmestyvät alaosassa. Hoito 100 ug AECHL-1 osoitti putkimainen vakuolisaatiota, putkimainen laajentumista, aivoverenvuotoon kunnossa ja hajallaan krooninen tulehduksellinen soluinfiltraat- (Kuva 8.1I-8.1K). Sisplatiini käsitellyistä hiiristä osoittivat hajallaan lymfosyyttejä ja aluksen ympärille. Monet neutrofiilit olivat myös nähtävissä tubulukset ja interstitium eli pyelonefriitti (kuvio 8.1L).

Verrattuna kontrolli, maksan hiiret käsiteltiin 50 ug AECHL-1 ei vaikuta normaaliin arkkitehti. Hiiret käsiteltiin 100 ug AECHL-1 säilyy normaalin arkkitehti maksan (Kuva 8.1m-8.1O). Sisplatiinin käsitellyillä hiirillä kuitenkin, laaja nekroosia hepatosyyttien havaittiin. Nuoli oikealla puolella näkyy kuolleita maksasoluissa ja tätä mallia voidaan nähdä erilaisia ​​maksamyrkkyjen, jossa painopiste maksasoluissa nekroosia lymfosyyttitunkeutumisella tapahtuu. Näissä kudoksissa, leesiot näyttävät samanlaisilta kuin Tyzzer tauti ominaista kuolion vaihtelevalla tulehdus vastauksena kuolion. Akuutti maksan vauriot koostuvat nekroottisen pesäkkeitä ympäröi minimaalinen, ensisijaisesti neutrofiilien, tulehdusta (kuva 8.1P).

edustaja perna osastoja Ohjaus ja hiiret käsiteltiin 50 ug AECHL-1 näytti normaalia perna arkkitehti ja hiiriä hoidettiin 50 ug AECHL-1. Ohjaus ja hiiriä käsiteltiin 100 ug: AECHL-1 ja sisplatiinin osoitti liikakasvun valkoinen massa, erityisesti reunavyöhykkeen (Ψ). Histologia osoitti lisääntynyt määrä granulosyyttien että reunavyöhykkeet (kuva 8.1Q-8.1T).

histologinen tutkimus kasvainkudoksen ja muiden elinten nude-hiirissä

Kasvaimet kontrollista hiiret osoittivat korostunut uudissuonittumista kaikkialla osan ympäröi erittäin tiheä solujen ja puuttuessa nekroottisen soluja (kuvio 8.2a). AECHL-1 5 mikrog annos osoitti vähentynyt kasvainsolun tiheys ja aukkojen koko kasvaimen alueella. Se osoitti myös menetyksen neovasulization ja puuttuessa aivoverenvuotoon alueilla (kuvio 8.2B). AECHL-1 10 ug osoitti paljon tyhjiä tiloja, esiintyminen aivoverenvuotoon alueiden nähtiin mutta väheneminen vasculization ei nähty (kuvio 8.2C). Paklitakselihoidon alensi kasvainsolun tiheyden esiintyminen paljon tyhjiä tiloja ja nekroottinen alueilla osassa (Kuva 8.2D).

hoito 5 ug AECHL-1 ei osoittanut mitään muutosta normaaliin sydänlihaksessa, kun taas 10 ug AECHL-1 ja paklitakselin osoitti nekroosia sydänlihaksen kuituja. Paklitakseli osoitti laaja sydänlihaksen kuitu kuolion hajanaisuuteen ja tahroja sydänlihaksen (Kuva 8.2E-H). Mitään merkittävää muutosta ei havaittu munuaisten rakenteeltaan AECHL-1 hoidetuilla ryhmillä, kun taas paklitakselihoidolla osoitti merkkejä putkimainen vakuolisaation dilataatio kanssa hemorraginen alueilla (Kuva 8.2I-8.1L). Sekä AECHL-1 ja paklitakselin ei osoittanut mitään muutosta normaalin arkkitehtuurin maksan (Kuva 8.2M-8.2P) ja pernan kohdat (kuvio 8.2Q-8.2T).

Keskustelu