Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavanomaisen kemoterapian aivokasvaimia on temotsolomidi (TMZ), mutta jopa 50% aivokasvainten ovat tiettävästi TMZ kestävät lähtevät potilaat ilman kemoterapia-vaihtoehto. Suoritimme sarja seulonta TMZ resistenttien astrosytooman solulinjoissa, ja tunnistettu yhdisteitä, jotka ovat sytotoksisia näihin soluihin. Kaikkein sytotoksinen yhdiste oli analoginen tiobarbituurihappoa että me kutsumme CC-I. On annoksesta riippuvainen sytotoksinen vaikutus CC-I temotsolomidin resistenttien astrosytoomasoluihin. Solukuolemaa näyttää esiintyvän apoptoosin kautta. Sen jälkeen CC-I altistus oli kasvua astrosytoomasoluihin S ja G2 /M vaiheessa. Vuonna

in vivo

atyymisissä (

nu Twitter /

nu

) nude-hiirissä ihon alle ja kallonsisäinen kasvain malleja, CC-I estivät täysin kasvaimen kasvua ilman maksan tai munuaisten myrkyllisyys. Molekyylimallinnusta ja entsyymiaktiivisuuden määrityksiä osoittavat, että CC-I estää selektiivisesti topoisomeraasi IIα samankaltainen muiden huumeiden sen luokan, mutta sen sytotoksisia vaikutuksia astrosytoomasoluihin ovat vahvempia kuin näitä yhdisteitä. Sytotoksinen vaikutus CC-I on vahvempi soluissa, jotka ilmentävät metyloimaton O

6-metyyliguaniini metyylitransferaasin (MGMT), mutta on edelleen myrkyllistä soluille denaturoidulla MGMT. CC-Voin myös parantaa myrkyllinen temotsolomidin vaikutusta astrosytooman kun nämä kaksi yhdistettä yhdistetään. Yhteenvetona olemme tunnistaneet yhdiste, joka tehoaa astrocytomas lukien TMZ kestävä astrocytomas sekä soluviljelmässä ja

in vivo

aivokasvain malleja. Parannettu sytotoksisuus CC-I ja turvallisuusprofiili tämän perheen huumeiden voisi tarjota kiinnostava työkalu laajempaa arviointia vastaan ​​aivokasvaimia.

Citation: Lee SY, Slagle-Webb B, Rizk E, Patel A, Miller PA, Sung SS, et ai. (2014) Characterization of Novel Anti-Cancer Yhdiste astrocytomas. PLoS ONE 9 (9): e108166. doi: 10,1371 /journal.pone.0108166

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: toukokuu 19, 2014; Hyväksytty: 19 elokuu 2014; Julkaistu: 25 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Hanke rahoitetaan osittain avustuksella National Cancer Institute of National Institutes of Health alle Award Number R21CA167406 SL. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Institutes of Health. Tämä tutkimus tukee myös osittain Elsa U. Pardee Foundation ja Tara Leah Witmer Endowment. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Connor on osaomistaja NuHope LLC, joka on taloudellinen intressi kehittämisessä yhdisteiden hoitoon aivokasvaimia, jotka olivat aluksi seulottiin käyttämällä solulinjoja valittu HFE genotyypin. Lee on royalty kanssa NuHope LLC. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Glioomat osuus 28% kaikista ensisijainen aivojen ja keskushermoston (CNS) kasvaimia, ja 80% gliooma ovat pahanlaatuisia [1]. Joukossa gliooma, glioblastooma (glioblastoma multiforme, luokka IV astrosytooma, GBM) on yleisin pahanlaatuinen gliooma. Kuolleisuus on ensisijainen pahanlaatuisen aivojen ja keskushermoston kasvaimia on korkea; noin 22620 uutta aikuisten tapausta pahanlaatuisten aivojen ja keskushermoston syöpien vuonna 2013 [1] ja 13700 kuoli vuonna 2012 [2]. Keskimääräinen elinaika varten GBM potilaille oli 14,6 kuukautta ja 2 vuoden eloonjäämistä sairastavien potilaiden GBM oli 10,4% sädehoidon yksin ja ainoastaan ​​26,5% olevien yhdistetyn hoidon hoito temotsolomidia (TMZ) ja säteily [3].

nykyinen standardi hoitoa GBM on kokoresektioksi jälkeen annetaan sädehoitoa yksin tai yhdistettynä TMZ kemoterapia [4], [5]. TMZ on suun kautta alkyloiva aine käytetään hoitoon aivosyövän,

esim.

, GBM ja oligodendrogliooman [6]. Sitä on myös käytetty melanooman, eturauhassyövän, haima- syöpä, pehmytkudoksen sarkooma, ja munuaissolukarsinooma [7] – [11]. TMZ estää solujen lisääntymiseen estämällä DNA: n replikaatiota [12] ja on ainutlaatuisia ominaisuuksia verrattuna muihin alkyloivat aineet. Esimerkiksi, se on suun kautta, läpäisee veri-aivoesteen, on vähemmän myrkyllinen kuin muut alkyloivat aineet, ja ei kemiallisesti cross-link DNA. Vaikka temotsolomidi on nykyinen kemoterapia-standardin hoitoon aivokasvaimia ja muita syöpiä, jopa 50% aivokasvainten ovat vastustuskykyisiä temotsolomidihoidon [13], [14]. Lisäksi lähes kaikki kasvaimet lopulta palata takaisin ja suurin osa toistuva kasvaimet ovat resistenttejä kemoterapiaa [15], [16]. Siksi uusien hoitovaihtoehtoja mukaan lukien uudet lääkkeet terapia kestävä aivokasvainten tarvitaan kipeästi.

Lisäksi alkylointi- aineiden kuten TMZ, topoisomeraasin estäjät ovat toinen ryhmä syöpälääkkeet arvioitavana. Topoisomeraaseista ovat tärkeä ydinvoiman entsyymejä, jotka säätelevät topologia DNA, ylläpitää genomista eheys ja ovat välttämättömiä DNA: n kahdentuminen, rekombinaatio, transkriptio ja kromosomi eriytymistä [17]. On kuusi ihmisen topoisomeraasi entsyymit [18] ja kolme heistä, topoisomeraasi I, topoisomeraasi IIα ja topoisomeraasi IIβ, ovat merkittävä osallistuminen syövän ja syövän kemoterapian [19]. Topoisomeraasi I entsyymin naarmuja ja rejoins yksi juoste DNA, ja topoisomeraasi II entsyymi lyhytaikaisesti taukoja ja sulkee kaksijuosteinen DNA [20]. Topoisomeraasi I inhibiittorit (esim topotekaani) on käytetty potilailla, joilla on toistuvia pienisoluinen keuhkosyöpä, uusiutuva pahanlaatuinen gliooma, toistuva lapsuusiän aivokasvainten [21], [22]. Vaikka topoisomeraasi-II-inhibiittorit tutkittiin glioomasoluihin [23] – [25], topoisomeraasi II estäjien ei ole laajalti käytetty aikuisten ensisijainen aivokasvaimia johtuen niiden huonosta CNS penetrance. Siksi pienet molekyylit on valmius tunkeutua aivoihin olisi erittäin toivottavaa käsitellä gliooma

in vivo

.

Olemme aiemmin raportoitu, että humaanineuroblastoomasoluja ja ihmisen astrosytoomasoluihin ilmentävät yleisesti esiintyviä polymorfismit että HFE-geeni olivat resistenttejä kemoterapiaa ja säteily [26]. HFE geenituote osallistuu raudan homeostaasiin ja yhteisen HFE polymorfismien, H63D ja C282Y johtaa useita muutoksia soluissa, kuten lisääntynyt Endoplasmakalvosto stressi ja lisääntynyt oksidatiivinen stressi [27] – [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin astrosytooma solulinjoja, jotka olemme määritelleet kanssa HFE-geenin variantit ja temotsolomidin vastustuskyky näytön yhdisteiden DIVERSet yhdisteen kirjasto Chembridge (San Diego, CA), ja havaittiin useita tehokkaita yhdisteitä, joilla on samanlainen kemotyyppi. Havaitsimme analogi tiobarbituurihappoa yhdistettä, joka on vahva myrkyllinen vaikutus temotsolomidin kestävä astrosytoomasoluihin. Raportoimme tässä luonnehdinta johtoon yhdisteen

in vitro

soluviljelmässä ja

in vivo

aivokasvain malleja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), naudan sikiön seerumia (FBS) ja muut soluviljelmä ainesosat hankittiin Life Technologies (Grand Island, NY). Kaikki PCR Array aineosat syötetään SABiosciences (Frederick, MD). Temotsolomidin ostettiin Oakwood Products Inc. (West Columbia, SC) ja liuotettiin soluviljelyelatusainetta tai 100% DMSO: ta. Etumatka kemotyyppi yhdisteellä I (CC-I) tilattiin ChemBridge Corporation (San Diego, CA). Yhdiste liuotettiin DMSO: hon kantaliuoksena ja laimennettu kokeen. Topoisomeraasi entsyymit I ja IIα määritys sarjat tilattiin TopoGen Inc. (Port Orange, FL). Merbaroni Calbiochem (San Diego, CA). Kaikki muut käytetyt kemikaalit hankittiin Sigma Co. (St. Louis, MO).

Ihmisen astrosytooma soluviljelmissä, hoito ja sytotoksisuusanalyysin

Ihmisen astrosytoomasoluihin (SW1088-luokan III, U87-MG-luokan IV, CCF-STTG1-luokan IV, T98G-luokan IV, LN-18-luokan IV) tilattiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja ylläpidetään DMEM (Gibco Life Technologies, luettelo 11885), jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 0,29 mg /ml L-glutamiinia ja 10% FBS: ää. Kaikki kokeet suoritettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä soluviljelmässä olosuhteissa. Sytotoksisuuden määritykset, testatut yhdisteet valmistettiin laimentamalla ensin ne kantaliuosta soluviljelyalustoissa. Yhdisteet altistettiin soluja 3-6 päivää. Solusytotoksisuutta suoritettiin MTS [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetrazolium] soluproleferaatiomäärityksessä (Promega, Madison, WI ) tai sulforodamiini B (SRB) -määrityksellä lopussa soluviljelyn aikana.

Akuutti myrkyllisyys määrittämiseksi

Akuutti myrkyllisyys CC-I määritettiin kateenkorvattomissa nude-hiirissä (kanta 088 tai 490, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) mukaan NIH lääkekehitysohjelmassa akuutti myrkyllisyys menettely pienin muutoksin. Määrittää akuutti myrkyllisyys, yhteensä kuusi naaraspuolisia hiiriä (1-2 kuukautta vanhoja) injektoitiin intraperitoneaalisesti 3 eri annoksilla (esimerkiksi 20 mg /kg, 37,5 mg /kg, 50 mg /kg) CC-I tai ajoneuvon ohjaus kerran viikossa ja sitten havaittiin ajaksi 7-14 päivää. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin painon muutoksia, näkyvä ja /tai käsin tunnustelemalla ihon infektio, läsnäolo askites, ruoan tai ravitsemustilaa ja grooming tai heikentynyt liikkuvuus tai kuoleman määrittää akuutti myrkyllisyys. 7-14 päivän kuluttua hoidosta, 0,5-1 ml verta kerättiin läpi sydämen reikä, kun hiiret olivat nukutuksessa (ketamiinia 100 mg /painokilo /ksylatsiinilla 10 mg /painokilo, vatsaonteloon) veren myrkyllisyys tutkimusta . Kaikki eläimet tutkimukseen asutettiin alkio-vapaa ympäristö huonetta, ja yksittäiset kupla järjestelmiä. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin (IACUC # 2011-062), jonka Pennsylvania State University Institutional Animal Care ja Käytä jäsen.

ihonalainen kasvainmuoto

Voit testata antituumorivaikutus CC- I ihmisen astrosytooma kasvain, yksi-kaksikuukausi vuotias nainen immuunivajaisiin (

nu Twitter /

nu

) nude-hiiriin (kanta 088, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) istutettiin 10 x 10

6 solua hiirtä kohden ihon alle temotsolomidilla herkkä SW1088 tai TMZ kestävät CCF-STTG1 astrosytoomasoluihin. Kun kasvain saavutti noin 32-100 mm

3 koko, hiiret (n = 10 tai 11) jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään. CC-I injektoitiin intraperitoneaalisesti pitoisuutena 25 mg /kg kehon painoa tilavuudessa 200-300 ui 12,5%: ista etanolia kerran viikossa 7 viikkoa. Kontrolliryhmä sai fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) samaan tilavuuteen ja hoito. Kasvaimen koko mitattiin viikoittain mikrometrillä 7 viikon tutkijan sokkona koeolosuhteissa. Kasvaimen tilavuus (V) laskettiin kaavalla V =

2/2 × b, jossa

ja

b

ovat pieniä ja suuria akselit ja kasvainpesäkkeitä, vastaavasti. Tuumorin koko, terveys ja selviytyminen hiiret näkyvästi seurattiin päivittäin ja kasvaimen kokoa mitataan viikoittain. Emme ottaa kuvia kasvaimia. Me harkitsee kuvia tuleviin kokeisiin. Voit seurata myrkyllisyys yhdisteiden, eläimet lopetettiin ketamiini /ksylatsiini 100/10 mg /painokilo intraperitoneaalisesti, ja mitattiin maksan ja munuaisten myrkyllisyys lopussa kokeen.

kallonsisäinen ksenograftimallissa

nainen immunodefisienssimalleissa nude-hiiriin (kanta 088, Charles River Laboratories, Wilmington, MA), jotka painoivat 20-30 g, nukutettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti ketamiini-ksylatsiini 100 mg /kg-10 mg /kg kehon paino. Ihmisen U87-MG ja CCF-STTG1 astrosytooma solulinjoja istutettiin luoda aivoihin -tuumoriksenografti. Lyhyesti, pää pidettiin vaakasuorassa ja 1 miljoona astrosytoomasoluihin tilavuudessa 10 ui injektoitiin hitaasti caudatukseen kivi alueen pienellä eläin stereotaktinen laite. Stereotaktiset koordinaatit käytetään ksenografteista ovat P = 0,5, L = 1,7, H = 3.8 mm. Astrosytoomasoluihin ruiskutettiin hitaasti 10 minuutin ajan, jotta vältetään kohoamista kallonsisäinen paine tai ylöspäin solususpension vuoto kautta radan neulan. Eläimille annettiin buprenorfiinia (0,05-0,1 mg /kg kehon painoa ihonalainen) kivun aikana ja leikkauksen jälkeen. Tämä annettiin välein 8-12 tuntia 24-48 tuntia leikkauksen jälkeen. Eläimille tehtiin T1 painotettu magneettikuvaus (MRI) kahdesti; kerran päättää, että kasvain on perustettu aivoissa (~ 3 viikkoa injektion astrosytoomasoluihin) ja lopussa kokeen. Eläimiä tarkkailtiin päivittäin ja ruumiinpaino tallennettiin viikoittain. Kun kasvain havaittiin, hiiret (n = 12 tai 15) jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään. CC-I (25 mg /kg) tai PBS: ää injektoitiin kerran viikossa intraperitoneaalisesti. Yleinen hiirten eloonjääntiin suoritettiin Kaplan-Meier selviytymisen käyrä. Eläimet lopetettiin mukaisesti hyväksyttäviä menetelmiä eutanasiakysymystä määritellyt American Veterinary Medical Association (AVMA) suuntaviivat Eutanasia – Hyväksytty Eutanasia Methods, 2013. Kun eläimet saavat kehon kunnossa pistemäärä on alle 2, eläimet lopetettiin ketamiini /ksylatsiini 100/10 mg /kg kehon painoa intraperitoneaalisesti samoin kuin toissijainen menetelmä kaula sijoiltaan. Tällä kokeiden päättyessä, plasma kerättiin analysointia maksan ja munuaisten toksisuutta eutanasia ketamiini /ksylatsiini 100/10 mg /painokilo intraperitoneaalisesti.

T1 punnittiin MRI-kuvia

T1 painotettu MRI käytettiin visualisoimaan kasvaimen kasvua käyttämällä 7T MRI-järjestelmän (Bruker, Biospec GmbH, Ettlingen, Saksa). Kuvantamisen parametrit T1 scan ovat TR /TE = 540 ms /11 ms, 8 keskiarvoja, 192 × 192, 0,5 mm leikkeen paksuus, ja 3,2 cm

2 FOV. Hiiret nukutettiin hengittämällä 1-2% isofluraanilla, ja ne on sijoitettu paikkaan, jossa aivojen sijaitsee keskellä käämin. Kallonsisäinen kasvain tilavuus arvioitiin käyttäen Gadolinium tehostetun T1 punnittiin multislice aksiaalinen nopea spin kaiun kuvia. Näistä kuvista koko kasvain laskettiin käyttäen Region-of-Interest työkalu saatavilla Paravision ohjelmisto (Bruker Biospec, Ettlingen, Saksa).

Maksa ja munuaistoksisuutta

Maksa ja munuaistoksisuutta (yhteensä bilirubiini, veren ureatyppi (BUN), kreatiini, aspartaattiaminotransferaasin (ASAT), alaniiniaminotransferaasin (ALT), ja alkalinen fosfataasi) arvioitiin sekä ihonalaisen kasvainmuoto ja kallonsisäinen ksenograftimallia käyttäen automatisoitua kemian analysaattoriin (Roche Cobase MIRA) ja sarjat valmistanut Thermo Electron (Louisville, CO). Veri saatiin ohjaus- tai CC-I ruiskutetaan hiirten astrosytoomasoluihin päättyessä kokeilun.

apoptoosimäärityksessä

apoptoosimäärityksessä, 3 × 10

6 CCF-STTG1 soluja viljeltiin 48 tunnin ajan, jossa on useita konsentraatioita (~36 uM) CC-I tai aktinomysiini D (-80 nM) positiivisena kontrollina. Solut kerättiin seuraavat trypsiini-EDTA-altistus ja pestiin kylmässä PBS: ssä. Sitten 100 ui solususpensiota (~ 1 x 10

6 solua) inkuboitiin 1 ui 100 ug /ml puna-fluoresoivia propidiumjodidin nukleiinihappoa sitovan väriaineen ja 5 ui anneksiini V-FITC: tä (Molecular Probes, Carlsbad, CA) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Solut analysoitiin virtaussytometrialla (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ja emissio 530 nm: ssä (esim. FL1) ja 575 nm (esim. FL3). Solut, joita sitoo anneksiini V havainnollistavat aikaisin apoptoottisia soluja. Solut, jotka ovat reaktiivisia sekä anneksiini V ja propidiumjodidilla ovat nekroottisia soluja.

geeniekspressioprofilointi

Käytimme Apoptosis PCR Array (SABiosciences, Frederick, MD) mitkä geenit muutettu CC -I in TMZ kestävä CCF-STTG1 soluissa. PCR Array suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin ajoneuvo (0,1% DMSO) käsitellä tai CC-I käsitelty CCF-STTG1 solulinjoissa käyttämällä qPCR-Grade RNA Isolation Kit. Yksi ug RNA: ta käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi käänteistranskriptiolla kanssa MMLV käänteistranskriptaasia. Sitten reaaliaikainen PCR suoritettiin laimealla cDNA ja master sekoittuvat ROX suodatin. Signaalin havaitseminen, ABI Prism 7900 Sequence Detector System on ohjelmoitu ensimmäinen steriloinnin vaiheen 2 minuuttia 50 ° C: ssa, jonka jälkeen 10 minuutin denaturaatio 95 ° C: ssa ja sen jälkeen 40 sykliä 15 sekunnin ajan 95 ° C: ssa, 1 minuutti 60 ° C: ssa ja 30 sekunnin 72 ° C: ssa. Kukin reaktio näyte tehtiin kolmena kappaleena. PCR Array tiedot laskettiin ΔΔcycle kynnyksen (ΔΔ

Ct

) menetelmällä, sitten normalisoidaan vastaan ​​useita siivous geenejä ja esitetään keskiarvo kertamuutoksia CC-I käsiteltyjen näytteiden suhteessa ajoneuvon käsitelty kontrolli näytteitä.

Solusyklianalyysiä

solusyklin analyysi, CCF-STTG1 soluja viljeltiin yön yli, jonka tiheys on 2-5 x 10

6 solua pulloa kohti. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CC-I tuoretta soluviljelyalustassa. 24-48 tuntia myöhemmin, kiinnittyneet solut kerättiin ja split (1 x 10

6 solua per putki) pesuun Hankin puskurilla, sitten kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla yön yli -20 ° C: ssa. DNA värjäys päivä, soluja inkuboitiin propidiumjodidilla (100 ug /ml) ja RNaasi A: ta (20 ug /ml) 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa (valolta suojattuna). Näytteet analysoitiin käyttäen BD FACS Calibur Flow Cytometry Analyzer.

topoisomeraasi rentoutumista ja decatenation määritys

DNA rentoutumista ja kinetoplast DNA (kDNA) decatenation määritys suoritettiin käyttäen topoisomeraasi I tai II lääkeseulontaan kit tai Topopoisomerase II iinianalyysikitissä (TopoGEN, Inc., Port Orange, FL) mukaisesti valmistajan ohjeiden [30]. Topoisomeraasi IIα decatenates kDNA, joka koostuu erittäin katenoida verkkojen pyöreän DNA: n ATP-riippuvaisessa reaktiossa, jolloin saadaan yksittäisiä minicircles DNA: ta. Lyhyesti, ja topoisomeraasi IIα välitteisen kDNA decatenation määrityksessä, 20 ui reaktioseos sisältää seuraavia komponentteja; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 0,5 mM ditiotreitolia, 30 ug /ml naudan seerumin albumiinia, 2 mM ATP: tä, 260 ng kDNA useita pitoisuuksia yhdisteitä, ja 4 U ihmisen topoisomeraasi IIα. Lopullinen pitoisuus 0,5% (tilavuus /tilavuus) DMSO: ta käytettiin, koska tämä pitoisuus ei vaikuta aktiivisuuteen topoisomeraasi IIα. Inkubointi määritys seosta suoritettiin 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja pysäytettiin lisäämällä 4 ui stop-loading dye. KDNA decatenation tuotteet reaktioseoksesta erotettiin 1% agaroosigeelissä 100 V: ssa 40 minuuttia, sitten värjättiin 0,5 ug /ml etidiumbromidia TAE-puskurissa (4 mM Tris-emästä /jääetikkaa [0,11% (v /v)] /2 mM Na

2EDTA).

molekyylimallinnus tutkimuksen

molekyylimallitus tutkimukset perustuivat X-ray kiderakenne ihmisen topoisomeraasi IIα sitoutunut L-peptidin 1,50 Å resoluutio (ATE tunnus: 2q5a) [31]. Asema L-peptidiä käytettiin määrittämään mitat CC-I sitoutumiskohta telakointi tutkimuksessa. Telakka välillä topoisomeraasi IIα proteiinia ja CC-I suoritettiin käyttäen GLIDE ohjelmaa (Grid Based ligandia telakointi alkaen Energetics, mistä Schrödingerin, L.L.C.) [32], [33]. Jorgensen OPLS 2005 voimakenttä käytettiin muutettaessa GLIDE ohjelmassa. Optimaalinen sitova geometria kullekin mallille saatiin GLIDE, joka vetoaa Monte Carlo otantatekniikoita yhdistettynä energiaa minimointi. GLIDE SP (Standard Precision-tila) käytettiin telakoida yhdiste CC-I seurasi GLIDE XP (Extra Precision-tila). Schrödingerin LigPrep käytettiin tuottamaan 3D-konformaatioita CC-I

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot tehtiin tilastollinen analyysi opiskelija

t

-testi verrattaessa kaksi ryhmää. Käytimme yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukey-Kramer testi yli kahden ryhmän vertailussa onko erot ovat merkittäviä. Vertailtaessa aikaa kurssin tai pitoisuusdatan suoritimme toistettujen mittausten kaksisuuntaista ANOVA seurasi Tukey-Kramer-testi. Erot avulla pidetään tilastollisesti merkitsevä, kun

p

arvo on pienempi kuin 0,05. LC

50 (50% tappava pitoisuus) yhdisteiden määritettiin käyttämällä tilasto-ohjelmalla (GraphPad Prism 6) yleisenä indikaattorina kemikaalin myrkyllisyys.

in vivo

aivokasvain malli tuumorimäärä tiedot on tiivistää keskiarvoja standardin virheitä. Hiiret eloonjääminen verrattiin ryhmien välillä käyttämällä Kaplan-Meier selviytymisen analyysin logrank testi.

Tulokset

tunnistaminen sytotoksisen yhdisteen vastaan ​​TMZ resistenttejä astrosytoomasoluihin

seulontaan tunnistaneet tiobarbi- analoginen ja annetaan tunnistamista tag kemotyyppi yhdisteellä I (CC-I). Rakenne CC-I on esitetty kuviossa 1A. CC-olin sytotoksinen sekä TMZ-resistenttejä ihmisen astrosytooma solulinjoissa CCF-STTG1 ja TMZ-herkkien SW1088 (kuvio 1 B). LC

50 CC-I SW1088, U87-MG ja CCF-STTG1 solulinjoissa on 13,6 uM, 23,6 uM ja 25,4 uM.

(A) rakenne CC-I. (B) Sytotoksisuus CC-I

in vitro

. Ihmisen astrosytooma solulinjoja viljeltiin eri annoksilla CC-I 3 päivää ja sitten sytotoksisuus määritettiin SRB-määrityksellä. LC

50 CC-I SW1088 solulinjoja (13,6 uM) ovat merkittävästi erilaiset kanssa LC

50 CC-I U87-MG ja CCF-STTG1 solulinjoissa (23,6 uM ja 25,4 uM) ( p 0,001).

Välitön myrkyllisyys CC-I nude-hiirissä

ruiskeet CC-I kerran viikossa 50 tai 75 mg /painokilo olivat tappavia 7 päivää. Kerran viikossa injektiona 35 mg /kg kehon paino oli siedetty. Siksi käytimme noin 70% siedetty annos (25 mg /kg) CC-I pitoisuus

in vivo

tuumorimallissa tutkimus.

Anti-kasvain vaikutus CC -I ihonalainen hiiren kasvain malli

Muodosta kasvaimen vastainen vaikutus CC-I astrosytoomasoluihin, käytimme immuunivajaisiin nude hiiren ihonalaisen kasvainmuoto injektoitiin joko TMZ herkkä SW1088 tai TMZ kestävät CCF-STTG1 solulinjat. Hiiret kasvaimia peräisin CCF-STTG1 solulinja ei havaittu syövän etenemisen seuraavat CC-I injektiot jälkeenkin injektion päättynyt (kuvio 2A), kun taas käsittelemättömän kontrolliryhmän kasvaimen tilavuuden kasvanut dramaattisesti yli 7 viikon aikana (p 0,0001) . Kasvaimet hiirillä päässä SW1088 solulinjasta myöskään edetä aikana injektion aikana, mutta kasvain eteni, kun CC-I injektiot lopetettiin (kuvio 2A). Emme ottaa kuvia kasvaimia. Me harkitsee kuvia tuleviin kokeisiin. Kehon paino torjunta- tai CC-I käsitellyissä hiirissä ei laskenut aikana tutkimuksen ajan (kuvio 2B).

(A) Hiiret istutettiin kymmenen miljoonaa solua kanssa SW1088 tai CCF-STTG1 soluissa. Lähtöaineena kasvaimen koon CCF-STTG1 solut vaihtelivat 80-100 mm

3. SW1088 solut kasvoivat hitaammin niin CC-I hoito aloitettiin, kun kasvaimet saavuttivat 30 mm

3. CC-I injektoitiin intraperitoneaalisesti pitoisuutena 25 mg /kg kehon painoa kerran viikossa 7 viikkoa (n = 7~10). Kontrolliryhmä sai PBS samaan tilavuuteen ja hoito (n = 3-8). Kasvain hitaasti uudelleen syntynyt vuonna TMZ-herkkä SW1088 astrosytooma pistetään nude-hiiriin, mutta ei toistu vuonna TMZ kestävä CCF-STTG1 pistetään nude-hiiriin, kun CC-I lopetettiin (yli 7 viikkoa). CC-I inhiboi kasvaimen kasvua ja ei ollut letaali tahansa hoitoryhmässä. Jotkut virhe palkit ovat liian pieniä ollakseen näkyvä. (B) Keskimääräinen hiirten kehon painon esitetään grammoina. Jotkut virhe palkit ovat liian pieniä ollakseen näkyvä.

Anti-kasvain vaikutus CC-I kallonsisäistä aivokasvain malli

muodostamisen jälkeen

in vivo

tehoa ja turvallisuus CC-I vastaan ​​sekä TMZ herkkiä ja resistenttejä solulinjoja ihonalainen aivokasvain malli, selvitimme kallonsisäistä ksenograftissa aivokasvain malli. U87-MG tai CCF-STTG1 astrosytooma-solut ruiskutettiin hiiren aivoissa ja muodostivat kasvaimia (varmistettiin MRI) ~ 3 viikkoa implantaation jälkeen (kuvio 3A). Yksikään käsittelemätön kontrolli hiiret selvisivät yli 30 päivää, ja mediaani elinaika oli 20 päivää. Jos hiiret, joita hoidettiin CC-I, mutta 64% (7/11) ja U87-MG kasvaimen kantavien hiirten olivat elossa 60 päivää ja 89% (8/9) ja CCF-STTG1 kasvain hiirille oli asuu edelleen 60 päivää (p 0,0001) (kuvio 3B) eikä kasvain oli näkyvissä MK (kuvio 3A). Viisi hiiret U87-MG kasvain ryhmä ja kuusi CCF-STTG1 kasvain ryhmä sai CC-I injektiot olivat elossa 200 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen injektion (137 päivää viimeisen CC-I injektio). Kuten systeemisiä kasvain mallissa ei ollut viitteitä maksan tai munuaisten myrkyllisyyden CC-I kallonsisäistä ksenograftin hiirissä (kuvio 3C). Kehon paino eläimistä ei laskenut saavilla eläimillä CC-I (kuvio 3D).

(A) edustaja MRI otettuja kuvia T1-painotettu MRI (7T MR kuvantamisjärjestelmä) jälkeen kallonsisäistä kasvaimen muodostumisen (yksi-kolme viikkoa implantaation astrosytooman solut) tai sen jälkeen, kun kasvaimen muodostumisen jälkeen syötettiin CC-I (25 mg /kg kehon paino) ja 7 viikkoa. CC-I estivät täysin kasvaimen kasvua sekä astrosytooma solulinjoissa. (B) Kaplan-Meier selviytymisen kuvaaja kallonsisäinen aivokasvain hiirillä annon jälkeen CC-I. CC-I ulottuu selviytymisen hiirillä verrattuna käsittelemättömiin hiiriin (n = 9 tai 11) (p 0,0001). Yksikään hiiristä, jotka saivat PBS: ää (kontrolli) selvisi sen jälkeen, kun 30 päivää ja mediaanielossaolosta kaikki eläimet oli 20 päivää (n = 3 tai 4). (C) Maksa ja munuaiset myrkyllisyys CC-I. Maksa ja munuaistoksisuutta (yhteensä bilirubiini, veren ureatyppi (BUN), kreatiini, aspartaattiaminotransferaasin (ASAT), alaniiniaminotransferaasin (ALT), ja alkalinen fosfataasi) määritettiin käyttämällä automatisoitua kemian analysaattoriin kone (Roche Cobase MIRA) ja sarjat on valmistettu Thermo Electron. Nämä tiedot eivät osoita maksan tai munuaisten myrkyllisyyttä CC-I nude-hiirissä. Myrkyllisyys näkyvien tietojen keskiarvoina ± SEM. (D) Mean hiirten kehon painon grammoina.

Apoptosis CC-I: TMZ resistenttien astrosytoomasoluihin

Seuraavaksi kysyttiin solukuoleman CC-I TMZ kestävä CCF-STTG1 astrosytoomasoluihin välittyy apoptoottisen reitin. CC-I: n indusoiman apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla CCF-STTG1 solulinjoissa (kuvio 4A). Määrä CCF-STTG1 apoptoottista solukuolemaa 36 uM oli verrattavissa positiiviseen kontrolliin apoptoosin indusoija, aktinomysiini D. On näyttöä nekroottisen solukuoleman CCF-STTG1 altistuminen CC-I, mutta vähemmän soluja leimattiin ja merkitys oli saavutetaan vasta kahdesti konsentraatio, jossa apoptoosin ensimmäisenä havaittiin (kuva 4B).

Solukuolemaan seurattiin apoptoottisten ja nekroottista solumarkkerien 48 tunnin kuluttua CC-I altistuminen CCF-STTG1 soluissa. Solukuolemaa määritettiin rekombinantti anneksiini V: konjugoitu fluoreseiini, jota seurasi virtaussytometria-analyysin. Apoptoottista solukuolemaa on esitetty paneelissa A. paneeli B on nekroottinen solukuolema. Aktinomysiini D: tä käytettiin positiivisena kontrollina indusoimaan apoptoottisen solukuoleman. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen seuraavat CC-I käsittely kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla CCF-STTG1 soluja. Ei ollut voimakas annoksesta riippuva nousu nekroottisen solukuoleman CCF-STTG1 solujen kunnes suurempina pitoisuuksina. Tiedot arvioidaan käyttämällä Student

t

testi ja näytetään tarkoittaa ± SEM. Jotkut virhe palkit ovat liian pieniä ollakseen näkyvä. Symbolit osoittavat merkittävää eroa kontrolliin verrattuna. (*** P 0,001).

Apoptosis geenijärjestelyillä CC-I käsitelty TMZ kestävä CCF-STTG1 solujen

Voit selvittää apoptoottisen reitin aktivoitiin CC-I hoito teimme geeniekspressioprofiilien kohdistamalla paneelit apoptoosin. Ihmisen Apoptosis Microarray paljasti, että tuumorinekroositekijä (TNF) reitin geenit ovat suurimmat muutokset geeni-ilmentymisen CC-I käsitellyissä soluissa verrattuna vehikkelillä hoidettuihin soluihin. CC-I (36 uM) lisäsi TNF-superperheen jäsenen 1, 2, 5, 6, ja 9 sekä TNF-reseptoreiden superperheen 5, 9, 10a 30-700-kertaisesti. Niistä kaspaasi-reitin geenit, vain kaspaasi 10 ja kaspaasi 14 indusoitiin. Taitteen suhde muuttunut geenien yhteenveto taulukossa 1.

Effect of CC-I solusyklin temotsolomidin resistenttien astrosytoomasoluihin

Ymmärtääksemme paremmin sytotoksista vaikutusta CC -I, suoritimme solusyklin analyysi CCF-STTG1 solujen jälkeen CC-I hoitoa. CC-I hoidossa CCF-STTG1 soluissa johti merkittävään väheneminen G0 /G1 vaiheeseen, ja kasvu S ja G2 /M vaiheessa verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 5A B).

CCF-STTG1 soluja käsiteltiin 18 tai 36 uM CC-I 24 tai 48 tuntia. Solut värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin sitten solusyklin jakautuminen käyttäen FACScan-analysaattorin. CC-I hoito lisäsi merkittävästi S ja G2 /M solupopulaation, mutta laskivat G0 /G1 vaiheeseen. Symbolit osoittavat merkittävää eroa kontrolliin verrattuna. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001).

topoisomeraasi IIα inhibition CC-I

määritettävä, CC-I voi sitoa ihmisen topoisomeraasi IIα on molekyylimallinnuksen tutkimus. Molekyylimallinnus- dataa ihmisen topoisomeraasin IIα ja CC-esitin, että CC-I sopii onteloon ihmisen topoisomeraasi IIα jossa se voi toimia inhibiittorina (kuvio 6A). Siksi teimme DNA rentoutumista ja kDNA decatenation Määrityksissä kyky CC-I inhiboida topoisomeraasi IIα entsyymiaktiivisuutta. CC-I inhiboi topoisomeraasi IIα aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla. Pitoisuuksina suurempi kuin 23 uM, CC-I inhiboi topoisomeraasi IIα katalysoitu kDNA decatenation (kuvio 6B). Etoposidi (VP16), tunnettu topoisomeraasi II myrkkyä, inhiboi topoisomeraasi IIα 1 mM, mutta ei 0,1 mM pitoisuus (kuvio 6B). Seuraavaksi määritetään, onko CC-I on erityinen estäjä topoisomeraasi IIα käyttämällä super- DNA rentoutumista määrityksessä. CC-En parantaa topoisomeraasin I-välitteisen relaksaation superkierteisen pHOT1 DNA (kuvio 6C). Kamptotesiini, topoisomeraasi I: n estäjä, käytettiin positiivisena kontrollina määrityksessä ja osoittivat odotettua esto topoisomeraasi I-välitteisen DNA rentoutumista. Sen sijaan CC-I osoitti voimakasta estävä vaikutus topoisomeraasin IIα välittämän rentoutumisen superkierteistä pHOT1 DNA (kuvio 6D). Tehollinen konsentraatio CC-I topoisomeraasi IIα välittämän DNA rentoutuminen nähtiin ensimmäisen kerran 11 uM.

(A) rakenne CC-I telakoitu johonkin topoisomeraasi IIα (ATE koodi 1ZXM). Topoisomeraasi näkyy ruskea värinen nauha jäämiä sitoutumiskohtaan.