Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Colon syöpä (CRC) kehittäminen sisältyy usein kromosomi epävakaus (CIN) johtavat monistukset ja poistot suurten DNA-segmenttejä. Epidemiologisia, kliininen ja sytogeneettinen tutkimukset osoittivat, että on olemassa huomattavia eroja CRC kasvaimia Afrikkalainen amerikkalaiset (AAS) ja valkoihoisilla. Tässä tutkimuksessa määritimme genomista kopiomäärä poikkeavuuksia satunnaista CRC kasvaimia AA: laiset, jotta tutkimaan mahdollisia selityksiä havaitun erot.

Menetelmät /Principal Havainnot

sovelletaan genominlaajuisten array vertaileva genomin hybridisaatio (aCGH) käyttäen 105k siru tunnistaa kopioluvun poikkeamia näytteissä 15 AAs. Lisäksi teimme väestö vertaileva analyysi aCGH tiedot valkoihoisista sekä laajalti julkisuutta luettelo paksusuolensyöpä geenien (CAN geenejä). Oli keskimäärin 20 poikkeavuuksien potilasta kohti enemmän monistuksissa kuin poistot. Analyysi DNA kopiomäärän usein muuttunut kromosomeja paljasti, että deleetiot tapahtui pääasiassa kromosomeissa 4, 8 ja 18. Kromosomi päällekkäisyyksiä esiintyi yli 50%: ssa tapauksista kromosomeissa 7, 8, 13, 20 ja X. CIN profiili osoitti joitakin eroja verrattuna valkoihoinen muutoksiin.

Johtopäätökset /merkitys

kromosomi X vahvistus miehillä ja kromosomeissa 4, 8 ja 18 poistot olivat näkyvästi poikkeavuuksia AAs. Jotkin CAN geenit muutettiin korkeilla taajuuksilla AAs kanssa

EXOC4, EPHB6, Gnas, MLL3

ja

TBX22

kuin yleisimmin poistetut geenit ja

HAPLN1, ADAM29, Smad2

ja

Smad4

kuin yleisimmin monistaa geenejä. Havaittu CIN voi olla aseman tunnusmerkkinä CRC AAs.

Citation: Ashktorab H, Schäffer AA, Daremipouran M, Smoot DT, Lee E, Brim H (2010) Distinct geneettisten muutosten peräsuolen syövän. PLoS ONE 5 (1): e8879. doi: 10,1371 /journal.pone.0008879

Editor: Ulrich Zanger, Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology, Saksa

vastaanotettu: 30 syyskuu 2009; Hyväksytty: 02 tammikuu 2010; Julkaistu 26. tammikuuta 2010

Copyright: © 2010 Ashktorab et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat PHS avustusta National Institutes of Health CA102681, The Intramural tutkimusohjelma of NIH, NLM ja GCRC palkinnon Howard yliopistosta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syöpä Yhdysvalloissa [1]. Se on suurempi ilmaantuvuus ja aiheuttaa enemmän kuolemia Afrikkalainen amerikkalaiset kuin muissa roturyhmiä. Useimmat kolorektaalisyövissä syntyvät adenoomia, prosessissa kuvataan adenooma-karsinooma-sekvenssin [2]. Kuten muutkin syövät, taudin alkamisen ja etenemisen CRC liittyy kertymistä toiminnan muutokset keskeisten sääntelyn geenien ja geneettinen epävakaus.

kolme päätyyppiä geneettinen epävakaus CRC on kuvattu [2], [3 ], [4]. Noin 13% CRC tapauksissa yhteensopimattomuuden korjauksen puute johtaa microsatellite epävakauteen (MIN) [5]. Noin 40% CRC kasvaimia on tunnusomaista epigeneettisiä muutoksia, erityisesti DNA: n metylaatio, ilmiö jota kutsutaan CpG Islands Methylator fenotyypin (CIMP) [6], [7]. Lopuissa 47% CRC, kromosomi epävakaus johtaa voittoja ja tappioita suuressa osassa kromosomien [8].

CIN luokkaan kuuluvat syöpiä aneuploidi tai polypoid karyotyyppejä, ja syövät, joissa on useita voittoja tai deleetioita kromosomi käsivarret, tai useita translokaatioita. CIN tulokset spesifisiä mutaatioita ja /tai geenejä vaiennetaan ja voivat johtua rakenteellisista vioista liittyy sentromeerien tai sentrosomimäärän, mikrotubulusten toimintahäiriö, telomeres eroosio, kromosomin hajoamista ja epäonnistuminen solusyklin tarkastuspisteitä [9]. Hankinta toistuvia kromosomi voitot ja tappiot etenemisen aikana korkealaatuisesta adenoomia invasiivisia karsinoomia löytyy CRC kasvaimissa [10]. Yksi varhaisimmista hankittujen geneettisten poikkeavuuksien aikana CRC etenemisen liittyy kromosomi 7 vahvistus, joka on myös havaittu joillakin paksusuolen adenoomia [11]. Myöhemmissä vaiheissa, muiden erityisten kromosomipoikkeamakoe yleistyneet, kuten voitot 8q, 20q [12], 7, 13 [13], [14] ja poistot on 8p, 17p, 18q [13], [15] 15q ja 20q [16].

CIN ja MIN fenotyypit pidettiin aluksi toisensa poissulkevia, koska MIN kasvaimet yleensä vakaa ja diploidinen karyotyyppejä [17], [18]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat havainneet, että MIN ja CIN voi esiintyä samassa kasvaimen [19], [20]. Trautmann et ai. ilmi, että ainakin 50% MSI-H kasvaimet on jonkinasteinen kromosomaalisten muutosten [21]. Vaikka todisteet jonkinasteista CIN voisi löytyä useimmissa MSI-H kasvaimia, erityiset muutokset tunnistetaan vaihteli MSI-H ja MSS kasvaimia. MSI-H kasvainten satama voitot kromosomeja 8, 12, 13 ja tappiot 15q ja 18q kun MSS kasvaimia on korkea ja vaihteleva kromosomaalinen erilaisia ​​poikkeamia [16], [21].

Lassmann et al. tutkittiin 287 kohdesekvensseistä 22 valkoihoinen Kolorektaalituumorien ja löytyy usein poikkeamia tietyillä alueilla kromosomeja 7, 8, 13, 17, 20 ja ehdotti joitakin kandidaattigeenit usein poistetaan tai vahvistus näillä alueilla [22]. Tutkimukset että geenien tunnistamiseen, joilla on muuttunut kopio useita liittyy kasvaimen kehittymisen voi johtaa havaitsemisen erityisiä tavoitteita syöpähoidon ja lisätä ymmärrystä kasvaimen. Oletamme, että tunnistaminen kromosomipoikkeavuuksia CRC AA potilaat saattavat auttaa selittämään näkökohtia paksusuolen syövän synnyssä nimenomaan tässä potilasryhmässä. Siksi tutkimme CIN AA CRC potilailla soveltamalla aCGH kasvaimen näytteitä. Vertasimme tuloksia äskettäin julkaisemat tulokset valkoihoisilla [22] sekä luettelo paksusuolensyöpä geenien ehdottama Sjöblom ym [23] sen jälkeen, kun niiden perusteellisen geneettinen analyysi 11 paksusuolen kasvaimista.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi Howard University Institutional Review Board, ja kirjallinen lupa saatiin.

Potilaat

tuore paksusuolen koepaloja (n = 15) saatiin Afrikkalainen Amerikan potilailla, joille tehdään kolonoskopia Howard University Hospital. Tutkimus hyväksyi Howard yliopiston Institutional Review Board. Tämän tutkimuksen selitettiin potilaille ennen kolonoskopia ja osallistuvien potilaiden antoi tietoon perustuvan suostumuksen. Kliiniset tiedot kerätään kunkin potilaan mukana rodun, sukupuolen, liittyy ohi sairaushistoria, hoitojen käytöstä, ja suvussa paksusuolen syöpä. Potilaat hyväksyä, jos kolonoskopia johti diagnoosi adenokarsinooma, vahvisti histopatologisesti. Vuodesta tarkastelu potilastiedot, kliiniset tiedot kerättiin ja tuloksista perustuu amerikkalaisen sekakomitean Cancer pysähdyspaikan järjestelmä. Tämän tutkimuksen potilaiden itsensä tunnistettu AAs.

Näytteet valinta ja DNA Extraction varten aCGH Analysis

tuore kasvainkudospalasta leikattiin 5 um: n leikkeitä Superfrost dioja (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) . Kasvain ja normaali alueet ominaista patologi (E.L.) käyttäen H

Lista CNVs määrittämällä alku, loppu, ja suhde kunkin geeni;

kynnysrajat voittoja ja tappioita.

ohjelmisto kertomuksen joka geeni siten, että on olemassa risteävän voitto /tappio, joiden suhde on yli /alle käyttäjän määrittämän suhteet. Esimerkiksi geeni

APC

sijaitsee ihmisen kromosomissa 5 välillä [112101484, 112209836]. Kaksi potilasta on tappioita suhteissa 0,8 risteävät välin [112101484, 112209836] ja seitsemän potilailla on voittoja suhteissa 1,2 risteävät samalla aikavälillä. Samoja kynnysarvoja käytettiin tutkimuksessa [22], jolla Vertasimme tuloksia. Yhteenveto tilastot liitetyt ja poistot esitettiin taulukkomuodossa sisällä uusia ohjelmistoja ja Excel.

Tulokset

Ominaisuudet tutkituissa näytteissä

Tutkimme 15 paksusuolen adenokarsinooman AA potilaista. Keski-ikä tässä potilasryhmässä oli 63,5 vuotta kahdeksan naista ja seitsemän urosta. Kasvaimet olivat pääasiassa kohtuullisesti erilaistunut (93%), ja vaiheen II tai III (87%). Kaksi kolmasosaa näytteistä oli oikeanpuoleinen (67%, taulukko 1). Vertailu ryhmämme sairastavien potilaiden kuin Lassmann et al [22] ei osoittanut tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä (taulukko 1).

Yhteenveto Perimän muutostyöt

kaikki 15 tapausta näkyvissä joitakin kromosomi epävakautta. Nämä kromosomimuutokset eivät jakaudu kaikkien kromosomeja. Vain kromosomi 21 eivät osoittaneet mitään monistukset ja vain kromosomin 8 ei osoittanut mitään poistoja. Kaikkiaan 182 monistumistapahtumia ja 101 poisto tapahtumia löytyivät 15 näytettä kaikki yhdessä, jolloin keskimääräinen määrä oli 12,1 monistukset ja 6,7 ​​poistot potilasta kohden. keskimäärin 20 poikkeamia havaittiin kullekin potilaalle tämän tutkimuksen. Monistukset olivat näkyvästi kromosomien 2 (40%), 6 (47%), 7 (80%), 8 (60%), 12 (40%), 13 (60%), 16 (47%), 20 (67 %) ja X (60%). Kromosomihäviämiä olivat yleisempiä kromosomeissa 2 (47%), 4 (53%), 5 (60%), 7 (40%), 8 (67%), 17 (40%), 18 (60%), 19 (40%), ja 22 (40%; taulukko 2).

poikkeavuuksia ovat jakautuneet epätasaisesti 15 potilaalla, joilla neljä potilasta, joilla on vähemmän kuin 10 poikkeamia (potilaat 3, 11, 12 ja 13 ). Lukumäärä poikkeavuuksien ei näytä olevan vaiheen erityisiä, koska nämä neljä potilasta ovat vaiheiden 1, 3c, 3c, ja 3a vastaavasti. Potilaille, joilla on näissä vaiheissa näkyy paljon enemmän poikkeamia (potilaat 2, 4, 5, 8, 9, 10, 11 ja 13). Määrä CNVs ei näytä riippuvan potilaan iästä lähtien potilaat 1 ja 2, nuorin ryhmämme (51 ja 53 vuotta vanha), on 55 ja 42 poikkeamia vastaavasti, kun taas potilaat 3, 11, 12 ja 13 kanssa vähiten poikkeavuudet ovat 65, 83, 73 ja 61 vuotias, vastaavasti. Lisäksi ei ollut mitään korrelaatiota sukupuolen ja taajuuden CNVs.

vertailu aCGH Data CRC CAN Geenit

tarkasteltuna Sjöblom ym. [23] 11 rinta- ja 11 koolontuumoreissa johti perustamiseen luettelo mahdollisesti muuttunut geenien tällaisissa kasvaimia. Yli 90%: n kasvaimia vaihe IV Sjöblom ym verrattuna 6,6% tässä tutkimuksessa. Tarkistimme aCGH tiedot voitot /tappiot 68 geenejä, havaittiin yleisesti muuttaa paksusuolen syöpä kasvaimia. Useimmat näistä geeneistä osoittavat ei-nolla taajuus muutoksen meidän näytteitä. Niistä CRC geenit perustetun Sjöbolm et al [23], yleisimmin poistettu meidän näytteet olivat

EPHB6, EXOC4 (SEC8L1), Gnas, MLL3,

ja

TBX22

. Yleisimmin monistettujen geenien olivat

HAPLN1 (CRTL1), ADAM29, Smad2,

ja

Smad4

(taulukko 3).

vertaileva analyysi aCGH välinen tietojenvaihto AAs ja valkoihoiset

Vertasimme aCGH tiedot AA potilaalla on luettelo useimpien poistettu tai monistettujen geenien saadaan valkoihoinen kasvain kudosten Lassmann et al. [22]. Peräsuolen syöpiä tutkimuksessamme oli yli 90% kohtuullisesti erilaistunut, joka on samanlainen kuin Lassmann et al tutkimus. Kuitenkin osuudet vaiheen II ja III kasvaimet olivat 68% ja 32% Lassmann et al ja 33%, 53% tässä tutkimuksessa. Meidän vertailu osoitti, että 29 geenit ovat samanlaisen muutoksia molemmissa ryhmissä samalla 13 geenit näkyvät eri profiilit (taulukko 4). Näistä 13 geenit,

ATM

geeni pääasiassa monistettiin valkoihoisilla.

DCC

geeni pääasiassa monistettiin valkoihoisista mutta poistettu AA: laiset (p 0,05).

EGR2, FLII, LLGL1, MAP2K5, PCNT, RAF1, SP6, THRB

, ja

TOP3A

geenit poistettiin valkoihoisista mutta muuttumattomina AA potilailla. Kuusi geenit poistettiin in AA: laiset, mutta ei valkoihoisilla tilastollisesti merkitseviä eroja nimittäin;

ATM, INS, KAL1, LRRC32, TOP3A

ja

Xist

(taulukko 4).

STS

geeni oli tuhoutunut valkoihoisilla (p 0,05) ja monistettiin AA: laiset kun

PRPF6

monistettiin AA: laiset ja muuttumattomina valkoihoisilla (taulukko 4). Vertailumenetelmä poissuljettua tunnistaa geenejä, jotka ovat usein muuttuneet Aas mutta eivät sisälly Lassmann et al tutkimus.

Keskustelu

tulkita mahdollisimman geneettinen syitä yleisyys paksusuolen syövän Aas olemme aiemmin suoritettu tutkimuksia MSI, metyloinnin CAN geenien ja mutaatioiden tunnettuja geenejä, kuten

BRAF

ja

KRAS

[24], [25], [26 ]. Vaikka nämä tutkimukset paljastivat joitakin geneettisiä ja epigeneettiset yksityiskohtia tässä potilasryhmässä, kukaan ei ole osoittanut huomattavan suuria eroja AA: laiset ja väestössä. Me täällä johti ensimmäisen analyysin koko genomin paksusuolen kasvaimista AA potilaiden kanssa tavoite saada kattavampi näkymä genomialueiden mukana paksusuolen syövän synnyn. Vertasimme kyseessä olevien julkaistu valkoihoinen näytteistä [22] ja laajalti julkisuutta luettelo paksusuolensyöpä geenien [23].

keskimäärin 20 poikkeavuuksien löytyivät analysoi kasvaimet aseman vahvistamiseksi kromosomi epävakaudesta paksusuolen syövän syntymistä tässä potilasryhmässä enemmän vahvistusta (12,13 tapausta kohti) kuin poistot (6,73 per tapaus) osoittaa kohti suurempaa roolia onkogeenien aktivoituminen kuin tuumorisuppressorigeeneille aktivoinnin tässä prosessissa. CRC muutokset kohdennettu tiettyihin kromosomit enemmän kuin toiset. Kromosomit 7, 8, 13, 20 ja X monistettiin yli 50% tapauksista tässä tutkimuksessa. On osoitettu, että kromosomit 7, 8, 13 ja 20 ovat mukana CRC kautta vahvistus [22]. Meidän tulokset osoittavat, että lisäksi on tärkeää kromosomin X, joka monistettiin 60%: ssa tapauksista. Monet julkaisut viittaavat kromosomi X sisältäviä tuumorisuppressorigeeneille havaitaan sen jälkeen poistot kasvaimissa [27]. Monistaminen kromosomi X p ja q aseiden esiintyi useammin miehillä (5 out of 7 (71,4%)) kuin naisten niistä (2 out of 8 (25%)). Tutkimus Japani CRC potilaista todettu samalla, että voitot X-kromosomissa ovat näkyvämpiä mies- kuin naispuolisilla potilailla [28].

Meidän alaryhmässä 7 miespotilailla, 3 (42,8%) osoitti poistetaan yhteisen alue ulottuen Yq11.223 kautta centromere on Yp11.31 bändi. Keskustellaan siitä mahdollisesta roolista Y kromosomi tappiot sairauksia kuten akuutti myelooinen leukemia tai onko tällainen prosessi on vain ikään liittyvä [29]. Potilaat 4, 7 ja 10, joissa Y kromosomihäviämiä ovat 71, 57 ja 64 vuotias vastaavasti. Suurempi mies CRC väestö tarvitaan selvittämään roolin tässä kromosomissa saattaa olla paksusuolensyöpä.

Kromosomit johon poistot tiedetään olevan yleisiä CRC ovat 8, 15, 17 ja 18 [22]. Ryhmämme kromosomeja 4, 8 ja 18 näkyvät poistot yli 50%: ssa tapauksista, kun taas kromosomien 15 ja 17 poistettiin taajuuksilla 33,3% ja 40% vastaavasti. Siten toimenpide kromosomien usein deleetioita, CRC AAs näyttää olevan samanlainen CRC valkoihoisista.

Tarkistimme luettelo 68 geenien Sjöblom ym [23], jotka ovat mahdollisesti mukana paksusuolensyöpä nähdä tilan näiden geenien meidän potilasryhmässä. Kaikki nämä geenit osoittavat jonkin verran muutos (vahvistus tai poistetaan) meidän potilailla. Nämä tulokset vahvistavat CAN geeni tila (taulukko 3). Yksi poistetut geenit oli

EPHB6

, jonka tiedetään hidastavan rintasyövän solulinjat invasiivisuus [30]. Toinen geeni

EXOC4 (SEC8L1),

joka sisältää polymorfismi liittyy tyypin 2 diabetes [31] Myös usein poistettu meidän näytteitä, ja tiedetään rooli synaptogenesis ja aivojen kehitys [32]. Proteiini EXOC4 on osa exocyst kompleksin, joka on liitetty rintasyövän invasiivisuus [33].

MLL3

geeni ei muutu Korean CRC potilailla [34] ja harvoin muuttunut toisessa tutkimuksessa [35], mutta se on yksi yleisimmistä tavoitteista poisto meidän potilasryhmässä.

Gnas

jonka ilmentymisen lisää Galphas lauseke on proapoptoottiset geeni mukana monissa kiinteiden elinten syöpiin [36]. Sen tehtävänä on johdonmukainen havainneet, että se on myös erittäin poistetaan AA CRC potilailla. Mutaatiot usein poistettu geeni

TBX22

liittyy ei-oire- suulakihalkiota [37], mutta

TBX2

ei tiettävästi roolia kasvainten synnyssä.

Yksi CAN geenit alkaen Sjöblom ym. lista [23], seuraavat ovat yleisimmin monistaa AA potilaat:

Smad2, Smad4, ADAM29

, ja

HAPLN1

. Proteiinit ADAM perhe ovat ryhmä metalloproteinaasi jonka ADAM17 on eniten tutkittu. ADAM17 tarvitaan sukupolven aktiivisten muotojen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) ligandeja, ja sen toiminta on tärkeää kehitystä epiteelikudosten [38]. Pitäisi ADAM29 toimivat myös aktivoida kasvua reseptoreihin, niin sen vahvistus kasvaimissa olisi järkevää.

HAPLN1

(

CRTL1

) geeni koodaa soluväliaineen proteiini, joka on tärkeä rooli sydämen kehityksen [39]. Ilmaus

HAPLN1

voidaan muuttaa aikana ja peräsuolen syövän synnyn [40]. Molemmat

Smad2

ja

Smad4

tiedetään osallistuvan solujen lisääntymisen, apoptoosin ja erilaistumisen kautta TGF-reitin [41]. Sinänsä niiden vahvistus saattaa olla avuksi kasvun edistämiseksi ja syövän syntymistä yhdessä muiden geenien.

tarkastetaan 42 CRC geenien ehdottama Lassmann et al. olla usein tavoitteisiin CNVs [22]. Me kommentoida muutamia geenejä, jolle Kaukasian ja AA näytteet osoittivat eri mallien poikkeavuuksia.

ATM

geenin, jonka koodaama proteiinituote on välttämätön DNA-vaurioita vastaus ja edistää solujen homeostaasin [42], oli usein monistettiin valkoihoisten potilaiden keskuudessa, mutta ei AA ryhmässä. Toisaalta,

PRPF6

vain monistetaan AA: laiset (taulukko 4). Mutaatiot geeneissä samasta perheestä (

PRPF3

,

8

, ja

31

) ovat sekaantuneet retinitis pigmentosa [43]. Kuitenkaan mitään roolia syövän

PRPF6

tai muiden siihen liittyvien geenien tiedetään. Kaksi geeniä osoitti vastapäätä muutoksia kahdessa potilasryhmissä;

DCC

oli ensisijaisesti monistettiin valkoihoisista mutta poistetaan AA: laiset, kun taas

STS

geeni oli tuhoutunut valkoihoisilla ja monistettu AAs. Todellakin,

DCC

on yleensä alas-tai poistuneita paksusuolen syöpäpotilaiden koska sen TSG ominaisuuksia, joita on enemmän sopusoinnussa sen deleetiosta käyttämällä aCGH meidän potilailla [44]. Konstitutiivinen ilmentyminen

STS

geenin (steroidisulfataasin geeni) edistää kasvua ihmisen rinta- syöpäsolujen [45]. Vaikka erot Lassmann et ai, Sjöblom ym [22], [23] ja tutkimuksemme saattaa johtua osittain tasolle kromosomipoikkeavuuskokeessa, data meidän tutkimus osoitti, ettei kasvain vaiheessa eikä erilaistumista tila oli vaikutus kromosomi epävakautta. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan, missä vaiheessa ja erilaistumisen Hyväksytty kasvaimia eri populaatioiden arvioidaan.

Yhteenvetona meidän aCGH analyysi 15 AA peräsuolen karsinoomat osoittaa, että kaikki kasvaimet sisältävät jonkin verran kromosomi epävakautta. Georgiades et ai. ovat tunnistaneet ryhmä karsinoomien ilman CIN [4]. Sellainen ei ole meidän AA potilaille. Suurempi määrä potilaita on tarpeen tutkia, onko tällainen CRC kasvaimia esiintyy AAs tai kaikki AA CRC on joitakin tasoja CIN. Laajempi analyysissa MSI ja metylaation profiilit analysoidaan kasvainten lisäksi CIN analyysi voi myös valaista koukeroita ja erityispiirteet näiden eri prosessien kasvainten synnyssä. Rooli X-kromosomissa monistuman paksusuolen syövän syntymistä AA potilailla, erityisesti miehillä, ansaitsee lisätutkimuksia.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää M. Nouraie hänen kommentteja tilastollinen osa tätä käsikirjoituksen.