Krooninen sairaus

tiivistelmä

Artonin E on prenyloitua flavonoidi eristetään varren kuori

Artocarpus elasticus

Reinw. ( Moraceae). Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää apoptoottinen mekanismien aiheuttama artonin E on metastasoitunut ihmisen munasarjasyövän solulinja SKOV-3

in vitro

. MTT-määritystä, klonogeenisten määritys, akridiinioranssilla ja propidiumjodidilla kaksinkertainen värjäys, solusyklin ja anneksiini-V-analyysit suoritettiin tutkimaan tila artonin E-solukuolema eri ajankohtina. DNA-tikapuiden, kaspaasien aktivaatio-3, -8, ja -9, multi-parametrinen sytotoksisuus-3analysis korkean sisällön seulonta, mittaus reaktiivisen hapen tuotannon, ja Western blot käytettiin tutkimaan reittejä mukana apoptoosin. MTT tulokset osoittivat, että artonin E esti kasvua SKOV-3-soluissa, IC

50-arvot 6,5 ± 0,5 ng /ml 72 tunnin kuluttua hoidon, ja osoitti vähemmän toksisuutta kohti normaalia ihmisen munasarjan solu lineT1074, jossa IC

50-arvo 32,5 ± 0,5 ng /ml. Tulokset osoittivat, että artonin E aiheuttaman apoptoosin ja solusyklin pysähtyminen S-vaiheen. Tämä yhdiste on myös edistänyt kaspaasien aktivaatio-3, -8, ja -9. Lisätutkimisesta ehtyminen mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapauttamaan sytokromi

c

paljasti, että artonin E indusoi apoptoosin kautta sääntely ilmentymisen pro-selviytymisen ja proapoptoottisten Bcl-2-perheen jäseniä. Ilmentymistasojen surviviinin ja HSP70-proteiineja myös alas säännelty SKOV-3-soluja käsiteltiin artonin E. Ehdotamme, että artonin E indusoi antiproliferatiivinen vaikutus, joka johti S-vaiheeseen solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin kautta säätelyhäiriö mitokondrioiden polkuja, erityisesti pro – ja anti-apoptoosin signalointireitteihin.

Citation: Rahman MA, Ramli F, Karimian H, Dehghan F, Nordin N, Mohd Ali H, et al. (2016) Artonin E indusoi apoptoosia kautta Mitokondrioiden säätelyhäiriön in SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 11 (3): e0151466. doi: 10,1371 /journal.pone.0151466

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 05 helmikuu 2015; Hyväksytty: 29 helmikuu 2016; Julkaistu: 28 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Rahman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: kirjoittajat haluavat kiittää Malayan yliopisto tarjoamiseksi tutkimuksen avustuksia UMRG hanke (RG077- 12BIO), Institute of Research Management and Monitoring Research Grant (PG162-2014B) ja opetusministeriön korkeakoulu Malesian High Impact Research Grant (UM-Mohe UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09) niiden taloudellista tukea suorittaa tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut : kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyövän pidetään kaikkein tappava gynekologinen maligniteetti [1]. Maailmanlaajuisesti yli 230000 uutta tapausta munasarjasyövän raportoidaan vuosittain noin 140153 kuolemantapausta vuosittain [2]. Epidemiologiset tutkimukset osoittivat, että ilmaantuvuus munasarjasyövän ovat suurin läntisellä ja kehitysmaiden teollisuusmaissa. Vuonna 2012 lähes 22280 uutta tapausta munasarjojen syöpiä diagnosoitiin Yhdysvalloissa, jossa on noin 15520 odotettavissa kuolemaa [3]. Malesiassa, varsinkin Malakka, munasarjasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä naisilla, jotka muodostavat 5% kaikista naisten syöpätapauksista [4].

Lähes 75% munasarjasyövän potilailla esiintyy etäpesäkkeitä tauti pidemmälle munasarja koska syövän sijainnista [5, 6]. Ei seulontatestit on tällä hetkellä saatavilla varhaiseen havaitsemiseen munasarjojen syöpien. Siksi seuraava sytoreduktiivisen leikkauksen, kemoterapian on ollut tärkein lähestymistapa munasarjasyöpä hoitoon. Useimmat nykyiset terapeuttisen menettelyt munasarjasyöpä potilaille perustuvat platina johdettuja lääkkeitä yhdessä paklitakselin [7, 8]. Sisplatiini ja karboplatiini ovat voimakkaimpia platina-johdettu kemoterapiaa huumeita käytetään hoidettaessa munasarjasyöpää. Vaikka kemoterapia ja sytoreduktiivisen leikkaus pääsee hoitoon munasarjasyöpä, nämä lähestymistavat ovat huomattavasti tehottomia ja erittäin myrkyllistä alhainen eloonjäämisaste. Lisäksi lääkeresistenssin kehittymisen, joka tapahtuu ajan mittaan tekee munasarjasyövän haastavampaa. Myrkyllisyys ja kestävyys nykyiset kemoterapeuttisten ovat kannustaneet tutkijoita tutkimaan uusia lääkekandidaatteja luonnontuotteista, keskittyen apoptoosin fysiologinen prosessi, joka tarjoaa tehokkaan, ei-sytyttävät lähestymistapa karkottaa vahingoittaa soluja kudoksista, näin turvata kudosten homeostaasin [9]. Koska syöpäsolut ovat kehittyneet useita väyliä vastustaa apoptoosin, hyödyntämällä luonnollisia tuotteita, jotka saattavat olla kyky tukahduttaa, tappaa, lohko, ja kääntää kasvaimen kehittymisen prosessi voi tarjota uusia mahdollisuuksia syövän lääkekehityksessä, erityisesti hoidettaessa munasarjasyöpää [ ,,,0],10].

suvun

Artocarpus

(Moraceae) käsittää lähes 55 lajia, jotka ovat jakautuneet laajasti koko trooppisilla ja subtrooppisilla alueilla, kuten Malesia, Indonesia, Uusi Guinea, ja eteläisen Tyynenmeren [11 ]. Tietyt lajit tämän suvun ovat olennaisia, hyvää ruokaa, kuten

Artocarpus chempeden

(Chempedak),

.

heterophyllus

(jakkipuun), ja

.

altilis

(leipäpuun) Monet jäsenet kirjataan on lääkkeiden arvo hoidossa useita sairauksia, kuten malaria, tulehdus, haavauma, ja ripuli [12, 13]. Erityisesti

Artocarpus elasticus

Reinw. Ex Blume on merkittävä lähde flavorful ruoka, puu, ja perinteisen kansanlääkinnässä monia sairauksia.

Artonin E on tunnettu prenyloituja flavonoidi. Tämä yhdiste löytyy useista

Artocarpus

kasveja, kuten

.

elasticus

,

.

nobilis

[14],

.

gomezianus

[15], ja

.

communis

[16]. Aiemmat tutkimukset toiminnan artonin E vastaan ​​valittu syöpä solulinjoja, mukaan lukien MCF-7 (rinta adenokarsinooma), HCT-8 (ileocecal), MDA-MB-231 (rinta adenokarsinooma), KB (ihmisen suun epidermoidikarsinooma) Vero-soluista linja, ja P388 (leukemia) solulinjat, näytetään mielenkiintoinen antiproliferatiivinen tulokset [11, 17, 18]. Tämä yhdiste oli myös vahva radikaalinsieppausaktiivisuus ominaisuuksia vastaan ​​DPPH radikaali [19] ja se osoittautui olevan voimakas arakidonaatista 5-lipoksigenaasin estäjän kanssa IC

50-arvo 0.36μM [20]. Lisäksi, artonin E parantaa anoikis (irtoaminen indusoiman apoptoosin) ja H460-solujen (keuhkosyöpä) annoksesta riippuvalla tavalla [21]. Tämä yhdiste on myös herkistyneet soluista vähen- tämisessä anti-apoptoottisen myeoloid leukemia cell-sekvenssi-1 (MCL1) proteiini [21]. Viime aikoina artonin E osoittivat lupaavaa kulkeutumista estävällä ja anti-hyökkäys ominaisuuksia ihmisen keuhkosyövän solujen H460 [15]. Parhaan tietomme mukaan mekanismi artonin E syöpävastaisena ja apoptoosin indusoiva aine ihmisen munasarjasyöpäsoluja ei ole selvitetty. Näin ollen esillä oleva tutkimuksen tavoitteena oli tutkia apoptoosia indusoiva ominaisuudet artonin E ihmisen munasarjasyövän solujen ja mahdolliset mekanismit.

Materiaalit ja menetelmät

Kasviaines

varsi kuoria

.

elasticus

kerättiin Ulu Langat, Selangor, Malesia vuonna 2010. Kokoelma kasviaineiston ei edellytä lupaa paikallisilla viranomaisilla, koska kasvi ei ole uhanalainen laji. Näytteet tunnistettiin Dr. Rusea Go päässä Biologian laitos, tiedekunta, yliopiston Putra Malesia. Tosite näyte (S94408) talletettiin laitoksella kasvio [22].

Plant louhinta

Kuivattu kuori

.

elasticus

(1,5 kg) jauhettiin ja sen jälkeen uutetaan huoneen lämpötilassa käyttäen heksaani, EtOAc: lla ja metanolia liuottimina. Liiallinen liuottimet konsentroitiin pyöröhaihduttimella, jolloin saatiin 1,55 g, 40,22 g ja 30,52 g tummanruskeaa puolikiinteitä uutetta, vastaavasti. EtOAc-raakauute (38,22 g), päällystettiin silikageelillä ja alistettiin jakotislauspoisto tyhjiötä käyttäen nestekromatografiaa. Pylväs eluoitiin heksaanin, heksaani /CHCl

3, CHCI

3 /EtOAc, EtOAc /MeOH, ja MeOH: lla, jolloin saatiin 60 jakeet 200 ml kutakin. Samanlaisia ​​jakeet yhdistettiin perusteella TLC profiilin. Kiteytys fraktiot 26-36 saatiin 2,3 g (0,06%) keltaista jauhetta. Sen jälkeen yhdiste kiteytettiin uudelleen heksaanista ja asetonia, jolloin saatiin artonin E, jonka sulamispiste (sp) on 232-233 ° C [23] ja m.p.of 231-232 ° C: ssa, vastaavasti. Metanoli Uute fraktioitiin käyttäen tyhjiö pylväskromatografialla (samanlainen tyhjiö pylväskromatografialla) tuottaa toisen erän artonin E tuotetta (0,6 g, keltaisena kiinteänä aineena).

eristäminen artonin E

Artonin E eristettiin keltaisena jauheena (3 g), sp 232-233 ° C [23], sp 231-232 ° C, metanolista ja etyyliasetaatista kuori otteita

.

elasticus

. Isolaatit tehtiin tunnistamista ja tarkempaa analysointia, ja saatiin seuraavat tulokset: IR

v

max cm

-1 3417 (OH), 2979 (tyydyttyneitä CH), 1644 (C = O), 1462, ja 1354; UV λ

max nm, (log ε) 351 (0,35), 268 (1,29), 209 (1,01);

1H-NMR (400 MHz, asetoni

-d

6

) on δ 13,19 (

s

, 1H, OH-5), 6,82 (

s

, 1H, H-6 ’), 6,57 (

d

,

J

= 11 Hz, 1H, H-14), 6,54 (

s

, 1H, H-3 ’), 5,62 (

d

,

J

= 10,1 Hz, 1H, H-15), 5,08 (

t

J

= 6,3 Hz, 2H, H-10), 3,1 (

d

,

J

= 7.36Hz, 2H, H-9), 1,52 (

s

, 3H, H-13), 1,41 (

s

, 3H, H-12), 1,39 (

s

, 3H, H-17), ja 1,39 (

s

, 3H, H-18); APT-NMR (100 MHz, asetoni

-d

6

) on δ 182,4 (C = O), 161,8 (C-2), 161,4 (C-7), 159,1 (C-5), 152,4 (C-8a), 148,9 (C-2 ’), 148,6 (C-4’), 138,2 (C-5 ’), 131,5 (C-11), 127,2 (C-15 ), 121,6 (C-10), 120,8 (C-3), 116,2 (C-6 ’), 114,6 (C-14), 110,5 (C-1’), 104,7 (C-4a), 103,8 (C- 3 ’), 100,7 (C-6), 98,8 (C-8), 77,9 (C-16), 29,1 (C-18), 29,1 (C-17), 27,4 (C-13), 23,7 (C- 9), ja 16,8 (C-12); EIMS

m /z

(% intensiteetti) 436 (M

+, 45), 421 (100), 393 (24), 203 (66), 182 (22), ja 69 (15 ). Perustuen edellä mainitut fyysiset ja spektritiedot, yhdiste tunnistettiin tunnettu flavone nimeltä artonin E (kuvio 1) [23].

Soluviljely

Metastasoitunut munasarjan adenokarsinooma (SKOV- 3) ja normaalin kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO) solulinjat alun perin saatu American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). SKOV-3-soluja viljeltiin McCoyn 5A-väliaine ja CHO-soluja viljeltiin F12K väliaineessa. Ihmisen säikeet fibroblastisolulinjassa ostettiin Lonza, USA ja ylläpidetään strooman solujen peruselatusaineessa [24]. T1074 (normaali kuolemattomaksi ihmisen munasarjan pintaan epiteelisolulinja) alun perin hankittiin Applied Biological Materials (ABM

®) Kanada ja viljeltiin Prigrow 1 väliaineessa [25, 26].

solunelinkykyisyysmääritys

inhiboivat vaikutukset artonin E ja kaksi positiiviset kontrollit paklitakselia ja karboplatiinia tutkittiin MTT: llä. Solut tiheydellä 5 x 10

3cells /kuoppa asetettiin 96-kuoppaiselle levylle ja jätettiin 24 h liittää. Kiinnittyneet solut altistettiin artonin E, paklitakseli ja karboplatiini eri pitoisuuksina ja inkuboitiin 24, 48 ja 72 h. Sen jälkeen, 20 ui 5 mg /ml MTT-liuosta lisättiin sen jälkeen, kun lääkehoitoa ja saatua seosta inkuboitiin 4 h muodostamiseksi violetti formatsaanin. Sen jälkeen 100 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) siirrettiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi violetti formatsaania, ja tulokset mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Sveitsi) absorbanssilla 570 nm: ssä. Puoli-maksimaalinen pitoisuudet, jotka aiheuttivat solujen kasvun esto (IC

50-arvot) saatiin MTT-elinkyky kasvukäyrän.

Morfologiset tutkimus käyttäen normaalia käännettyä mikroskooppia

SKOV-3 solut pantiin 6-kuoppalevylle ja jätettiin 24 tunnin liittää. IC

50 artonin E 48 h hoidon jälkeen (8 ug /ml), joka perustuu tuloksiin MTT solunelinkykyisyysmääritys käytettiin hoitoon solujen koko kokeissa, lukuun ottamatta klonogeenisten määrityksessä. Kiinnittyneet solut käsiteltiin artonin E 24, 48, ja 72 h ja niitä tarkkailtiin normaalin käännettyä mikroskooppia 200-kertaisella suurennuksella. Solu morfologisia muutoksia arvioitiin ja verrattiin käsittelemättömään eläviin soluihin.

klonogeeninen määritys

SKOV-3 solut trypsinoitiin, sentrifugoitiin, ja täydennetään tuoreella liuoksella. Solut välittömästi laskettiin ja ympättiin (300 solua /levy) on 60 mm petrimalja, ja jätettiin yöksi liittää. Liitteenä soluja käsiteltiin 0, 1, 5, 10, 15, ja 20 ug /ml artonin E 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen käsitelty media poistettiin ja tuoretta väliainetta lisättiin. Soluja inkuboitiin kolmen viikon ajan, jolloin muodostuu pesäkkeitä. Elossa pesäkkeet kiinnitettiin 90% etanolilla ja värjättiin kristallivioletilla.

morfologinen arviointi apoptoottisten solujen akridiiniorans- ja propidiumjodidilla kaksinkertainen värjäys

vaikutus artonin E indusoimisessa solukuoleman SKOV -3 soluihin määritettiin käyttäen akridiiniorans- (AO) ja propidiumjodidia (PI) kaksinkertainen värjäys. SKOV-3-soluja maljattiin 5 x 10

5cells on T75cm

2: n pulloon ja inkuboitiin yön yli kiinnittymisen sallimi-. Sitten solut altistettiin 8 ug /ml artonin E 24, 48, ja 72 h. Inkuboinnin jälkeen käsitellyt solut pestiin PBS: llä, ja sitten ne trypsinoitiin, ja sentrifugoitiin 1500 rpm 5 minuutin ajan. Sitten solut suspendoitiin uudelleen kylmään PBS: ään ja sentrifugoitiin kahdesti saada tuoretta puhdasta pellettien. Tuoreet pelletit sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa fluoresoivan väriaineen värjäysliuosta (1: 1), joka käsittää 10 ug /ml AO ja 10 ug /ml PI (PBS-liuos). Juuri värjätään Solususpensio pudotetaan lasilevylle ja tarkkailtiin UV-fluoresenssi mikroskooppi (Leica kiinnitetty Q-Flora Software) 30 min, ennen häipyminen fluoresenssin. Morfologiset kriteerit luokittelua varten terve, apoptoottisten, ja nekroottiset solut ovat seuraavat: (i) elävät solut osoittavat vihreä ydin pyöreä ehjä rakenne; (Ii) varhaisen apoptoosin näyttää tiheä kirkkaan vihreä ydin kromatiinin tiivistyminen; (Iii) myöhäinen apoptoosin osoittaa tiheä oranssi alue kondenssiveden muodostumisen vuoksi kromatiinin; ja (iv) toissijainen kuolion näyttää oranssin /punainen ehjä tuma [27].

anneksiini V määritys

anneksiini V määritys suoritettiin käyttäen BD Pharmingen

TM anneksiini V-FITC apoptosis Detection Kit (ApoAlert anneksiini V, Clontech, Kalifornia, USA). Solut pantiin 6-kuoppalevylle ja jätetään yön yli liittää. Sitten soluja käsiteltiin 8 ug /ml artonin E 24, 48, ja 72. Käsiteltyjen solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin 1500 rpm: ssä 10 minuutin ajan jäljelle jääneen media. Sen jälkeen, 1X sitova puskuria lisättiin huuhdella tuorepelletit ennen uudelleen suspendointia 200 ui: aan sitoutumispuskuria. Solut sekoitettiin sen jälkeen 5 ui anneksiini V: n ja 10 ui PI ja inkuboitiin 15 minuuttia pimeässä huoneen lämpötilassa. Valmistetut solut olivat heti analysoitiin virtaussytometrianalyysin (FACS Canto 11 Becton-Dickson). Sitten 300 ui sitomispuskuria lisättiin kuhunkin näytteeseen säätää reaktion tilavuus vähintään 500 ui varten virtaussytometria-analyysiä. Soluja käsiteltiin DMSO: ta (0,1%, tilavuus /tilavuus), käytettiin kontrollina.

Solusyklianalyysiä

SKOV-3-soluja pitoisuutena 5 x 10

5-soluja maljataan T75cm

2 pulloon ja inkuboitiin yön yli, jotta kiinnitys. Liitteenä soluja käsiteltiin 8 ug /ml artonin E eri ajankohtina. Käsittelyn jälkeen solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin 1500 rpm: ssä 10 min. Tuoreet pelletit pestiin kahdesti PBS, kiinnitettiin 500 ui 70% kylmää etanolia, ja inkuboitiin -20 ° C: ssa yön yli. Jäljellä oleva etanoli poistettiin sitten ja solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 20 ui RNaasi A: ta (10 ug /ml) ja 2 ui PI (2,5 ug /ml). Saatua seosta inkuboitiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa pimeässä. Näytteet analysoitiin välittömästi käyttämällä FACS Canto 11 Becton-Dickinson virtaussytometria. Kunkin näytteen 10000-soluja mitattiin. ModFit LT-ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME) käytettiin analysoimaan solujen prosenttiosuus eri vaiheissa.

Detection reaktiivisten hapen lajien sukupolven

2 ’, 7’-Dichlorofluorescin diasetaatti (DCFH-DA) käytettiin tutkimaan tuotannon solunsisäisten reaktiivisten hapen lajien SKOV-3-soluja käsiteltiin artonin E. SKOV-3-soluja siirrostettiin 96-musta levy ja inkuboitiin yön yli liittää. Solut käsiteltiin sitten 8 ug /ml artonin E 24, 48, ja 72 h. Hankin tasapainotettu suolaliuos ilman seerumia käytettiin solujen pesuun. Sitten 100 ui DCFH-DA-liuosta lisättiin kuhunkin määrättyyn kuoppaan, ja levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Tulokset analysoitiin käyttäen fluoresenssi- mikrolevynlukijaa (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Sveitsi) 485 nm: n virityksellä ja 520 nm emissio.

moniparametrisissä Sytotoksisuus 3 korkea-pitoisuus seulonta

Cellomics moniparametrinen sytotoksisuus 3 kit (Thermo Scientific

TM, Pittsburgh, PA, USA) käytetään suorittamaan samanaikaisesti havaita ratkaiseva apoptoottisten tapahtumien SKOV-3-soluja käsiteltiin artonin E. Lyhyesti, SKOV-3-soluja ympättiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa musta tasapohjaiseen 96 kuopan levyille (PerkinElmer, Inc., Wellsley, MA, USA) ja jätettiin yön yli liittää. Liitteenä soluja käsiteltiin 8 ug /ml artonin E 24, 48, ja 72 h. Käsitellyt solut altistettiin sitten 50 ui elävien solujen värjäytymisen liuokseen 30 minuutin ajan. Ylimääräinen väliaine ja elävien solujen värjäytymisen liuos oli varovasti poistetaan ja solut kiinnitettiin sitten 16% paraformaldehydillä. Kiinnityksen jälkeen solut altistettiin kanssa permeabilisointipuskuriin seurasi estopuskurissa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ensisijainen Sytokromi

C

vasta-aineita ja toisen DyLight 649 konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä lisättiin ja annettiin olla vuorovaikutuksessa 1 tunnin ajan kutakin. Hoechst 33342 väriainetta käytettiin värjäämään tumien SKOV-3-soluissa. Mosaiikki SKOV-3-soluja 96-kuoppalevyillä analysoitiin käyttäen ArrayScan high-content seulonnan (HCS) järjestelmä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja kokeet toistettiin kaksi kertaa.

Sytokromi c vapauttava apoptoosimäärityksessä

Sytokromi c vapauttavan apoptoosia iinianalyysikitissä (ab65311) hankittiin Abcam

® (Cambridge, Iso-Britannia ). Määritys suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, SKOV-3-soluja indusoitiin artonin E eri ajankohtina. Indusoitujen ja un aiheuttama solut otettiin talteen ja sentrifugoitiin 6,00 x

g

5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut pestiin kaksi kertaa 10 ml: lla jääkylmää PBS: ää, sentrifugoitiin ja kerättiin pelletti. Tuoreet pelletit uudelleen suspendoitiin 1,0 ml: aan 1X sytosolin uuttopuskuria yhdistelmä, joka sisältää DTT: tä ja proteaasi-inhibiittori ja inkuboitiin jäillä 10 minuutin ajan. Sitten solut Dounce-homogenisoidaan ennen sentrifugoimalla 7000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin ja tallennetaan solulimafraktiot. Jäljellä olevat pelletit suspendoitiin uudelleen 0,1 ml: mitokondrion uuttopuskuria, vorteksoitiin 10 sekunnin ajan ja tallennetaan mitokondrioiden jakeet. Sekä soluliman ja mitokondrioiden fraktiot haettu proteiinien analyysiä ja eteni standardin Western blot menettelyä.

Aktivointi kaspaasien-3, -8, ja -9 määritys

Kalorimetriset määritys aktivoinnin kaspaasien -3, -8, ja -9 suoritettiin käyttäen T K-järjestelmä kit, USA. Lyhyesti, on T75cm

2: n pulloon 90% konfluentteja SKOV-3-soluja indusoitiin artonin E 24, 48, ja 72 h. Indusoidun solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin 1800 rpm: ssä 10 min. Tuoretta Pelletit pestiin kylmällä PBS: llä ja heti lyysattiin proteiinia hajotuspuskuria. Solulysaatti pidettiin sitten jäillä 10 min, sentrifugoitiin 10000 g: ssä 15 minuutin ajan, ja siirrettiin uuteen putkeen. Tuore Solulysaatti (50 ui), joka sisälsi 100-200 ug proteiinia, lisättiin 96-kuoppaisen levyn kolmena kappaleena. Viisikymmentä mikrolitraa reaktiopuskuria ja 5 ui kaspaasi siirrettiin sitten kunkin nimetyn hyvin ennen inkuboimalla levyä on CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 2 tuntia. Mikrolevynlukijaa (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Sveitsi) käytettiin analyysiin aallonpituudella 405 nm.

DNA: n fragmentoituminen määrityksessä

SKOV-3-soluja käsiteltiin artonin E eri ajankohtina, ja korjataan lisäämällä trypsiinin edistämiseksi irtoaminen. Irrotetuista soluista sentrifugoitiin ja pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä. DNA soluista suspensio uutettiin käyttäen itsemurha Track

TM DNA ladder eristyspakkausta (Calbiochem, EMD Bioscience, Saksa). Sitten solut hajotettiin sekoittamalla 55 ui TE (Tris ja EDTA) lyysipuskuria ja 20 ui entsyymiä, A (RNaasi A). Saatua seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen, 25 ui entsyymin B (proteinaasi K) lisättiin ja lysaattia pidettiin vesihauteessa 50 ° C: ssa yön yli. Inkuboinnin jälkeen 2 ui Pellet Paint, 60 ui 3 M natriumasetaattia, ja 662 ui 2-propanolia, lisättiin lysaatti, ja liuos lyhyesti sekoitettiin inversion ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 min. DNA saostettiin sitten sentrifugoimalla näytteet 16000 x

g

5 min. Supernatantti poistettiin ja tuoreen pelletit huuhdottiin kaksi kertaa 70% ja 100% jääkylmää etanolia. Pelletit kuivattiin ilmassa huoneen lämpötilassa muutaman minuutin hylätä etanolia ja suspendoitiin uudelleen 50 ui DNA uudelleensuspendointipuskuriin. Valmistettua DNA tikapuut näytteet ladattiin 1,5% geelielektroforeesilla perustamista ja 50 vakio volttia 3 tuntia. Kun elektroforeesi oli suoritettu, geeli välittömästi värjättiin SybrGreen ™ ja bändi saatu visualisoitiin käyttäen UV Gel Documentation järjestelmä (Biospectrum 410, UVP).

Western blot

SKOV-3-soluissa maljattiin 75cm

2 viljelypulloon ja altistettiin artonin E 24, 48, ja 72 h. Lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 120 mM NaCl, 0,5% NP-40, ja 1 mM PMSF), käytettiin erottamaan proteiinin kokonaismäärästä. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinimääritysreagenssilla kit (Bio-Rad, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia (40 ug) uute altistettiin SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin päälle polyvinylidenedifluoride kalvo (Bio-Rad). Sitten blotit blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBS-Tween-puskurissa 7 (0,12 M Tris-emäs, 1,5 M NaCl, ja 0,1% Tween 20) 1 h huoneen lämpötilassa. Kun oli inkuboitu sopivan primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa, blotit pestiin ja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Proteiinin vyöhykkeet havaittiin käyttäen pico tai femto kemiluminesenssin (ECL-järjestelmää), ja visualisoitiin käyttämällä UV-geeliä asiakirjat järjestelmään. Myöhemmin primaarisilla vasta-aineilla, jotka sisältävät ne, β-aktiini (1: 10000), Bax (1: 10000), Bcl-2 (1: 10000), HSP-70 (1: 10000), surviviini (1: 10000), kaspaasi -3 (1: 10,000), kaspaasi -8 (1: 10,000), kaspaasi -9 (1, 10000) ja sytokromi c (1: 200) ostettiin Abcam, Cambridge, Iso-Britannia.

tilastollinen analyysi

Mean datafrom vähintään kolme mittausta jokaisesta testatusta näytteestä normalisoitiin käsittelemättömiin tuloksia. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-16,0-paketti ja GraphPad Prism -ohjelmaa 5,0. Tulokset esitettiin keskiarvo ± SD ja

p 0

.

05

katsottiin merkitseväksi.

Tulokset

Artonin E estää selektiivisesti syöpäsolujen kasvun solut ja normaalit solut

in vitro

antiproliferatiivinen vaikutus artonin E eri solulinjoja arvioitiin käyttäen MTT-määritystä, kuten on esitetty taulukossa 1. Tämä koe on perustettu perusteella, pystytäänkö NADP (H): sta riippuvaisessa solujen oksidoreduktaasientsyymi vähentää keltainen tetratsolium sen liukenemattomia violetti formatsaaniksi, joka heijastaa osan elävien solujen läsnä. Niistä testatuissa solulinjoissa, alin IC

50-arvot havaittiin SKOV-3-soluja 24 tunnin kuluttua hoidosta. IC

50-arvot SKOV-3-soluja käsiteltiin artonin E merkittävästi vähentynyt, kun 48 ja 72 tuntia hoidon, vastaavasti, kuten on esitetty taulukossa 2. Sitä vastoin normaalin ihmisen munasarjan solut (T1074), normaalin ihmisen säikeet fibroblastisoluja ja normaali CHO-solut käsiteltiin artonin E olivat vähemmän myrkyllisiä. IC

50-arvot SKOV-3-soluja käsiteltiin artonin E oli hieman alhaisempi kuin käsitelty karboplatiini, joka on hyvin tunnettu kemoterapeuttinen lääkeaine (taulukko 2). Paklitakseli ja karboplatiini käytettiin positiivisena kontrollina. Molemmat lääkkeet väheni solujen elinkykyä in SKOV-3 solujen ajasta riippuva tavalla (taulukko 2).

Artonin E vähenee solujen selviytymistä

morfologisia muutoksia Skov-3-solut käsiteltiin artonin E havaittiin normaaleissa käänteinen mikroskoopilla (kuva 2). Dissosioidut morfologinen rakenne käsiteltyjen solujen oli ilmeinen 24 tunnin kuluttua altistumisesta artonin E. Solukalvo blebs havaittiin jyrkkä lasku solujen määrä, mikä osoittaa, että kasvun estäminen oli tapahtunut. Muodostuminen apoptoottisten kappaleiden jälkeen havaittiin pidemmän valotusajan. Sitä vastoin normaalin SKOV-3-soluja säilyi vakaana ehjä rakenne.

(A) Käsittelemättömät solut. (B) Soluja 24 tunnin kuluttua hoidosta. (C) Solut 48 tunnin jälkeen hoidon. (D) Solut 72 tunnin jälkeen hoidon. IC: Ehjä solu rakenne; DC: erottaa solurakenteen; MB: kalvo kupliminen; ja AB: apoptoottisten elin.

Artonin E estää pesäkkeiden muodostumista SKOV-3-solujen

klonogeeninen määritys suoritettiin tutkimaan pitkällä aikavälillä vaikutusta SKOV-3-solut käsiteltiin artonin E . tulokset kuviossa 3 osoittavat, että artonin E estää pesäkkeiden muodostumista annoksesta riippuvaisella tavalla. 5 ug /ml artonin E, lähes puolet pesäkkeet alennettu, pienentämällä voimakkaasti pitoisuudella 10 ug /ml. Ei pesäkkeet muodostivat jälkeen, kun solut oli käsitelty 15 ja 20 ug /ml artonin E, mikä viittaa siihen, että tämä yhdiste on anti-proliferatiivinen vaikutuksia SKOV-3-soluihin.

Solut altistettiin eri pitoisuuksina ja artonin E 24 tuntia ja sitten inkuboitiin kolme viikkoa muodostaa pesäkkeitä. Pesäkkeet muodostunut kiinnitettiin etanolilla ja värjättiin kristallivioletilla.

kvantifiointi apoptoosin avulla AO-PI kaksinkertainen värjäys

AO-PI analyysin käytettiin tutkimaan muutoksia ydin- morfologian SKOV-3 käsiteltyihin soluihin. Apoptoottisten solujen arviointi perustuu ydin- tiivistymistä ja pirstoutumista. Tässä tutkimuksessa 200 soluja kunkin kokeen pisteytettiin ja määrällisesti satunnaisesti. Tulokset paljastavat (kuvio 4), joka artonin E laukaisi morfologiset muutokset, jotka liittyvät apoptoosin jo 24 tunnin kuluttua hoidon. Tunnusomaista varhaisen apoptoosin havaittiin AO interkaloituina sisällä hajanainen DNA. Tänä ajankohtana, kalvon rakkuloituminen ja marginaatioon tuman oli selvästi nähtävissä. Edelleen 48 h altistumisen osoitti, että käsiteltyjen solujen oli tehty myöhässä apoptoosin havaitun kupliminen ja punainen /oranssi väri. Toissijainen kuolion ominaisella kirkkaan punainen väri havaittiin 72 tunnin kuluttua hoidon vuoksi PI sitoutumisen DNA kuolleita soluja. Sitä vastoin käsittelemättömillä soluilla osoitti vihreä ehjä ydin- rakenteen. Tilastollisesti merkittävä

(p 0

.

05) B-ero apoptoosin käsitellyssä-soluissa (kuvio 5) havaittiin. Lisäksi samanaikainen kasvu solukuolemaan (toissijainen kuolio) havaittiin

(p 0

.

05) B pitkäaikaisen altistuksen jälkeen ajan, eli 72 h käsittelyn jälkeen (kuvio 5) . Nämä tulokset osoittivat ajasta riippuvaa tyypillisiä syntyy morfologisia ominaisuuksia, jotka liittyvät apoptoosin, kun artonin E hoito SKOV-3-soluihin.

Käsitellyt solut altistettiin 8 ug /ml artonin E 24, 48, ja 72 h . (A) Käsittelemättömät solut. (B) Soluja 24 tunnin kuluttua hoidosta. (C) Solut 48 tunnin jälkeen hoidon. (D) Solut 72 tunnin jälkeen hoidon. VI: eläviä soluja; BL: kupliminen solukalvojen; LA: lateapoptosis; ja SN: toissijainen kuolion.

(EA: varhainen apoptoosi, LA: myöhään apoptoosin, ja SN: toissijainen kuolio). Tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolme toistoa. * Tarkoittaa merkitsevää eroa ohjauspaneelista kunkin vaiheen (

p

0,05).

Artonin E indusoi apoptoosia SKOV-3-solujen

Apoptosis on kaksi erillistä morfologiset ja biokemialliset luonnehdintoja. Muutokset morfologinen apoptoottisten solujen kuten plasmamembraanin menetys epäsymmetrian ja kiinnitys, solukalvon kupliminen, kondensaatio sytoplasman ja tuman, liittyy aina useita biokemiallisia muutoksia [28]. Tuloksemme tähän mennessä osoittanut tyypillisiä morfologisia ominaisuuksia apoptoosin artonin E käsitelty SKOV-3-soluissa. Kaksoisvärjäys anneksiini V /PI virtaussytometrialla käytettiin selvittääkseen biokemiallisia muutoksia artonin käsitelty SKOV-3-soluissa. Yksi aiemmin biokemiallisia muutoksia apoptoosin tapahtumiin on erilainen kinetiikka fosfatidyyliseriinin (PS) altistumisen ulomman seloste solukalvon. Anneksiini V, Ca

2 +: sta riippuvaisen fosfolipidi-sitoutuva proteiini on tunnettu vuorovaikutuksessa spesifisesti ja voimakkaasti PS ja niitä voidaan käyttää havaitsemaan apoptoosia kohdistamalla plasmamembraanin menetys epäsymmetrian [29]. AV /PI- värjäyksen osoittaa eläviä soluja vuoksi PI ei läpäisevä osaksi ehjä solukalvon, kun taas AV + /PI-värjäyksen edustaa varhain apoptoottisia soluja, menettämisen vuoksi plasmamembraanin epäsymmetrian ja liimautuu AV-FITC PS. Sen sijaan, AV + /PI + edustaa myöhään apoptoottiset ja AV /PI + edustaa nekroottista vaiheeseen, joka johtuu vähentää solukalvon ja tumakalvoa eheys joiden avulla PI läpi kalvot ja interkalatoi osaksi nukleiinihapon. Kuten kuvassa 6, yli 40% soluista varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa apoptoosin jälkeen 24 ja 48 tuntia käsittelyn jälkeen, vastaavasti, mikä osoittaa ajasta riippuvan merkittäviä

(p 0

.

05 ) B lisäys verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Lisäksi hoito artonin E osoitti myös aikariippuvainen väheneminen elinkelpoisten solujen samanaikainen kasvu nekroottisia soluja. Siksi nykyinen tulokset viittaavat siihen, että kasvua estävät ja apoptoosia SKOV-3 käsitellyt solut liittyvät läheisesti toisiinsa.

[A] Ohjaus (käsittelemätön), [B] 24 tuntia hoitoa, [C] 48 tuntia hoitoa, ja [D ] 72 h hoito. [E] Histogrammi. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolme toistoa.