PLoS ONE: Rosamines kohdistaminen Cancer oksidatiivisen fosforylaation Pathway
tiivistelmä
uudelleenohjelmointi energia-aineenvaihdunnan on keskeinen syövän, joten mitokondriot ovat potentiaalisia kohteita syövän hoitoon. Tekniikan tutkimus on osoittanut antiproliferatiivista aktiivisuutta uuden luokan mitokondrioiden kohdistaminen rosamines. Tämä nykyinen tutkimus kuvaa
in vitro
sytotoksisuutta toisen sukupolven rosamine analogit, niiden toimintatapaa ja niiden
in vivo
tehoja kasvain allografted hiirimallissa. Täällä osoittivat, että nämä yhdisteet osoittivat voimakkaasti sytotoksisia (keskimääräinen IC
50 0,5 uM), esti Complex II ja ATP nopaliinisyntaasin toimintaa mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaatioreitti ja indusoi mitokondrion transmembraanisen potentiaalia. NCI-60 solulinjojen kuvaruutua entisestään osoitti, että rosamine analogit 4 ja 5 näytteillä voimakas antiproliferatiivinen vaikutuksia Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 uM) ja olivat tehokkaampia vastaan peräsuolen syöpä sub-paneeli kuin muut solulinjat. Alustava
in vivo
tutkimuksissa 4T1 hiiren rintasyövän kantavien BALB /c-hiirten osoitti, että hoito analoginen 5 yhdessä annostelun 5 mg /kg tai aikataulun annostelun 3 mg /kg kerran joka 2. päivä 6 kertaa (Q2D x 6) osoittivat vain vähäisiä induktio kasvaimen kasvun viivästyminen. Tuloksemme viittaavat siihen, että rosamine analogeja voidaan edelleen kehittää mitokondrioiden kohdentaminen aineina. Epäilemättä asianmukaista strategioita on kehitetty parantamaan kasvaimeen oton rosamines, eli integraatio kantajamolekyyleihin paremmin hoitotulokseen.
Citation: Lim SH, Wu L, Kiova LV, Chung LY, Burgess K, Lee HB (2014) Rosamines kohdistaminen Cancer Oksidatiivinen fosforylaatioreitti. PLoS ONE 9 (3): e82934. doi: 10,1371 /journal.pone.0082934
Editor: Siyaram Pandey, University of Windsor, Kanada
vastaanotettu: 13 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 30 lokakuu 2013; Julkaistu: 12 maaliskuu 2014
Copyright: © 2014 Lim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Cancer Research aloitteita Foundation, Malesia opetusministeriön korkeakoulu n HIR-Mohe avustuksia (UM.C /625/1 /HIR /Mohe /MED /17 ja UM.C /625/1 /HIR /Mohe /MED /33), Universiti Malaya Jatko Research Grant (PS204 /2010B) sekä apurahoja KB The National Institutes of Health (GM087981) ja Robert A. Welch Foundation (A-1121). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Perinteiset syövän kemoterapia riippuu lääkkeet, jotka vaikuttavat katkaisemalla DNA: n kahdentuminen, eli estämällä synteesin tai toiminnan uusien nukleiini- aineita tai aiheuttamalla korvaamatonta vahinkoa elintärkeitä nukleiinihappojen kautta intercalation, alkyloidaan tai entsymaattinen esto. Puute selektiivisyys kasvainsoluja näytteillä nämä lääkkeet tyypillisesti rajoittaa niiden menestys käsittelyaineet. Contemporary kemoterapeuttinen strategioita, jotka kohdistuvat signalointipolkujen tai tietyn geenin tuotteita yleensä rajoitettu syövät ohjaa hallitseva onkogeenin ja ovat usein alttiita vastuksen kautta moninaisuus tumorigeneesin signalointipolkujen [1]. Esimerkiksi suurin osa HER-2 positiivinen metastasoitunut rintasyöpä potilailla, jotka aluksi hoitovaste trastutsumabilla kehittää toissijainen trastutsumabi resistenssin vuoden sisällä hoidon jälkeen alkoi [2]. Samanlaisia havaintoja on tehty BRAF kohdistetun vemurafenib melanooman hoitoa [3] ja EGFR-kohdennettuja gefitinibi tai erlotinibi hoitoon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [4].
Suhteellisen uusi vaihtoehto kohdistaminen DNA ja entsyymien nopeasti lisääntyviä soluja, tai erityiset signalointireitteihin on keskittyä soluelimiin kuten mitokondrioita. Mitokondrioita energia generaattorit, jotka ylläpitävät solun elämää ja keskeisiä solujen toimintoja, kuten useita signalointikaskadien jotka säätelevät solujen esimerkiksi aineenvaihdunta, solusyklikontrollin, kehitys, ja solukuolemaa [5]. Syövän kemoterapiassa, mitokondriot kohdistus lääkkeet häiritsevät syöpäsolun metabolisms mukaan pertubing mitokondrion transmembraanisen potentiaalin, estäen elektronien redox ketju komplekseja, häiritsevät mitokondrion transmembraanisen läpäisevyys, ja kohdentamalla mitokondrio-DNA [6],. Yleisimmät mitokondrioita kohdistaminen lääkkeet ovat lipofiilisiä, kationisia lääkkeet; nämä ovat selektiivisiä syöpäsoluja, koska ne ovat yleensä korkeampia mitokondrion kalvon potentiaalit kuin normaali epiteelisolujen [8], [9].
Olemme aiemmin raportoitu rakenteen ja aktiivisuuden välisiä suhteita (SAR) syövän vastaisille ominaisuuksia sarja rosamines (Fig. 1A) [10], [11]. Nämä yhdisteet ovat delocalized lipofiilisiä kationeja (DLC) ja reuna-syklisten amiinien ja eri ryhmien on
meso
asennossa; Suurin osa näistä kationeista ovat oleellisesti tehokkaampia kuin rodamiini-123, joka on hyvin tutkittu delocalized lipofiilinen kationi. Johdonmukaisuus tämän, SAR tietoja rosamines ehdotettu hyvä potencies korreloi hydrofobisten syklisten amiinien ja
meso
-aryyli substituentteja. Tiofuryyli ja 4-jodifenyyli
meso
korvaaminen vastasi noin 5-kertainen parannus tehokkuudessa verrattuna fenyyli korvaaminen. Lisäksi tulokset osoittivat, että huomattavasti pienempi IC
50-arvot saatiin epäsymmetrisiä yhdisteiden (X
1 ei sama kuin X
2), mutta yhdistelmä epäsymmetrisen amiinisubstituentit kanssa tiofuryyli ja 4-jodifenyyli
meso
korvaaminen ei tutkittu. Solunsisäinen kuvantaminen edustavat esimerkit osoitti nämä yhdisteet kertyvät mitokondrioissa. Nämä yhdisteet (eli rosamine 2 ja 5) on myös todettu olevan sytotoksinen syöpäsoluja vastaan verrattuna kuolemattomaksi normaalin epiteelisolujen saman elimen tyypin [10].
(A) rosamine väriaineiden vaihtelevasti funktionalisoitu
meso
asemaa aikaisemmin raportoineet Lim et al. (Syöpälääkkeitä 2009, 20: 461-468), tässä esitetyistä kanssa
meso
– thiofuran tai 4-jodifenyyli oli ylivoimainen syövän vastaista toimintaa solukokeet. (B) Toisen sukupolven tavoitteita esillä tässä työssä.
Tutkimus raportoitu tässä tehtiin koetin kuinka kaksi molekyylitason muutokset vaikuttavat cytotoxicities tässä sarjassa: (i) korvaaminen
para
jodi tai thiofuran ryhmiä muiden
para
-halide tai furaania ryhmiä; ja, (ii) yhdistelmää tiofuryyli ja 4-jodifenyyli
meso
korvaaminen piperidiinillä /morfoliinin yhdistelmiä. Siten me raportoimme synteesejä toisen sukupolven rosamines (Fig. 1 B) ja niiden cytotoxicities suhteessa paneelin kiinteiden tuumorien solulinjoissa. Yhdisteet, joilla on lupaava aktiivisuus arvioitiin edelleen NCI-60 ihmisen tuumorisolulinjaa näytöllä. Valitut rosamines tutkittiin myös niiden vaikutus solujen redoksisysteemien ja vaikutuksia käytettäessä
in vivo
tuumorimallissa.
Materiaalit ja menetelmät
Ethics lausunto
Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollien mukaisesti tarkistanut ja hyväksynyt tohtori Haji Azizuddin Bin Haji Kamaruddin, Laboratory animal Centre (LAC) animal Care ja käyttö komitean Lääketieteellinen tiedekunta, University of Malaya (viitenumero FAR /14/07 /2010 /LSH). BALB /c-hiiret vuotiaiden 6-8 viikkoa jonka paino on vähintään 17 g pidettiin valvotussa ympäristössä 12 tunnin valo-pimeä-sykleillä vapaasti ruokaa (vakio pellettiruokaa ostettu Altromin International, Lage, Saksa) ja puhdistettua vettä. Nainen hiiriä käytettiin, koska hormonaalista ympäristön kehityksen kannalta välttämätöntä implantoidun 4TI hiiren rintasyöpä olisi läsnä.
Materiaalit
Minimum essential medium Earlin suolalla ja L-glutamiinia, RPMI 1640 -alustassa L -glutamine, naudan sikiön seerumia, Pen-Strep (10 000 U /ml penisilliiniä, 10 mg /ml streptomysiiniä), trypsiini 10 x toimitti GIBCO, Invitrogen (Auckland, Uusi-Seelanti). JC-1 hankittiin Molecular Probes, Invitrogen (Oregon, USA). Dimetyylisulfoksidi (DMSO), kloorivetyhappo 37%, polyetyleeniglykoli 400 (PEG 400) ja 2-propanolia ostettiin Merck (Hohenbrunn, Saksa). Etyleeniglykoli
bis
(aminoetyylieetteri) –
tetra
etikkahappo (EGTA), etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 3 – (
N
-morfolino) propaanisulfonihappo (MOPS ), kaliumkloridi, kaliumdivetyortofosfaatilla, natriumkloridi, natriumvetykarbonaatti, dinatriumvetyortofosfaatilla vedetön, sakkaroosi ja Tris ostettiin Fisher Scientific (Leicestershire, UK). Tiatsoyyliryhmä sininen liumbromidi (MTT) hankittiin Amresco (Ohio, USA). Suolaliuosta (0,9% natriumkloridi) saatiin Duopharma Sdn. Bhd. (Selangor, Malesia). Karbonyyli syanidia 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) hankittiin Sigma (Steinheim, Saksa). Proteiinimääritys väriainereagenssia konsentraatti saatiin Bio-Rad Laboratories (California, USA). Complex I, kompleksi II, kompleksi IV ja ATP-syntaasin entsyymin aktiivisuus mikrolevyn iinianalyysikitissä hankittiin MitoSciences (Oregon, USA).
synteesit Rosamine analogien
Rosamines syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Lähtöaine xanthone ditriflate valmistettiin liuoksessa triflaation fenolien, jonka jälkeen animaation triflaatti piperidiinillä, jolloin saatiin symmetrinen sykliset amiinit vaihdosta (Fig. 2A), tai vaiheittain lisäämällä piperidiiniä ja morfoliinia, jolloin saatiin epäsymmetrisiä sykliset amiinit vaihdosta ( Fig. 2B) [11]. Saatu 3,6-diamino-ksanteeni-9-oni saatettiin reagoimaan organolitium- tai Grignardin reagenssien, jolloin saadaan haluttu rosamine rakenteita.
(A) mukainen lähtöaine xanthone ditriflate valmistettiin liuoksessa triflaation on fenolit, jonka jälkeen animaation triflaatti piperidiinillä, jolloin symmetrinen syklisiä amiineja korvaaminen tai; (B) vaiheittain lisäämällä piperidiiniä ja morfoliinia, jolloin saatiin epäsymmetrisiä sykliset amiinit vaihdosta.
Yleensä Grignard-reagenssin tai litiumreagenssin (1,0 mmol) lisättiin tipoittain 1 minuutin aikana liuokseen, jossa oli 0,2 mmol 3,6-diamino-ksanten-9-onia 5 ml: ssa THF: a 0 ° C: ssa. Reaktioseosta sekoitettiin 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Reaktion päättymisen jälkeen, 2 ml 2 M vesipitoista HCl: a lisättiin, sekoitettiin 10 minuutin ajan reaktion sammuttamiseksi ja laimennettiin 20 ml: lla CH
2CI
2. Orgaaninen kerros pestiin vedellä ja suolaliuoksella, kuivattiin vedettömällä Na
2SO
4, ja konsentroitiin alennetussa paineessa. Jäännös puhdistettiin flash-kromatografialla (5%: sta 10% MeOH /CH
2CI
2), jolloin saatiin puhdasta tuotetta.
Spektritiedot varten syntetisoidut yhdisteet on lueteltu tässä paitsi synteesiä ja spektritiedot rosamines 1, 2 ja 5, kuten aikaisemmin on raportoitu [11]. Ne on nimetty alla siten, että kuvaa
meso-
substituenttien ja olettaa, että yhdiste on symmetrinen, ellei toisin mainita.
4-bromibentseeni Rosamine 3.
1H-NMR (300 MHz, CDCI
3) δ 7,72 (d, 2H,
J
= 8,4 Hz), 7,27-7,21 (m, 4H), 7,09 (dd, 2H,
J
= 9,6, 2,6 Hz), 6,94 (d, 2H,
J
= 2,6 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);
13C-NMR (75 MHz, CDCI
3) δ 158,1, 156,3, 155,0, 132,2, 131,6, 130,9, 130,5, 124,9, 115,0, 113,3, 97,4, 49,1, 25,9, 24,0; λ
max abs 570 nm, λ
max emiss 590 nm, ε 110800 M
-1 cm
-1, FWHM 38 nm, Φ 0,78 ± 0,02 CH
2CI
2; HRMS (ESI) m /z laskettu (M-CI)
+ C
29H
30BrN
2O 501,1542; löydetty 501,1539.
4-klooribentseenimagnesi- Rosamine 4.
1H-NMR (300 MHz, CDCI
3) δ 7,56 (d, 2 H,
J
= 8,4 Hz), 7,30 (d, 2H,
J
= 8,4 Hz), 7,26 (d, 2H,
J
= 9,6 Hz), 7,09 (dd, 2H,
J
= 9,6, 2,4 Hz), 6,95 (d, 2H,
J
= 2,4 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);
13C-NMR (125 MHz, CDCI
3) δ 158,1, 156,3, 155,1, 136,7, 131,6, 130,8, 130,1, 129,3, 115,0, 113,4, 97,5, 49,2, 25,9, 24,1; λ
max abs 570 nm, λ
max emiss 590 nm, ε 119100 M
-1 cm
-1, FWHM 38 nm, Φ 0,80 ± 0,02 CH
2CI
2; HRMS (ESI) m /z laskettu (M-CI)
+ C
29H
30ClN
2O 457,2047; löydetty 457,2052.
Furan Rosamine 6.
1H-NMR (500 MHz, CDCI
3) δ 7,97 (d, 2 H,
J
= 9,7 Hz), 7,92-7,91 (m, 1 H), 7,18 (dd, 2H,
J
= 9,7, 2,6 Hz), 7,15-7,14 (m, 1 H), 6,90 (d, 2H,
J
= 2,6 Hz), 6,82-6,81 (m, 1H), 3,74-3,72 (m, 8H), 1,76 (br, 12H);
13C-NMR (125 MHz, CDCI
3) δ 158,2, 156,0, 147,3, 145,7, 142,2, 132,0, 120,5, 115,0, 113,3, 111,8, 97,5, 49,0, 25,9, 24,1; λ
max abs 592 nm, λ
max emiss 627 nm, ε 86900 M
-1 cm
-1, FWHM 105 nm, Φ 0,38 ± 0,01 CH
2CI
2; HRMS (ESI) m /z laskettu (M-CI)
+ C
27H
29N
2O
2 413,2229; löydetty 413,2232.
epäsymmetrinen 4-jodifenyyli Rosamine 7.
1H-NMR (300 MHz, CDCI
3) δ 7,96 (d, 2 H,
J
= 8,3 Hz), 7,35-7,29 (m, 2H), 7,17-7,09 (m, 6H), 3,88 (t, 4H,
J
= 4,7 Hz), 3,78-3,71 (m, 8H) , 1,77 (br, 6H);
13C-NMR (75 MHz, CDCI
3) δ 158,6, 157,9, 156,9, 156,7, 155,9, 138,2, 131,9, 131,5, 131,1, 131,0, 115,5, 114,6, 114,0, 113,7, 98,6, 97,9, 97,1, 66,4, 49,5, 47,4, 26,1, 24,0; λ
max abs 565 nm, λ
max emiss 586 nm, ε 80900 M
-1 cm
-1, FWHM 39 nm, Φ 0,52 ± 0,02 CH
2CI
2; HRMS (ESI) m /z laskettu (M-CI)
+ C
28H
28in
2O
2 551,1195; löydetty 551,1192.
epäsymmetrinen tiofuryyli Rosamine 8.
1H-NMR (500 MHz, CDCI
3) δ 7,69 (dd, 1H,
J
= 4,8, 1,4 Hz), 7,62 (d, 1 H,
J
= 9,7 Hz), 7,59 (d, 1 H,
J
= 9,7 Hz), 7,26-7,22 (m, 2H) , 7,19 (dd, 1 H,
J
= 9,7, 2,5 Hz), 7,09 (dd, 1 H,
J
= 9,7, 2,5 Hz), 7,00 (d, 1 H,
J
= 2,5 Hz), 6,90 (d, 1 H,
J
= 2,5 Hz), 3,78 (t, 4H,
J
= 4,9 Hz), 3,68-3,65 (m , 8H), 1,67 (br, 6H);
13C-NMR (75 MHz, CDCI
3) δ 158,1, 157,5, 156,6, 156,3, 149,8, 132,2, 132,0, 131,7, 130,6, 130,6 (kaksi huippua: 130,62, 130,56), 128,2, 115,2, 114,6, 114,3, 114,0, 97,8, 97,2, 66,2, 49,1, 47,2, 25,9, 23,9; λ
max abs 576 nm, λ
max emiss 599 nm, ε 87600 M
-1 cm
-1, FWHM 42 nm, Φ 0,30 ± 0,01 CH
2CI
2; HRMS (ESI) m /z laskettu (M-CI)
+ C
26H
27N
2O
2S 431,1793; löydetty 431,1795.
Soluviljelmä ja
In Vitro
solunelinkykyisyysmääritys
MCF-7 rintasyöpä ja HCT-116 koolonkarsinooma solulinjat saatiin American Tissue Culture Collection ( Virginia, USA) ja pidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. HSC-2 suuontelon ihmisen squamous kohdunkaulan solut saatiin Health Science Research Resources Bank (Japani). HK-1, joka on aiemmin tunnettu nenänielun squamous kohdunkaulan soluissa [12] on lahja professori Wong Y.C. yliopistosta Hong Kong. Molemmat solulinjat kasvatettiin MEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Solujen elinkyvyn, solut 4000 solua /kuoppa 80 ul: ssa väliainetta, ympättiin 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Soluja käsiteltiin sitten kunkin yhdisteen konsentraatioissa 0,001-10 uM antaa lopullinen tilavuus 100 ui kuhunkin kuoppaan. Lopussa itämisaika, 15 ui 5,0 mg /ml MTT fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) lisättiin ja inkuboitiin 4 tuntia. Medium ja liiallinen MTT imettiin pois, ja tuloksena formatsaanikiteet liuotettiin 100 ul: aan dimetyylisulfoksidia. Absorbanssi luettiin 570 nm: ssä SpectraMax M4 mikrolevyspektrofotometrillä (Molecular Devices, CA).
NCI-60 ihmisen kasvainsolulinjaa Screen
NCI-60 solujen paneeli seulonta suoritettiin NCI /National Institutes of Health kehityshäiriöitä terapeuttisten ohjelma (Bethesda, USA). Tämän alustan avulla voidaan määrittää kasvua estävän profiilien Testiyhdisteiden 60 eri ihmisen syöpäsolulinjoissa, jotka edustavat leukemia, melanooma ja keuhko-, paksusuoli-, keskushermoston, munasarja-, rinta-, eturauhas-, ja munuaisten aluslaatta. Sulforodamiini B määritystä käytettiin arvioimaan sytotoksisuuden testin aineiden paneelia 60 solulinjojen [13]. Lyhyesti, ihmisen kasvainsolulinjoissa syövän seulonnan paneelin kasvatettiin RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 5% FBS: ää ja 2 mM L-glutamiinia. Tyypillisessä seulonnassa kokeessa soluja ympättiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille 100 ul maljatiheyksiin riippuen kahdentumisaika yksittäisten solulinjojen. Soluinokulaation jälkeen, mikrotiitterilevyt inkuboidaan 37 ° C: ssa, 5% CO
2 ja 100%: n suhteellisessa kosteudessa 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen alikvootit 100 ui yhdisteen eri laimennoksia lisättiin sopiviin mikrotiitterilevyn kuoppiin ja inkuboitiin edelleen 48 tuntia. Vuoden määritys päätepisteen, solut kiinnitettiin trikloorietikkahapolla seurasi sulforodamiini B värjäystä solun proteiinipitoisuus. Sulforodamiini B absorbanssi luettiin aallonpituudella 515 nm mittaus solutiheyden.
mitokondrioissa eristäminen ja Detergent Solubilization
Functional mitokondrioita eristettiin hiiren maksasta differentiaalisentrifugaatiolla menetelmällä [14]. Lyhyesti, hiiren (-30 g) ruokittu yön yli ennen uhrattiin taittamalla niskasta. Maksa kerättiin nopeasti ja huuhdeltiin jääkylmällä mitokondrioiden eristämisen-puskuria (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA /Tris, 0,2 M sakkaroosi, pH 7,4), kunnes veri-vapaa. Maksa sitten leikataan pieniksi paloiksi dekantterilasissa saksilla pitäen jäähauteessa. Puskuri korvattiin 5 ml: lla tuoretta eristäminen puskuria ja maksan homogenoitiin Polytron koetin (Ultra-Turrax T8, Ika-Werke, Saksa) tasaiseksi. Homogenaattia sentrifugoitiin nopeudella 1000 g 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pelletti heitettiin pois ja supernatantti sentrifugoitiin 12000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa pelletoimiseksi mitokondriot. Mitokondriot pestiin kahdesti suspendoimalla uudelleen 4 tilavuutta eristäminen, joka sisälsi 1 x proteaasi cocktail estäjä. Pitoisuus mitokondrion proteiinin määritettiin käyttämällä Bradford (Biorad-proteiini-määritys) menetelmän. Mitokondriot jäädytettiin 10 mg /ml: n näyte -80 ° C: ssa.
Pesuaine liukeneminen mitokondrioiden proteiinien tehtiin ennen mittausta oksidatiivisen fosforylaation komplekseja toimintaa. Mitokondriot laimennettiin 5,5 mg /ml PBS: llä ja liuotetaan lisäämällä 1/10-tilavuuteen detergenttiä edellyttäen, jolloin saadaan lopullinen proteiinipitoisuus on 5 mg /ml. Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia ja sentrifugoitiin 17 000 g: llä 4 ° C: ssa 20 min. Supernatantti kerättiin ja laimennettiin sopivaan konsentraatioon kunkin oksidatiivisen fosforylaation komplekseja toimintaa.
Measurement oksidatiivisen fosforylaation Complexes Activity
Mittaukset mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation toimintaa Complex I, II, IV ja ATP- syntaasi suoritettiin käyttäen mikrolevyn Immunocapture ELISA iinianalyysikitissä mukaan kyseisen valmistajan protokollien [15]. Yleensä levy valmiiksi päällystää sopivilla Immunocapture vasta-ainetta inkuboitiin mitokondrioita purkaa suositellulla pitoisuus sallimaan immobilisoimiseksi niiden komplekseja. Komplekseja aktiivisuus mitattiin lisäämällä substraatteja liuosta sekoitetaan, jonka sarjasta ja yhdistettä lisättiin konsentraatiolla, joka vaihtelee 0,01-10 uM kolmena kappaleena. Kontrollikuopat käsiteltiin vain 0,1% DMSO (v /v), ja kuopat ilman mitokondrioita uutetta inkuboinnin sisällytetty viitteellisesti. Kineettinen kompleksien aktiivisuuden on tallennettu SpectraMax M4 mikrolevyspektrofotometrillä lukija ehdotetuilla mittausparametrit.
JC-1 analyysi mitokondrion kalvon Mahdolliset
mitokondrion kalvon potentiaali mitattiin perustuu mahdollisesta -riippuvaista kertyminen kationisen JC-1 väriainetta, joka johtaa siirtymä fluoresenssin emission vihreä (~525 nm) punaiseksi (~590 nm) muodostumisen vuoksi J-aggregaattien [16]. Näin ollen, mitokondrion Depolarisaatio osoitetaan lasku punainen /vihreä fluoresenssi-intensiteetin suhde. Lyhyesti, solut kerättiin ja suspendoitiin 1 ml: aan lämmintä media noin 1 x 10
6 solua /ml. Kun ohjausputki, 1 ui 50 mM CCCP lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5 min. Sitten 10 ui 200 uM JC-1, lisättiin soluihin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Solut pestiin kahdesti lämpimällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää ja analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä käyttäen 488 nm: n virityksellä, jossa 530/30 nm ja 585/42 nm bandpass emissiosuodattimia.
In Vivo
Kasvaintenvastainen tehoa
Kasvaimen allotransplantaatteja aloitettiin subkutaanisella injektiolla 5 x 10
5 4T1 hiiren rintasyöpä 0,1 ml RPMI 1640 -levy imusolmukkeet utarerasvaa-tyynyt hiiriä [17]. Kasvaimen kasvua seurattiin ja hoito aloitettiin, kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden noin 200 mm
3. Arvioida kasvaimen kasvun estäminen, 4T1 kasvain kantavia hiiriä satunnaistettiin ryhmiin, joissa on vähintään kahdeksaa eläintä ryhmää kohti. Yhdiste 5 valmistettiin 0,3 mg /ml fysiologista keittosuolaliuosta ja hoito annettiin suonensisäisesti 5 mg /kg liselle tai 3 mg /kg joka toinen päivä kuuden hoitoja (Q2Dx6). Kontrolliryhmässä, normaalia suolaliuosta annettiin. Eläin painot ja kasvaimen tilavuus mitattiin kolme kertaa viikossa 14 d. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen yhtälöä: (pituus x leveys
2) /2 ja suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) laskettiin jokaiselle kasvaimen tilavuus kulloinkin (V
T) vastaan kasvaimen tilavuus pysähdyspaikan päivä (V
0) kaavalla: V
T /V
0. RTV – aika profiilin kullekin ryhmälle piirrettiin ja kasvaimen kasvu viivästyy saavuttaa tietyn määrän kahdentumisen verrattuna kontrolliin määritettiin [18], [19]. Tulokset ilmaistiin mediaani ± 95%: n luottamusväli (n = 8).
Tilastollinen analyysi
Tilastollinen merkittävyys tehtiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA
jälkikäteen
kanssa Bonferronin testi (SPSS 16.0, IBM Corporation, Armonk, NY) ja ero pidettiin merkittävinä, kun
P
0,05.
tulokset ja keskustelu
Rosamine analogit
aikaisemmat tutkimus osoitti rakenteet
meso
-substituoitu 4-jodi- bentseenistä 2 ja thiofuran 5 oli 5 kertaa aktiivisempi kuin fenyylisubstituoitu yhdiste 1. yhdisteet 3, 4 ja 6 syntetisoitiin testata, jos
meso
-replacement 4-bromibentseeni 3, 4-klooribentseeniä 4 tai 2-furyyli 6 ryhmää vaikuttaisi syövän vastaista aktiivisuutta. Lisäksi 4-jodibentseeniä 7 tai 2-thiofuran
meso
substituentilla 8
ja
epäsymmetrisen piperidiini /morfiini amiinisubstituentit syntetisoitiin ja tutkittiin. Rosamines 1-4 ja 7 eivät olleet tuntuvasti vesiliukoisia, joten ne olivat käyttövalmiiksi DMSO klo 10 mM hoidon varastossa. Rosamines 5, 6 ja 8 liukenee helposti vesipitoiseen väliaineeseen pitoisuudet vastaavat pitoisuuksia, joten käytettiin ilman DMSO: ta.
In vitro
Antitumor tehokkuus Rosamine ja NCI-60-Screen
in vitro
antituumorivaikutuksen rosamines arvioitiin käyttäen 48 h päätepisteen solujen elinkykyä methylthiazolyldiphenyl liumbromidi (MTT) vasten paneelin kiinteää ihmisen kasvaimen solulinjojen rintasyöpä- (MCF-7), paksusuoli karsinooma (HCT-116), suun okasolusyöpä (HSC-2) ja nenänielun karsinooma (HK-1). IC
50-arvot näille rosamines koko paneelin syövän testatuista solulinjoista olivat 0,07-1,2 uM jotka esitetään taulukossa 1. Tässä tutkimuksessa rosamines joissa fenyyli- halogenidi tai heterosyklinen ryhmät olivat merkittävästi (
P
0,05) tehokkaampi kuin fenyylisubstituoitu rosamine 1. halogeenidisubstituution paransi sytotoksisuuden; Tämä oli odotettavissa, koska korvaaminen
H
by halogenidi käytetään yleisesti lisäämään yhdisteen lipofiilisyyttä joka parantaa lipidien kaksikerroksinen läpäisevyyttä [20]. Sisällä halogenidi sarja, cytotoxicities kasvaa seuraavassa järjestyksessä 4 3 2 (CI Br I), joskaan ei tilastollisesti merkitsevä (
P
0,05). Yhdisteet, joissa
meso
heterosyklinen substituentteja 5 ja 6 olivat tehokkaampia kuin aromaattista halogenidit 2-4. Näiden kahden yhdisteen kanssa
meso
-heterocycles thiofuran-substituoidut 5 oli hieman aktiivisempi kuin 6, furaani-substituoitu yhdellä.
Yhdisteet 7 ja 8 on enemmän polaarinen yhdistelmän on amiinisubstituentit kuin symmetrinen
bis
piperidiini 2, ja ne osoittautuivat sytotoksisia (taulukko 1). Tämä on yhdenmukaista aiempien tietojen 2-methylbenzenes epäsymmetrisesti substituoitu piperidiinin ja morfoliinin joka osoitti lähes 2 kertaa pienempi IC
50-arvot verrattuna symmetrinen hydrofobinen rakenne, joka sisältää vain piperidiini [10]. Samaan varten
meso
-thiofuran 5, korvaaminen yksi piperidiiniryhmillä morfoliinin antaa 8, joka on hieman
vähentynyt
toimintaa, vastoin odotuksia.
Rosamines voi esiintyä fototoksisuutta johtuen reaktiivisten hapen lajien valon läsnä ollessa. Voit testata tätä, kaksoiskappale levy, säteilytettiin 5,3 J /cm
2 laajakirjoisten valoa 2 tunnin kuluttua yhdisteen hoidon rinnalla levy säilytetään pimeässä. Ei ollut merkittäviä eroja IC
50-arvoja välillä sekä säteilytettyä ja ei säteilytetty kokeet (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa valomyrkyllisyys ollut ongelma.
Sen tulosten perusteella edellä, rosamines 4 ( NSC751819) ja 5 (NSC751817) toimitettiin NCI-60 ihmisen tuumorisolulinjaa seuloa antamaan lisätietoja kasvunestoaine profiileja vastaan 60 erilaista ihmisen syövän solulinjoissa, jotka edustavat leukemia, melanooma ja keuhko-, paksusuoli-, keskushermosto , munasarja-, rinta-, eturauhas-, ja munuaisten osapaneelin. Tämä alusta mahdollistaa toimintatapa voidaan päätellä vertaamalla lääkkeellä-työvoimaosuudessa standardin aineita, joiden tiedetään olevan kohdistuksen ominaisuuksien avulla COMPARE (atk kuvio-nistusalgoritmi) analysoi [21]. GI
50-arvot syntyvät NCI-60 solulinjojen näyttö osoitti, että molemmat rosamine 4 ja 5 näytteillä voimakas antiproliferatiivinen vaikutuksia Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 uM) ja olivat erityisen tehokkaampia vastaan alapaneelin paksusuolisyövän solulinjojen (Fig. 3). COMPARE analyysit osoittivat, että nämä molemmat rosamines ollut samanlaisia malleja toimintaa metyyliviolettia (NSC271967), kationinen triaryylimetaanivärit jota on aiemmin käytetty lääketieteessä sen mikrobilääkkeiden, sienilääkkeet ja antihelmintic ominaisuuksia. Tämä luokka väriaineiden oli osoitettu edistävän mitokondrioiden hengityselinten esto estämällä ATP synteesi, vaimentavan mitokondrion kalvon potentiaalia ja asiakkuutta mitokondrio läpäisevyys siirtyminen [22], [23]. Siten NCI-60 solulinjojen näyttö osoitti testatuista yhdisteistä oli allekirjoituksen ainutlaatuinen energia-aineenvaihdunnan kohdistuksen syöpälääkkeiden.
GI
50 (50% kasvun inhibitio) keskiarvo kaavioita toiminnan malleja 4, 5 ja metyyliviolettia (NSC271967) NCI-60 solulinjan näyttöjä. Sekä rosamines näytteillä voimakas antiproliferatiivinen vaikutuksia Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 uM) ja olivat erityisen tehokkaampia vastaan kolorektaalisyövän paneeli. COMPARE analyysit ilmoitetaan 4 ja 5 on samanlainen kuvio toimintaa kuin metyyliviolettia Pearson korrelaatiokerroin arvot 0,767 ja 0,72, vastaavasti.
Rosamines häiritsi Energy Redox
Olemme aiemmin osoittaneet että rosamines pääasiassa paikallistaa mitokondrioissa [10] ja että kertyminen sytotoksisten DLC tiedetään muuttaa mitokondrion transmembraanisen potentiaalin [24], [25]. Siten korjauksilla mitokondrion kalvon potentiaalia aiheuttamat rosamines 2 ja 5 seurattiin perustuu kertyminen mahdollisten riippuvaisen JC-1 väriainetta, joka johti siirtymä Fluoresenssiemission vihreästä (~525 nm) punaiseen (~590 nm) takia muodostumista J-aggregaattien. Tutkimuksesta, HSC-2-soluja käsiteltiin 2 0,1 uM, 9% solupopulaation esillä puhkeamista mitokondrion transmembraanisen mahdollinen menetys 1 tunnin kuluessa hoidon jälkeen ja nostetaan asteittain 19% (
P
0.05) 8 h (Fig. 4). Samaan aikaan mitokondrion transmembraanisen mahdollinen tappio oli huomattavampi HSC-2-solut käsiteltiin 5 0,1 uM. Noin 21% (
P
0,05) solupopulaation vaikutti ensimmäisen tunnin ja prosenttiosuus kasvoi voimakkaasti 34% 8 h. Sillä käsittelemätön kontrolli solujen väestö depolarisoituneiden soluja 8 tuntia pysyi noin 8%. Samaan aikaan, solut käsiteltiin 5 uM CCCP 5 min johtivat menetykseen kalvon potentiaalia 70% (
P
0,05) solun väestöstä. CCCP on oksidatiivisen fosforylaation irrottamista aine, joka toimii positiivisena kontrollina kokeiluun.
edustaja sattuessa mitokondrion transmembraanisen mahdollinen menetys HSC-2-solut käsiteltiin 2 ja 5 0,1 uM. Sen jälkeen 8 h hoidon 2 ja 5 prosenttiosuus solupopulaation kanssa mitokondrion transmembraanisen mahdollinen tappio kasvoi 19% ja 34%, vastaavasti. Prosenttiosuus depolarisoituneiden solu hoitamattomien 8 h säilyy 8%, kun taas positiivisena kontrollina, soluja käsiteltiin 5 uM karbonyyli syanidia 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) 5 min tuloksia 70% depolaroiduissa solupopulaation. * Ero
P
-arvo 0,05 verrattuna kontrolliin 0 h.
edelleen ymmärtää mitokondrion esto esillä on rosamines, niiden vaikutus oksidatiivisen fosforylaatioreitti tutkittiin . Käyttämällä Immunocapture ELISA mikrolevyn määrityksessä entsyymikinetiikka mitokondrion redox harjoittajien Complex I, Complex II, Complex IV ja ATP-syntaasi seurattiin käsittelemällä 2 tai 5. aktiivisuus Complex II (kuvio. 5B) osittain estyy 5 kanssa IC
50-arvo 9,6 ± 0,1 uM taas 2 esto havaittiin, mutta ei saavuttanut 50% jopa enimmäispitoisuudet tutkittu. Samaan aikaan, sekä 2 ja 5 näkyy esto ATP nopaliinisyntaasin toimintaa (Kuva. 5D), jossa IC
50-arvot 3,9 ± 0,3 uM ja 3,0 ± 0,8 uM. Aktiivisuus Complex I ja Complex IV (Fig. 5A ja 5C) ei vaikuta rosamines pitoisuuksina ylärajaan saakka käytetty, 10 uM. Nämä tiedot viittaavat siihen, että rosamines 2 tai 5 kompromissi mitokondrioiden bioenergetiikan pääasiassa estämällä ATP-syntaasi, protoni perustuva entsyymillä, joka tuottaa ATP ADP ja epäorgaaninen fosfaatti. Samanlaisia biokemiallisten vuorovaikutus havaittiin rodamiini-123 ja tämä vaikutus on odotettavissa, koska yhdisteellä on rakenteellisesti hyvin samankaltainen kuin rosamines [26].
annos-vaste eston mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation Complex 1 (A), Complex