Krooninen sairaus

tiivistelmä

Poikkeava kertymistä solunsisäisen β-kateniinin on hyvin tunnettu ominaisuus useiden syöpien, mukaan lukien eturauhas-, paksusuoli-, ja maksan syövät, ja on potentiaalinen kohde kehittämiseen syövän vastaisen hoito. Täällä käytetty solu-pohjainen pieni molekyyli seulonta tunnistaa CGK062 estäjänä Wnt /β-kateniinin signalointia. CGK062 edistänyt proteiinikinaasi Ca (PKC-a) -välitteisen fosforylaation β-kateniinin at Ser33 /Ser37, merkintä sen proteasomaalisten hajoamista. Tämä vähensi solunsisäisen β-kateniinin tasoilla ja näin ollen antagonisoivat β-kateniinin vaste transkriptio (CRT). Farmakologinen esto tai ehtyminen PKC-a-kumotaan CGK062-välitteisen fosforylaation ja hajoamista β-kateniinin. Lisäksi, CGK062 tukahdutettu ilmentymistä koodaavien geenien sykliini D1, c-myc, ja ak- siini-2, β-kateniinin kohdegeenien, ja näin ollen esti kasvua CRT-positiivisten syöpäsolujen. Lisäksi hoito kantavien nude-hiirten PC3 ksenograftikasvaimissa kanssa CGK062 annoksilla 50 mg /kg ja 100 mg /kg (i.p.) suppressoi merkittävästi kasvaimen kasvua. Tulosten perusteella näyttää, että CGK062 kykenee sen syövän vastaista aktiivisuutta edistämällä PKC-a-välitteisten β-kateniinin fosforylaatio /hajoamista. Näin ollen, CGK062 on merkittävä terapeuttinen potentiaali hoidettaessa CRT-positiivisia syöpiä.

Citation: Gwak J, Lee JH, Chung YH, Song GY, Oh S (2012) Small Molecule-Based edistäminen PKC-a-välitteisen β-kateniinin Hajoaminen estää leviämisen CRT-Positive syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (10): e46697. doi: 10,1371 /journal.pone.0046697

Editor: Manfred Jung, Albert-Ludwigs-Universität, Saksa

vastaanotettu: 30 tammikuu 2012; Hyväksytty: 07 syyskuu 2012; Julkaistu: 05 lokakuu 2012

Copyright: © Gwak et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Basic Science Research Program kautta National Reserch Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, Science and Technology (2012R1A2A2A01002941). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wnt /β-kateniinin reitti, joka aktivoituu vuorovaikutuksen Wnt1, Wnt3a, ja Wnt8 kanssa Frizzled (Fz) reseptorit ja LDL-reseptoriin liittyvä protein5 /6 (LRP5: stä /6) co reseptoreihin, pelaa tärkeä rooli solujen lisääntymisen, erilaistumisen, ja oncogenesis [1]. Keskeistä tämän reitin on taso sytosolin β-kateniinin, joka säätelee sen kohdegeenien. Koska on Wnt-signaalin, β-kateniinin fosforyloituu sekä kaseiinikinaasin 1 (CK1), ja glykogeenisyntaasikinaasi-3β (GSK-3β), joka muodostaa kompleksin adenomatoottisen polypoosin coli (APC) /ak- siini (tuhoaminen kompleksi) . Tämä on sitten tunnustettu F-box β-transdusiini toista sisältävä proteiini (β-TrCP), komponentti ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen, mikä johtaa hajoamiseen β-kateniinin [2] – [4]. Reseptorin aktivoitumista sen Wnt ligandien säätelee negatiivisesti tuhoaminen monimutkainen ja johtaa soluliman β-kateniinin stabilointi [5].

Epänormaali aktivoitumisen Wnt /β-kateniinin reitin ja myöhemmin säätely ylöspäin β-kateniinin vaste transkriptio (CRT) ajatellaan edistää ja etenemiseen tiettyjen syöpien [6]. Onkogeeninen mutaatio β-kateniinin tai muiden osien tuhoutumiseen kompleksin (APC tai ak- siini) havaitaan paksusuolen syöpä, hepatocelluar karsinooma, ja eturauhassyövän [6] – [8]. Nämä mutaatiot johtavat liiallinen kertyminen β-kateniinin sytoplasmassa ja sitten β-kateniinin kulkeutua tumaan, jossa se komplekseja T solutekijä- /lymfosyytti tehostajana tekijä (TCF /LEF) perhe transkriptiotekijöitä aktivoida ilmentymistä Wnt /β-kateniinin reagoiva geenejä, kuten

c-myc

,

sykliini D1

ja metalloproteinaasi-7 (

MMP-7

), joka on tärkeä merkitys kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden [9] – [11]. Kertyminen β-kateniinin havaitaan myös muiden syöpien, kuten munasarjasyövän, melanooman, kohdun limakalvon syöpä, medulloblastooma, ja pilomatricoma [6] – [8]. Näin ollen poikkeava aktivaatio Wnt /β-kateniinin reitti on potentiaalinen terapeuttinen kohde kemopreventioon ja hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnistettu CGK062, joka selvästi estää Wnt /β-kateniinin reitin ja solujen leviämisen CRT-positiivisten syöpäsolujen. CGK062 edistänyt hajoamista solunsisäisen β-kateniinin kautta PKC-a-välitteisen β-kateniinin fosforylaation.

Tulokset

tunnistaminen CGK062 estäjänä Wnt /β-kateniinin reitin

tunnistamiseksi pienimolekyylisiä antagonisteja Wnt /β-kateniinin polku, käytimme HEK293 reportteri soluja, jotka stabiilisti kanna TOPFlash toimittaja ja ihmisen Frizzled-1 (HFZ-1) plasmidit. Inkuboinnin jälkeen nämä reportteri solujen Wnt3a-CM ja kutakin yhdistettä, mittasimme tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus käyttäen mikrolevylukijaa, ja sitten havaittiin, että CGK062 (3- (3,4-dihydroksi-fenyyli) akryylihapon 2,2-dimetyyli- 8-okso-3,4-dihydro-2H, 8H-pyrano [3,2-g] kromen-3-yyliesteri) estäjänä Wnt /β-kateniinin reitin (kuvio 1A, B ja S1). Kuten kuviossa 1C on esitetty, hoito HEK293 reportteri-solujen eri pitoisuuksilla CGK062 johti annoksesta riippuva väheneminen β-kateniinin vaste transkription (CRT), joka oli indusoitu Wnt3a-CM (IC

50 = 12,3 uM) . CGK062 ei vaikuttanut FOPFlash aktiivisuutta HEK293 ohjaus soluissa ja solujen elinkelpoisuus HEK293 reportteri soluissa (kuvio 1C ja S2A). NF-KB ja p53 toimittaja toiminta ei vaikuttanut CGK062 (kuvio S2B ja S2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CGK062 voimakkaasti ja spesifisesti estää Wnt /β-kateniinin reitin.

(A) seulonta yhdisteitä, jotka estävät Wnt /β-kateniinin kautta. Yhdisteet moduloiva TOPFlash reportteriaktiivisuutta seulottiin käyttäen HEK293 toimittaja soluja. Verrokkeihin määritettiin läsnä ollessa tai poissa ollessa Wnt3a-CM. (B) Kemiallinen rakenne CGK062. (C) annos-riippuvainen inhibitio β-kateniinin vasteen transkription. HEK293 toimittaja soluja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla CGK062 läsnä ollessa Wnt3a-CM. 15 tunnin kuluttua, lusiferaasin aktiivisuudet määritettiin ja ilmoitettiin suhteellinen valo yksikkö (RLU) normalisoitu soluun tiitteri. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta, ja palkit osoittavat keskihajonnat. *,

P

0,05, ja **,

P

0,01 verrattuna Wnt3a-CM-käsitellyn kontrolliryhmän. (D) Sytosoliset proteiinit valmistettiin HEK293 toimittaja soluja käsiteltiin joko vehikkelillä (DMSO) tai osoitetut pitoisuudet CGK062 läsnä ollessa Wnt3a-CM 15 tuntia ja sitten suoritettiin Western-blottauksella β-kateniinin vasta-aine. (E) Semikvantitatiivinen RT-PCR β-kateniinin, ja GAPDH suoritettiin kokonais-RNA valmistettiin HEK293 reportteri-soluja joko vehikkeliä (DMSO) tai osoitetut pitoisuudet CGK062 läsnä ollessa Wnt3a-CM 15 tuntia. (F) Sytosoliset proteiinit valmistettiin HEK293 reportteri-solut, jotka inkuboitiin ajoneuvon (DMSO) tai CGK062 (25 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa Wnt3a-CM, altistuvat MG-132 (10 uM) 8 tuntia, tehtiin Länsi blotting anti-β-kateniinin vasta-aine. In (D) tarkistus (F), vahvista yhtä suuri lastaus, täplää uudelleenseulottiin anti-aktiini vasta-aine.

Wnt /β-kateniinin reitin, CRT on pitkälti riippuvainen tasosta solunsisäinen β-kateniinin, jota ohjataan ubikitiinistä riippuvainen proteolyysiä [12]. Tutkia vaikutuksen CGK062 on solunsisäisen tason β-kateniinin, olemme analysoineet määrä sytoplasmisen β-kateniinin Western-blottauksella anti-β-kateniinin vasta-CGK062-käsiteltyjen HEK293 toimittaja soluja. Taso sytoplasminen β-kateniinin, joka oli kertynyt Wnt3a-CM, on dramaattisesti vähentynyt käsittelemällä CGK062 (kuvio 1 D), joka on sopusoinnussa CRT tulokseen. Sen tutkimiseksi, onko vähentämistä sytoplasmisen β-kateniinin proteiinin tämän yhdisteen johtui väheneminen β-kateniinin mRNA-tasolla HEK293-reportteri-soluissa, suoritimme semikvantitatiivinen RT-PCR määrän määrittämiseksi β-kateniinin mRNA. Kuten kuviossa 1E The β-kateniinin mRNA-tasolla ei muuttunut vastauksena eri pitoisuuksia CGK062 HEK293 reportteri soluissa.

Seuraavaksi tutkia onko säätely alaspäin β-kateniinin by CGK062 välittävät proteasomi käytimme MG-132 estää proteasomin välittämää proteiinien hajoaminen HEK293 reportteri soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 1F, CGK062 johdonmukaisesti johti vähenemiseen β-kateniinin proteiinin tason; kuitenkin, lisäämällä MG-132 kumottu vaikutus CGK062 on vähentänyt β-kateniinin. Ammoniumkloridi, lysosomiin estäjä, ei vaikuttanut CGK062-välitteisen β-kateniinin hajoamiseen (kuvio S3). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CGK062 vaimentaa Wnt /β-kateniinin reitin mekanismin kautta, johon hajoamisen solunsisäisen β-kateniinin.

CGK062-välitteisen β-kateniinin hajoamiseen vaatii β-TrCP mutta ei GSK-3βactivity

Koska fosforylaatiota β-kateniinin GSK-3β ja sen myöhempi yhdessä β-TrCP johtaa p-kateniinin hajoamiseen [13], tutkimme onko GSK-3β toiminta on tarpeen hajoamista β kateniinia aiheuttama CGK062. Kun HEK293 toimittaja soluja inkuboitiin LiCl tai 6-bromoindirubin-3′-oni-oksiimi (BIO), GSK-3β, CRT oli stimuloitu (kuvio 2A ja 2B), mikä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien [14], [15]. Kuten kuviossa 2A ja 2B, hoito CGK062 johti tukahduttaminen CRT annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi Western blot-analyysillä käyttämällä anti-β-kateniinin vasta-ainetta osoittivat johdonmukaisesti, että CGK062 johti down-regulation of solunsisäisen β-kateniinin tasoja, jotka kertynyt LiCl (kuvio 2C), mikä viittaa siihen, että CGK062-välitteinen β-kateniinin hajoamiseen on riippumaton GSK-3β.

(A) HEK293-reportteri-soluja inkuboitiin CGK062 läsnä ollessa 20 mM LiCl: a. (B) HEK293-reportteri-soluja inkuboitiin CGK062 läsnä ollessa 0,75 uM BIO. (A) ja (B), kun 15 h, lusiferaasin aktiivisuudet määritettiin ja ilmoitettiin suhteellinen valo yksikkö (RLU) normalisoitu soluun tiitteri. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta, ja palkit osoittavat keskihajonnat. *,

P

0,05 verrattuna LiCl- tai BIO-käsitellyn kontrolliryhmän. (C) Sytosoliset proteiinit valmistettiin HEK293 toimittaja soluja käsiteltiin joko vehikkelillä (DMSO) tai kasvavia määriä CGK062 läsnä ollessa 20 mM LiCl: a 15 tunnin ajan ja sitten alistettiin Western-blottauksella β-kateniinin vasta-aine. (D) HEK293-solut transfektoitiin Δβ-TrCP ekspressioplasmidin ja inkuboitiin sitten joko vehikkeliä (DMSO) tai CGK062 (25 uM), kun läsnä on Wnt3a CM 15 tuntia. Sytosoliset proteiinit alistettiin Western blotting kanssa β-kateniinin ja β-TrCP aineita. In (C) ja (D), blotteja uudelleenseulottiin anti-aktiini-vasta-aine latauskontrollina.

Sitten määritetään, onko β-TrCP on tarpeen CGK062-indusoimaa hajoamista ofβ-kateniinin. Kuten kuviossa 2D on esitetty, ektooppinen ilmentyminen määräävän-negatiivinen muoto β-TrCP (Δβ-TrCP), joka on vuorovaikutuksessa fosforyloidun β-kateniinin, mutta ei kykene muodostamaan SCF

β-TrCP ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi [16] , kumosi CGK062 indusoimaa hajoamista β-kateniinin. Lisäksi, CGK062 ei vaikuttanut CRT, joka oli aktivoitu yliekspressio β-kateniinin mutantteja, S45A ja S37A (kuvio S4). Nämä tulokset osoittavat, että β-TrCP ja N-terminaalisten tähteiden β-kateniinin tarvitaan CGK062-välitteisen β-kateniinin hajoamiseen.

CGK062 indusoi PKC-a-välitteisen β-kateniinin fosforylaatio /hajoamista

Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että aktivoitu PKC-a katalysoi fosforylaatiota β-kateniinin at Ser33 /37 ja sen myöhemmät yhdessä β-TrCP johtaa p-kateniinin hajoamiseen [17], [18]. Edelleen saadaan käsitys mekanismi, ensin tutki PKC-a aktivoidaan käsittelemällä CGK062. Koska aktivoitu PKC-a siirtyy sytoplasmasta solukalvon [19], me eristetty kalvofraktiot CGK062-käsiteltyjen ja -untreated soluja, ja mitattu määrä PKC-a-Western blot -analyysillä. CGK062 hoito johti kertymistä PKC-a on solukalvon HEK293-soluissa (kuvio 3A). Havaitsimme myös CGK062 aiheuttama kalvon translokaatio PKC-a HEK293-soluissa immunofluoresenssianalyysin avulla (kuva S5). Johdonmukaisesti, CGK062 parannettu kinaasiaktiivisuutta PKC-a

in vitro

, kun käytetään synteettistä peptidiä, joka sisältää PKC-a-fosforylaatiokohdan substraattina (kuvio 3B). Lisäksi BIM I spesifinen inhibiittori PKC poistettiin vaikutus CGK062 (kuvio 3B), mikä viittaa siihen, että CGK062 on

bona fide

aktivaattori PKC-a.

(A) Sytosoliset ja membraanifraktioiden valmistettiin HEK293-solut käsiteltiin vehikkelillä (DMSO) tai CGK062 (25 ja 50 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa Wnt3a-CM Western blotting anti-PKC-a-vasta-ainetta. Täplät uudelleenseulottiin anti-tubuliinia tai anti-MDR-vasta-aineita kuin murto valvontaa. (B) osoitti peptidi inkuboitiin puhdistetun PKC-a ja CGK062 (12,5 ja 25 uM) tai BIM (0,5 uM). Määrät ATP reaktiossa havaittiin Kinase-Glo ™ luminesenssikoe Kit (Promega). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta, ja palkit osoittavat keskihajonnat. *,

P

0,05 verrattuna hikkelikontrolliryhmään. (C) Sytosoliset proteiinit valmistettiin HEK293 toimittaja soluja käsiteltiin CGK062 (25 uM) tai BIM (10 uM) poissa tai läsnä ollessa Wnt3a-CM Western blotting anti-β-kateniinin vasta-aine. (D) HEK293-reportteri-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin (NC) siRNA (40 nM) tai PKC-a-siRNA (40 nM), ja inkuboitiin sitten CGK062 (25 uM) 15 tunnin puuttuessa tai läsnä Wnt3a-CM. Solulysaatit altistettiin Western blot-analyysi anti-PKC-a ja anti-β-kateniinin aineita. In (C) ja (D), blotteja uudelleenseulottiin anti-aktiini-vasta-ainetta vahvistaa yhtä suuri kuormitus. (E) GST-β-kateniinin (100 ng) inkuboitiin puhdistetun PKC-a ja CGK062 (12,5 ja 25 uM) tai BIM (0,5 uM). Näytteet analysoitiin Western-blottauksella anti-fosfo-p33 /37-β-kateniinin vasta-aine. (F) HEK293-reportteri-soluja inkuboitiin CGK062 (25 uM) ja BIM (10 uM) 15 tunnin poissa tai läsnä Wnt3a-CM. Solulimafraktioita valmistettiin ja alistettiin Western blot-analyysi anti-fosfo-p33 /37-β-kateniinin tai anti-β-kateniinin vasta-aine. (G) HEK293-reportteri-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin (NC) siRNA (40 nM) tai PKC-a-siRNA (40 nM), ja inkuboitiin sitten CGK062 (25 uM) 15 tunnin puuttuessa tai läsnä Wnt3a-CM. Solulysaatit altistettiin Western blot-analyysi anti-β-kateniinin ja anti-P33 /37-β-kateniinin aineita. In (F) ja (G), sama määrä β-kateniinin ladattiin kuhunkin kaistaan.

jälkeen tutkittiin PKC-a-aktiivisuus on olennaista CGK062-välitteisen β-kateniinin hajoamiseen. Estyminen PKC-a-aktiivisuuden avulla BIM minä poisti säätely alaspäin β-kateniinin by CGK062 (kuvio 3C). Erityisesti selektiivinen ehtyminen endogeenisen PKC-a käyttäen pieniä-häiritsevä RNA (siRNA), myös kumosi CGK062-indusoimaa hajoamista ofβ-kateniini (kuvio 3D), mikä osoittaa, että PKC-a on vastuussa hajoamista β-kateniinin, jonka CGK062.

Seuraavaksi testata CGK062 välittömästi tukevaa PKC-a-välitteisten β-kateniinin fosforylaation Ser33 /37, teimme

in vitro

kinaasimääritykseen avulla bakteereissa ilmaistu β-kateniinin ja puhdistettu PKC-a. PKC-a helposti fosforyloituu β-kateniinin läsnäollessa CGK062 ja BIM minä esti tämän fosforylaation (kuvio 3E). Myös tutki CGK062 edistää PKC-a-välitteisten β-kateniinin fosforylaation Ser33 /37 ja Ser45 HEK293 reportteri soluissa. Western blot-analyysi osoitti, että Wnt3a-CM inhiboi fosforylaatiota β-kateniinin on Ser33 /37 ja Ser45 (kuvio 3F, S6 ja S7). Lisäksi, CGK062 indusoi fosforylaatiota β-kateniinin on Ser33 /37 ja Ser45 (kuvio 3F, S6 ja S7), ja Ser33 /37 fosforylaatio kumottiin lisäämällä BIM I (kuvio 3F). Johdonmukaisesti, CGK062 hoito pelastettiin fosforylaatiota β-kateniinin on Ser33 /37, joka inhiboitui Wnt3a-CM, ja pudotus PKC-a-suppressoitui merkittävästi CGK062 aiheuttama Ser33 /37 fosforylaation HEK293-reportteri-soluissa (kuvio 3G).

CGK062 edistää myös β-kateniinin hajoamiseen CRT-positiivisten syöpäsolujen

seuraavaksi testasimme, onko CGK062 aktivoi PKC-a-CRT-positiivisten syöpäsolujen, kuten PC3 (eturauhassyöpä), SNU475 (hepatooma), ja SW480 (paksusuolen syöpä). Yhdenmukaisia ​​tuloksia HEK293-solut, CGK062 edistää translokaatiota PKC-a-solukalvoon näissä syöpäsoluissa (kuvio 4A). Sen määrittämiseksi, onko CGK062 myös estää β-kateniinin toiminto CRT-positiivisten syöpäsolujen, TOPFlash plasmidi transfektoitiin CRT-positiivisten syöpäsolujen seuraa käsittely kasvavien pitoisuuksien kanssa CGK062. Kuten kuviossa 4B, CGK062 johdonmukaisesti tukahdutettu CRT PC3, SNU475, ja SW480-soluissa. Samanaikaisesti Tässä kokeessa määritimme vaikutus CGK062 tasoon sytosolin β-kateniinin näissä CRT-positiivisten syöpäsolujen Western blot-analyysi. Tasaisen, hoito CGK062 johti alas-säätely solunsisäisen β-kateniinin tasolla pitoisuudesta riippuvalla tavalla PC3, SNU475, ja SW480-solut (kuvio 4C). Olemme myös havainneet, että CGK062 edisti fosforylaatiota β-kateniinin at Ser33 /37, ja tämä fosforylaatio lakkautettiin BIM I SW480-soluissa (kuvio S8). Nämä tulokset osoittavat, että CGK062 indusoi myös β-kateniinin hajoamiseen CRT-positiivisten syöpäsolujen.

(A) Sytosoliset ja kalvon fraktiot valmistettiin PC3, SNU475, ja SW480-solut käsiteltiin vehikkelillä (DMSO) tai CGK062 varten Western blotting anti-PKC-a-vasta-aine. Täplät uudelleenseulottiin anti-tubuliinia tai anti-MDR-vasta-aineita kuin murto valvontaa. (B) PC3, SNU475, ja SW480-solut kotransfektoitiin TOPFlash ja pCMV-RL plasmidit ja inkuboitiin CGK062 15 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 39 tuntia transfektion jälkeen ja ilmoitetaan suhteellisina valon yksikkö (RLU) normalisoitu

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta, ja palkit osoittavat keskihajonnat. *,

P

0,05, ja **,

P

0,01 verrattuna hikkelikontrolliryhmään. (C) Sytosoliset proteiinit valmistettiin PC3, SNU475, ja SW480-solut käsiteltiin ajoneuvon (DMSO) tai CGK062 15 tuntia ja sitten suoritettiin Western-blottauksella β-kateniinin vasta-aine. Blotit uudelleenseulottiin anti-aktiini-vasta-ainetta vahvistaa yhtä suuri kuormitus.

CGK062 tukahduttaa ilmentymistä β-kateniinin riippuva geenien

Sen määrittämiseksi, onko CGK062 vaikuttaa ilmaus β- kateniinin riippuvainen geenejä, promoottorin aktiivisuus

sykliini D1

, joka on tunnettu β-kateniinin riippuvainen geenin, arvioitiin. Reportteri-konstrukti, joka sisältää

sykliini D1

promoottori, joka sisältää β-kateniinin /TCF-4 reagoiva alue, transfektoitiin PC3, SNU475, ja SW480-solut, jota seuraa käsittely eri pitoisuuksilla CGK062. Kuten on esitetty kuviossa 5A,

sykliini D1

promoottorin aktiivisuus tukahdutettu CGK062 näissä CRT-positiivisten syöpäsolujen. Olemme myös arvioitiin proteiinin taso sykliini D1 CGK062 saaneilla CRT-positiivisten syöpäsolujen. Vastaa meidän tulos

sykliini D1

promoottori, annoksesta riippuvainen väheneminen sykliini D1-proteiinin ekspressio havaittiin vasteena CGK062 (kuvio 5B) PC3, SNU475, ja SW480-soluissa. Lisäksi, ekspressio

c-myc

ja

ak- siini-2

perustettu alavirtaan tavoitteet β-kateniinin [9], olivat myös merkittävästi vähentää näiden CRT-positiivisten syöpäsolujen inkuboinnin jälkeen kanssa CGK062 (kuvio 5B). Näissä olosuhteissa PKC-a-taso ei muuttunut vastauksena eri pitoisuuksia CGK062 (kuvio S9).

(A) PC3, SNU475, ja SW480-solut ko-transfektoitiin sykliini D1-RL ja pSV40- FL, ja sitten inkuboitiin osoitetun määrän CGK062 15 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 39 h transfektion jälkeen. Sykliini D1 promoottori aktiivisuus ilmoitetaan suhteellisena valon yksikkö (RLU) normalisoitu tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta, ja palkit osoittavat keskihajonnat. *,

P

0,05, ja **,

P

0,01 verrattuna hikkelikontrolliryhmään. (B) PC3, SNU475, ja SW480-soluja inkuboitiin ajoneuvon (DMSO) tai CGK062 15 tuntia ja sitten solu-uutteet valmistettiin Western-blottauksella anti-ak- siini, anti-sykliini D1 ja anti-myc-vasta-aineita. Vahvista yhtä suuri lastaus, blotit uudelleenseulottiin anti-aktiini vasta-aine.

CGK062 estää leviämisen CRT-positiivisten syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että häiriöt β-kateniinin toiminto antisense, siRNA, tai erittää Wnt antagonisti strategioiden on osoitettu spesifisesti inhiboivan kasvua CRT-positiivisten syöpäsolujen [20] – [22] . Koska CGK062 edisti hajoamista solunsisäisten β-kateniinin, me arveltu, että CGK062 myös tukahduttaa leviämisen CRT-positiivisten syöpäsolujen. Tutustua hypoteesin, arvioimme vaikutus CGK062 kasvuun eri CRT-positiivisten syöpäsolujen. Kuten on esitetty taulukossa 1 ja kuviossa S10, CGK062 tehokkaasti esti kasvua CRT-positiivisia paksusuolen syövän soluja (DLD-1, SW480, HCT15, SNU475, ja PC3-solut), jossa IC

50-arvot 1,62 uM 18,60 uM. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että CGK062 merkittävästi estää soluproliferaatiota CRT-positiivisten syöpäsolujen.

edelleen arvioimista antituumorivaikutuksen CGK062

in vivo

, kateenkorvattomia nude-hiiriin, joissa oli muodostuneita sc PC3 ksenograftikasvaimissa hoidettiin päivittäin i.p. anto CGK062 varten 5 viikkoa 50 ja 100 mg /kg. Verrattuna kantajaa (kontrolli), hiirten käsittely CGK062 esti merkittävästi PC3 kasvaimen kasvua (kuvio 6A). Annos 100 mg /kg CGK062 indusoi lähes täydellinen kasvaimen kasvun inhibitiota. Jopa annoksena 50 mg /kg, CGK062 inhiboi kasvaimen kasvua -70% verrattuna kontrolliryhmään. Kaikki hiiret siedetty hoito ilman merkittävää menetystä kehon paino (kuvio 6B).

(A ja B) CGK062 estää eturauhassyövän -tuumoriksenografti kasvua

in vivo

. Ihonalainen PC3 tuumoriksenografteja perustettiin ja käsittelyt annettiin kuvattu materiaalit ja menetelmät. (A), keskimääräinen kasvainten (n = 6) (B), keskimääräinen keskimääräinen paino muuttuu hoidon aikana. *,

P

0,05 verrattuna hikkelikontrolliryhmään.

Keskustelu

Aberrant säätely ylöspäin solunsisäisen β-kateniinin on mukana kehittämässä useiden syöpien, mukaan lukien eturauhas- syöpä, peräsuolen syöpä, ja hepatosellulaarista karsinoomaa [6] – [8]. Tässä raportissa käytimme solupohjaisessa seulonta tunnistaa CGK062 niin voimakas estäjä Wnt /β-kateniinin reitin. CGK062 edellyttäen merkittävää terapeuttista hyötyä suhteessa kasvaimenvastaista tehoa eri β-kateniinin vaste transkription (CRT) -positiivinen syöpäsolut, kuten paksusuolen syövän soluja (SW480, DLD-1, ja HCT15), hepatosellulaarinen karsinooma (SNU475), hormoni-tulenkestävät eturauhasen syöpäsolujen (PC3).

CGK062-aktivoidun PKC-a-katalysoitu fosforylaatiota β-kateniinin on Ser33 /Ser37, ja siten vähentää solunsisäisen β-kateniinin tasolla β-TrCP riippuvainen proteasomaalisten hajoamista. Lisäksi farmakologinen esto ja PKC-a-siRNA kumottu CGK062 aiheuttama β-kateniinin fosforylaatio /hajoamista, mikä osoittaa, että PKC-a vastaa CGK062 estoa Wnt /β-kateniinin reitin. Tulokset Useiden tutkimusten, joista osa toteutettiin aiemmin laboratoriossamme, viittaavat keskeinen rooli PKC-a säätelyssä Wnt /β-kateniinin signalointi. Wnt5a on osallistuvilla solunsisäisen Ca

2+, myöhempi aktivaatio PKC-a, ja inhibitio Wnt /β-kateniinin reitin [23], [24]. Orford

et al.

[25] on raportoitu, että PKC: n estäjät aiheuttavat kertymistä β-kateniinin ihmisen rintasyövän soluissa. Äskettäin, retinoiinihappo liittyvät orpo tumareseptori α (ROR α) on todettu heikentävän Wnt /β-kateniinin signalointi paksusuolen syövän stimuloimalla PKC-a-riippuvaisia ​​fosforylaatio [26]. Aikaisemmin osoitimme, että PKC-a säätelee negatiivisesti Wnt /β-kateniinin signalointi HEK293-soluissa, joilla on normaali Wnt /β-kateniinin reitin toiminto [17] ja että PKC-a säätelee solunsisäinen β-kateniinin tasolla koolonkarsinoomasoluissa [18]. Tämä tutkimus ulottuu niitä aikaisempia havaintoja osoittamalla, että aktivointi PKC-a, jonka romaani agonisti, CGK062, edistää β-kateniinin hajoamiseen kolmessa syöpäsolulinjoissa – PC3 (eturauhassyöpä), SNU475 (hepatooma), ja SW480 (paksusuolen syöpä) – joka näyttää poikkeava säätely ylöspäin solunsisäisen β-kateniinin tason.

pienmolekyylisalpaajien jotka antagonisoivat CRT on löydetty korkean suoritustehon seulonnan. Pienet molekyylit, jotka estävät yhdistyksen välillä TCF4 ja β-kateniinin heikentää β-kateniinin riippuvaiset toimintaa, kuten solujen lisääntymisen ja päällekkäistä alkion selkä akselia

Xenopus laevis

[27]. Toinen pieni molekyyli, ICG-001, joka estää vuorovaikutuksen β-kateniinin ja syklisen AMP-elementti sitova proteiini (CBP), erityisesti indusoi apoptoosia koolonkarsinoomasoluissa [28]. Kaksi muuta pieniä molekyylejä, IWR-3 ja XAV939, on viime aikoina osoitettu stimuloivan hajoamisen β-kateniinin stabilointi ak- siini ja siten inhiboimaan DLD-1 paksusuolen syövän soluja, jotka kantavat mutaatiota APC [29], [30 ]. Toisin kuin aiemmin tutkittu pieniä molekyylejä, CGK062 vähensi solunsisäisen tason β-kateniinin kautta PKC-a-välitteisen fosforylaation /hajoamista. Erityisesti se pystyi edistämään β-kateniinin hajoamista SNU475 hepatoomasolujen, joka kuljettaa ak- siini mutaatio, sekä SW480 koolonkarsinoomasoluissa kanssa APC-mutaatio, ja tukahdutti kasvu CRT-positiivisten syöpäsolujen. CGK062 merkittävästi tukahdutti kasvua PC3 eturauhasen kasvaimia hiiren ksenograftimallia, vastaa tuloksia, meidän

in vitro

analyyseissä.

Yhteenvetona tunnistimme CGK062 joka edistää PKC-a-välitteisten β- kateniinin fosforylaation ja sen hajoamista. CGK062 tukahdutettu ilmaisuna sen kohdegeenien, mukaan lukien koodaus sykliini D1, c-myc ja ak- siini-2, samalla poistetaan kasvaimen kasvua

in vitro

ja

in vivo

. Yhdessä CGK062 edustaa lupaava ehdokas hoitoon CRT-positiivisia syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, plasmidit, transfektio, ja lusiferaasianalyysissä

HEK293, PC- 3, SNU475, DLD-1, HCT15, SW480, ja Wnt3a erittävät L-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja ylläpidetään Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 120 ug /ml penisilliiniä, ja 200 ug /ml streptomysiiniä. Wnt3a-väliaine (Wnt3a-CM) valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [31]. HEK293 reportteri ja valvonta-solulinja perustettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. PTOPFlash ja pFOPFlash toimittaja plasmidit saatiin Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Hallitseva negatiivinen β-TrCP (Δβ-TrCP) ekspressioplasmidin oli lahja M. Davis (Hebrew University-Hadassah Medical School, Israel). pCMV-RL ja pSV- FL plasmidit hankittiin Promega. PKC siRNA on suunniteltu, kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. Transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lusiferaasimääritys suoritettiin käyttäen Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA).

seulonta pienimolekyylinen inhibiittori Wnt /β-kateniinin signalointi

HEK293 toimittaja solut ympättiin 96-kuoppalevyille 15000 solua kuoppaa kohti kahtena kappaleena ja kasvatettiin 24 tuntia. Wnt3a-CM lisättiin, ja sen jälkeen yhdisteet (800-yhdisteet), mukaan lukien kumariinit, flavonoidit, naftokinonit, ja terpenoideja lisättiin kuoppiin lopulliseen pitoisuuteen 30 uM. 15 tunnin kuluttua levyt määritettiin tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta ja solujen elinkykyä.

valmistaminen membraanifraktio

Soluja kasvatettiin 100 mm: n viljelymaljoissa pestiin jääkylmällä PBS: llä. Sitten solut suspendoitiin 1 ml: aan jääkylmää uuttopuskuria (20 mM Tris (pH 7,5), 0,5 mM EDTA: ta, ja 0,5 mM EGTA); homogenoitu ruiskulla (26 G); ja inkuboitiin jäillä 30 min. Homogenaattia sentrifugoitiin 13400 x

g

2 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti sentrifugoitiin 100.000 x

g

30 minuutin ajan 4 ° C: ssa 100Ti roottorin (Beckman, USA). Pelletti suspendoitiin uuttopuskuria, joka sisälsi 0,5% (w /v) Triton X-100.

Western blotting

sytosolifraktion valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [33]. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE 4-12% gradienttigeelissä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja tutkittiin anti-β-kateniinin (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), anti-fosfo-β-kateniinin (Ser33 /Ser37 /Thr41) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-fosfo-β-kateniinin (Ser45) (Cell Signaling Technology), anti-sykliini D1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-PKC-a (BD Transduction Laboratories), anti-ak- siini (BD Transduction Laboratories), anti-β-TrCP (Santa Cruz Biotechnology), anti-MDR1 (Santa Cruz Biotechnology) ja anti-aktiini vasta-aineita (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) . Membraanit inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun anti-hiiri-IgG- tai anti-kani-IgG (Santa Cruz Biotechnology), ja visualisoitiin käyttämällä ECL-järjestelmää (Santa Cruz Biotechnology).

RNA ja semikvantitatiivinen RT -PCR

Yhteensä-RNA eristettiin Trizol reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaisesti valmistajan ohjeita. cDNA-synteesi, käänteistranskriptio ja PCR: n (polymeraasiketjureaktion) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Monistettu DNA erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja värjättiin etidiumbromidilla.

Immunofluoresenssianalyysi

HEK293cells viljeltiin lasikammiota dioja ja sitten käsiteltiin DMSO: ssa tai CGK062 15 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% formaldehydiä, läpäiseviksi 0,3% Triton X-100, ja blokattiin 4% naudan seerumin albumiinia 1 tunnin ajan.