Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ruokatorven syöpä on yksi yleisimmistä syövistä, ja 5 vuoden pysyvyys on vähemmän yli 10% puutteen vuoksi tehokkaita terapeuttisia aineita. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida antituumorivaikutuksen Ec-LDP-Hr-AE, äskettäin kehitetty bispesifisen enediyne päästää fuusioproteiini kohteena sekä epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2 (HER2), on ruokatorven syöpään. Fuusioproteiini Ec-LDP-Hr-AE koostuu kahdesta oligopeptidin ligandien ja enediyne antibioottia lidamycin (LDM) reseptorisitoutumiselle ja solun tappaminen, vastaavasti. Nykyinen tutkimus osoitti, että Ec-LDP-Hr oli suuri affiniteetti sitoutua ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) soluja, ja enediyne virtaa fuusioproteiini Ec-LDP-Hr-AE osoittivat voimakas sytotoksisuus ESCC solujen ero ilmaus EGFR ja HER2. Ec-LDP-Hr-AE voi aiheuttaa merkittäviä G2-M-pysähtymisen EC9706 ja KYSE150 soluja, ja se myös indusoi apoptoosia ESCC solujen annos-riippuvaisella tavalla. Western blot analyysit osoittivat, että Ec-LDP-Hr-AE edistänyt kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 toimintaa sekä PARP pilkkominen. Lisäksi Ec-LDP-Hr-AE inhiboi solujen proliferaatiota kautta vähenee fosforylaatio EGFR ja HER2, ja edelleen kohdistetaan eston aktivoinnin niiden loppupään signalointimolekyylien.

In vivo

kello siedetty annos, Ec-LDP-Hr-AE inhiboi kasvaimen kasvua 88%: lla, kun sitä annettiin nude-hiirissä, joilla on ihmisen ESCC solun KYSE150 ksenografteja. Nämä tulokset osoittivat, että Ec-LDP-Hr-AE näytteillä voimakas anti-caner Tehoa ESCC, viittaa se voisi olla lupaava ehdokas täsmähoitoihin ruokatorven syöpään.

Citation: Guo XF, Zhu XF, Yang WC Zhang SH, Zhen YS (2014) EGFR /HER2-Bispesifiset ja Enediyne-Virroitetut rifuusioproteiini Näyttää korkea tehoa ruokatorven syöpään. PLoS ONE 9 (3): e92986. doi: 10,1371 /journal.pone.0092986

Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 marraskuu 2013; Hyväksytty: 27 helmikuu 2014; Julkaistu: 24 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat osittain Natural Science Research Project opetusviraston Henanin maakunnassa Kiinassa (nro 12B350004 ja XFG), National Natural Science Foundation of China (nro 81202447 ja XFG, https://www.nsfc.gov. cn /Portal0 /default152.htm), ja avustusta USCACA (nro USCACA-TIGM-001 WCY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on yksi yleisimmistä syövistä, sekä kuudes yleisin syy syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa. Pohjoisten alueiden Henanin maakunnassa Kiinassa on korkein esiintyvyys ruokatorven syöpä, erityisesti ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) [1], [2]. Vaikka monet hoitovaihtoehtoja ovat nyt käytettävissä, kuten leikkaus yhdistettynä modality strategiat, kuten esi- tai leikkauksen kemoterapiaa tai ilman säteilyä, ja lopullisia chemoradiation, ennuste ruokatorven syöpään on huono ja 5 vuoden pysyvyys alle 10% [3] – [5]. Koska haitat kemoterapeuttisten aineiden, kuten vakavia toksisia sivuvaikutuksia, poikkeuksellisen korkea lääkeresistenssideterminantit, ja vähän vaikutuksia eloonjäämiseen, on kiireellinen tarve kehittää uusia tehokkaita terapeuttisia aineita, jotka on suunnattu tietyille molekyyli poikkeavuuksia ruokatorven karsinoomat, erityisesti ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (HER) perhe [6].

HER-tyrosiinikinaasi reseptorien sisältää neljä jäsentä: HER1 /EGFR, HER2 /neu, HER3 ja HER4. Ligandin sitoutumista reseptoreihin johtaa reseptorin dimerisaation, aloittaa sitten useita solunsisäisiä tapahtumia, jotka lopulta edistää solujen kasvua, proliferaatiota, erilaistumista ja muuttoliike [7]. Yliekspressio epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptoria 2 (HER2) on havaittu monissa ihmisen syövissä, kuten keuhkojen, pään ja kaulan, rinnan, munasarjojen, ja ne on osoitettu olevan tärkeitä rooleja sekä muodostumista ja etenemistä monia yleisesti esiintyviä syöpiä [8]. Ruokatorven syöpä, EGFR yli-ilmentyminen esiintyy 30% -90% [9], [10], ja yli-ilmentävät HER2 vaihtelee 19% -43% [11]. Lisäksi yliekspressio sekä EGFR ja HER2 havaittiin 18% -25% potilaista, joilla ruokatorven syöpä [12], [13]. Siksi aine on kohdistettu sekä EGFR ja HER2 osoittaisi tehokkaampia terapeuttisia vaikutuksia ruokatorven syöpäpotilailla.

Ec-LDP-Hr-AE, bispesifinen fuusioproteiinia, joka sisältää kaksi oligopeptidien (Ec, 22 aminohappoa EGF ja Hr, VH CDR3 alue anti-HER2 C6.5-aine) spesifinen EGFR ja HER2, ja enediyne antibioottia lidamycin (LDM), rakennettiin ja raportoitu edellisessä tutkimuksessa [14]. Se osoitti sytotoksisiksi erilaisia ​​karsinoomasoluja

in vitro

, ja se oli erittäin tehokas kasvun estämiseksi ihmisen munasarjan caner SK-OV-3-ksenografteissa

in vivo

. Kuitenkin antituumorivaikutuksen tehosta Ec-LDP-Hr-AE on ruokatorven syöpä ei ole hyvin tutkittu. Tässä tutkimuksessa emme vain mitata sitoutumisaffiniteettia Ec-LDP-Hr fuusioproteiinin ruokatorven syöpäsoluissa, mutta myös arvioitiin tehoa jännitteiset fuusioproteiinien

in vitro

ja

in vivo

. Vaikutukset Ec-LDP-Hr-AE solusyklin jakelu- ja apoptoosin tutkittiin myös. Valottaa mekanismeja sytotoksisuus ja apoptoosin induktio Ec-LDP-Hr-AE, ilmaus apoptoosin liittyvien molekyylien ja keskeisten molekyylien HER signaalireitteihin analysoitiin samoin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

BALB /c-nude-hiiriin (6-8 viikkoa) käytettiin kokeissa hankittiin Institute of Laboratory Animal Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences, ja isännöi tietyin taudinaiheuttaja vapaa olosuhteissa. Koejärjestely hyväksynyt eläinkokeet eettisen komitean Institute of Medicinal Biotekniikan, Kiina Academy of Medical Sciences.

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen ruokatorven sinoomasolulinjoja EC1, ECa109, EC9706 ja KYSE150 ja hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3 saatiin Cell Center Peking unionin Medical College, Kiinassa, ja viljeltiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ( FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 2 mmol /L glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

Reagenssit ja vasta-aineet

(3- (4, 5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli) -2, 5-dipheny-ltetrazolium bromidia (MTT), fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja isoprophyl-β-D-thiogalactopranoside (IPTG) ostettiin Sigma Aldrench Chemical Inc. (St. Louis, MO, USA). Kaikki vasta-aineet, mukaan lukien fosforyloituja-HER2, -EGFR, -AKT, -extracellular säännelty proteiinikinaasi (ERK), -p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK), -c-Jun N-terminaalisen kinaasin ( JNK) monoklonaalisia vasta-aineita ja anti-EGFR-, -HER2, -AKT, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -caspase 3, -caspase 7, -cleaved PARP-vasta-aineita saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-β-aktiini vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). (HRP) konjugoitua vuohen anti-kani /hiiri-vasta-aineita hankittiin myös yhtiöstä Cell Signaling Technology.

valmistaminen jännitteiset fuusioproteiinien

valmistus bispesifisten fuusioproteiinin Ec-LDP- hr-AE ja sen vastaava Yksilajisten fuusioproteiinit Ec-LDP-AE ja LDP-h-AE oli kuvattu edellisessä tutkimuksessa [14]. Lyhyesti, DNA-fragmentit, jotka koodaavat Ec-LDP-Hr, Ec-LDP ja LDP-Hr saatiin PCR: llä ja DNA-kloonauksen tekniikoita, ja sitten ne insertoitiin pET30a vektoriin tuottaa ekspressioplasmideilla Pet-

Ec-LDP- hr

, lemmikki-

Ec-LDP

ja lemmikki-

LDP-hr

. Nämä plasmidit transformoitiin sitten

Escherichia coli BL21

(

DE3

), ja fuusioproteiinit ekspressoitiin lisäämällä IPTG: llä. Fuusioproteiinit poimittu periplasmiseen tilaan

E.coli

osmoottisen shokin menetelmällä (pET järjestelmä manuaalinen, 9

painos, Novagen) ja puhdistettiin affiniteettikromatografialla (HisTrap HP sarake, GE Healthcare) . Virtaa fuusioproteiinit Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE ja LDP-Hr-AE rakennettiin yhdistämällä aktiivinen enediyne kromofori (AE) on lidamycin osaksi Ec-LDP-Hr, Ec-LDP ja LDP- h proteiineja, vastaavasti.

Sitoutumisaffiniteettiä määrityksessä

virtaussytometrialla-pohjainen immunofluoresenssimäärityksellä käytettiin mittaamaan sitoutumisen affiniteetti fuusioproteiinin Ec-LDP-h ruokatorven syövän soluihin [15] . Ec-LDP-Hr proteiinin FITC-leimatulla 16 h karbonaattipuskuriin liuosta (100 mmol /L NaHCO

3, 10 mmol /l Na

2CO

3, pH 9,0) 4 ° C: ssa . Leimatun proteiinin erotettiin sitoutumattomasta FITC käyttämällä Sephadex G-25-pylvään (GE Healthcare). Sitten FITC-leimatun Ec-LDP-Hr proteiinia inkuboitiin 10

6 EC9706 soluja, KYSE150 soluja tai NIH 3T3-soluissa 100 ui puskuria (PBS + 2% FBS: ää) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavat kolme pesua 500 ui puskuria, solut analysoitiin virtaussytometrillä (BD Company). Aineisto analysoitiin Prism 5 ohjelmisto (GraphPad Software).

MTT-määritys

Solut irrotetaan trypsinaation ja levytettiin 96 kuopan tasapohjaisille levyille, viljeltiin 24 tuntia ennen altistusta erilaisia ​​pitoisuuksia LDM, Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE tai LDP-Hr-AE: ssa 48 tuntia. MTT-liuosta (5 mg /ml, 20 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin vielä 4 h 37 ° C: ssa. Supernatantti poistettiin ja 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin käyttäen Multiskan-spektri väline (Thermo Labsystems, Rochford, IL, USA). Absorbanssiarvot ilmaistiin prosenttiosuutena, että käsittelemättömät solut, ja pitoisuudet testataan aineiden tuloksena 50%: kasvun esto (IC

50) laskettiin.

Cell cycle-analyysillä

vaikutukset bispesifisten fuusioproteiinin Ec-LDP-Hr-AE solusyklin arvioitiin käyttämällä propidiumjodidi (PI) värjäys. Käsittelyn jälkeen 0,1 nmol /l, 0,5 nmol /l ja 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE 48 tuntia, EC9706 ja KYSE150 solut pilkottiin trypsiinillä-EDTA: lla ja pestiin PBS: llä. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää, jossa 50 ug /ml PI: n ja 100 ug /ml RNaasi A Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, solut analysoitiin fluoresenssi virtaussytometrillä (BD Company).

Cell apoptoosimäärityksessä

The effects of bispesifisten fuusioproteiinin Ec-LDP-Hr-AE on apoptoosin indusoimiseksi ESCC soluissa mitattiin käyttämällä Hoechst värjäystä ja anneksiini V-FITC /PI värjäystä. Hoechstin värjäys, KYSE150 soluja kasvatettiin coverslides ja inkuboitiin 24 tunnin ajan, sitten 0,1 nmol /l, 0,5 nmol /l ja 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE ja inkuboitiin vielä 48 tuntia. Solut coverslides kiinnitettiin metanolilla, pestiin PBS: llä ja värjättiin 1 mg /ml Hoechst 33342: ssa 15 min. Kuvat havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Nikon TE 2000 u). Anneksiini V-FITC /PI-värjäys, apoptoottisten solujen mitattiin anneksiini V-FITC /PI-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (Biosea teknologia). Sen jälkeen kun 0,1 nmol /l, 0,5 nmol /l ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE hoitoa 48 tuntia, solut kerättiin, pestiin kahdesti PBS: llä, ja sentrifugoitiin 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan sitovaa puskuria, joka sisälsi 10 ui Annexin V-FITC: llä ja 5 pl PI, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 min ajan, ja analysoitiin sitten fluoresenssi virtaussytometrillä (BD Company).

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin 30 min radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskuri sisälsi useita proteaasi-inhibiittoreita (esim 1 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 2 mmol /L NAvó

4, ja 50 mmol /l NaF). Proteiini uutettiin soluista kvantitoitiin käyttäen bikinkoniini- happoa (Pierce Biochemicals), ja 30 ug kutakin kokonaisproteiinia levitettiin 10% SDS-PAGE ja sen jälkeen elektroblotattiin päälle polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore). Membraanit inkuboitiin 1% BSA: ta 2 h huoneenlämmössä ennen inkubointia yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden (laimennettu 1:1000 TBST-puskurilla, Cell Signaling Technology). Sitten kalvoja inkuboitiin toisen asteen HRP-konjugoiduilla vasta-aineilla (1:5000 laimennus; Cell Signaling Technology) 1 h sen jälkeen, kun oli pesty kolme kertaa TBST-puskurilla. Erityinen vyöhykkeet visualisoitiin Immobilon Länsi Kemiluminesenssiin HRP Substrate Kit (Millipore) ja vangiksi ChemiImager 5500 kuvantamisjärjestelmä (Alpha Innotech Corp.).

In vivo

tehon määritys

in vivo

tehoa jännitteiset fuusioproteiinien arvioitiin KYSE150 ksenografteissa nude-hiirimallissa. 1 x 10

7 KYSE150 solut suspensoitiin 200 ul PBS s.c. oikeassa kainalossa nude-hiirten. 3 viikon kuluttua kasvaimet otettiin pois nude-hiirissä ja leikeltiin aseptisesti steriiliin suolaliuokseen. Kappaletta kasvainkudoksen (2 mm

3 koko) on istutetaan sitten oikean kainalon nude-hiirillä troakaarin, ja haava suljettiin kollodiumiin. Tuumoreita kantavaa hiirtä jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään (n = 7), kun tuumorin koko oli yli 100 mm

3 (noin 10 päivää myöhemmin). Lidamycin (0,05 mg /kg), ja bispesifisen fuusioproteiinin Ec-LDP-Hr-AE (0,3 mg /kg) injektoitiin i.v. häntälaskimoon ja annetaan 200 ul: n tilavuudessa PBS: ää päivänä 11 ja päivänä 21, vastaavasti. Hiirten kontrolliryhmä sai 200 ui PBS: ää hoitoa samalla fuusioproteiineina. Tuumorin koko mitattiin joka 3 päivä ja kasvaimen tilavuus määritettiin pituus x leveys

2/2. Esto laskettiin 1 – kasvaimen tilavuus (käsitelty) /kasvaimen tilavuus (kontrolli) x 100%.

Tilastollinen

tulokset määrällisiä tietoja tässä tutkimuksessa esitettiin keskiarvona ± SD. Erot ryhmien analysoitiin tilastollisesti käyttämällä paritonta kaksisuuntainen t-testi, ja P-arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

valmistaminen jännitteiset fuusioproteiinien

mukaan edellisessä lähestymistavan koodaavat geenit fuusioproteiinien Ec-LDP-Hr, Ec-LDP ja LDP-Hr rakennettiin ja koodatut proteiinit ekspressoitiin periplasmiseen tilaan

E.coli

. Fuusioproteiinit puhdistettiin Ni

2+ affiniteettikromatografia ja puhtaus fuusioproteiinien kaikki oli yli 90% määritettynä SDS-PAGE: lla ja korkean suorituskyvyn-neste-kromatografialla (HPLC). Aktiivinen enediyne kromofori (AE) ja LDM ja kolme fuusioproteiinit käyttövalmiiksi

in vitro

tuottaa jännitteiset fuusioproteiinit Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE ja LDP-Hr-AE. Tulokset käänteisfaasi-HPLC: llä osoitti, että kolme jännitteiset fuusioproteiinit onnistuneesti koottu.

Sitoutumisaffiniteettiä Ec-LDP-Hr proteiinin ruokatorven syöpä solujen

EC9706 soluja, KYSE150 solut ja NIH 3T3 soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien FITC-leimatun Ec-LDP-Hr, ja fluoresenssin intensiteetit mitattiin virtaussytometrillä. Keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetit (MFI) on EC9706 solujen ja KYSE150 solut sekä lisäsi merkittävästi (P ​​ 0,05), mikä osoitti, Ec-LDP-Hr oli vahva sitoutumisen aktiivisuus ruokatorven syöpä soluja (kuvio 1A, 1C). Kuitenkin rahalaitoksille NIH 3T3-solut eivät näytä merkittävää kasvua, mikä tarkoitti Ec-LDP-Hr kyennyt sitoutumaan EGFR ja HER2 negatiivinen NIH 3T3-soluissa (kuvio 1 E). Mukaan rahalaitoksille ja Ec-LDP-Hr pitoisuudet, sitoutumisaffiniteetti (K

d) arvot laskettiin Prism 5 -ohjelmalla. K

d-arvot Ec-LDP-Hr sidottu EC9706 ja KYSE150 soluja 5,283 umol /l ja 3,562 umol /l, vastaavasti (Fig. 1 B, 1 D).

EC9706 soluja (A) , KYSE150 solut (C) tai NIH 3T3-soluja (E) inkuboitiin FITC-leimatun Ec-LDP-Hr proteiinia ilmoitettuina pitoisuuksina, ja keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti (MFI) analysoitiin virtaussytometrillä. Kohonneet pitoisuudet FITC-leimatun Ec-LDP-Hr proteiineja inkuboitiin EC9706-solujen (B) tai KYSE150 soluja (D). Sen jälkeen FACS, rahalaitosten olivat funktiona proteiinikonsentraatioilla.

sytotoksisuus jännitteiset fuusioproteiinien

in vitro

sytotoksisuus bispesifisten vetää fuusioproteiinin Ec-LDP- hr-AE suoritettiin neljällä ihmisen ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) solulinjat ilmentävät eri EGFR ja HER2 ja EGFR /HER2 negatiivinen NIH 3T3-soluissa käyttämällä MTT-määrityksissä (kuvio. 2A). LDM ja Yksilajisten vetää fuusioproteiinit Ec-LDP-AE ja LDP-Hr-AE testattiin myös vertailun vuoksi. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, bispesifiset vetää fuusioproteiini Ec-LDP-Hr-AE tappoivat ESCC solut ja NIH 3T3-solujen kanssa erittäin suuri teho. IC

50-arvot Ec-LDP-Hr-AE 4 ESCC solut olivat alle 10

-10 mol /l tasolla (Fig. 2C). Kuitenkin, bispesifiset Ec-LDP-Hr-AE-proteiini ei ollut aina voimakkaampi kuin monospesifisten kollegansa ja LDM. Tulokset tilastollinen analyysi paljasti, että erot IC

50-arvot LDM, Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE ja LDP-Hr-AE EY-1, ECa109 ja EC9706 solut eivät olleet tilastollisesti merkitseviä . Mutta erot IC

50-arvot KYSE150 solut olivat merkittävästi (P ​​ 0,05). Lisäksi IC

50 arvon Ec-LDP-Hr-AE NIH 3T3-soluissa ei havaittu merkittäviä eroja verrattuna neljä ESCC soluja.

(A) ilmentyminen EGFR ja HER2 eri ruokatorven syöpäsolut ja NIH 3T3-solut analysoitiin Western blotilla. (B) Solujen tappaminen vaikutukset Ec-LDP-Hr-AE on ruokatorven syöpä solulinjoissa KYSE150, EC9706, ECa109 ja EC-1 ja hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3 testattiin MTT määrityksissä. Solut altistettiin eri pitoisuuksia Ec-LDP-Hr-AE 48 h ja tulokset saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) IC

50-arvot lidamycin (LDM), Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE, ja LDP-Hr-AE vastaan ​​4 erilaista ruokatorven syöpä solujen ja NIH 3T3-soluissa mitattiin MTT-analyysi. Pylväät, keskiarvoa kolmesta kokeita, baareja, SD.

Effects of bispesifisten fuusioproteiinin Ec-LDP-Hr-AE solusyklin jakelu

EC9706 ja KYSE150 solut altistettiin 0,1 , 0,5 ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE 48 tuntia, ja solusyklin jakautumisen arvioitiin PI-värjäyksellä ja virtaussytometrialla analysointia. Ohjaus solut (EC9706 ja KYSE150) jaetaan G2-M-vaiheessa oli 10,51% ± 0,98% ja 6,26% ± 1,96%: lla, kun taas solut käsiteltiin 0,1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE jaetaan G2-M-vaiheessa oli 86.00% ± 0,98% ja 89,36% ± 0,71% vastaavasti. Nämä tiedot osoittivat, että merkittävä G2-M pidätys johtui Ec-LDP-Hr-AE hoitoa (Fig. 3). Vaikka oli suuri muutos (noin 12,84% ~31.53% nousu) osaksi G2-M-faasin altistumisen jälkeen 0,5 nmol /l ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE, solut jaetaan G2-M vaihe oli vähemmän kuin käsiteltiin 0,1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE, joka osoitti, että G2-M-faasin solut saavuttivat huippunsa 0,1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE hoidon (Fig. 3).

EC9706 soluja tai KYSE150 solut altistettiin Ec-LDP-Hr-AE 48 h ilmoitettuina pitoisuuksina ja solusyklin jakautuminen määritettiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun PI-värjäyksen. Pylväät, keskiarvoa kolmesta kokeita, baareja, SD.

Effects of bispesifisten fuusioproteiinin Ec-LDP-Hr-AE apoptoosiin

Tulokset Hoechst 33342 värjäystä ja anneksiini V- FITC /PI-värjäys määritykset paljastivat, että apoptoottisia soluja (EC9706 ja KYSE150) kasvoivat selvästi annos-riippuvaisella tavalla hoidon jälkeen Ec-LDP-Hr-AE. Hoechst 33342 värjäytyminen käytettiin havaitsemaan muutoksia ydinvoiman morfologiassa. Ytimet käsittelemättömien solujen olivat normaaleja ulkonäkö ja leviää värjäytyminen kromatiinin. Altistuksen jälkeen eri pitoisuuksia Ec-LDP-Hr-AE: ssa 48 tuntia, KYSE150 solut esitetään tyypillisiä morfologisia muutoksia apoptoosin, kuten kromatiinin kondensaatio tai kutistunut ydin (Fig. 4A). Kuten on esitetty kuviossa. 4B, suhteet apoptoottisten EC9706 solujen hoidon jälkeen 0,1, 0,5 ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE oli 15,06% ± 0,29%, 38,10% ± 0,64% ja 50,00% ± 0,39%: lla, mikä osoitti merkittävää lisääntyy verrattuna säätökennoja (P 0,01). Apoptoottisten solujen lisääntynyt paljon, että KYSE150 solujen altistuksen jälkeen 0,1, 0,5 ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE, jossa apoptoosin suhde 16,29% ± 0,35%, 21,54% ± 0,51% ja 32,99% ± 0,38%, vastaavasti (P ​​ 0,01 verrokkiin nähden, Fig. 4C). Lisäksi Ec-LDP-Hr-AE aiheutti apoptoosia EGFR /HER2 negatiivinen NIH 3T3-solut, ja suhteet apoptoottisten solujen hoidon jälkeen 0,1, 0,5 ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE oli 16.47% ± 0,44%, 15,28% ± 0,45% ja 19,90% ± 0,12%, vastaavasti. Apoptoottiset NIH 3T3-solut olivat huomattavasti pienempi kuin EC9706 solujen ja KYSE150 solujen altistuminen annostuksilla 0,5 nmol /l ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE (P 0,05, Fig. 4D).

(A) KYSE150 soluja käsiteltiin Ec-LDP-Hr-AE ilmoitetuilla pitoisuuksilla 48 tunnin ajan, ja sitten värjättiin Hoechst 33342. kuvat havaittiin fluoresenssimikroskoopilla on x 200. EC9706 solut (B), KYSE150 solut (C) tai NIH 3T3-soluja (D) altistettiin osoitettujen konsentraatioiden Ec-LDP-Hr-AE: ssa 48 tuntia. Solut otettiin talteen ja värjättiin FITC-anneksiini V: n ja PI. Alempi vasen neljännesten (FITC

– /PI

-) osoitti elävät solut, ja oikeassa alakulmassa neljännesten (FITC

+ /PI

-) osoitti alussa apoptoottisia soluja. Oikeassa yläkulmassa neljännesten (FITC

+ /PI

+) osoitti myöhään apoptoottisia soluja, ja vasemmassa yläkulmassa neljännesten (FITC

– /PI

+) osoitti kuolleet solut.

Effects of bispesifisten fuusioproteiinin Ec-LDP-Hr-AE on EGFR /HER2 signalointipolkujen aktivointi

luonnehtia molekyylitason mekanismeja sytotoksisuus ja apoptoosin induktio Ec-LDP-HR AE, tutkimme sen vaikutuksia ilmaus apoptoosin liittyvien molekyylien ja useita keskeisiä molekyylejä EGFR /HER2 signalointireittejä. Kuten on esitetty kuviossa. 5, Ec-LDP-Hr-AE edistää kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 toimintaa sekä PARP lohkaisu, mikä osoittaa, että Ec-LDP-Hr-AE: n indusoiman apoptoosin voi liittyä mitokondrioiden polkuja. Lisäksi hoito Ec-LDP-Hr-AE lyijyä merkittävästi vähentynyt fosforylaatioon EGFR ja HER2, kun taas ilmaus inaktivoitua EGFR ja HER2 ei muutettu. Fosforylaatio alavirtaan signalointimolekyylien EGFR /HER2-reitin, kuten AKT, ERK, p38MAPK ja JNK edelleen esti käsittelemällä Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 5). Densitometria tiedot osoittivat, että fosforyloitu HER2 ja p38MAPK väheni merkittävästi kaikkien osoitettujen konsentraatioiden Ec-LDP-Hr-AE hoitoon (tietoja ei ole esitetty, P 0,05). Fosforyloituu EGFR, AKT ja JNK väheni huomattavasti 0,5 nmol /l ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE hoitoa (P 0,05) ja fosforyloitu ERK väheni huomattavasti 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE hoitoon (tietoja ei ole esitetty, P 0,05). Tasot koko AKT, ERK, p38MAPK ja JNK ei vaikuttanut hoitoon Ec-LDP-Hr-AE, ja tiheysmittaus tiedot tukevat tätä päätelmää (tietoja ei esitetty).

ilmentyminen apoptoosin liittyvän molekyylejä (esim Caspase 3, kaspaasi 7 ja PARP) ja avain molekyylien EGFR /HER2 signalointireittejä (esim fosforyloitua-EGFR, -HER2, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -AKT) määritettiin Western blot -analyysillä. β-aktiini toimi latauskontrollina.

In vivo

tehoa jännitteiset fuusioproteiinien

In vivo

antituumorivaikutukset jännitteiset fuusioproteiineja arvioitiin KYSE150 ksenografteissa nude-hiirimallissa. Kuten on esitetty kuviossa 6A, LDM tukahdutti kasvua KYSE150 ksenograftien 61,4% suurimmalla siedetyllä annoksella (0,05 mg /kg), ja bispesifisen fuusioproteiinin Ec-LDP-Hr-AE annoksella 0,3 mg /kg esti kasvu KYSE150 ksenograftien 88%, joka osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) verrattuna LDM-hoidetussa ryhmässä 0,05 mg /kg. Eläintä ei kuolemia havaittiin käsitellyissä ryhmissä, ja käyrät kehon painosta osoitti, että eläimet siedetty hyvin annoksesta Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 6B).

Nude-hiiriä (n = 7), joilla on ihmisen ruokatorven syöpä KYSE150 ksenografteja hoidettiin LDM tai Ec-LDP-Hr-AE 11. päivänä ja 21. päivänä tuumorin istuttamisen jälkeen häntälaskimoinjektiona. Keskimääräinen kasvaimen tilavuutta (A) ja keskimääräinen ruumiinpaino hiirten (B) kussakin ryhmässä on esitetty. Ec-LDP-Hr-AE annoksella 0,3 mg /kg esti kasvun KYSE150 ksenograftien 88%, mikä osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna LDM käsitellystä ryhmästä suurin siedetty annos (0,05 mg /kg) (P 0,05 ).

keskustelu

Kirurgia, sädehoito ja kemoterapia ovat edelleen hoidon kulmakivi ruokatorven syöpään, mutta viime aikoina, kohdennettujen hoitomuotojen tutkitaan, jonka tavoitteena on parantaa vasteen korko ja selviytymisen potilailla, joilla on ruokatorven syöpä [6], [16], [17]. Kuten tiedetään, yli-ilmentyminen EGFR ja HER2 on havaittu yli 30% ruokatorven karsinoomien, ja niiden yli-ilmentyminen korreloi alentunut selviytymisen, lisääntynyt riski toistumisen, etäinen etäpesäke, ja kestävyys sädehoidon [18]. Siksi vaikutukset joidenkin monospesifisten vasta-aineiden ja tyrosiinikinaasiestäjiksi jotka estävät EGFR tai HER2-toiminto, kuten setuksimabi, trastutsumabi, gefitinibi, ja erlotinibin ruokatorven syöpä on tutkittu, mutta tehoa on rajoitettu toistaiseksi [19] – [22] . Eroaa monoklonaalisia vasta-aineita ja tyrosiinikinaasin estäjät, immunotoksiineja pidetään erittäin tehokas syövän hoidon etuna spesifisyyden vasta-aineita tai ligandeja ja sytotoksisuutta toksiinien [23]. Kuitenkin kliinisen tutkimuksen tiedot immunotoksiineja ovat osoittaneet ristiriitaisia ​​tuloksia. Useat immunotoksiineja olivat erittäin tehokas vastaan ​​pahanlaatuiset hematologiset sairaudet. Esimerkiksi vaiheen III tutkimuksessa potilailla, joilla ihon T-solulymfooman (CTCL), 30% 71 hoidetuista potilaista denileukiini diftitoksi (DAB

389IL2, ONTAK) oli objektiivinen vaste, mukaan lukien 10% valmiina remissions. Ja vaiheen I tutkimuksessa 31 potilaalla karvasoluleukemiaa, BL22 indusoi 19 täydellinen vaste (61%) ja 5 osittainen vaste (19%) [24], [25]. Mutta kiinteisiin kasvaimiin, immunotoksiineja osoitti rajoitettu tuumorin vastaista tehokkuutta. Syyt epäonnistunut kiinteiden kasvaimien hoitoon sisältyvät huono tunkeutuminen kasvaimia ja vakava immuunivasteen [26] – [28]. Vallera ja työtoverit ovat kehittäneet uusia bispesifisiä molekyylejä fuusioimalla kaksi erillistä kohdistaminen ligandeja yhteen toksiini, jonka tavoitteena on parantaa spesifisyyttä, ja tulokset osoittivat, että bispesifiset molekyylit osoittivat joko parannettu antituumorivaikutus tai laajempi reaktiivisuus kuin Yksilajisten molekyylit [15 ], [29], [30] – [34]. Fuusioproteiini Ec-LDP-Hr-AE rakensimme aiemmin on bispesifinen molekyyli, joka on kohdistettu sekä EGFR ja HER2. Ec-LDP-Hr-AE käytetään kahta oligopeptidit reseptorisitoutumiselle ja myöhemmin solunsisäistä antanut siitä enediyne antibiootti lidamycin solujen tappamista. Tässä tutkimuksessa antituumorivaikutuksen Ec-LDP-Hr-AE on ruokatorven syöpä tutkittiin, koska co-overexpresssion EGFR ja HER2 havaittiin useimmissa ruokatorven squamous karsinoomia.

Sitovat vastaaviin reseptoreihin on edellytys Ec-LDP-Hr-AE käyttämään sen kasvainsolun-selektiivisiä sytotoksisia vaikutuksia. Siksi sitomiskapasiteetti Ec-LDP-Hr proteiinin ESCC solut arvioitiin käyttäen virtaussytometrialla-pohjainen immunofluoresenssimäärityksellä. Tulokset osoittivat, että Ec-LDP-Hr proteiini pystyi sitoutumaan ESCC soluihin suurella affiniteetilla. Kuitenkin Ec-LDP-Hr pystynyt osoittamaan sitoutumisen aktiivisuus EGFR ja HER2 negatiivinen NIH 3T3-soluissa. Vuonna solunelinkykyisyysmääritys, bispesifiset ja enediyne virrattomissa fuusioproteiini Ec-LDP-Hr-AE osoitti äärimmäisen voimakkaita tappaminen vaikutuksia ruokatorven syöpä solujen IC

50 arvot hyvin alhaisella tasolla (alle 10

-10 mol /L). Sillä KYSE150 solut, jotka ilmentävät sekä EGFR ja HER2, Ec-LDP-Hr-AE oli kaikkein sytotoksinen ruokatorven syöpäsolujen verrattaessa LDM ja kaksi Yksilajisten fuusioproteiinit (Ec-LDP-AE ja LDP-Hr-AE). Tehostettu aktiivisuus bispesifisten fuusioproteiini voidaan selittää, että Ec-LDP-Hr-AE sitoutui sekä EGFR ja HER2, ja teki sen vähemmän todennäköisesti erottuvat solusta pinnasta, mikä lisää mahdollisuuksia sisäistämisen sen sytotoksiseen osaan ja kohdistamaan solu tappaminen vaikutuksia. Kuitenkin bispesifiset Ec-LDP-Hr-AE-proteiini ei ollut aina voimakkaampi kuin Yksilajisten kollegansa ja LDM kuin tulosten tilastollinen analyysi paljasti, että erot IC

50-arvot LDM, Ec-LDP-Hr-AE , Ec-LDP-AE ja LDP-Hr-AE EY-1, ECa109 ja EC9706 solut eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Lisäksi olemme havainneet, että sytotoksisuus jännitteiset fuusioproteiineja ESCC soluja ei korreloi hyvin EGFR ja HER2-ekspressiotasot. Esimerkiksi IC

50 arvon Ec-LDP-Hr-AE EC9706 solujen alhainen HER2 ilme oli 5,12 x 10

-12 mol /l, kun taas IC

50 vastinetta KYSE150 soluja, joilla on suuri EGFR ja HER2 taso oli 6,10 x 10

-11 mol /l. Samanlainen tuloksia myös havaittu teho monospesifisten fuusioproteiineja ja EGFR /HER2 tasoilla. Tämä ilmiö on havaittu muissa tutkimuksissa noin kohdennettuja lääkkeitä, kuten lapatinibi [35], [36]. Tämän seurauksena lisätutkimuksia keskittyen paljastaen molekyylimekanismeihin herkkyys Ec-LDP-Hr-AE ovat selvästi tarpeen ja tämä saattaa antaa hyödyllisiä tietoja valittaessa potilaita, jotka hyötyvät EGFR /HER2-bispesifinen aineita.

valaista bispesifisen Ec-LDP-Hr-AE näytteillä sytotoksisuus ruokatorven syöpä soluja, PI värjäystä, Hoechst värjäystä, ja anneksiini V-FITC /PI-värjäys tutkimukset suoritettiin tutkimaan solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Tulokset solusyklin analyysi osoitti, että Ec-LDP-Hr-AE aiheutti merkittäviä G2-M pidätys, jossa G2-M-faasin solut saavuttivat huippunsa 0,1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE hoitoa. Tämä tulos oli mahdollisesti johtuu apoptoottisten ja kuolleet solut kasvoivat hoidon jälkeen 0,5 nmol /l ja 1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE. Siksi G2-M-pidätys oli vähäisempi kuin 0,1 nmol /l Ec-LDP-Hr-AE hoitoa. Ec-LDP-Hr-AE indusoi myös apoptoosin EC9706 ja KYSE150 solujen annos-riippuvaisella tavalla, ja indusoiman apoptoosin Ec-LDP-Hr-AE voi liittyä mitokondrioiden polkuja, koska kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 toimintaa sekä PARP lohkaisu kasvoi merkittävästi, kuten on esitetty Western blot-analyysi.