Krooninen sairaus

tiivistelmä

CDA-2 (solujen erilaistumiseen agentti 2), virtsan valmistelu, on voimakas anti proliferatiivisia ja pro-apoptoottinen ominaisuudet syöpäsoluissa. Kuitenkin mekanismit kasvain estovaikutuksen CDA-2 ovat kaikkea muuta kuin selvä, ja erityisesti ei ollut raportin keuhkosyöpään. Tässä osoitamme, että CDA-2 ja sen pääkomponentti fenyyliasetyyliglutamiini (PG) vähentää metastaattista keuhkojen kasvaimen kasvua, ja lisää elinaikaa istuttamisen jälkeen Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) solujen annoksesta riippuvalla tavalla C57BL6 hiirillä. Proliferatiivinen analysointi- syöpäsoluissa paljasti perustavanlaatuinen vaikutus CDA-2 ja PG: n proliferaatiota ja apoptoosia, mukaan lukien Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, surviviinia, PCNA, Ki-67-proteiinit ja TUNEL-määrityksissä. CDA-2 ja PG vähensi merkittävästi NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuuden keuhkosyövän soluissa ja keuhkorakkuloiden makrofagien kasvaimen kantavien hiirten ja erityisesti vähensi inflammatoristen tekijöiden, mukaan lukien TNFa, IL-6, ja KC. Lisäksi CDA-2 ja PG vähentää ilmaisuja TLR2, TLR6, ja CD14, mutta ei TLR1, TLR3, TLR4, ja TLR9 luun-luuytimestä johdettujen makrofagien (BMDM) hiirten stimuloidaan LLC-väliaine (LLC-CM ). Yli-ilmentävien TLR2 BMDM esti CDA-2 ja PG inhiboivat NF-KB: n aktivaation, sekä induktion TNFa ja IL-6. TLR2: TLR6 komplekseja välittävät vaikutusta NF-KB: n inaktivoituminen CDA-2. Lopuksi, CDA-2 estää voimakkaasti keuhkojen kasvainten kehittymistä pelkistämällä tulehdus keuhkojen kautta tukahduttaminen NF-KB: n aktivaation valkosoluissa, liittämällä modulaatio TLR2 signaloinnin.

Citation: Wang X, Jiang CM, wan HY, Wu JL, Quan WQ, Bals R, et ai. (2012) CDA-2, virtsan valmistelu, Estää keuhkosyövän Development kautta tukahduttaminen NF-kappaB Aktivointi myeloidisolun. PLoS ONE 7 (12): e52117. doi: 10,1371 /journal.pone.0052117

Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 09 marraskuu 2012; Julkaistu: 17 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusohjelma komitean Science and Technology of Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmassa, aiheuttaen yli miljoona kuolemantapausta maailmanlaajuisesti [1]. Edistysaskelista huolimatta varhainen havaitseminen ja tavallinen hoito, keuhkosyöpä diagnosoidaan usein edennyt pitkälle ja on huono ennuste. Siksi ehkäisy ja hoito keuhkosyövän ovat keskeisiä intensiivisen nykyinen tutkimus [2].

CDA-2 (solujen erilaistumiseen aine 2) on virtsan valmiste, joka on eristetty terveen ihmisen virtsasta Kiinassa. Se on uusi monitoiminen lääke, joka on käyttökelpoinen sekä ehkäisyyn ja hoitoon useita kasvaimia, mukaan lukien leukemia, rintasyöpä, maksasyöpä, ja feokromosytooma, prekliinisen tutkimuksissa [3] – [5]. Kuitenkin mekanismit kasvain estovaikutuksen CDA-2 ovat kaikkea muuta kuin selvä, ja erityisesti ei ollut raportin keuhkosyöpään. CDA-2 sisältää useita aktiivisia komponentteja, mukaan lukien fenyyliasetyyliglutamiini (PG) (41%), bentsoyyli glycocoll (35%), peptidien (MW 400-2800) (17%), 4-OH-fenyylietikkahappoa (6%), ja 5 -OH-indolietikkahappo (1%), joka eri mekanismien syöpälääkkeiden [5]. Vaikka kasvaimen inhibitio voi johtua näistä komponenteista, PG on todennäköisesti merkittävä kasvaimen estävä komponentti [3]. Faasi I /II /III kliinisissä tutkimuksissa CDA-2 on valmistunut Kiinassa vuonna 2003. elokuussa 2004 valtion Drug Administration (SDA) Kiinan hyväksytty käyttöön CDA-2 syöpälääkkeenä kiinteissä kasvaimissa. Vaikka CDA-2 oli ehdotettu vaikuttavan kasvaininhibitioaktiivisuuden kautta säätely ylöspäin peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin-γ (PPAR-γ) ja tukahduttaminen PI3 /Akt-signalointireitin kasvainsoluissa, kasvain estävästä vaikutuksesta CDA-2 oli tähän mennessä pääasiassa osoitettu syöpäsoluissa ja sen toimintaa kasvain mikroympäristöihin, erityisesti immuunijärjestelmän /tulehdussolujen kasvaimen strooman, ei ole arvioitava kriittisesti [6], [7].

NF-KB on keskeinen koordinaattori tulehdus- ja immuunivasteen ja on äskettäin todettu keskeinen rooli syövän synnyssä useita syöpiä, kuten keuhko- tai paksusuolen syöpä [8], [9]. On huomionarvoista, että proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien on yhdistetty syöpää prosesseja ihmisissä ja hiirissä, ja säätelee NF-KB-reitin kautta. Esimerkiksi NF-KB-driven sytokiinituotannon myeloidisoluissa (esim kypsät makrofagit, dendriittisolut, ja neutrofiilit), kuten TNF-α: n ja IL-6 tarvitaan keuhkojen kasvaimen kasvu [9]. Hiirimallissa koliitin liittyvän syövän (CAC), IKKβ poistettiin myeloidisoluissa (mikä alentaa NF-KB: n aktiivisuutta), kasvaimen koko oli huomattavasti pienempi verrattuna kontrolleihin ja ilmentymisen pro-inflammatoristen sytokiinien, kuten TNFa: n, IL -6, ja IL-1, oli myös merkittävästi alentunut [10]. Siten valkosoluissa, NF-KB: n aktivaatio edistää kasvaimen kasvua. Tämä vaikutus johtuu pääasiassa tehostetun kasvainsoluproliferaation kautta TNFa: n tuotannon, IL-6, ja muita sytokiineja, jotka säätelevät NF-KB-reitin ydinsoluissa [10], [11].

Täällä , raportoimme viime työtä koskevat tuumorisuppressiogeeneksi ja molekyylitason mekanismeja CDA-2 ja sen tärkein osatekijä, PG, keuhkosyöpään. Käytimme kokeellinen hiiren keuhkosyöpää malleja, joissa CDA-2 ja PG vähentää keuhkojen kasvaimen kasvua, ja osoittivat, että NF-KB inaktivoitumista ydinsoluissa vastaa CDA-2 aiheuttama kasvaimen regressio. Olemme havainneet, että inhibitio TLR-2-signalointi on keskeinen mekanismi CDA-2-indusoidun NF-KB: n inaktivoitumista. Tuloksemme viittaavat siihen, että uusi teoria syövän hoitoon, jonka CDA-2, joka perustuu NF-KB: n ydinsoluissa kasvaimen mikroympäristöihin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

hiiren Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) solut saatiin American Type Culture Collection, ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagles (DMEM, Hyclone laboratorioissa. Inc, South, Utah, USA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä (Hyclone laboratorioissa. Inc, South, Utah, USA). Soluviljelmät suoritettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa 5% CO

2.

Eläimet

Nainen C57BL /6 hiiret saatiin National jyrsijä Laboratory Animal Resource (Shanghai Branch , PRC) ja ylläpidettiin patogeenivapaassa Central Animal Facility Tongji yliopistossa. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Tongji yliopiston eettisen komitean on käytön ja hoidon Animals.

Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Generation keuhkosyöpään hiirissä ja hoito CDA-2 ja PG

keuhkosyövän etäpesäke malli C57BL /6-hiirten synnytettiin suonensisäisen injektion LLC soluja. Lyhyesti, subkonfluenteista LLC-solut tai A549-solut kerättiin ja johdettiin 40 pm solusiivilän (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), pestiin kolme kertaa PBS: llä, suspendoitiin uudelleen seerumitonta DMEM: ää ja injektoitiin pitoisuudessa 2 x 10

5 LLC solut oli häntälaskimoon. After14 päivää, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti (ip) 500 mg /kg, 1000 mg /kg, ja 2000 mg /kg CDA-2 (ystävällisesti toimittanut koskaan Life Pharmaceutical Co Ltd Hefei, Anhui, Kiina) tai 200 mg /kg, 400 mg /kg, ja 800 mg /kg PG (Sigma Aldrich, Steinheim, Saksa) PBS: ssä tai pelkkää PBS: ää kerran päivässä 10 päivän ajan.

Evaluation of Lung kasvaimia

nimetty ajankohtina hiiret tapettiin, ja niiden keuhkot poistettiin, punnittiin, ja histologisesti tutkittiin. Jotkut hiiret pidettiin kuolemaan saakka ja selviytymisen tiedot saatiin. Keuhkosyövän kyhmyt olivat microdissected käyttäen 18 G: n neulalla mikroskoopilla proteiinin analyysiin. Kasvainten lukumäärää ja maksimaalinen koot olivat määritettäessä kuvatulla [9]. Lyhyesti, koko kasvain keuhkoissa oli käsin täytetään ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja upotettu. Parafinoidut keuhkot sarjaan leikattiin 350 um ja histologisesti tutkittiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Hiiren anti-PCNA, kanin anti-cIAP1, kanin anti-Surviviinispesifisiä (kaikki kolme Abcam, Cambridge, UK); hiiren anti-β-aktiini (Sigma Aldrich, Steinheim, Saksa). HRP-konjugoitua vuohen anti-kani (Santa Cruz Biotechnology) tai kaniinin anti-hiiri käytettiin sekundaarisena vasta-aineena (Dako, Glostrup, Tanska).

bronkoalveolaarinen huuhtelu (BALF) leukosyyttimäärät ja alveolimakrofagit Isolation

BALF määritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [14]. Prosenttiosuudet valkosolujen osapopulaatioiden määritettiin laskemalla 100 leukosyyttien satunnaisesti valitun osan Sytospin dia. Kokonaismäärä leukosyyttien BALF määritettiin hemosytometrillä (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Keuhkorakkuloiden makrofagien eristettiin EMSA kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, BALF oli siemen DMEM ja ylläpidetään Soluviljelymaljassa. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa 5% CO 2: ssa 1 tunti. Astia pestiin sitten 3 kertaa PBS: llä, ja tarttuneet solut, pääasiassa makrofagit, kerättiin tumaproteiiniuutetta.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

Nuclear proteiinit eristettiin keuhkojen kasvaimet ja keuhkorakkuloiden makrofagien käyttäen Nuclear Extract Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) ja NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus mitattiin EMSA, kuten on kuvattu [13]. Lyhyesti, tumaproteiinit inkuboitiin [

32P] -leimalla kaksijuosteinen NF-KB konsensuskoetin (Promega) huoneenlämpötilassa 30 min. DNA-proteiini-kompleksit erotettiin 4% polyakryyliamidigeeleillä tasapainotettu 0,5 × TBE alle 300V. Geelit kuivattiin ja altistettiin Hyperfilm ECL (Amersham Bioscience) -80 ° C: ssa ja kehitettiin käyttäen Kodak elokuva (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).

Sytokiinit ELISA-määritys

BALF näytteitä valmistettiin kuten edellä on kuvattu. TNFa, IL-6, ja KC mitattiin kaupallisesti saatavilla sandwich-tyyppinen ELISA: lla (R hiiren IL1B, 5′-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3 ’ja 5′-GATCCACACTC TCCAGCTGCA-3′; hiiren IL6, 5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3 ’ja 5′-TCC ACGATTTCCCAGAGAAC-3′, hiiri TNFa, 5’-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3 ’ja 5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′; hiiren Kc, 5’-CTTGGGGACACCTTT TAGCA-3 ’ja 5′-GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3′; hiiren MIP1, 5’-TGGAG CTGACACCCCGAC-3 ’ja 5′-ACGATGAATTGGCGTGGAA-3′; hiiren Mcp1, 5’-GCAGGTCCCTGTCATGCTTC-3 ’ja 5′-TCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3’; hiiren TLR2, 5’TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTG -3 ’ja 5′-CGCTCCGTACGAA GTTCTCAG -3’; TLR6, 5’CAACTTAACGATAACTGAGAG -3 ’ja 5′-CCAGAG AGGACATATTCTTAG -3′; CD14, 5’- ACA TCT TGAACC TCC GCA AC -3 ’ja 5’AGGGTTCCTATCCAGCCTGT -3 ”. Erityisyys RT-PCR hallinnassa ”” ei käänteistranskriptio ” valvontaa ja sulamiskäyräanalyysi. Kvantitatiivinen PCR tulokset saatiin käyttämällä ΔΔCT (syklin kynnys) menetelmällä. Data normalisoitiin p-aktiini-tasot kussakin näytteessä.

Tilastollinen analyysi

Arvot näkyvät keskiarvona plus tai miinus SEM. Vertailut ryhmien välillä analysoitiin t-testi (kaksipuolinen) tai ANOVA kokeisiin, joissa on enemmän kuin kaksi alaryhmää tai Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittävä P-arvot alle 0,05.

Tulokset

CDA-2 Vähennykset Lung kasvaimen kasvua hiirissä Kasvain mallit

vaikutuksen tutkimiseksi CDA-2 ja sen pääkomponentti PG kasvuun keuhkojen kasvain, kasvaimet tuotettiin ruiskuttamalla laskimonsisäisesti 2 x 10

5 LLC solujen C57BL6 hiirillä. After14 päivää, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti (ip) 500 mg /kg, 1000 mg /kg, ja 2000 mg /kg CDA-2 tai 200 mg /kg, 400 mg /kg, ja 800 mg /kg PG PBS: ssä tai PBS: ää alone kerran päivässä 10 päivän ajan. Hiiret tapettiin, ja niiden kasvainten lukumäärää ja maksimaalinen kasvaimen kokoa keuhkotuumoreiden arvioitiin. Toisin ohjaus, anto CDA-2 hiirille vähentää merkittävästi keuhko- kasvainten lukumäärää ja maksimaalinen kasvaimen kokoa (Fig. 1A, B). H 0,05. (C) Eloonjäämiskäyrät hiirten (p 0,001; Log-rank testi tilastollinen analyysi; n = 10).

(A) Lung ulkonäkö (ylöspäin) ja histologia (H down) LLC ympätty C57 /BL6-hiirten 10 päivän kuluttua PG hoidon osoitetun annoksilla. 2 x 10

5 LLC-soluja injektoitiin suonensisäisesti sukupuoleen sovitettu C57 /BL6-hiirten häntälaskimoon, 14 päivää myöhemmin hiiret käsiteltiin PBS: llä tai PG on 10 päivää, päivänä 25, keuhkot poistettiin. (B) Keuhkojen kasvainten lukumäärää ja maksimaalinen kasvainten koot määritettiin kuten kuviossa 1B. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM, n = 5, merkittävä ero, * p 0,05.

CDA-2 Alennettu leviämisen ja aiheutti apoptoosia Lung Cancer Cells

Seuraavaksi tutkia CDA-2-indusoidun muutoksen keuhkojen tuumorimassa johtui muuttuneesta soluproliferaation tai apoptoosin, tutkimme soluproliferaation immuno-histokemiallista analyysiä Ki-67 ja solujen apoptoosin in situ terminaalin-transferaasin dUTP-välitteisen nick end merkintöjä (TUNEL) määritys. 2 x 10

5 LLC-soluja injektoidaan hiiriin ja 14 päivää myöhään 2000 mg /kg CDA-2, 800 mg /kg PG tai PBS: ää annettiin kuten edellä 5 päivää. Yhdenmukainen muutoksiin keuhkon kasvaintaakka, Ki-67-positiivisia soluja olivat alhaisempia CDA-2 tai PG-käsitellyt tuumorit verrattuna kasvaimia PBS-käsiteltyjen eläinten (Fig. 3A). Toisaalta, apoptoosi huomattavasti voimistunut jälkeen CDA-2 tai PG käsittelyyn, ja että hyvin vähän apoptoosia havaittiin sen jälkeen, kun PBS hoidon (Fig. 3B).

(A) Kasvaimen kantavia hiiriä käsiteltiin 2000 mg /kg CDA- 2 tai 800 mg /kg PG varten 5 päivää, ja keuhkot poistettiin, kiinteä ja parafiiniin. Parafinoidut kasvain keuhkoissa leikkeet tutkittiin immunovärjäämällä anti-Ki-67-vasta-ainetta jakautuvat solut. Bar = 100 pm. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n = 5, merkittävä ero, * p 0,05. (B) Apoptoottiset solut tunnistettiin TUNEL värjäys. Bar = 200 pm. (C) leikataan keuhkokasvaimet analysoitiin ekspressiota osoitettu proliferatiivisia ja apoptoottisten proteiinien immunoblot-analyysillä. Ekspression β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina proteiinin määrä.

tutkittiin joitakin proteiineja ja geenit, joiden tiedetään osallistuvan solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Kasvaimet huolellisesti microdissected käyttämällä neuloja keuhkoista, hajotettiin, ja tutkittiin immunoblottauksella. Toisin kuin PBS hoitoryhmässä, ilmentymisen antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, ja surviviinin oli voimakkaasti alentunut vastauksena CDA-2 hoitoa (Fig. 3C). CDA-2 hoito vähensi myös ilmaus lisääntyvien solujen tuma-antigeenin (PCNA), toinen S-vaiheessa markkeri solusyklin (Fig. 3C). Immunoblot-analyysi kasvaimen lysaatit hiirillä paljasti myös downregulation Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, ja surviviinin sekä PCNA keuhkojen kasvainten jälkeen PG hoidon (Fig. 3C). Nämä tulokset korreloivat ne noudattavat analyysi Ki-67 ja TUNEL.

CDA-2 Estää NF-KB aktivoituminen ja keuhkotulehdus Lung Hiirien

On osoitettu, että NF -κB aktivointi on keskeinen rooli säätelyssä tulehdus- ja immuunivasteen, apoptoosin, ja onkogeneesissä joka liittyy tulehdukseen edistää kasvaimen kasvua [19], [20]. Valaista mekanismeja kasvainta estävä vaikutus CDA-2, ensin verrataan NF-KB-aktivaation leikataan syövän hiiristä CDA-2, PG tai PBS hoitoon. Huomattavaa on, että resektoitiin kudos sisälsi kasvainkudoksen lukien kasvain ja tulehdussolujen. Nuclear uutteet valmistettiin ja NF-KB: n aktivaatio tutkittiin EMSA. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, CDA-2 käsittely laski merkittävästi NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta verrattuna kontrolliin jälkeen 5 päivää 2000 mg /kg CDA-2 hoitoa. Tärkeää on, NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta myös voimakkaasti esti vastauksena CDA-2 hoitoa keuhkorakkuloiden makrofageissa bronkoalveolaarinen huuhtelu nesteen (BALF) (Fig. 4B). Seuraava hoito 800 mg /kg PG varten 5 päivää tuumoria kantavissa hiirissä esti tehokkaasti NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta sekä kasvainsoluissa ja keuhkorakkuloiden makrofagien (Fig. 4C). Tämä tulos viittaa siihen, että PG on samanlainen vaikutus estämällä NF-KB: n aktivaation.

EMSA tumauutteiden eristetty kasvainsoluista ja keuhkorakkuloiden makrofagien esittää ydin- sitovan NF-KB: n kuluttua 5 päivä 2000 mg /kg CDA-2 (A ja B) tai 800 mg /kg PG (C) hoitoon. Solujen kokonaismäärä ja leukosyyttipopulaation BALF kerättiin C57BL6-hiirten 3 tai 5 päivää 2000 mg /kg CDA-2 (D) ja 800 mg /kg PG (E) tai PBS: ää hoitoon. Cellular koostumus määritettiin käyttäen Sytospin valmisteita. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n = 5, merkittävä ero, * p 0,05.

Seuraavaksi kysyimme, onko CDA-2 aiheuttama inaktivaatio NF-KB ydinsoluissa muuttaa tulehduksellinen tilanne keuhkoissa. Olemme tunnettu tulehdussolujen ja välittäjien hiirten keuhkoissa altistettiin hiiret syöpään malliin. Solujen kokonaismäärä ja absoluuttinen määrä makrofagien, neutrofiilien ja lymfosyyttien BALF merkittävästi vähentynyt 3 ja 5 päivää sen jälkeen, kun 2000 mg /kg CDA-2 hoitoa (Fig. 4D) tai 5 päivää sen jälkeen, kun 800 mg /kg PG hoitoon (Fig. 4E ). CDA-2 tai PG hoito vähentää tehokkaasti ilmentymisen eri inflammatoristen sytokiinien ja kemokiini-mRNA: iden, kuten Il1b, IL6, Kc, TNFa, Mip1α, ja Mcp1 keuhkoissa (Fig. 5A, B). CDA-2 tai PG hoito vähensi myös eritystä TNF-α, IL-6, ja KC keuhkojen solut (Fig. 5C, D). Opinnäytetyöt tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen tulehdusreaktion estämällä NF-KB: n aktivaation, todennäköisesti merkittävä kasvaimen estävä mekanismi CDA-2 ja PG.

induktio inflammatoristen sytokiinien ja kemokiinin mRNA homogenaateissa 3 tai 5 päivää 2000 mg /kg CDA-2 (A) tai 800 mg /kg PG (B) käsiteltiin keuhkoihin mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n = 5, merkittävä ero, * p 0,05. Pitoisuus tulehduksellisten sytokiinien BALF 3 tai 5 päivää 2000 mg /kg CDA-2 (C) tai 800 mg /kg PG (D) käsiteltyjen hiirten arvioitiin ELISA: lla. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n = 5, merkittävä ero, * p 0,05.

CDA-2 Estää TLR2 Signaling in Bone-luuytimestä johdettujen makrofagien

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet että Toll-Like reseptorit (TLR: t) -välitteisen signalointi suosivat NF-KB: n, joka johtaa pro-inflammatorinen vaste [21]. Puuttumaan onko CDA-2 esti NF-KB kautta TLR signalointireitistä selvitimme ilmaus TLR perheenjäsenten luuytimestä johdettujen makrofagien (BMDM), jotka stimuloitiin seerumia vailla oleva väliaine LLC soluista (LLC-CM) . LLC-CM merkittävästi indusoima TLR2 ja sen koreseptoria TLR6 ja CD14 (Fig. 6A, B), mutta ei TLR1, TLR3, TLR4, ja TLR9 in BMDM (tuloksia ei ole esitetty). Tärkeää on, lisäämällä CDA-2 tai PG merkittävästi tukahdutti TLR2: n ekspressio, TLR6 ja CD14 pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 6A, B). Inkubointi BMDM CDA-2 tai PG yksinään ei ollut vaikutusta TLR2, TLR6, ja CD14 ilme (Fig. 6A, B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TLR2 signiling voi toimia välittäjänä, ja edistää NF-KB: n inaktivoitumisen CDA-2 ja PG.

BMDMs käsiteltiin 24 h seerumittomassa DMEM (SFM) tai LLC-CM tai yhdistelmän CDA-2 (A) tai PG (B). Yhteensä RNA: t eristettiin BMDMs, ja geenin ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset ovat keskiarvo kertainen muutos ± SEM, n = 3, merkittävä ero, * p 0,05.

inhibitio CDA-2 NF-KB: n aktivaatio kumottiin yli-ilmentyminen TLR2

edelleen arvioimista TLR2 signalointi-välitteinen NF-KB: n aktivaatio säätelee CDA-2, suoritimme NFKB-driven lusiferaasireportterigeenillä määrityksessä. Adenovirusyhdistelmävektoreita kertyi koodaavat TLR2 ilmaistu BMDM. TLR2 tai kontrollivektorille tartunnan BMDM tartutettiin NF-KB lusiferaasireportteriplasmidin adenovirus. Molemmat tartunnan BMDMs hoidon LLC-CM johti merkittäviä lisäyksiä sitoutumisen NF-KB: sen DNA konsensussekvenssin, joka näkyy lisääntyminen lusiferaasin aktivoitumisen (Fig. 7A). TLR2 tartunnan BMDM osoitti merkittäviä lähtötasoon aktivointien tämän transkriptiotekijän ja korkeampia arvoja LLC-CM kontrolliin verrattuna arvoihin (Fig. 7A). Hoito CDA-2 tai PG aiheutti merkittävää laskua LLC-CM aiheuttama NF-KB transaktivaatiota ohjaus tartunnan BMDM, kun taas ei muutosta reportteri aktiivisuutta CDA-2 tai PG TLR2 infektoituneita soluja (Fig. 7A). Yhdenmukainen NF-KB-transaktivaation tulokset, nämä konstruktit tuotetaan myös samankaltaisia ​​vaikutuksia ilmaisuja TNFαand IL-6 (Fig. 7B). Näin ollen, TLR2 ilmentymisen inhibitio CDA-2 ja sen komponentti PG tarvitaan inaktivoimiseksi NF-KB: n valkosoluissa.

(A) BMDMs oli infektoitu samanaikaisesti TLR2: n ja NF-KB: n lusiferaasireportterigeenillä adenoviruksen konstrukteja . 24 tuntia infektion jälkeen, solut käsiteltiin SFM tai LLC-CM ja /tai CDA-2 tai PG kuten on osoitettu. Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Data näytetään keskimääräisenä ± SEM kertaiseksi kontrolliin verrattuna. n = 3, merkittävä ero, * p 0,05; ns, ei ole merkittävä. (B) induktio inflammatoristen sytokiinien mRNA tartunnan BMDMs edellä kuvatulla. Tulokset ovat keskiarvo kertainen muutos ± SEM, n = 3, merkittävä ero, * p 0,05; ns, ei ole merkittävä.

Keskustelu

Tärkein havainto Tämän tutkimuksen on, että CDA-2, virtsan valmistelu, estää keuhkojen kasvaimen kasvua kautta myeloidisolun väli. CDA-2 vähentää tulehdusta keuhkoissa kautta tukahduttaminen NF-KB: n aktivaation ydinsoluissa kanssaan modulaatio TLR2 signalointi. Pääkomponentti CDA-2, PG, on todennäköisesti keskeinen rooli anti-kasvain vaikutus CDA-2.

Tutkimus suoraan testattu tärkeät kasvainta estävä vaikutus CDA-2 käyttäen kokeellista keuhkojen kasvainmuodoista. Aikaisemmat tutkimukset olivat osoittaneet, että CDA-2 on mahdollisesti arvoa syövän vastaisen aineen [3], [7]. CDA-2 on tutkittu ja osoitettu estävän kasvua ihmisen rintasyövän soluja, gliooma soluja, ja ihmisen leukemiasolujen

in vitro

ja

in vivo

[3], [7]. Kliinisesti, CDA-2 osoitti merkittäviä vaikutuksia parantamisessa kemoterapiaa vasteet gliooman, hepatooma, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, ja potilailla, joilla on rintasyöpä [7]. PG on merkittävä bioaktiivinen aineosa CDA-2. Aikaisemmat tutkimukset viittaavat siihen, että PG on mahdollinen kasvain estävä vaikutus, ja se on myös tärkeä osa antineoplastoni AS2-1, seos natriumsuoloja fenyylietikkahappo ja PG, joka on anti-kasvain huumeiden [3], [22] . Esillä data Ensimmäinen vahvistavat, että CDA-2 hoito suoraan johtaa kasvun pysähtymisen keuhkojen kasvain ja pidentää elinikää hiirillä osoittaa voimakas antituumorivaikutus CDA-2 estossa kasvaimen kasvua annoksesta riippuvaisella tavalla. Sekä leviämisen-eston ja apoptoosin-asiakkuutta vaikutuksia havaittiin keuhkotuumoreita, osoituksena immunohistokemiallisesti ja western blotting-analyysi. PG myös osoittaa suora vaikutus keuhkojen kasvaimen kasvua, ja on samanlaisia ​​tuloksia kasvaimen inhibitiota CDA-2. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CDA-2 voi olla potentiaalinen terapeuttinen lääke hoitoa varten keuhkosyövän, ja PG uskotaan myötävaikuttavan suuria bioaktiivisuus CDA-2 johtuen korkeasta prosenttia (41%) ja kirkas tuumorisuppressiogeeneksi vaikutus.

kasvain mikroympäristölle on kriittinen rooli kasvaimen aloittamista ja edistämiseen ja sisältää immuunijärjestelmän soluja ja sidekudoksen, kuten fibroblastit, endoteelisolut, perisyytit, ja mesenkymaalisten solujen [23]. Yleisimmin havaittu immuunijärjestelmän solujen kasvain microenvironment ovat kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM). TAM enimmäkseen edistää kasvaimen kasvua ja voi olla pakollista angiogeneesiä, hyökkäystä, ja etäpesäke mukaan tulehduksellisten sytokiinien ja kemokiinien ja niiden läsnäolo keuhkosyöpä on korreloitu huonon ennusteen keuhkosyöpäpotilaiden [24], [25] ja muiden tulosten kuten lisääntynyt pienten suonten count [26]. Osina pakkosyöttöperiaatteen eteenpäin silmukoita, kemokiinit tuottama TMA houkutella uusia immuunijärjestelmän /tulehdussolujen kuten makrofagien kasvaimen mikroympäristölle [27]. Tuloksemme osoittavat hoito CDA-2 tai PG johtaa laskua koko solujen BALF, jotka enimmäkseen vaikuttaa makrofageja, vähentää tulehdusta. Näin ollen on todennäköistä, että CDA-2 inhiboi keuhko- kasvaimen kasvua suppression väestöstä immuunijärjestelmän /tulehdussolujen ja tulehduksen keuhkoissa.

NF-KB: n on vastuussa induktion eri kohdegeenien jotka ovat tärkeitä kasvaimien synnyn [28], [29]. NF-KB: n aktivaation tulehdussolujen ohjaa tuotantoa pro-inflammatoristen sytokiinien, mukaan lukien TNFa, IL-1, IL-6, ja IL-23, jotka välittävät tuumorin edistämiseen ja etenemiseen, sekä NF-KB: n aktivaatio kasvainsoluissa [ ,,,0],8], [11]. NF-KB: n aktivaation myös löytyy kasvainsoluissa, joissa se säätelee solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, angiogeneesiä, hyökkäystä, ja etäpesäkkeiden [30] – [32]. Edistettäessä vaikutusta NF-KB: n aktivoitumisen keuhkojen syövän synnyn on jo esitetty erilaisia ​​lähestymistapoja ja raportoitu eri ryhmiin, ja ehtyminen myelooisen solu- tai epiteelin NF-KB näytä olevan vaikutusta vähentämisessä keuhkojen kasvaimien syntyyn [9], [ ,,,0],33] – [36].