Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ihmisen papilloomaviruksen (HPV), erityisesti HPV16, liittyy kehittää sekä kohdunkaulan ja Nielurisoista syövän ja intratype varianttien aminohapposekvenssin HPV16 E6 onkoproteiini on osoitettu olevan yhteydessä virus- pysyvyys ja syövän vaurioita. Tästä syystä läsnäolo HPV16 E6 variantit nielurisojen levyepiteelisyöpä (TSCC) kohdunkaulan syövän (CC), sekä kohdunkaulan näytteistä (CS), tutkittiin.

Methods

HPV16 E6 sekvensoitiin 108 TSCC ja 52 CC näytteitä potilaista diagnosoidaan 2000-2008 läänissä Tukholman ja 51 CS nuoret naiset osallistuvat nuorten terveyskeskus Tukholmassa.

tulokset

harvinainen E6 variantti R10G oli suhteellisen usein (19%) vuonna TSCC, puuttuu CC ja harvoin (4%) CS, kun taas tunnettu L83V muunnos oli yleinen TSCC (40%), CC (31%), ja CS (29%). Ero R10G oli merkittävä välillä TSCC ja CC (p = 0,0003), sekä välillä TSCC ja CS (p = 0,009). HPV16 Euroopan phylogenetic linjaa ja sen johdannaiset hallitsee kaikissa näytteissä ( 90%).

Johtopäätös

suhteellisen korkea tiheys R10G muunnos TSCC, verrattuna siihen, mitä on todettu CC sekä esillä olevassa tutkimuksessa sekä useissa muissa tutkimuksissa eri maissa, se voi olla merkki ero TSCC ja CC osalta syöpäkasvainten ja kehitystä. Vaihtoehtoisesti voisi olla eroja suullista ja kohdunkaulan yleisyys tämän variantin, jotka on selvitettävä tarkemmin.

Citation: Du J, Nordfors C, Näsman A, Sobkowiak M, Romanitan M, Dalianis T, et ai. (2012) ihmisen papilloomaviruksen (HPV) 16 E6 vaihtoehdot in Nielu Cancer verrattuna niihin kohdunkaulan syövän Tukholmassa. PLoS ONE 7 (4): e36239. doi: 10,1371 /journal.pone.0036239

Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugali

vastaanotettu: 10 helmikuu 2012; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2012; Julkaistu: 27 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tarjosi Swedish Institute for Infectious Disease Control, Ruotsin Cancer Foundation (100258), Ruotsin Research Council (K2011-56X-15282-07-6), Tukholman Cancer Society (101081), Tukholman kaupunginvaltuusto (2010067) ja Karolinska Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija Torbjörn Ramqvist on PLoS ONE Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaalit ..

Johdanto

infektio korkean riskin (HR) ihmisen papilloomavirusten (HPV) on vuodesta 1980-luvun alussa on tunnustettu aiheuttavan kehittämistä kohdunkaulan syövän ja viime aikoina myös nielun syöpä [1], [2]. Niistä nielun syöpiä pääasiassa Nielurisoista ja pohjan kielen syövistä liittyy HPV. Huomattavaa on, että HPV-positiivisia nielun syöpä on kasvanut viime vuosikymmeninä, sekä Euroopassa ja Yhdysvalloissa [3] – [5]. Ruotsalaisen Syöpärekisteri, Ruotsissa, nykyisin yli 400 uutta tapausta kohdunkaulan syövän ja noin 200 tapausta tonsillaaristen syöpä diagnosoidaan vuosittain.

Kaikki HPV-tyypit tiedetään liittyvän kanssa nielusta syöpään liittyvät myös kohdunkaulan syöpä ja HPV16 hallitsee molemmissa aiheuttaen 50-60% kaikista HPV positiivisia kohdunkaulan syövän ja noin 90% kaikista HPV positiivisia nielurisojen syöpä. Lisäksi, kun taas HPV-genomi on useimmiten integroitu kohdunkaulan syöpä, on usein episomaalinen on nielurisojen syövän [6]. Tämä osoittaa, että vaikka on olemassa monia yhtäläisyyksiä näiden kahden kasvaintyypeille voisi myös olla eroja, sekä suhteessa mahdollisuuksia HPV16 aiheuttaa kasvainten kehittymiseen, ja siihen, miten eri HPV-tyypit aiheuttavat kasvaimia.

Vaihtoehdot HPV16-genomin kohdunkaulan syövän, ennalta vaiheissa kohdunkaulan syövän ja kohdunkaulan näytteissä eri maantieteellisillä alueilla on tutkittu paljon ja HPV on luokiteltu phylogenetic suvusta kuin Euroopan (E), Aasian (As), Aasiassa ja Yhdysvalloissa (AA), Afrikkalainen-1 ja -2 (Af-1 ja Af-2), ja Pohjois American1 (NA1) [7] – [11].

Suurin muuttamassa proteiinit HPV16, E6 ja E7 , kohdistaa p53 ja Rb vastaavasti estävät apoptoosin ja edistää proliferaatiota ja siksi useimmat tutkimukset HPV16 vaihtoehdot ovat keskittyneet E6 ja E7 lisäksi tutkimuksia ei-koodaava ohjaus alue (NCCR). Muuttujat on osoitettu usein eroavat E6 ja NCCR, kun E7-proteiini on usein enemmän konservoituneita [12], [13]. Lisäksi suurten variantti suvusta, variantteja yhden nukleotidin muutokset esiintyvät usein, erityisesti kasvaimia. Yleisin näistä mutaatioista on T G siirtymän nt 350 E6, lyhennettynä E-T350G, aiheuttaa aminohapon muutos leusiinin valanine on aminohapot 83 (L83V). Useat tutkimukset L83V variantti ovat osoittaneet yhdessä virus- pysyvyys ja syövän etenemistä kohdunkaulan syöpä, vaikka myöhemmin tutkimukset ovat epäonnistuneet vahvistaa tätä yhdistys [14] – [17]. Muut vaihtoehdot ovat myös yhdistetty ominaisuuksia tärkeää kasvainten kehittymiseen kuten esim. ne, joilla on kyky estää p53 transaktivaatiota [18].

Vaikka monet tutkimukset HPV16 variantteja ole tehty kohdunkaulan syöpä, hyvin harvat tämän kaltaisia ​​tutkimuksia on tehty pään kaulan syöpä [19], [20 ]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli siis selvittää onko mitään eroja esiintyminen ja taajuus HPV16 E6 varianttien välillä Nielurisoista syövän ja kohdunkaulan syövän. Tästä syystä esiintyvyys HPV16 E6 sekvenssejä verrattiin kohdunkaulan ja nielurisojen syövän näytteitä potilaista diagnosoidaan aikana samassa ajassa läänissä Tukholmassa. Lisäksi vertailla saatuja tietoja näistä kasvaimista kanssa HPV16 varianttien terveillä vapaaehtoisilla, HPV16 E6 analysoitiin myös kohdunkaulan näytteissä terveiden nuorten naisten nuorten klinikalla Tukholmassa.

Tulokset

HPV16 E6 variantit aminohapossa R10G ja L83V

Viisikymmentäviisi HPV16 positiivinen tekstiilisuojalauseke, 52 CC ja 51 CS analysoitiin osalta HPV16 E6 järjestyksessä, taulukko S1. Merkittävin ero TSCC ja CC havaittiin osalta taajuudet E-A131G variantti aiheuttaen muutoksen arginiinista glysiinin aminohapot 10 (R10G). Tämä mutaatio oli läsnä 22% (12/55) ja TSCC, kun taas kokonaan puuttuu CC näytteiden ja läsnä vain 4% (2/51) kohdunkaulan näytteistä. Tämä ero oli merkitsevä sekä välillä TSCC ja CC (p = 0,0003) välillä sekä TSCC ja CS (p = 0,009).

E-T350G variantti oli yleisin yksi kaikkien kolmen ryhmän näytteiden . Tämä variantti, aiheuttaen siirtyminen leusiinin valimiin vuonna aa 83 (L83V), oli erityisen tavallisia TSCC (45%) ja sen jälkeen CC (31%) ja HT (29%), vastaavasti.

validointi R10G ja L83V taajuudet edelleen TSCC näytteissä

edelleen vahvistaa lisääntynyt taajuudet R10G ja L83V mutaatioita TSCC, 53 ylimääräistä TSCC näytteitä, potilaista diagnosoidaan samassa sairaalassa samana aikana, arvioitiin vain R10G ja L83V mutaatioita. Näistä 53 näytettä 17% (9/53) kantoi R10G ja 34% (18/53) L83V mutaatio. Kun kaikki 108 näytteet tiivistää 19% oli R10G ja 40% L83V mutaatio. Suurin osa (12/21) E6 peräisin TSCC kätkeminen R10G sisälsi myös L83V. Mitään merkittävää eroa ei havaittu alun perin valitun 55 TSCC ja laajennetun TCC: t ryhmän osalta nämä kaksi mutaatiota.

Frequency muiden muunnosten

Mutaatiot muissa kohdissa olivat harvinaisempia kaikenlaisille näytteet, ja vain 19/28 näistä vaikutti aminohapposekvenssin. Yleisimpiä olivat Q14H ja H78Y, molemmat läsnä 4% CC ja CS, kun taas 7% of TSCC oli Q14H ja H78Y. Lisäksi kaksi kohdunkaulan syöpä näytteillä oli 27 bp toistojen välillä nt 528 ja 554.

jakautuminen eri fylogeneettiseen suvusta

Kuten esitetään taulukossa S1, HPV16 E6 Euroopan prototyyppi havaittiin 38% of TSCC, 65% CC ja 59% CS. Kuitenkin, kun näytteitä Euroopan tyyppi sisältää vähäisiä nukleotidin eroja (mukaan lukien R10G ja L83V) on mukana, nämä luvut kasvoi 93, 94 ja 96% vastaavasti. Kuten myös esitetty taulukossa S1 muunlaisia, Afrikkalainen-1 ja 2, Itä-Aasian. Aasian Amerikan ja Pohjois-Amerikan olivat vain löytyy muutamia näytteitä.

Korrelaatio HPV16 E6 variantit nielurisojen syövän kliinisiä parametrejä

TSCC-näytteitä verrattiin huomioon potilasta ja kasvainten ominaisuuksiin perustuvat läsnäolo R10G, L83V tai puuttuminen näiden varianttien kuten esitetään taulukossa 1. ei ollut kuitenkaan mitään merkittäviä eroja mihinkään näistä parametrien, vaikka oli taipumusta kasvaimista R10G olla pienempi T vaiheessa.

läsnäolo R10G tai L83V variantit nielurisojen syövän analysoitiin korrelaation 3 vuoden tautivapaan elinajan (DSF) potilaista. Ei kuitenkaan ole merkittävää korrelaatiota ei havaittu, kun DSF verrattiin potilaiden välillä läsnäolon tai poissaolon R10G variantin välillä tai potilailla, joilla on läsnä tai poissa ollessa L83V variantin (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet ja verrattiin taajuus eri HPV16 E6 variantit TSCC, CC ja CS, kaikki saadut Tukholman alueella samana ajanjaksona. Olemme havainneet, että HPV16 R10G oli suhteellisen yleisiä TSCC, puuttuu CC ja harvinaisia ​​CS. HPV 16 Euroopan linjaa dominoi ja L83V muunnos oli hyvin yleinen kaikissa kolmeen luokkaan näytteitä.

Se, että muuten harvinaisen HPV16 E6 variantti R10G havaittiin TSCC, mutta ei CC potilailla diagnosoidaan samalla kaudella samassa sairaalassa on silmiinpistävää. Tämä vaihtoehto on meidän tietääksemme aina ollut harvinaista, joskin havaittiin CC eräissä muissa tutkimuksissa [11], [13], [18]. Vaikka aika HPV-infektio kehittämiseen tonsillar syöpä ei ole tiedossa, on todennäköistä samanlainen kohdunkaulan ja nielurisojen syöpä, koska mediaani potilaan iästä on vertailukelpoinen. Näin ollen on perusteltua olettaa, että tämän tutkimuksen potilaiden kanssa kohdunkaulan ja nielurisojen syöpä oli todennäköisesti tartunnan HPV16 aikana suunnilleen samana ajanjaksona. Syynä tiheä R10G muunnos TSCC Tukholmasta, verrattuna CC sekä Tukholman ja muilla alueilla, ei tunneta. Yksi mahdollisuus on, että tämä HPV16 muunnos jostain syystä oli /on yleisempää suullista verrattuna sukuelinten alueella. Lisätutkimukset HPV16 saadut suun näytteitä tarvitaan tutkimaan tätä mahdollisuutta. Toinen mahdollisuus voisi olla, että tämä variantti HPV16 on suurempi taipumus aiheuttaa TSCC. Erityisesti vaikka suurin osa potilaista, joilla TSCC oli miehiä, ja vain naisilla on CC, ei ollut sukupuoleen liittyviä eroja suhteellisen taajuudet R10G in TSCC. Kerätyt tiedot osoittavat, että lähes kaikki potilaat kantavat R10G variantti oli Ruotsin lähtömaahansa, mutta meillä ei ole tietoa, jos he ovat muuttaneet Tukholmaan muualta Ruotsista.

On hyvin tunnettua, että HPV16 E6 yhdessä E6AP (E6 liittyvä proteiini) muodostaa kompleksin, joka kohdistuu erityisesti p53 ja välittää p53 hajoaminen, joka on välttämätön kasvaimien synnyn [21], [22]. Useita tutkimuksia on tehty sen R10G muunnos kohdunkaulan syöpiä. R10G mutaatio on N-terminaalisessa päässä, mikä on tärkeää p53 sitoutumisen ja hajoaminen, ja se on myös osoitettu johtavan modifioitu B /T-soluepitoopin [13], [23], [24]. On osoitettu, että sekä E6 kanssa R10G ja L83V säilyttävät kyvyn kumota kasvun pysähtymisen ja voimakkaasti vähentää vakaan tilan tasoja p53 [25]. Vaikka E6 kanssa R10G on vähentynyt sitoutuminen E6BP (E6-sitova proteiini) ja alentunut kyky aiheuttaa Bax hajoamisen, E6 kanssa L83V E6 on lisääntynyt sitoutuminen E6BP ja säilyttää kyky aiheuttaa Bax hajoaminen verrattuna prototyyppi HPV16 E6 [18 ]. E6 kanssa sekä R10G ja L83 muuttaminen, mikä 9/12 TSCC oli tässä tutkimuksessa, käyttäytyi samanlainen prototyyppi [18]. Lisäksi R10G sivusto on myös raportoitu olevan olennainen tumalokalisaatiosignaalin [26]. Siten useat eri ominaisuudet R10G sivusto voi vaikuttaa syövän etenemiseen, vaikka on epäselvää, missä määrin. Tässä tutkimuksessa ei havaittu merkittävää eroa osalta 3 vuoden tautivapaan elinajan keskuudessa potilailla, joilla on TSCC kuljettavat liittyykö niihin HPV16 E6 R10G variantti. Tämä puhuu sitä vastaan ​​mahdollisuutta, että tämä muunnos aiheuttaisi aggressiivisesti kasvava TSCC.

Muita muunnelmia HPV16 E6, erityisesti L83V, eroavat maantieteellisesti ja voivat vaikuttaa patologisen riski [27]. Tässä tutkimuksessa L83V oli yleisin muunnos kaikille materiaaleille, mikä on linjassa monien muiden havaintojen sekä sukupuolielinten ja pään ja kaulan alueen [16], [19], [20], [28], [ ,,,0],29]. Tässä muita yleisemmin L83V löytyi TSCC verrattuna CC ja CS, esiintyvyys taas jälkimmäisessä luokkien olivat suunnilleen yhtä mieltä aikaisempien raporttien [12], [14], [29] – [31]. On olemassa kuitenkin useita tutkimuksia, jotka osoittavat yhdistyksen välillä L83V ja lisääntynyt virus pysyvyys, ja riski kohdunkaulan neoplasian ja syövän etenemistä [28], [32]. Lisäksi tutkimukset HPV16 E6 variantit ja sellulaarisen immuunivasteen esiin erityisiä muutoksia, koska jo isäntä-virus immunologian kannalta voi selittää muunnettua onkogeenisiä [33] – [35]. Huomionarvoista, emme löytäneet mitään merkittävää korrelaatiota läsnäolon tai poissaolon L83V variantin ja 3 vuoden taudista vapaan eloonjäämisen potilaista.

On huomattava, että Euroopan HPV16 variantti on selvästi suunnilleen sama hyvin korkea taajuus CS nuoret naiset, saadaan 2009-2010, kuten CC näytteissä. Lisäyksen kanssa matkustaminen viime vuosikymmenten aikana kasvu HPV16 variantteja muilta maantieteellisiltä alueilta ei olisi ollut odottamatonta, mutta ei havaittu tällaista riskin kasvua.

rajoituksena esillä olevassa tutkimuksessa on määrä analysoiduista näytteistä. Kuitenkin 108 TSCC analysoitu muodostavat noin 65% kaikista potilaista maakunnalta Tukholman HPV16 positiivinen TSCC diagnosoitu tämän ajanjakson aikana ja jossa koepaloja olivat saatavilla [1], [36]. Toinen rajoitus on se, että ainoastaan ​​alueelta E6 analysoitiin. Niinpä, onko mitään eroja NCCR, E7 tai E5 alueiden välillä TSCC ja CC näytteitä, nämä olisi jäänyt.

Tässä tutkimuksessa löydettiin merkittävä ero jakelussa HPV16 varianttien välillä TSCC ja CC näytteitä tuotujen potilaiden samassa sairaalassa aikana tietyn ajan kuluessa. Tarkemmin sanottuna harvinaisia ​​R10G variantti oli huomattavasti yleisempää TSCC kuin CC, ja se oli usein yhdessä L83V muunnos entisen kasvaimia. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään jos R10G variantti voi olla yleisempää suun kautta verrattuna kohdunkaulan näytteistä. Lisäksi oli suhteellinen välistä yhdenmukaisuutta läsnäolo varianttien CC ja CS.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksyttiin eettisen komitean Karolinska institutet, Stockholm, Sweden, mukaan eettisissä 2005 /431-31 /4, 2005 /1330-32, 2008 /870-31 /4, 2008 /813-31 /2 ja 2009 /1278-31 /4. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta tutkimukseen osallistuneet.

Kasvain ja kohdunkaulan näytteiden materiaali

Esikäsittely parafiiniin kasvainbiopsioissa potilaista maakunnalta Tukholman diagnosoitu 2000-2007 kanssa nielurisojen okasolusyöpä (TSCC) tai 2003-2008 syöpä kohdunkaulan (CC). Kaikki tuumorinäytteet oli aiemmin analysoitu läsnäolo ja tyyppi HPV [1], [36] – [38]. Niistä 166 TSCC ja 90 CC jotka olivat HPV16 positiivisia, 55 TSCC ja 52 CC valittiin satunnaisesti. Toisessa osassa Tutkimuksen validointiin, 53 ylimääräistä, satunnaisesti valittu, HPV16 positiivinen TSCC samasta ajassa olivat mukana. Vuokaavio varten TSCC näytteet on esitetty kuvassa 1. Lisäksi 51 HPV16 positiivinen kohdunkaulan näytettä (CS), edellisestä tutkimus 2009-2010 at nuorten terveyskeskuksessa Tukholmassa [39] valittiin satunnaisesti ja analysoidaan. Keskimääräinen iät syöpäpotilaiden olivat 59,7 y (mediaani 59 y, alue 30-84 y) ja TSCC potilaille ja 50,3 y (mediaani 45 y, alue 25-88 y) CC potilaille, kun taas keski-ikä naisille on nuorten klinikka oli 19,9 y (mediaani 20 y, range16-22 y).

Yhdistelmät

DNA uutettiin ja analysoitiin läsnäolo HPV ja HPV-tyypin kuvatulla aiemmissa tutkimuksissa [1], [37], [39]. Analysointia varten HPV16 E6 syöpään kudoksista kaksi alukeparia, jotka kattavat koko alueelta E6 käytettiin. 5’CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 ’yhdessä 5′-TGCTGTTCTAATGTTGTTCC-3’ monistamaan emäsparin 57-375 ja 5’GGAATCCATATGCTGTATGT-3 ’yhdessä 5’TGCAATGTAGGTGTATCTCC-3′ monistamaan bp 273-587. Kohdunkaulan näytettä yksi alukeparia, joka kattaa koko E6 käytettiin; 5’-CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 ’ja 5′-GTACCCTCTTCCCCATTGGT-3’ monistamaan bp 57-902. PCR suoritettiin hehkutus lämpötila 49 ° C: ssa ja tuotteet puhdistettiin käyttämällä ExoSAP-IT (USB, VWR) protokollan mukaisesti valmistajan. PCR sekvensointia suoritettiin puhdistetulla tuotteita Big Dye ™ terminaattori (Applied Biosystems) ja amplikoneista analysoitiin Applied Biosystems 3130 sekvensserin. Molemmat DNA-säikeet sekvensoitiin ja DNA-sekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi verrattiin viite Euroopan HPV16 järjestyksessä (viite koodi: NC_001526.1) käyttäen Sci-Ed ohjelmisto (Science and Educational Software, Durham, NC, USA). Kolme tutkijat (JD, CC ja MS) olivat mukana sekvenssien analyysin. Tapauksissa, joissa saatu tulos oli epäselvä, sekvensointi toistettiin.

Tilastollinen

erot taajuuksilla variantteja TSCC ja CC tai CS arvioitiin chi-neliö ja Fischerin eksakti testi ( kaksisuuntainen) käyttäen on-line tilastollisen analyysin ohjelmisto (GraphPad Software). Keski-ikä oli ikä ensimmäisen diagnoosin.

Tautivapaa elinaika (DFS) määriteltiin aika alkaen diagnoosi päivämäärä viimeinen tunnettu tilaisuudessa, että potilas oli taudista vapaan tai jona tauti uusiutuu (paikallinen, alueellinen tai etäpesäkkeenä). Death ilman dokumentoitua toistuminen sensuroitiin klo kuolinpäivä. Kumulatiivinen eloonjääminen laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja analysoidaan log-rank-testi. Analyysi selviytymisen suoritettiin SPSS (IBM SPSS Statistics, version 20).

tukeminen Information

Taulukko S1.

taajuudet eri HPV16E6 variantit kohdunkaulan syövän (CC), nielurisojen levyepiteelisyöpä (TSCC) ja kohdunkaulan näytteistä (CS).

doi: 10,1371 /journal.pone.0036239.s001

(DOC)

Kiitokset

kirjoittajat kiittää kätilöt, Jenny Kugelberg, Ingrid Madarász, Anne Henriksson Klintberg, Kicki Bergström, Åsa Weitzberg, Kerstin Johanssson nuorisotalolla klinikan apua näytteenotossa .