Krooninen sairaus

tiivistelmä

monilääkeaineresistenssin yhä merkittävä este tehokkaalle kemoterapiaa paksusuolen syöpä. ABCG2, koska puolen kuljettaja G alaryhmään ATP-sitova kasetti kuljettaja geenejä (ABC kuljettajat), tiedetään olevan ratkaiseva merkitys monilääkeresistenssin. Kuitenkin, molekyylimekanismi valvoa ABCG2 ilmentymisen lääkeresistenssin paksusuolen syöpä on epäselvä ja tuskin raportoitu. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme systemaattisesti tutkia mahdollisuuksia roolia c-Jun-NH2-pään kinaasin (JNK) signaali väylän ABCG2 aiheuttaman monilääkeaineresistenssin paksusuolen syöpä. Vuonna hydroksikamptotesiinin (HCPT) resistentti solulinja SW1116 /HCPT ihmisen paksusuolen syövän solulinja SW1116, ABCG2 on tärkeä tekijä monilääkeresistenttisyyden, muita kuin hyvin tutkittu ABCB1 tai ABCC1. Tuloksemme osoittavat, että estämällä JNK-reitin estäjä SP600125 vähentää ekspressiotaso ja kuljetus toiminta ABCG2 in lääkeresistenttiä solua SW116 /HCPT. Huomattavaa on, että kokeet Sirna kohdistuvista JNK1- JNK2 mukaan vain hiljaisuus JNK1 geeni on yhtäläinen vaikutus kuin SP600125 siitä defosforylointia transkriptiotekijän c-Jun ja ilmentymistä ABCG2 proteiinin, kun vastaava ilmiöitä ei havaittu sen jälkeen, kun hiljaisuus of JNK2 geenin. Samaan aikaan, SP600125 indusoi apoptoosin SW116 /HCPT soluja edistämällä lohkaisu PARP ja tukahduttaa anti-apoptoottisen proteiinin surviviiniperäisten ja BCL-2, ja herkkyys kasvaa SW1116 /HCPT on HCPT. Yhdessä työmme osoitti, että JNK1 /c-jun signalointireitin oli mukana ABCG2 välittämää monilääkeaineresistenssin paksusuolen syöpäsoluissa. Ehdottomasti, esto JNK1 /c-jun-reitti on käyttökelpoinen käännetään ABCG2-välitteisen lääkeresistenssin HCPT kestävä paksusuolen syöpäsoluissa.

Citation: Zhu MM, Tong JL, Xu Q, Nie F, Xu XT Xiao SD, et ai. (2012) Lisääntynyt JNK1 signalointireitin vastaa ABCG2 välittämää monilääkeaineresistenssin Human Colon Cancer. PLoS ONE 7 (8): e41763. doi: 10,1371 /journal.pone.0041763

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 12 tammikuu 2012; Hyväksytty: 28 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 01 elokuu 2012

Copyright: © Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30770964, https://159.226.244.22/portal/proj_search.asp) ja Key laboratorio Program Science and Technology komissio Shanghai kunta (nro 06DZ22027, http: //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

monilääkeresistenttisyyttä, jolla solut vastustavat monet rakenteellisesti ja toiminnallisesti jotka eivät liity lääkkeiden, on merkittävä este tehokkaalle syövän kemoterapiaan. Mitä mekanismeja monilääkeresistenttisyyttä, tärkein on, että kertyminen lääkeaineen soluissa vähenee vähennetään sisäänpäin kuljetuksen tai lisääntynyt huumeiden ulosvirtaus, kuten yli-ilmentyminen Adenosiinitrifosfaatti (ATP): aa sitova kasetti (ABC) kuljettajat [1]. Luonnollisesti syvästi ymmärrys molekyylitason mekanismi kuljettajan ilmaisun on herättänyt intensiivisesti pitoisuuden onnistunut hoito-taustalla lääkeresistenssi.

Ihmisen genomin, 48 eri ABC kuljettajat on tunnistettu ja jaettu seitsemään alaperheisiin (AG), joka perustuu sekvenssin samankaltaisuuksia [2]. ABCG2, kuten puoli kuljettaja jäsen ABCG alaperheen, on 655 aminohapon proteiini, joka sisältää ATP: tä sitovan domeenin ja kuusi transmembraanidomeeni [3]. ABCG2 on alun perin tunnistettu syöpälääke vastustuskykyisiä ihmisen syövän solulinjojen in vitro valinta [4] – [6]. Sekä hyvin tutkittu monilääkeresistenttiä proteiini P-glykoproteiini (ABCB1), yliekspressio ABCG2 johtaa syöpäsolujen resistenttejä erilaisten kemoterapeuttisten ekstrudoimalla nämä yhdisteet ulos soluista, kuten topotekaani ja metotreksaatin [7], [ ,,,0],8]. Edellisessä tutkimuksessa, sekä geeni siru ja reaaliaikaisen PCR-tuloksiin perustuen SW1116 /HCPT soluista osoitti, että ilmaus ABCG2 kasvoi merkittävästi toisin kuin vanhempien SW1116 solut [9]. Tarkemmin sanottuna mRNA: n ekspressio on ABCG2 SW1116 /HCPT solujen parannettu yli 200 kertaa toisin vanhempien SW1116-soluissa, kun taas muut kuljettajat kuten ABCB1, ABCC2, ABCC3 ja ABCC6, kasvoi vain 0,5-1,0 kertaa. Tulokset osoittivat, että ABCG2 pitäisi olla tärkeä rooli vastus SW1116 /HCPT solujen hydroksikamptotesiiniksi (HCPT), estäjä topoisomeraasi I ja vähemmän myrkyllisiä kuin camptothecin. Kuitenkin molekyylimekanismi ABCG2 ilmaisun ja sääntely lääkeresistenssin ei ole selvä ja vastattu.

lisäksi yli-ilmentymisen monilääkeresistenteistä syöpäsolujen, ABCG2 on myös laajalti ilmaistu erilaisissa normaaleissa kudoksissa, kuten epiteelin ohutsuolen, maksan pienten kanavien kalvo ja kanavien ja lobules rintojen [10]. Lisäksi ABCG2 on tärkeä rooli ylläpito kantasolujen fenotyyppi korreloi huonoon ennusteeseen kemoterapian [11]. Alustava karakterisointi ABCG2 promoottorin paljastaa, että se on TATA-vähemmän useita aktivaattoriproteiini 1 (AP1) sitoutumiskohdat [12].

C-Jun NH2-pään kinaasin (JNK) on jäsen mitogen- aktivoitu proteiinikinaasi perheen, jotka sitovat NH2-pään aktivaatiodomeenia transkriptiotekijän c-Jun, mikä on ratkaiseva jäsen AP1 perheen. Aktiivisuus JNK on osallisena solujen jakautumisen, apoptoosin ja kasvain muutosta. Tärkeää on, että aiemmin raportit osoittivat, että modulaatio JNK aktivaatio voi olla uusi menetelmä kääntää monilääkeresistenttisyyden kautta asetus ekspressiotaso monilääkeresistenssin proteiinia, kuten P-glykoproteiini (ABCB1) ja MRP1 (ABCC1) [13] – [16 ]. Kuitenkin suhde JNK aktivaation ja ABCG2 ilmentyminen on tuskin tutkittu, erityisesti paksusuolen syöpäsoluissa. Äskettäin on raportoitu, että syöpäsolut ABCG2-yliekspressoivassa oli selvästi muuttunut endogeenisen JNK toimintaa [17], [18]. Ja eri topoisomeraasin estäjät todettiin aktivoida JNK ja aiheuttamaan apoptoosin [19] – [21]. Näiden mielissä keskityimme ilmaisua kytkös ABCG2 ja osallistumista JNK /c-Jun on HCPT kestävä paksusuolisyöpäsolulinjassa alilinja SW1116 /HCPT. Alla tulokset meidän tutkimukset osoittavat, että esto JNK-reitin pystyy alas-säädellä ABCG2 ja JNK-reitin voidaan hyödyntää voittamiseksi ABCG2 välittämää monilääkeaineresistenssin paksusuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

RPMI1640-viljelyväliaine, ja naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin GIBCO Life Technology (Gibco, Grand Island, NY). MTT [3- (4, 5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi], dimetyylisulfoksidi (DMSO), BSA: ta, fumitremorgin C (FTC), Hoechst33342, propidiumjodidi (PI) ja SP600125 olivat Sigma (St. Louis, MO). HCPT hankittiin Tiancheng Pharmaceutical Co. (Changchun, Kiina). Spesifisiä vasta-aineita kanin JNK, P-JNK (Thr183 /tyr185), c-Jun, P-c-Jun (Ser63), surviviini, bcl-2, PARP saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine ABCG2 ostettiin Santa Cruz (CA, USA). Kanin polyklonaalinen vasta-aine GAPDH, anti-kani-IgG, anti-hiiri-IgG saatiin Kangcheng Biotechnology (Shanghai, Kiina). SP600125 liuotettiin DMSO.

Cell Culture

paksu- ja peräsuolisyövän solulinja SW1116 (saatu Academy of Military Medical Science, Shanghai, Kiina) ja sen HCPT kestävä alalinja SW1116 /HCPT ( laaditaan ja niitä ylläpidetään laboratoriossamme) [9], [22], [23], viljeltiin pulloissa RPMI 1640, johon oli lisätty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 2 mmol /L L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. SW1116 /HCPT solut määritettiin lisäämällä konsentraatiogradientti HCPT vaiheittain ja näytetään 120.0-, 48.2- ja 2,1-kertainen resistenssi HCPT, adriamysiini ja oxymatrine verrattuna niiden vastaavat emosoluista, vastaavasti. SW1116 /HCPT soluja pidettiin kasvualustassa on jo kuvattu, ja kun läsnä oli 100 ug /L HCPT ja inkuboitiin lääkeaineen väliaineessa vähintään yhden viikon ajan ennen käyttöä.

Pienet häiriöt RNA (siRNA) ja JNK1 ja JNK2

Erityiset JNK1 /2 siRNA (JNK1: GACCAUUUCAGAAUCAGACUU, JNK2: GAUGCUAACU UAUGUCAGGUU) on suunniteltu mukaan cDNA-sekvenssin JNK1 /2 [24]. Negatiivinen kontrolli siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) koodattuja sekvenssit ohjaus siRNA ole merkittävää homologization ihmisen ja hiiren cDNA. SiRNA syntetisoitiin GenePharma yritys (Shanghai, Kiina). SW1116 ja SW1116 /HCPT solut transfektoitiin 100 nM siRNA: ssa 48 tuntia käyttäen Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen, kun siRNA transfektion JNK1 /2 siRNA, JNK1 /2-proteiinin ekspressiotasoja havaittiin Western blot.

semikvantitatiivinen Käänteinen transkriptio-PCR ABCG2

Soluja käsiteltiin joko 20 uM SP600125 tai 100 nM JNK1 /2 siRNA, ja kokonais-RNA uutettiin sitten käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, San Diego, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA puhtaus ja saanto arvioitiin spektrofotometrinen. cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen RNA LA PCR -kittiä (Takara, Tokio, Japani). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix ja ABI-7300H Sequence Detection System (Applied Biosystems). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja normalisoitiin sisäinen viite-geenin glycer-aldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH). Suhteellinen mRNA: n ekspression laskettiin käyttäen 2

(- Delta CT) menetelmää, kuten on kuvattu aiemmin [25], jossa CT (sykli count) on raja-syklin arvoa.

Western blot -analyysi

Kokosolulysaatti uutteet valmistettiin, ja proteiini mitattiin BCA Protein Assay Reagent (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Proteiini uutteet (30 ug /kaista) erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Elektroforeesin jälkeen proteiini siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Millipore, Bedford, MA). Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan Tris puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween 20 ja 5% rasvatonta maitojauhetta, ja inkuboitiin sitten ensimmäisen primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C:? yön yli ja sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa, vastaavasti. Spesifiset proteiinit visualisoitiin ECL Western blotting mukainen valmistajan ohjeiden (Pierce Biotechnology). Varmistaa samanlainen proteiinin lastaus membraani tutkittiin monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen GAPDH.

ulosvirtausaika Pitoisuus

tunnettu substraatti ABCG2, Hoechst 33342 on valittu arvioimaan ulosvirtausta määritystä ABCG2. SW1116 ja SW1116 /HCPT soluja inkuboitiin Hoechst 33342, ja solujen osuus, jotka eivät sisällä Hoechst 33342 arvioitiin MoFlo (DakoCytomation, Fort Collins, CO, USA) [26]. Erityiset estäjä ABCG2, fumitremorgin C (FTC), käytettiin positiivisena kontrollina [27]. Lyhyesti, soluja inkuboitiin (10 * 6 solua /ml) esilämmitettyä RPMI1640 (joka oli täydennetty 10% FBS: ää), joka sisälsi 5 ug /ml Hoechst 33342 37 ° C: ssa 90 minuutin ajan ajoittain ravistellen. Ohjaus soluja inkuboitiin, kun läsnä oli 10 uM FTC 30 min. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen kylmään PBS: ään, joka sisälsi 1 ug /ml PI merkitä kuolleiden solujen virtaussytometrianalyysiä. Vain tapahtumia elinkelpoisia soluja käytettiin tietojen analysointia. Hoechst 33342 väriaine viritettiin 355 nm, ja sen emissiofluoresenssi havaittiin käyttäen 450 nm: n ja 675 nm suodatin järjestelmiä. Kaikki tulokset analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (Puu Star, Ashland, OR, USA).

Cell Proliferation ja Elinkykymääritykset

Vaikutukset soluproliferaatiota arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Eri pitoisuuksilla lääkkeitä käytettiin, jotka vaihtelevat välillä 0,1 mg /l 0,8 mg /l HCPT varten SW1116-soluissa, ja 0,1 mg /l 62,5 mg /l HCPT varten SW1116 /HCPT soluja. Lyhyesti, solut ympättiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille alkutiheydellä 3 x 10

3 solua /kuoppa. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, soluja inkuboitiin 20 uM SP600125 sarjalaimennoksia HCPT ja yhdisteen SP600125 ja HCPT määrätyille aikoja (24 tai 48 tuntia), vastaavasti. SiRNA transfektion kokeissa solut transfektoitiin 100 nM siRNA, mukaan lukien ei siRNA, negatiivinen siRNA, ja siRNA kohdistaminen JNK1 ja JNK2. Transfektion jälkeen 12 tuntia, eri pitoisuuksia HCPT lisättiin. Määritykset suoritettiin 24 ja 48 tuntia transfektion jälkeen mukaan valmistajan protokollia. Kaksikymmentä mikrolitraa MTT-liuosta (1 mg /ml), kuten lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja sen jälkeen 4 tuntia, 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 10 minuuttia. Absorbanssi mitattiin mikroviljelylevyille levylukijalla 570 nm: ssä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi määritettiin virtaussytometrialla analyysi käyttämällä anneksiini-V FITC ja PI kaksinkertainen värjäys määritystä noudattaen valmistajan ohjeiden (Jingmei, Shenzhen, Kiina) kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti, käsittelyn jälkeen, sekä kelluva ja trypsinisoitiin kiinnittyneet solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen tiheydellä 1 x 10

6 solua /ml 200 ul: sitovaa puskuria, joka sisälsi 5 ui anneksiini-V-fluoreseiini-isotiosyanaatti ja 5 ui PI, inkuboitiin sitten 10 minuuttia pimeässä huoneenlämmössä. Analyysi heti suoritetaan käyttäen virtaussytometriä.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 17.0 ohjelmistolla (SPSS, Chicago, IL). Jatkuvat esitettiin keskiarvo ± keskihajonta (SD) vähintään 3 toistettiin erillisiä kokeita kullekin ryhmälle. Tilastolliset erot määritettiin ANOVA ja Studentin t-testi riippumaton näytteitä. Arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Kestää Solulinjat normaalia suurempia ilmentäminen ABCG2 ja suurempi aktiivisuus JNK /c-jun Pathway

monien eri mekanismeja tulkita kehittämiseen monilääkeresistenssin fenotyypin syöpäsoluissa, laajimmin tutkittu toinen perustuu ABC kuljettajat. HCPT kestävä alalinja SW1116 /HCPT, joka on valittu SW1116-solulinja kasvavien pitoisuuksien kanssa HCPT näytetään monilääkeresistenttisyyden fenotyyppi niiden laaja ristiresistenssiä ja vikoja solunsisäisen lääkeaineen kertymistä.

Kuviossa. 1A, SW1116 /HCPT näytetään ilmeisesti yli-ilmentymisen ABCG2, kun taas lähes ABCG2 ilmentymistä havaittiin kantasolulinjoista SW1116. Vaikka muut kuljettajat kuten ABCB1, ABCC2, ABCC3 ja ABCC6, kasvoi vain 0,5-1,0 kertaa. Se osoitti, että moniresistentti fenotyyppi oli pääasiassa välittävät lisääntyneen ilmentymisen ABCG2. Lisäksi taso ja aktiivisuus JNK-reitin SW1116 /HCPT tutkittiin sen jälkeen, kun solut vapautettiin huumeiden väliaineessa 7 päivää. On selvää, aktiivisuus JNK ja transkriptiotekijä C-jun kasvoi merkittävästi vuoden SW1116 /HCPT kuin että vanhempien linjat (Fig. 1 B).

mRNA ilmentymä ABCB1, ABCC1-6, ABCG2 vuonna SW1116 ja SW1116 /HCPT solut mitattiin Reaaliaikainen PCR. B. SW1116 ja SW1116 /HCPT solut kerättiin valmistamiseksi solulysaateista. Lysaatit alistettiin SDS-PAGE: lla ja blotattiin vasta-aineita. Tasot ABCG2, fosforyloidun JNK (P-JNK), yhteensä JNK, fosforyloitu c-jun (Pc-kesäkuu) ja koko c-jun havaittu.

SP600125 ja siRNA JNK1 inhiboivat JNK: n aktivaatio /c-jun Pathway

SP600125, estäjä JNK-reitin, vähensi P-JNK ja Pc-jun ilmentymisen merkittävästi muuttamatta yhteensä JNK ja c-jun ilmentymistä (Fig. 2A). Pieni häiritsevä RNA: t (siRNA: t) teknologia tarjoaa tehokkaan lähestymistavan täsmähoitoihin syövän. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, eri JNK isoformeja voi olla erilaisia ​​toimintoja. Meidän tapauksessamme, pieni interfereing RNA kohdistaminen JNK1 ja JNK2 jotka kaikkialle tuotettu valittiin estämään JNK1 /2-signaalin väylän SW1116 /HCPT soluja. Western blot-analyysi osoitti, että proteiini taso JNK1 ja JNK2 laski 72,3% ja 78,4%, kun JNK1 /2 siRNA transfektio, verrattuna kontrolliryhmiin. Ja osittainen hiljaisuus JNK1 johti merkittävään laskuun aktiivisuuden P-JNK1 ja P-c-kesäkuu Kuitenkin osittain hiljaisuus JNK2 vain vähentynyt fosforylaatio JNK2, mutta ei fosforylaatiota c-jun (Fig. 2B).

SW1116 /HCPT solut altistetaan DMSO: hon ja SP600125 pitoisuuksina 20 uM 24 ja 48 tuntia, keskitason korvaava 24 tunnin välein. Sitten ilmentyminen fosfo-JNK /JNK ja fosfo-c-jun /c-jun mitattiin Western blotit. B. SW1116 /HCPT solut transfektoitiin kontrolli-siRNA, siRNA JNK1 tai siRNA JNK2 48 tuntia, sitten ilmentyminen fosfo-JNK /JNK ja fosfo-c-jun /c-jun-proteiinin tasot mitattiin Western blot.

esto JNK1 /c-jun Pathway Down-regulation ABCG2 Expression taso

tutkia ABCG2 oli alassäädetty inhiboimalla JNK-reitin mRNA-tasolla, ABCG2 mRNA ilmentyminen semikvantitatiivinen RT-PCR analysoitiin. Käsittelyllä 20 uM SP600125 24 tai 48 tuntia kuvassa. 3A ABCG2 mRNA: n ekspression SW1116 /HCPT solujen havaittiin pienentyneen noin 45,42% ja 67,83% vastaavasti. Lisäksi estävä vaikutus transfektion JNK1 /2 siRNA tutkittiin. Erityisesti hiljaisuus JNK1 näytteillä voimakkaampi vaikutus alaspäin säätäminen ABCG2 mRNA ilmaisu kuin hiljaisuus JNK2 (Fig. 3B). ABCG2 proteiinin ekspressiotasoja Sitten määritettiin Western blot -analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, SP600125 hoito 48 tuntia tukahdutetaan ABCG2 proteiinin ilmentymisen 54,29%, mikä osoittaa, että esto JNK-reitin voisi alas-säädellä ABCG2 proteiinin ilmentymisen. Mielenkiintoista, verrattuna merkittävää vaikutusta alaspäin säätäminen ABCG2 proteiinin ilmentymistä kuin hiljaisuus JNK1, ei ollut ilmeistä vaikutusta hiljaisuus JNK2 (Fig. 3d).

Reaaliaikainen-PCR-analyysi ABCG2 geeniekspressiota SW1116 /HCPT solut käsittelemällä ilman tai yli ajan kuluessa SP600125 ja JNK1 /2 siRNA. *,

P

0,05, **,

P

0,01. C ja D. ilmentyminen ABCG2 proteiini havaittiin Western-blot-analyysi sen jälkeen, kun SP600125 ja JNK1 /2 siRNA hoitoon.

inhibitio JNK1 /c-jun Pathway Estää ulosvirtausaika määritys ABCG2

Tuloksemme muistutti SP600125 ja JNK1 siRNA pystyivät alas säätelemään ABCG2 ilmaisun SW1116 /HCPT soluja, joten ensi päätimme vaikutuksen arvioimiseksi esto JNK-reitin päälle ABCG2 ulosvirtausta. Tätä tarkoitusta varten, Hoechst 33342 määritettiin mittana ABCG2 ilmaisun /toiminto virtaussytometrialla. Tunnetut ABCG2 estäjä, FTC, käytettiin positiivisena kontrollina. Olemme havainneet, että SW1116 /HCPT-solut, jotka yli-ilmentynyt ABCG2 geeni, joka sisältyy hyvin alhainen Hoechst 33342 sisäänoton toisin vanhemman SW1116-soluissa. Hoidon jälkeen SP600125 48 tuntia, Hoechst 33342 otto lisääntyy selvästi SW1116 /HCPT soluja. Kun taas vain 1,9% SW1116 /HCPT solut valikoivasti kertynyt Hoechst 33342, tämä parannettu 21,1% käsittelyn jälkeen SP600125 (Fig. 4A). Hoechst 33342 kertymistä arvioitiin myös SW1116 /HCPT solujen jälkeen siRNA transfektion JNK1 /2 siRNA 48 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, JNK1 siRNA transfektio indusoi kasvua solujen osuus, jotka kertyvät Hoechst 33342 (1,1%: sta 12,5%), kun taas ei ollut selvää muutosta Hoechst 33342 kerääntyminen hiljaisuus JNK2 geenin. Yhteenvetona virtaussytometria analyysi perustuu Hoechst 33342 osoitti esto JNK1 reitin voisi alas-säätelemään ja kuljetustoimintaa ABCG2.

solunsisäinen fluoresenssi Hoechst 33342 analysoitiin virtaussytometrillä vuonna SW1116-soluissa ja SW1116 /HCPT solut, joita käsiteltiin tai ei SP600125. FTC positiivinen kontrolli inkuboitiin 30 min. B. Hoechst 33342 havaittiin SW1116 /HCPT solujen jälkeen Transfektiomenetelmätapa kanssa JNK1- tai JNK2 siRNA 48 tuntia. Laatikko on Hoechst33342 värjäys kestävä alue.

esto JNK1 /c-jun Pathway johtaa suurempiin apoptoosin että resistenttien solulinjojen

havaitsemiseksi roolia JNK /c -Jun väylän selviytymisen moniresistenttien solulinjojen apoptoosin jälkeen SP600125 hoidon tai JNK1 /2 siRNA transfektio analysoitiin virtaussytometrialla analysointia. Kokonaismäärä apoptoottinen korko jälkeen SP600125 hoidon 48 tunnin kuluttua oli 9,26% vanhempien SW1116-soluissa, kun taas 14,95% for SW1116 /HCPT solut (

P

0,01). Lisäksi SP600125 ja hiljaisuus JNK1 geenin voisi synergistisesti lisätä indusoiman apoptoosin HCPT sijasta hiljaisuus JNK2 geenin. Kontrolliin verrattuna soluihin (0,1% DMSO: ta ja HCPT), oli merkittävästi enemmän apoptoottisia soluja SP600125 hoitoryhmässä (SP600125 ja HCPT) in SW1116 /HCPT soluja (60,63% vs. 29,45%), mutta ei SW1116-soluissa (30,87% vs. 29,45%) (Fig. 5A). Vuonna SW1116 /HCPT soluja, JNK1 siRNA transfektio synergistisesti apoptoosin joka indusoi HCPT, vertaamalla vastaavien transfektio epäspesifinen siRNA (29,97% vs. 17,04%), kun taas JNK2 ei huomautus vaikutusta parantamiseen apoptoottisen korko (15,35% VS. 17,04%) (Fig. 5B). PARP pilkkominen keskeisenä tapahtuma apoptoosin ja surviviinin, Bcl-2 markkereina estää apoptoosin ja regulateing solunjakautumisen, tehtiin Western blot-analyysi. Tuloksena osoittivat, että SP600125 voi estää surviviinin ilmentymiseen ja bcl-2 ja indusoivat pilkkominen PARP vastustuskykyisten SW1116 /HCPT solut (Fig. 5C). Siten inhibitio JNK-reitin indusoi apoptoosin SW1116 /HCPT soluissa ekspressiota sääteleviä apoptoosiin liittyvä proteiini.

apoptoottinen hinnat SW1116 ja SW1116 /HCPT soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden HCPT, kanssa tai ilman SP600125 48 tunnin ajan, analysoitiin virtaussytometrialla analysointia värjäyksen jälkeen anneksiini V /PI. B. Apoptootosinopeudet of SW1116 /HCPT soluja käsiteltiin yhdistelmällä JNK1 /2 siRNA ja HCPT, analysoitiin. C. Vaikutus SP600125 on apoptoosin säädin proteiinit SW1116 /HCPT solut mitattiin Western-blot-analyysi.

esto JNK1 /c-jun Pathway herkkyys kasvaa SW1116 /HCPT solut ja syöpälääkkeiden

vaikutukset SP600125 ja JNK1 siRNA on ABCG2 proteiinin tason ja kertymistä Hoechst 33342 ehdotti, että JNK1 toimettomuus voisi herkistää SW1116 /HCPT solujen HCPT. Olemme siten edelleen arvioinut tehoa JNK signaloinnin inhibiittorit yhdistettynä HCPT. MTT-määritystä osoitti, että SP600125 voi vähentää IC50-arvojen HCPT SW1116 /HCPT soluja. Kuviossa. 6A, kun yhdistelmä hoidon SP600125 48 tuntia, IC 50-arvot HCPT pienenivät 7-kertaiseksi, 2,41 mg /l 0,328 mg /L SW1116 /HCPT soluja ja 0,154 mg /l 0,142 mg /L SW1116-soluissa. Vastaavasti, JNK1 siRNA transfektio myös huomattavasti lisääntynyt herkkyys SW1116 /HCPT solujen HCPT by 7-kertaiseksi, 2,27 mg /l 0,310 mg /l, kun taas JNK2 siRNA transfektion lisääntynyt vastus SW1116 /HCPT solujen HCPT (IC50 2,27 mg /l 4,271 mg /l) päinvastoin (Fig. 6B).

SW1116 ja SW1116 /HCPT soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet HCPT, kanssa tai ilman SP600125, 48 tuntia . Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Prosenttiosuus elävien solujen määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. B. Solujen elinkelpoisuus SW1116 /HCPT soluista määritettiin MTT-menetelmää hoidon jälkeen JNK1-, JNK2 tai JNK1 ja JNK2 siRNA.

Keskustelu

tehokas kemoterapia hyvin rajallinen by monilääkeresistenttisyyttä potilaille, jotka kärsivät pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien metastaattinen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. ABCG2 on olennainen membraaniproteiini lääkkeeksi effluksipumpun ja vastaa ”puoli väestö” fenotyyppi kantasolujen ja näyttää olevan merkittävä rooli suojan hypoksia [28], [29]. Yliekspressio ABCG2 voi johtaa hankinnan monilääkeresistenttisyyden useita syöpälääkkeiden [7], [8]. Oikeastaan ​​tuloksemme osoittivat, että perustava yliekspressio ABCG2 in lääkeresistenttiä koolonsyöpäsoluihin SW1116 /HCPT aiheutti suurta vastustusta kemoterapeuttisia lääkkeitä, vaikka taustalla molekyylitason mekanismit jäi tuntemattomaksi yksityiskohtaisesti. Siten strategia kääntää moniresistentti fenotyyppi perustuu estoon ABCG2 ilmentymisen tai sen kuljetinfunktioon tehostamalla kertymiseen solun syöpälääkkeiden ansaitsee laajaa ja syvään tutkimus.

JNK aktivoidaan proinflammatoristen sytokiinien, ympäristön stressi ( esimerkiksi hypoksia, UV ja g-säteilyn, lämmön shock, redox stressi) tai useita sytotoksiset lääkkeet. Sen aktivointi yleisesti edistää sovittelun merkittävien solun tapahtumia. Aktiivisuus JNK on liitetty säätelyyn alkion morphogenesis, solujen lisääntymistä, kasvain transformaatio, ja apoptoosin [30] – [33]. Useimmat aiemmin raportit ovat tunnistaneet pro- tai anti-apoptoosin toimintoja JNK, riippuen solutyypistä, annostus ärsyke tai hoidon kestosta ja toiminnan muiden solun signalointireittien [34] – [38]. Ei ole kuitenkaan toistaiseksi ole yksimielisyyttä välisiä suhteita JNK-reitin ja ilmauksia kuljettajat. Lähes kaikki aiemmin tutkimukset olivat keskittyä P-glykoproteiinin välityksellä monilääkeaineresistenssin [15], [39], [40], mutta suhde JNK signaalireitin ja ABCG2 kuljettajat ei raportoitu koolonkarsinoomasoluissa.

tässä työssä, vaikutus JNK-reitin päälle ABCG2 ilmaisun /aktiivisuus ja vaikutuksia monilääkeresistenttisyyden välittämän nämä kuljettajat syvästi ja systemaattisesti tutkittu. Kolme JNK geenit on tunnistettu: JNK1, JNK2 ja JNK3. JNK1 ja JNK2 ovat ekspressoituvat, kun taas JNK3 ilmentyy pääasiassa aivoissa, kiveksissä ja sydän [41]. Joten roolit joko JNK1 tai JNK2 ohjelmassa monilääkeresistenssin olivat kaikki tässä tutkimuksessa tutkittu.

SP600125 on selektiivinen JNK /c-jun signalointireitin, joka voi näyttää 20-kertainen spesifisyys for JNK1 kinaasin suhteessa muihin kinaasien [42]. Tärkeää on, että rooli SP600125 on käännetään ABCG2-välitteisen monilääkeresistenssin SW1116 /HCPT soluja havaittiin myös kokeessa. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, fosforylaatio JNK: iden suureni SW1116 /HCPT soluja. Samaan aikaan, c-jun-aktiivisuus oli merkittävästi heikennetty SP600125 tai transfektion jälkeen kanssa JNK1 siRNA kuviossa. 2. Olemme myös havainneet, että esto JNK jonka SP600125 selvästi vähentynyt mRNA-tasolla, proteiinin taso ja kuljetustoimintaa ABCG2 in SW1116 /HCPT soluja.

syrjiä vaikutuksen JNK1 /2 signalointireitille on ABCG2 kuljettaja, lisää vertailevat kokeet suoritettiin. Kuten odotettua, saarto JNK1 aktiivisuuden avulla JNK1 siRNA säädeltiin ilmentymistä liikenteen proteiinin ABCG2 ja elinkelpoisuus SW1116 /HCPT soluja samoin SP600125, mutta ei saarto JNK2 toimintaa. Vaikka mRNA ilmaus ABCG2 laski jälkeen osittaisen hiljaisuus JNK2, proteiinin ilmentyminen oli jopa koholla. Nykyiset tiedot osoittivat, että vain JNK1 polku edistää vastustuskykyä HCPT ja säätelee positiivisesti ABCG2 proteiinin ilmentymistä monilääkeresistenttejä soluissa, mutta ei JNK2 kautta. Kuten edelliset raportoitu, JNK: n aktivaatiota reitin korreloi positiivisesti aktivointi transkriptiotekijä, c-Jun. Meidän tapauksessamme, Huomasimme myös, että fosforylaatiota JNK1 ja aktiivisuuden transkriptiotekijän c-jun olivat avaintekijöitä yliekspressio ABCG2 geenin lääkeresistenttiä solua SW1116 /HCPT. Olemme sitä mieltä, että c-jun, yhtenä jäsenenä AP-1, on todennäköisesti näytellä vaikuttamalla on AP1 sitoutumiskohdat ABCG2 promoottorin.

PARP on DNA korjaus entsyymi aktivoida DNA-vaurioita ja pilkkominen PARP on laajalti käytetty biokemiallinen markkeri apoptoosin [43]. Niinpä vielä tutkittu PARP tasoilla SW1116 /HCPT solujen altistuksen jälkeen SP600125 ja hiljaisuuden JNK1 tai JNK2 geeni. Western blot-analyysi osoitti, että intensiteetti 89 kDa pilkkomisen PARP kaistan lisättiin soluissa käsitelty SP600125 puolestaan ​​bcl-2 ja surviviini, kuten anti-apoptoosin proteiinia, olivat pieneni, kun yhtäläisen kohtelun. Nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio JNK1 reitin tehokkaasti aiheuttaman solukuoleman kautta apoptoosin induktion monilääkeresistenssin soluissa.

Viime aikoina enemmän todisteita osoittaa, että syöpälääkkeiden aktivoida monien signaalin polkuja, joista osa on kytketty kehittämiseen lääkeresistenssin kasvainsolujen [40], [44]. Kuten edellä mainittiin meidän tapauksessa inkubointia HCPT 24 tunnin ajan voi myös aiheuttaa JNK fosforylaation SW1116-soluissa, tämä tulos tukee edellisen raportin että JNK ensisijaisesti aktivoitiin HCPT muissa solulinjoissa [21]. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että JNK1 /c-jun signaalireitin on mukana ilmentymisen ABCG2 geenin koolonkarsinoomasoluissa, ja se voi myötävaikuttaa chemoresistance.

Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että JNK1 /c-jun reitti on mukana monilääkeresistenssin paksusuolen syöpäsoluja. Kuten SW1116 /HCPT soluissa esitetään korkeampia JNK /c-jun aktiivisuus kuin SW1116 soluja, estämällä tämän reitin johti vähemmän ABCG2 ilmaisun ja korkeamman apoptoosin induktion resistentit solut. Lisäksi JNK1 /c-jun esto korreloi alas-säätely surviviiniperäisten ja Bcl-2 ja PARP pilkkominen. Lisätutkimuksia muiden kasvaimeen malleja sekä

in vivo

tutkimuksissa auttaa ymmärtämään rooli JNK1 /c-jun-reitin monilääkeresistenssin. Vaikka erilaiset roolit JNK-isoformien edelleen epäselviä yksityiskohtaisesti asti, ei ole epäilystäkään siitä, että JNK1 /c-jun signalointiryöpyn olisi pidettävä houkutteleva kohde terapeuttiselle interventiolle tutkimuksemme.