Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma on ominaista laaja paikallinen kasvaimen invaasio, etäpesäke ja varhainen systeeminen levittämiseen. Valtaosa haimasyövän (PaCa) potilaille, jotka jo on etäpesäkkeitä komplikaatioita aikaan diagnoosi, ja kuolleisuus tämän tappavan syöpä on kasvanut viime vuosikymmeninä. Siten pyrkimyksiä identifioida uusia molecularly kohdennetut hoidot ovat prioriteetteja. Viimeaikaiset tutkimukset ovat viitanneet siihen, että serotoniinin (5-HT) edistää kasvaimen kasvua eri syövissä, mukaan lukien eturauhas-, paksusuoli-, virtsarakko- ja maksasyöpä. On kuitenkin puute näyttöä vaikutuksesta 5-HT-reseptoreihin edistämiseen haimasyöpä. Tutkittuaan roolia 5-HT-1-reseptoreihin, erityisesti 5-HT

1B ja 5-HT

1D alatyyppejä erityyppisissä maligniteettien tavoitteena oli tutkia roolia 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin PaCa kasvuun ja kehittymiseen ja analysoida niiden mahdollisuuksia sytotoksisia tavoitteita. Huomasimme, että knockdovvn 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin ilmaisua käyttäen erityisiä Sirna (siRNA), indusoi merkittävää proliferaation esto ja kyky muodostaa klooneja PaCa soluja. Lisäksi se merkittävästi tukahdutti PaCa solujen invaasiota ja vähensi aktiivisuutta uPAR /MMP-2 signalointi ja integriini /Src /Fak-välitteisen signaloinnin, kiinteänä tuumorisolun reitit liittyy invaasio, muuttoliike, tarttuvuus, ja leviämisen. Lisäksi kohdistaminen 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja down-regulation sinkki sormella ZEB1 ja Snail proteiineja, tunnusmerkkejä transkriptiotekijät säätelevät epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), samanaikaisesti up-säätely claudin- 1 ja E-kadheriinin. Lopuksi todettakoon, että tiedot viittaavat siihen, että 5-HT

1B- ja 5-HT

1D-välitteisen signaloinnin tärkeä rooli säätelyssä proliferatiivisen ja invasiivisen fenotyypin PaCa. Siinä korostetaan myös mahdollisesta terapeuttisesta kohdistaminen 5-HT

1B /1D-reseptorien hoidossa PaCa, ja avaa uuden keinon biomarkkereita tunnistamiseen, ja arvokkaita uusia terapeuttisia kohteita hallintaan haimasyövän.

Citation: Gurbuz N, Ashour AA, Alpay SN, Ozpolat B (2014) Down-asetus 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorit Estää leviämisen, kyky muodostaa klooneja ja Invasion of Human haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (8): e105245. doi: 10,1371 /journal.pone.0105245

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2014; Julkaistu: 29 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Gurbuz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Texas Center for Cancer nanolääketieteen (TCCN), National Cancer Instituten (NCI) Center for Nanoteknologia (454CA151668), ja siRNA Center -projektissa MD Anderson Cancer Center, UT, Houston, Texas, USA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PaCa), joka on vahva invasiivisia kapasiteetti usein etäpesäkkeitä ja toistuminen, tiedetään olevan yksi kaikkein vaarallisin ihmisen syöpiä 5% 5 vuoden pysyvyys [1]. Vaikka se vain sijoittuu kymmenes esiintyvyys yleisimpiä ihmisen syöpien, PaCa on neljänneksi yleisin syy syöpäkuolemista länsimaissa ja sen kuolleisuus ei ole vähentynyt viime vuosikymmeninä [2], [3]. Kaiken PaCa on noin 100% kuolleisuuden, koska se on yleensä havaita etukäteen vaiheissa, koska se ei yleensä aiheuta oireita aiemmissa vaiheissa [4]. PaCa on luontaisesti vastustuskykyinen apoptoosin ja huonosti vastaa nykyisiä hoitomuotoja, kuten yhdistelmä solunsalpaajahoitojen [5]. Ratkaista tämä maailmanlaajuinen terveysongelma, tutkimukset keskittyvät tunnistamisesta uusien molekyylikohteista kehittää uusia hoitostrategioita.

mitogeenista välittäjäaine, serotoniinin (5-HT) tiedetään aiemmin olleen toimii kasvutekijä [ ,,,0],6] useita erilaisia ​​ei-kasvainsolujen (esim verisuonten sileän lihaksen soluissa, keuhkojen fibroblastit ja munuaisten mesangiumsoluissa) [7], [8], ja kasvaimen solut (esim haiman karsi- soluja, pienisoluisen keuhkosyövän solut ja peräsuolen karsinooma) [9], [10], [11]. Äskettäin 5-HT on tullut tärkeä säätelijä solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvun eri syöpätyyppien [12], [13], [14], [15]. Aikana syövän etenemiseen, tyrosiinihydroksylaasi, nopeutta rajoittava entsyymi serotoniinin biosynteesipolun, on usein säädelty [16]. Tärkeää on, että eri 5-HT-reseptorit on tunnistettu (5-HT-1-7), joka perustuu niiden rakenteellisten, toiminnallisten ja farmakologiset ominaisuudet [17], [18]. Kuusi perheiden 5-HT-reseptorit ovat G-proteiiniin kytkettyjen, mukaan lukien Gi: 5-HT-1, Gs: 5-HT-4,6,7, ja Gq /11: 5-HT-2,5. Ainoastaan ​​5-HT-3 on ainutlaatuinen ligandi säätelemiin kationi kanavan, liittyy asetyylikoliinin nikotiinireseptorin [16]. 5-HT-reseptoreihin on edelleen jaettu eri alatyyppeihin, esim. 5-HT-1 -perheen on viisi alatyyppiä [18], joka sisältää 5-HT-1A, 1B, -1D, -1 e ja -1 f-reseptorit, ja parit valikoivasti Gi /o estävän cAMP: n muodostumisen [19], [20 ]. Erityisesti ihmisen 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorit ovat erityisen samanlaisia ​​sekvenssin huolimatta koodaa kaksi eri geenejä. Tarkkaa vaikutusta näiden reseptorien määrittelemätön, ja edistystä tämä on haitannut puute ligandeilla [21]. Aiemmin todettiin, että 5-HT-1-reseptorit ovat laajasti ilmaistuna ihmisen rintasyövän [22], eturauhassyöpä [23] ja virtsarakon syövän solujen [18], joka voisi selittää mitogeeniset vaikutukset agonistien näiden reseptorin tällaisista syövistä. Haimasyöpä tutkimus on keskittynyt lähinnä tutkimus geenimutaatioita ja signaalitransduktioreaktioteiden haiman adenokarsinooma (PDAC) soluihin, kun taas mahdollista roolia neurotransmitterireseptoreihin kehittämiseen ja etenemiseen tämän tappavan kasvainsairaus on jäänyt suureksi osaksi [4]. Ottaen huomioon mahdolliset osallistumista 5-HT-1-reseptorien signalointia leviämisen useita erilaisia ​​syöpiä, tuntematonta vaikutusta näiden reseptorien PaCa etenemiseen, tutkimme täällä roolia 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin leviämisen ja invasiivisen fenotyypin PaCa.

Paikallisia invaasio voidaan pitää alustavana ja välttämätön askel pahanlaatuisuuden karsinoomien, johtaa sukupolven johtaa yleensä kuolemaan kaukainen etäpesäke. Jotta syöpäsolut hyökätä kaukaisiin kudoksiin, niiden täytyy läpäistä ympäröivään matriiseina. Tällaiset syöpäsolun /ECM Vuorovaikutusta helpottavat Integriiniperheen Soluadheesiomolekyylien lukien tyrosiinifosforyloitunut alustoille (tyrosiinikinaasiperheen Src ja polttoväli adheesiokinaasi) [24]. Integriinit ovat trans-kalvomainen α /β heterodimeerisiä reseptoreja, jotka välittävät solu-vuorovaikutuksiin ja solun sitoutumista soluväliaineen (ECM) [25], ja ne toimivat reseptorit joillekin ECM proteiinit (esim fibronektiinin, vitronektiini, laminiini ja kollageeni) [ ,,,0],26]. Altered integriinin aktiivisuutta tai alustan affiniteetti voi edistää kasvainilmiasua. Normaalisti solu Src pidetään aktiivisessa tilassa, mutta useissa syöpätyypeissä, poikkeavat tapahtumat johtavat kohonnut kinaasiaktiivisuuden proteiinin ja aiheuttaa pleiotrooppista soluvasteita asiakkuutta transformaatio ja etäpesäkkeiden [27].

Koska karsinoomat edistystä, kasvaimet saattavat menettää epiteelin morfologia ja hankkia mesenkymaalisten ominaisuudet, jotka edistävät metastaattinen potentiaali. Epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), kriittinen prosessi samanlainen prosessi alkion kehityksen, uskotaan olevan tärkeä tapa edistää syövän eteneminen ja metastaasit [28]. Viime vuosina ZEB perheen sinkkisormi transkriptiotekijöiden on dokumentoitu olennainen pelaajat EMT [29]. Epiteelin adheesioproteiini, E-kadheriinin, on aktiivinen vaimennin hyökkäyksen ja kasvun monien epiteelisyöpien, ja sen alassäätöä pidetään tunnusmerkki EMT [30], [31]. E-kadheriinin on tärkeä tavoite geenin ZEB perheen transkriptiorepresso-. EMT-asiakkuutta välittäjäaineita, kuten TCF8, laukaista epiteelin erilaistamattomuuden huonontamalla ilmaus /toiminta E-kadheriinin [32]. E-kadheriinin repressors voi säädellä kehityshäiriöitä transkription ohjelmia EMT kasvainsoluissa altistaa hänet ja metastaasit [33]. Siten mutaatiot ZEB koodaavat geenit liittää nämä tekijät pahanlaatuinen kasvain etenemisen [29].

Nykyinen tutkimus keskittyi tutkimiseen rooliin 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin PaCa leviämisen ja invaasion. Tuloksemme osoittavat merkittäviä vähennyksiä PaCa solun kasvu, invaasio ja korreloivat alavirran signalointia vastauksena säätely alaspäin näiden serotoniinireseptoreihin ilmaisuja, mikä viittaa merkittävää näyttöä näiden reseptorien edistämisessä haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat, viljelyolosuhteet ja reagenssit

ihmisen haimasyövän solulinjoissa saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). PANC-1 ja MiaPaca-2-soluja viljeltiin DMEM /F12, johon oli lisätty 10% FBS: ää. Kaikki alustat sisältävät penisilliiniä ja streptomysiiniä (100 yksikköä /ml). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2/95% ilmaa, ja niitä käytettiin siirrostusten välillä 4 ja 15. Ihmisen haiman kanava epiteelin (HDPE) solut ystävällisesti toimitti Dr. Kapil Mehta, Department of experimental terapeuttinen, MD Anderson Cancer Center, kuin antelias lahja. HDPE-soluja pidettiin keratinosyyttien seerumittomassa elatusaineessa (Keratinosyyttien-SFM, 1 x), joka sisälsi L-glutamiinia, ja johon on lisätty prequalified ihmisen rekombinantti epidermaalisen kasvutekijän 1-53 (EGF 1-53) ja 25 mg /500 ml naudan aivolisäkeuutetta ( BPE) (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA). NF-KB-aktivaation inhibiittori II, JSH-23 (4-metyyli-N

1- (3-fenyylipropyyli) bentseeni-1,2-diamiini) (EMD Millipore Billerica, MA), liuotettiin DMSO: hon lopulliseen varastossa pitoisuutena 10 mM, ja sitä lisätään soluviljelmiin 25 ja 50 uM pitoisuuksina, joka selektiivisesti estää tumaansiirtymiseen NF-KB: n p-65 ja sen transkription aktiivisuus.

Transfektiot siRNA

eksponentiaalisesti kasvavat käsittelemättömän PANC-1 ja MiaPaca-2-solut maljattiin 24 tuntia ennen transfektiota. Päällystetty solut transfektoitiin kaksijuosteinen siRNA kohdistaminen mRNA serotonergisten reseptorien (5-HT-1) alatyypin -B tai -D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), tai transfektoitu ohjaus (ei-hiljentäminen) siRNA; (5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ’) [34], [35] (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). siRNA kohdistaminen kudostransglutaminaasi (TG2) (Qiagen, Valencia, CA) käytettiin myös [35]. Solut transfektoitiin joko siRNA, että lopullinen pitoisuus on 25-50 nM: ssa 72 tuntia, käyttäen HiPerFect transfektioreagenssia (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan protokollan. Pitoisuudet siRNA: ita valittiin perustuen annos-vaste-tutkimuksissa. Ei-hiljentäminen ohjaus siRNA-transfektoituja soluja käytettiin negatiivisina kontrolleina. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin /käsitelty lisäanalyysiä ja määritykset.

Solujen elinkelpoisuus ja lisääntymistä /kasvua määritykset

elinkelpoisuuden ja /tai solujen lisääntymistä havaittiin MTS-määritystä (Promega, Madison, WI, USA) sen jälkeen, kun solut hoidon, mitata solujen kasvua. Solut laskettiin käyttäen hemosytometria ja elävät solut tunnistettiin trypaanisiniekskluusiolla. Elävät solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (1,5 x 10

3 solua /kuoppa), ja transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA: t. 72 tunnin kuluttua hoidon, liuosta, joka sisälsi MTS (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksi-metoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium) ja PMS ( fenatsiinimetosulfaattia) (20:1 v /v) lisättiin soluihin. 2-3 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, elinkelpoisia kasvavat solut arvioitiin tarkkailemalla imeytymistä tuotteen 490 nm: ssä, joka perustuu sukupolven formatsaanin avulla elävien solujen. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja tulokset ilmoitettiin keskiarvona imeytyminen ± keskihajonta.

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

PaCa solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (1,5 x 10

3 solua /kuoppa), jotka oli transfektoitu ei-vaientaminen ohjaus siRNA, tai siRNA vastaan ​​5-HT

1B tai 5-HT

1D (kerran /viikko), ja kasvatettiin 2 viikkoa. Muodostuneet-pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja pesäkkeet-alue jakelun alueilla mitattiin densitometrisesti [36]. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset on ilmoitettu keskiarvona absorption ± keskihajonta.

Matrigel invaasiomääritys

PaCa-solut transfektoitiin 50 nM ilmoitettu siRNA: t, ja 72 tuntia myöhemmin, sama määrä käsiteltyjen elinkelpoisten solujen (4 x 10

4 solut), ympättiin Matrigel päällystetty siirtoaltaat (jossa 8- um huokoskoon suodattimien) in Matrigel invaasiota kammioissa (BD Biosciences, San Jose, CA). Solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat alemman membraanin 24 tunnin kuluttua määritettiin laskemalla solut vähintään neljä satunnaisesti valituilla alueilla. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja tulokset raportoitiin keskiarvona prosenttiosuuksien invaasion ± keskihajonta.

migraatiokokeessa

In-vitro

arpeutumisprosessit määritystä käytettiin arvioida solun liikkuvuus ja kyky siirtää. PANC-1-soluja maljattiin 6-kuoppalevyille (5 x 10

5 solua /kuoppa), ja niitä viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää saavuttaa lähes konfluentin yksisolukerrokselle. Naarmu sitten varovasti tehty solukerrokselle käyttäen 10 ui steriiliä mikropipetin kärki, ja kaikki solujen roskat poistettiin pesemällä PBS: llä poistaa kelluvat soluihin. Haavoittuneet monokerrosten transfektoidaan sitten 50 nM ilmoitettu siRNA: iden. Välittömästi sen jälkeen, hoidot, solut valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa (Nikon), määrittää haavan leveyden hetkellä 0. Viljelmät jatkettiin, ja solut valokuvattiin uudelleen 12 tunnin ja 24 tunnin kuluttua haavoittamiseen solun kerros. Haavanparantamislaite visualisoitiin vertaamalla otettuja valokuvia 0 h kanssa otettu 12 tuntia ja 24 tuntia myöhemmin, ja analysoitiin etäisyyden siirtynyt jonka etureuna haavan kunakin ajankohtana. Kulkeman matkan solut määritettiin mittaamalla haavan leveys 12 h ja 24 h, ja se vähennetään haavan leveyden hetkellä 0 Saadut arvot ilmaistaan ​​sitten% muuttoliike, jossa raon leveys 0 h 100%. Kolme kokeet tehtiin kolminkertaisina.

Western blot-analyysi

Solut ympättiin 25-cm

2 viljelypulloissa (0,5 x 10

6 solua /pullo). Seuraavista käsittelyistä, solut kerättiin, sentrifugoitiin, pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja kokosolulysaateista saatiin suspendoimalla solut hajotuspuskuria 4 ° C: ssa. Lysaatit sentrifugoitiin 13000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti fraktiot kerättiin. Kokonaisproteiinipitoisuus kunkin näytteen määritettiin pesuaineen yhteensopivan proteiinin iinianalyysikitissä (Bio-Rad, Hercules, CA), ja Western-blottaus suoritettiin, kuten 40 ug proteiinia /kaista 4-15% SDS-PAGE-geelissä. Proteiinit olivat elektro-siirrettiin PVDF-kalvoille ja inkuboitiin ensin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet; p-Src (Tyr-416), Src, β1-integriini, uPAR, MMP-2, Snail, TCF8 /ZEB1, NF-KB (p-105 /p-50), ja Claudin-1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); p-FAK (Tyr-397), FAK (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ); 5-HT

1 B (Sigma Chemical, St. Louis, MO); TG2 ja α-SMA (Abcam, Cambridge, MA); Fibronektiiniä ja 5-HT

1D (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aineella (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). β-aktiini (Sigma Chemical, St. Louis, MO), tai α-β-Tubulin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) käytettiin loading valvontaa. Kaikki vasta-aineet laimennettiin TBS-Tween 20, joka sisälsi 5% kuivamaitoa. Kemiluminesenssiosoitusta suoritettiin Chemi-hehku detektioreagensseja (Alpha Innotech, San Leandro, CA), ja blotit visualisoitiin FluorChem 8900 lämpökamera, ja kvantifioidaan tiheysmittari käyttäen kuva-analyysiä ohjelman (ImageJ 1.48s kuvankäsittelyohjelmisto, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Kaikki kokeet itsenäisesti toistettiin vähintään kaksi kertaa.

Käänteisfaasi proteiinijärjestelmien (RPPA) B

siRNA-transfektoiduissa PANC-1-soluja (0,5 x 10

6 solua /2 ml media) ympättiin 6-kuoppaiselle levylle. 72 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja 150 ui lyysipuskuria [1% Triton X-100, 50 mM Hepes (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA , 100 mM NaF: ää, 10 mM Sod. pyrofosfaatti, 1 mM Na-

3Vo

4 ja 10% glyserolia, joka sisälsi proteinaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Roche Applied Science, Indianapolis)] lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solulysaatit kerättiin ja RPPA oli käsitelty kuten edellä on kuvattu [35].

RNA: n eristys ja käänteiskopioijaentsyymi-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysi

Kokonais-RNA eristettiin kerätyt solut TRIzol Reagent (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA), ja cDNA saatiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). CDNA 5-HT

1B, 5-HT

1D, β1-integriini, TG2 ja GAPDH monistettiin käyttämällä Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen /Life Technologies), ja spesifisiä alukkeita. Lyhyesti, 2 ui yhteensä 20 ui käänteistranskriboitua tuotetta käytettiin PCR 1 x PCR-puskuria, joka sisälsi 1,5 mM MgCl

2, 200 uM deoksinukleotiditrifosfaatteja (dNTP: t), 1 yksikön Platinum Taq-polymeraasia, ja 0,2 uM kunkin osoitti alukkeiden (Integrated DNA Technologies, IDT) tai GAPDH alukkeet (Thermo Scientific). Sekvenssit sense ja anti-sense-5-HT

1B-alukkeet ovat 5′-TGCTGGTTATGCTATTGGCG-3 ’; ja 5’-GATGACACAGAGGTGCAGGATG-3 ’, vastaavasti. Sekvenssit sense ja anti-sense-5-HT

1D-alukkeet ovat 5′-TGCCGTGGTCCTTTCCGTC-3 ’; ja 5’-GGTGATGGTATAGGCGATGCTG-3 ’, vastaavasti. Sekvenssit sense ja anti-sense-β1-integriinin-alukkeet ovat 5’-CCTACTTCTGCACGATGTGATG-3 ’; ja 5’-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3 ’, vastaavasti. Sekvenssit sense ja anti-sense-TG2-alukkeet ovat 5’-TAAGAGATGCTGTGGAGGAG-3 ’; ja 5’-CGAGCCCTGGTAGATAAA-3 ’, vastaavasti. CDNA Näytteitä inkuboitiin 94 ° C: ssa (2-5 min.) Denaturoimiseksi mallin ja aktivoi entsyymin. Tämä vaihe seurasi 35 sykliä PCR-monistusta (kuten 94 ° C: ssa 30 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 60 s ja 5-HT

1B aluketta; 94 ° C 30 s, 60 ° C 30 s ja 72 ° C: ssa 60 s TG2 pohjamaali; 94 ° C 30 s, 58 ° C: ssa 45 s ja 72 ° C: ssa 60 s 5-HT

1D ja β1 integriinin alukkeita, vuonna kunkin jakson). PCR-reaktio lopetettiin lopullinen laajennus vaihe 5 min. 72 ° C: ssa. Monistetut Reaktiotuotteet analysoitiin 1,2% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia. CDNA-synteesi varmistettiin havaitseminen GAPDH transkriptin, jota käytettiin sisäisenä kontrollina.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta ja tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä Studentin

t

-testi, määrittää tilastollisen merkittävyyden. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja on merkitty tähdellä.

Tulokset

5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorit ovat yli-ilmennetään haimasyövän solut

Lisääntynyt 5-hydroksitryptamiini biosynteettisen kapasiteetin sekä vakavia muutoksia ilmaisussa kuviot 5-HT-reseptoreihin, on aikaisemmin raportoitu etenemisen rintasyövän [16]. Täällä arvioimme ilmaus 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorien eri PaCa soluissa sekä normaalin ihmisen haiman kanava epiteelin (HDPE) soluja. Olemme havainneet, että nämä reseptorit säädelty kaikissa PaCa soluissa testataan, vertaamalla sen heikkoa ilmentymistä normaalissa haiman epiteelissä (kuvio. 1A), mikä viittaa siihen, että dys-sääntely näiden reseptorien voitaisiin edistää signalointi hyväksi syövän etenemisen PaCa soluissa.

(A) 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja ekspressoidaan voimakkaasti useissa haimasyövän solulinjoissa. Solulysaattien useita PaCa solulinjojen ja normaaleihin ihmisen haiman kanava epiteelin (HDPE) solut altistettiin Western blot-analyysi osoitti. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B-C) 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorien ekspressiotasoja PANC-1 (B) ja MiaPaca-2-solut (C) sen jälkeen, kun pudotus reseptorien ilmentymisen niiden vastaavien siRNA: t. Solut transfektoitiin 50 nM ilmoitettu siRNA: t, ja 72 tuntia myöhemmin, solulysaatit altistettiin Western blot-analyysi. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. Histogrammit osoittavat suhteellinen kvantifiointi osoitti proteiinien tasot. (D-E) mRNA: n ekspressio on 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorien PANC-1 (D) ja MiaPaca-2-soluissa (E) jälkeen pudotus reseptorien ilmentymisen niiden vastaavien siRNA: t. Solut transfektoitiin 50 nM ilmoitettu siRNA: t, ja 72 tuntia myöhemmin, kokonais-RNA uutettiin ja transkriptin tasot 5-HT

1B ja 5-HT

1D määritettiin standardin RT-PCR: llä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. GAPDH käytettiin latauskontrollina. (F-G) siRNA-välitteinen 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja pudotus estää PaCa solujen lisääntymistä. PANC-1 (F) ja MiaPaca-2-soluja (G) transfektoitiin 50 nM ilmoitettu siRNA: iden, ja sen jälkeen 72 h, proliferaatiota havaittiin MTS-määrityksellä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. * P 0,05 vs. kontrolli-soluja. Kaikki kokeet itsenäisesti suoritettava kolme kertaa.

knockdovvn 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreiden ilmentyminen estää leviämisen /elinkelpoisuuden PaCa solujen

jonka tarkoituksena tutkia, joka edistää näiden reseptorien leviämisen ja kasvun PaCa soluja. Kohti Tämän vuoksi meidän pudotti ilmaisua kunkin reseptorialatyypin in PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa, käyttäen erityistä Sirna (siRNA). Huolimatta koodattu kaksi erillistä geenien ihmisen 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorit ovat erityisen samanlaisia ​​järjestyksessä [21]. Näin ollen, kuten kuviossa 1 B ja C, 5-HT

1B siRNA hoitoja johti suhteellisen alhainen ilmentyminen 5-HT

1D-proteiinin taso, jossa on samanlainen alemman 5-HT

1B-proteiinin tasot indusoitiin 5-HT

1D siRNA. Tämä voi johtua siitä, että sekä 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorien alatyyppejä jakaa korkean aminohapposekvenssi-identtisyys (~68% aminohapposekvenssihomologiaa), on samanlainen ligandin sitovat ominaisuudet, ja ne ovat lähes erottamattomat farmakologisesti [37]. Tällaiset yhtäläisyydet aiheuttama vuorovaikutus kahden reseptorin tyyppiä proteiinitasolla voidaan tapahtui sen jälkeen, kun geenin ilmentymisen (esim aikana proteiinin kypsymisen tai taitto). Siksi ilmaisu- reseptorien proteiinin ilmentymistä Western-blottauksella ei ollut täysin riittävä erottamaan nämä läheisesti liittyviä reseptorialatyyppeihin perustettava omat fysiologista merkitystä. Voittamiseksi ongelman selvittääkseen biologisten vaikutusten kohdistaminen kunkin alatyypin erikseen, käytimme RT-PCR-analyysi ja tutkittiin, mikä vaikutus siRNA hoitojen transkriptiotasoja vastaavan geenin alatyyppi. Tuloksemme osoittavat selvästi, että 5-HT

1B erityinen siRNA ja 5-HT

1D erityinen siRNA vahvistettiin inhiboivan ilmentymistä vastaavan mRNA ilman mitään merkittävää vaikutusta muihin rajat analoginen alatyypin sekä PANC-1 ja MiaPaca-2 solulinjoissa (Fig. 1 D ja E). Me seuraavaksi analysoitu leviämisen jälkeen 72 h siRNA hoitoa MTS-määritys. Kuten kuviossa 1F ja G, tuloksemme osoittivat, että pudotus 5-HT

1B ja 5-HT

1D ilmentymisen merkittävästi inhiboivat sekä PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa. Yhdistetty alassäätöä Sekä 5-HT

1B ja 5-HT

1D alatyyppejä heikentää lisääntymistä yli alas-säätely joko reseptorin yksinään (kuvio S1), mikä viittaa biologiseen etuudet samanaikaisesta kohteena sekä reseptoreihin.

Targeting 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin estää solujen kyky muodostaa klooneja PaCa solujen

varmistamiseksi edelleen roolia 5-HT-1 serotonergisiin-reseptorien PaCa solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumista, arvioimme klonogeeniset kapasiteettia PaCa seuraavaa solujen knock-down 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin ilme. Tämä määritys on

in vitro

solujen selviytymistä määritys perustuu kykyyn yhden solun kasvamaan ja muotoon pesäkkeitä osaksi siirtomaa [36]. Pudotus 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja, käyttäen erityisiä siRNA: t, merkittävästi estää kyky PANC-1 ja MiaPaca-2-solujen muodostamiseksi pesäkkeitä (Fig. 2A ja B, vastaavasti). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että 5-HT

1B- ja 5-HT

1D-välitteistä signalointia mukana leviämisen ja klonogeeniset valmiutta PaCa soluja.

PANC-1 (A) ja MiaPaca-2-solut (B) transfektoitiin (kerran /viikko) ja ilmoitetun siRNA. Soluja inkuboitiin 14 päivää, pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja pesäkkeet-alueen jakelun alueilla mitattiin densitometrisesti lopussa on 14 päivää. Histogrammit osoittavat prosenttiosuudet muodostivat pesäkkeitä, kun 14 päivää ensimmäisen transfektion. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona prosenttiosuuksien pesäkkeiden muodostumisen ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 vs. kontrolli soluja.

Targeting 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja heikentää soluinvaasiota /kulkeutuminen PaCa solujen

Haiman adenokarsinooma on ominaista erittäin invasiivisia fenotyyppiä ja vahva metastaattinen kapasiteetti [38]. Koska ilmentymisen 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja on kohonnut PaCa-soluissa, olemme arvioi nämä reseptorit ovat mukana edistämään tällaisten invasiivisia fenotyypin. Siksi me pudotti nämä reseptorit PANC-1 ja MiaPaca-2-soluihin siRNA: t ja arvioitiin muutoksia niiden invasiivisia valmius

in vitro

invaasiomääritys käyttäen Matrigel päällystettyjä Boyden kammioita. Tämä määritys jäljittelee

in vivo

hyökkäyksen prosessin ja toimenpiteiden määrä syöpäsolujen läpäisee tyvikalvon matriisin kohti väliainetta, joka sisälsi kemiallis-houkuttimia [39]. Räikein havainto oli, että knockdovvn 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin vähensi hyökkäyksen PANC-1-soluissa noin 76% ja 66%, tässä järjestyksessä (Kuva. 3A), ja vähensi hyökkäys MiaPaca-2-soluissa noin 75% ja 71%, tässä järjestyksessä (Kuva. 3B). Olemme ensi tutkinut osallistumista 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin välittämisessä PANC-1 solun liikkuvuus käyttäen naarmu määritystä 12 h ja 24 h ajankohtina. Analyysi paljasti, että kulkema siirtämällä solujen väheni huomattavasti, kun solut oli transfektoitu 5-HT

1B tai 5-HT

1D-reseptoreja siRNA verrattuna soluihin alttiina ei-hiljentäminen ohjaus siRNA (Fig. 3C ). Nämä tulokset osoittavat korrelaatiota PaCa solun liikkuvien käyttäytymistä ja 5-HT

1B /1D ilme. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja osansa välittämisessä PaCa soluissa muuttoliikettä ja invaasiota.

PANC-1-solut (A) ja MiaPaca-2 solut (B) transfektoitiin 50 nM tarkoitettu siRNA: iden (72 tuntia), ja yhtä suuret lukumäärät elävät solut ympättiin Matrigel kuorrutettu TranswellTM suodattimia matrigeeliin hyökkäystä kammioissa. Lukumäärä solujen hyökkäsi 24 tunnin kuluttua määritettiin in protokollaa. Suurennus, 100 x. Histogrammit esittävät keskimääräistä prosenttiosuuksien hyökkäystä ± SD kolmesta kokeesta. * P 0,05 vs. kontrolli-soluja. (C) osallistuminen 5-HT

1B ja 5-HT

1D reseptoreihin säätelyyn PANC-1 soluliikkuvuus analysoituna haavan paranemista määrityksessä. Yksi naarmu tehtiin keskelle yhtenäinen so- yksikerroksista, ja haavoittuneita yksisolukerrokset transfektoitu ilmoitettu siRNA. Haavat korjaus tarkkailtiin 24 tuntia ja visualisoida mikroskoopilla kanssa alkuperäinen suurennos x 100. Kuvat otettiin heti (0 h), ja sen jälkeen 12 h ja 24 h raapimista kulttuureissa. Histogrammi näyttää prosenttiosuudet solujen maahanmuuton ja tiedot ilmoitetaan keskiarvona prosenttiosuuksien maahanmuuton ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Edustaa merkittävää eroa osoitti ryhmien (P 0,05).

5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorit osallistuvat säätelyyn β1-integriinin ekspressioon PaCa Cells

Todettuaan, että 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptorit yli-ilmaistu PaCa soluissa, viittaavia merkittäviä muutoksia kasvua edistävää alavirran signalointia, tutkimme seuraavaksi joitakin alavirtaan molekyylien vaikutuksia naistaintumisprosenttia näiden reseptorien. Integriiniperheen transmembraaninen reseptoreihin yhdistää soluväliaineen (ECM) ja solunsisäinen aktiinisytoskeletonille polttopisteeseen kiinnikkeistä vuorovaikutusta pistettä. Tämän lisäksi rakenteellisia rooli, integriini klusterointi voi aloittaa solunsisäisten signalointi tapahtumia, jotka edistävät solujen proliferaatiota, eloonjäämistä ja muuttoliike sekä normaali- että tuumorigeenisia solujen yhteyksissä [40]. Vuodesta integriiniperheessä, β1-alatyypin tiedetään aiheuttavan Src ja FAK toiminnan kautta rekrytointi ja aktivointi Src /FAK dual kinaasikompleksi [41]. Koska alas-säätely 5-HT

1B /1D-reseptorien estää PaCa solua muuttoliike /invaasion (Fig. 3), tutkimme, ovatko nämä reseptorit säätelemään β1 integriini. Käytimme Western blot ja RT-PCR-analyysi määrittää ilmentymisen β1-integriinin proteiinin ja mRNA-tasot, vastaavasti, sen jälkeen, kun hiljentäminen näiden reseptorien. Huomasimme, että 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja Knockdown merkittävästi indusoi alas-säätely β1-integriinin ekspressioon sekä proteiini ja mRNA tasolla sekä PANC-1 ja MiaPaca-2-solut (Fig. 4A ja B).

(A-B) vaikutus siRNA: iden välittämä 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja alas-asetuksen β1-integriini /ECM-välitteistä loppupään signalointi PANC -1 (A) ja MiaPaca-2-soluissa (B). (Ylempi paneeli) transfektoitiin 50 nM ilmoitettu siRNA: iden, ja 72 tunnin kuluttua, kokonais-RNA uutettiin ja transkriptipitoisuuksissa 5-HT

1B ja 5-HT

1D määritettiin standardin RT PCR, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. GAPDH käytettiin latauskontrollina. (Alempi paneeli) Solut transfektoitiin 50 nM ilmoitettu siRNA: t, ja 72 tunnin kuluttua, solujen lysaatit altistettiin Western blot-analyysi. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C-D) vaikutus 5-HT

1B ja 5-HT

1D-reseptoreja alassäätöä EMT prosessin PANC-1 (C) ja MiaPaca-2-solut (D).