Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Only osajoukko radikaalisti resektoitiin haiman adenokarsinooma (PDAC ) potilaat hyötyvät kemoterapiaa, ja ennustavien tekijöiden identifiointia on perusteltua. Äskettäin miRNA nousseet diagnostisia biomarkkereita ja innovatiivinen terapeuttisina kohteina, kun taas suuren suoritustehon paneelit avaavat uusia mahdollisuuksia arvioida, voivatko ne ennustaa kliininen tulos. Tässä tutkimuksessa arvioitiin, onko kattavan miRNA ilmaisun profilointi korreloi yleistä (OS) in resektoidun PDAC potilailla.

Menetelmät /Principal Havainnot

korkean resoluution miRNA profiilit saatiin Toray n

3D-Gene

™ -miRNA-siru, havaitsemiseen yli 1200 ihmisen miRNA. RNA onnistuneesti eristettiin parafinoidut ensisijainen kasvaimia 19 ulos 26 vaiheen-pT3N1 homogeenisesti saaneilla potilailla (adjuvantti gemsitabiini 1000 mg /m

2 /vrk, päivää-1/8/15, joka 28 päivää), huolella valittu mukaan niiden tuloksista (OS 12 (N = 13) vs. OS 30 kuukautta (N = 6), eli lyhyen /pitkän OS). Erittäin tiukat tilastot t-testiä, etäisyys matriisi Spearmanin-sijoittui korrelaatio, ja iteratiivinen lähestymistapoja. Valvomatta hierarkkinen analyysi paljasti, että PDACs ryhmitelty niiden lyhyen /pitkän OS luokitus, kun ominaisuus valinta-algoritmi KEVENNYS tunnistettu alkuun 4 erotteleva miRNA näiden kahden ryhmän välillä. Nämä miRNA kohdentaa yli 1500 selostukset, mukaan lukien 169 kohteena kaksi tai enemmän. MiR-211 tullut paras erotteleva miRNA, huomattavasti korkeampi ilme pitkä- vs. lyhyen OS potilaille. Ilmaisu Tämän miRNA myöhemmin kvantitatiivisen PCR riippumattomalla kohortin laser-mikropaloitelluista PDACs 60 resektoitiin saaneilla potilailla samaa gemsitabiinin hoito. Potilaat, joilla on alhainen miR-211 ilmaisun mukaan mediaaniarvon oli huomattavasti lyhyempi mediaani (14,8, 95% CI = 13,1-16,5, vs. 25,7 kuukautta, 95% CI = 16,2-35,1, log-rank-P = 0,004). Monimuuttuja-analyysi osoitti, että matalan miR-211 ilmentyminen oli riippumaton tekijä huonoon ennusteeseen (riskisuhde 2,3, P = 0,03) säätämisen jälkeen kaikkien vaikuttavia tekijöitä tuloksen.

Johtopäätökset /merkitys

Through kattavaa mikrosiruanalyysi ja PCR validointi tunnistimme miR-211 kuin ennustetekijä resekoituun PDAC. Nämä tulokset nopea määritetään lisää mahdollisia tutkimus- ja kehitystyötä biologisen roolin miR-211 PDAC.

Citation: Giovannetti E, van der Velde A, Funel N, Vasile E, Perrone V, Leon LG, et al. (2012) suuren tuotantotehon MicroRNA (miRNA) Arrays purkaa Prognostic rooli MiR-211 Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (11): e49145. doi: 10,1371 /journal.pone.0049145

Editor: Nathan A. Ellis, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2012 Hyväksytty: 04 lokakuu 2012; Julkaistu: 14 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Giovannetti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. Tämä työ oli osittain tukevat avustuksia Alankomaat Organization for Scientific Research, Veni avustus (hanke numero 91611046 (Elisa Giovannetti)) ja Stimuleringfonds Open Access (Elisa Giovannetti), CCA-VICI Foundation avustus (Elisa Giovannetti, Amir Avan, Godefri- J Peters) , AIRC Marie Curie International Fellowship (Elisa Giovannetti), ja Italian ministeri Research, PRIN-2009 (Elisa Giovannetti, Niccola Funel, Ugo Boggi). Toray Industries, Inc. on rahoittaja johtuu työllisyyden Hiroko Sudo, joka antoi teknistä tukea toteuttamaan tämän projektin, mutta ei olla rooli tutkimuksen suunnittelussa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. Tässä tutkimuksessa kirjoittajat käyttävät tuotteet Toray Industries, Inc., 3D-GeneTM ”varten miRNA mikrosiru, mutta tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

5 vuoden pysyvyys on alle 5%, haiman adenokarsinooma (PDAC), mukaan lukien yli 90% haiman syövät, on kaikkein vaarallisin tärkeimpiä kiinteitä kasvaimia [1]. Viime vuosina on tapahtunut merkittävää edistystä ymmärrystä molekyylibiologian haimasyövän, sekä diagnosoinnissa ja lavastus. Kuitenkin minimaalinen edistystä on saavutettu ehkäisyssä, varhaisen diagnoosin, hoidon ja tulokset [2].

Kirurginen resektio on ainoa parantava liikennemuotojen varten PDAC, mutta vain 15-20% potilaista on kokoisen sairaus tuolloin diagnoosin. Kuitenkin, ennuste potilaiden jälkeen täydellisen resektio on huono, 3-vuoden tautivapaan elinajan (DFS) nopeus 27% (95% luottamusväli (CI): 23-32%) ja mediaani kokonaiselinaika (OS) 15 -19 kuukautta [3].

Only osajoukko radikaalisti resektoitiin PDAC potilaat hyötyvät kemoterapiaa, ja adjuvanttia hoidot voivat olla merkittäviä toksisuuksia [4]. Siksi uusien biomarkkereiden herkkyys adjuvanttihoito kiireellisesti oikeutettuja sen yksilöllisiä hoitoa ja parantaa hoitotulokseen [5].

Laajat tutkimukset ovat ominaista monimutkaisia ​​geneettisiä verkostoja ja transkriptomiikka muutoksia taustalla kehittymistä ja etenemistä PDAC [6]. Äskettäinen löytyminen MikroRNA (miRNA) on tarjonnut uusia oivalluksia mahdollisesti selittää, joka vallitsee kasvaimen genotyypin ja fenotyypin.

Mirna ovat luokan pieniä ei-koodaavan evoluutiossa säilytetyn RNA: t [19] – [23 nukleotidin] jotka on löydetty eläinten ja kasvien soluissa. Kuten tänään, 1921 ainutlaatuinen ihmisen kypsän miRNA on lueteltu miRBase tietokannassa (Release 18, marraskuu 2011) [7]. MicroRNA geenit transkriptoidaan kuten ei-koodaava transkriptien, ja käsitellään läpi sarjan peräkkäisiä vaiheita, joihin liittyy RNaasi III entsyymejä, Drosha ja Dicer. Jalostetut MikroRNA lopulta sisällytetään RNA-indusoidun hiljentäminen kompleksi (RISC) johtaa tämän kompleksin alas-säädellä geeniekspressiota sitoutumisen kautta 3’UTR kohde-mRNA: iden. Kasvien ja jotkut eläinten miRNA muodostavat täydellisen emäsparia-arvon mRNA: iden, jolloin niiden hajoamista. Kuitenkin suurin osa ihmisen miRNA sitoutuvat tavoitteensa 3’UTRs epätäydellisiä täydentävät ja siksi aiheuttaa translaation tukahduttaminen [8].

Keskeinen sääntelyn rooli kunkin miRNA kontrolloinnissa ilmentyminen useiden geenitranskriptien tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden tunnistaa kriittisiä miRNA informatiivinen biomarkkereita toteamisen, diagnosoinnin ja ennusteen kasvaimia, jotka johtuvat sääntelyn useiden geenien [9]. Tämä taustalla oleva biologinen mekanismi on todennäköisesti syy, miksi ekspressiomalleja 217 miRNA havaittiin luokitella syöpätyyppejä tarkemmin kuin tiedot perustuvat ilmentymisen profiili ~16000 mRNA: iden [10].

rooli miRNA että ohjaus proliferaation /erilaistumisen ja apoptoosin, ja niiden poikkeava ekspressio monissa kasvaimissa, ilmoittivat, että he voivat toimia tuumorisuppressorien ja onkogeenit, mikä viittaa niiden käyttöä diagnostisia ja terapeuttisia tarkoituksia varten. Lisäksi valitut miRNA voivat vaikuttaa kasvain pahanlaatuinen käyttäytymiseen ja vastaus kemoterapiaa [11].

Aiemmat tutkimukset keskittyvät miR-21 osoitti, että sekä Kaukasian ja Aasian potilaiden kätkeminen korkea ilmaus tästä miRNA niiden PDAC yksilöitä oli huomattavasti lyhyempi selviytyminen [12], [13]. Tämä miRNA on kutsutaan ”oncomir” (eli miRNA onkogeenisella ominaisuudet), koska se on lähes läsnä kaikkialla ja yli-ilmentyy ihmisen kasvaimissa. Viimeaikaiset

in vivo

tutkimukset miR-21 yliekspressoivassa hiirimallissa perustetun Cre /Tet-off teknologioiden osoittanut onkogeeniset rooli, joka osoittaa sen merkittävää vaikutusta kasvaimen aloittamisesta, ylläpito, selviytyminen ja hyökkäys [14].

kuitenkin, suuren suoritustehon teknologiset innovaatiot havaitsemaan satoja MikroRNA tarjoavat uusia tehokkaita tapoja purkaa myös muiden keskeisten miRNA säädellään useita geenejä, jotka saattavat selittää, miksi samanlaisten potilaiden kliinis ominaisuudet voivat olla huomattavaa vaihtelua kliinisiä tuloksia. Siksi esillä olevassa tutkimuksessa arvioitiin, onko kattavan miRNA ilmaisun profilointi käyttäen miRNA siru havaitsee yli 1200 eri ihmisen miRNA, voidaan erottaa PDAC potilaalla on hyvin lyhyt OS verrattuna pitkäaikaiseen eloonjääneitä.

erityisesti olemme huolella valittu 26 PDAC potilaalla on homogeeninen kliinis ominaisuudet, joille tehtiin resektoimalla parantava tahallisesti ja käsiteltiin kolme sykliä standardi gemsitabiinin adjuvanttia kuuri. Puolet näistä potilaista oli synkkä ennuste, kuolee 1 vuoden kuluessa diagnoosin, kun taas muut 13 eloonjäämistä enemmän kuin 30 kuukautta. Mirna mikrosiruanalyysi suoritettiin 19 näytteiden läpäissyt RNA laatukriteeri, joista 13 potilasta lyhyen selviytymisen ja 6 potilaalla on pitkä selviytymisen. Koska miR-211 ilmentymistilanne nousi eniten ennakoiva biomarkkeri hoitotuloksia näille potilaille, analysoida tarkemmin miR-211 ilmentyminen suoritettiin toisessa kohortissa 60 potilasta, kaikki hoidettu samalla adjuvanttihoitona. Tämä riippumaton joukko vahvisti merkittävän yhdistys miR-211 ilmentymistilanne sekä käyttöjärjestelmän ja DFS.

Methods

Potilaat

Potilaat, joille tehtiin radikaali kirurginen resektio kanssa parantava tahallisuus (pancreatico -duodenectomy yhteensä pancreatectomy ja distaalinen pancreatectomy) laitoksella General Surgery ja Transplant yliopistosairaalassa Pisa (Pisa, Italia), vuosien 2000 ja 2010 jälkikäteen tarkistetaan käyttämällä sähköisiä potilastietoja. Niistä korkean resoluution miRNA ilmentymisen profilointi valitsimme 26 samanlaisten potilaiden patologisia löydöksiä, kliinisiä piirteitä, ja hoito mutta huomattavaa vaihtelua kliinisiä tuloksia. Erityisesti puolet näistä potilaista oli erittäin huono ennuste, kuolee 1 vuoden sisällä diagnoosin ja luokiteltiin ”short-OS”, kun taas muut 13 eloonjäämistä yli 30 kuukautta, ja luokiteltiin ”pitkän OS”. Ominaisuudet nämä 2 ryhmää on esitetty taulukossa 1.

validointi kohortti koostui muista 60 radikaalisti resektoitiin PDAC potilaista diagnosoidaan ja hoidetaan samana aikana, niiden ominaisuudet kuvataan myös taulukossa 1 . Kaikki nämä potilaat saivat gemsitabiinia-pohjainen hoitona, kuten aiemmin on kuvattu [15].

Ethics

Kaikki potilaat antoivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen näytteen keräämiseen ja analysointiin ja tutkimus on sai hyväksynnän eettisen komitean Pisan yliopistollisen sairaalan kuin seurantatutkimus tutkimuksen protokollan nimeltä ”farmakogenetiikan gemsitabiinin liittyvien geenien haimasyöpä: korrelaatio kliinisten tutkimusten tulosten kanssa ja siedettävyys” [15]. Vastuussa tutkijat varmistaa, että tämä tutkimus tehtiin mukaan Helsingin julistuksen, Euroopan suuntaviivat Good Clinical Practice, sekä asianomaisten kansallisten ja alueellisten viranomaisten vaatimusten.

Kudokset

Formaliini Kiinteät parafiiniin ( FFPE) leikkeitä tarkasti läpi diagnosointiin ja kasvaimen sisältöä. Koska pitkä kokemus meidän patologian laboratorion suuret ikäluokat radikaalisti resektoitiin PDAC potilailla, ei ollut vaikeuksia valittaessa alueilla morfologista määritelty syöpäsoluja [16]. Kasvaimet luokiteltiin ja arvioitiin kasvaimen lavastus ja luokittelu ehdottama WHO, kuten esitetty taulukossa 1.

RNA uuttamalla FFPE liukuu

histologinen kohdissa (10 pm) valmistettiin kustakin FFPE yksilö. Parafiini poistettiin ksyleenillä käsittely ja kudokset pestiin etanolilla kahdesti ksyleenin poistamiseksi. Kudokset käsiteltiin sitten proteinaasi K: lla 37 ° C: ssa yön yli. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti käsiteltiin silika–spin-pylvääseen (New Frontiers Research Laboratories, Toray Industries Inc., Kanagawa, Japani), jotta saadaan puhdistetun kokonais-RNA: ta. Astetta RNA silloittumisen ja RNA: n hajoamisen analysoitiin elektroforeesilla käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Näytteet, jotka osoittivat että suurin osa RNA: iden at 4000 nukleotidin johtuen silloittumisen, tai suurin osa RNA: iden osoitteessa 1,000 nukleotidin johtuen hajoamisen elektroforeesikuvioiden olivat sopimattomia miRNA arviointiin ja näin ei ole käytetty. Niistä 26 tutkittiin näytteitä, 19 näytettä kulunut tämän kriteerin ja käytettiin miRNA profilointiin.

60 näytettä käyttää itsenäisenä validointi asettaa, keskiarvo 5000 neoplastiset solut leikattiin käyttämällä Leica LMD6500 väline (Leica, Wetzlar, Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Tarkkuus kapea painopiste lasersäteen johti pyydystäminen yksittäisten solujen suurella tarkkuudella (kuva S1). RNA onnistui eristettiin käyttäen RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA saannot ja puhtaus tarkastettiin 260 ja 280 nm: NanoDrop®-1000 Detector (NanoDrop-Technologies, Wilmington, USA).

Mirna profilointi

Hyödynsimme Toray: n 3D-Gene ™ (Toray Industries, Japani) ihmisen microRNA siruja miRNA ilmentymisen profilointiin. Uusittavuus ja vertailukelpoisuuden Taqman RT-PCR, ja koemenettelyt Toray n microarray, kuvattiin aiemmin [18], [19]. Lyhyesti, 500 ng kokonais-RNA: sta FFPE osassa analysoitiin miRNA profilointiin käyttäen microarray, 3D-Gene® miRNA oligo siru V.16 (Toray Industries), mukaisesti valmistajan protokollan vE1.10. Määrä asennettu miRNA tämän microarray on 1212 yhteensä. Microarray skannattiin ja saadut kuvat oli numeroitu käyttäen 3D-Gene® skanneri 3000 (Toray Industries). Ilmaisu taso kunkin miRNA oli maailmanlaajuisesti normalisoitiin käyttäen tausta-vähennetyn signaalin voimakkuus koko miRNA kussakin microarray (Kuvaus S1).

Kaikki microarray Tutkimuksen tuloksien ovat yhtä mieltä Minimi tietoa Microarray Experiment (MIAME) ja julkisesti saatavilla NCBI: n Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) alle sarjan ennätys GSE38781.

Overall klustereiden

tutkia eroja ekspressiokuvioiden kahden ryhmän välillä näytteitä, valitsimme miRNA joka osoitti merkittävää eroa ilmentymisessä. T-testi suoritettiin pitkän OS ja lyhyen OS ryhmien kaikille miRNA ja ne, jotka eivät näytä olevan merkittävästi erilainen (p 0,05) on suodatettu pois. Hierarkkinen valvomaton klusterin analyysi suoritettiin jäljellä 170 miRNA. Kaksisuuntainen Spearmanin sijoittui korrelaatio käytettiin tuottamaan etäisyyden matriisi. Myöhemmin etäisyyttä matriisi tuotettiin klusterit sekä miRNA ja näytteitä hierarkkinen klusterointialgoritmi, joka perustuu keskimäärin sidos [20] – [21].

Analyysi helpottuneena ja iteratiivisen KEVENNYS

ominaisuus valinta-algoritmi, KEVENNYS [22] – [24], käytettiin sen täydelliset tiedot asetettu, jotta löytää kaikkein vaativimmillekin miRNA. Helpotus on iteratiivinen algoritmi, joka määrittää painot ominaisuuksiin (eli miRNA ilmaus arvot) mukaan etäisyydet ominaisuuksia sisällä ja ryhmien välillä. Out of 1212 Mirs, 703 Mirs joka on enintään yksi puuttuva arvo yli kaikki näytteet valittiin. Helpotus algoritmia sovellettiin, jotta voidaan valita top 10 korkein punnitus miRNA. Kun seuraava analyysi me syntyy 100 satunnaisesti sarjaa 6 ulos 13 näytettä luokiteltu lyhyt. Jokaisena satunnainen joukko näytteitä, yhdistettynä 6 näytettä luokiteltu kauan helpotus algoritmia sovellettiin valita top 10 korkein punnitus Mirs. Kaikkien miRNA esiintyvät top 10 pistemäärä oli pidetty ja top 10 näkymisen miRNA valittiin.

Top miRNA kohdegeenien

Haku suoritettiin ennustettu tavoitteet kaikkein vaativimmillekin miRNA tunnistettu tutkimuksessamme käyttämällä

TargetScan

verkkokäyttöliittymässä v.6.1 (https://www.targetscan.org/) ja miRDB versio 4.0 (https://mirdb.org/miRDB/index.html) . Seuraavat vertailu kaikkien tietokokonaisuuksien, osajoukko geenejä, jotka oli suunnattu enemmän kuin yhden miRNA syntyi.

Käänteinen transkriptio (RT) ja kvantitatiivinen-PCR-analyysi miR-211 ja miR-4321

voidakseen vahvistaa havainnot mikrosiruanalyysi, arvioimme ilmaus kaikkein vaativimmillekin miRNA, miR-211, sekä harvoin tutkittu miR-4321 riippumattomalla kohortin PDAC potilaista. RNA: ta (10-100 ng), tehtiin käänteistranskriptio, ja tuloksena cDNA monistettiin käyttäen erityistä mukautetun TaqMan®-MicroRNA-määrityksissä (Applied Biosystems) ja miR-211 ja miR-4321. Suoritimme alustavan analyysin 3 endogeenisen valvonnan (RNU1, RNU6 ja RNU43) sarjassa 10 PDAC soluja. Koska arvot RNU6 olivat lähinnä geometrinen keskiarvot näistä geeneistä, käytimme tätä taloudenhoito normalisoimiseksi kaikkien seuraavan analyysin. PCR-reaktiot suoritettiin 7500HT järjestyksessä tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems), mukaisesti valmistajan ohjeita. Näytteet monistettiin kahtena kanssa sopivaa ei-templaattikontrollien. Monistusdatan normalisoitiin RNU6 ilmentymisen. Kvantifiointi suhteellinen ekspressio (ilmoitettu mielivaltaisina yksikköinä [A.U.]) suoritettiin käyttäen ACt menetelmää. Kvantitatiivinen PCR data osoitti vaihtelua kerrointa Ct aina pienempi kuin 2% keskiarvoista.

Korrelaatio miR-211 ja miR-4321 kanssa lopputulokseen

Comparison kliinisten tietojen ja miRNA ekspressiotasot tehtiin käyttämällä Pearsonin χ

2 testi ja Wilcoxonin testi. Suhde miRNA ilmaisun ja tuloksen arvioitiin kerrostetaan potilaiden suhteen mediaani lauseke arvo (korkea verrattuna matala ilme). Analyysit Näytteiden tehtiin sokkona suhteessa kliiniseen tulokseen.

OS laskettiin alkaen leikkaus kuolinpäivästä, DFS määriteltiin aika alkaen leikkauksen päivämäärä ensimmäisen uusiutumisen tai kuoleman. Survival konstruoitiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä, ja erot analysoitiin käyttäen log-rank-testi. Merkittävä prognostisia muuttujat OS ja DFS yhden muuttujan analyysiin, jotka sisältyivät monimuuttuja analyysit käyttämällä Coxin suhteellisten riskien mallia.

Suhde miR-211 ilmaisun ja tulos arvioitiin myös avulla valvomattoman klusterointialgoritmi k- tarkoittaa. Tämä algoritmi osioita datapistettä osaksi k ryhmiin iteratiivinen tavalla, annetaan ennalta määrätty määrä klustereita k (k = 2, maksimi toistojen = 1000).

Pearson χ

2 testiä, Wilcoxonin testi Kaplan-Meier käyrät, log-rank-testi ja monimuuttuja-analyysissä tiedot analysoitiin käyttämällä

SPSS V.17

tilasto-ohjelmalla (SPSS, Inc., Chicago, IL), kun taas kaikki muut laskennalliset analyysit tehtiin

R

(

R v.2.10.1

, paketteja: tilastot, dprep). Lisätietoja menetelmistä ja tilastot annetaan Supplemental tiedot.

In vitro

tutkimuksissa

Ihmisen PDAC solulinjat AsPc-1, Capan-1, CFPAC-1 , HPAC, HPAF-II, MIA PaCa-2, PANC-1, PL45, ja Su86.86 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), kun taas viisi primääriset soluviljelmät (LPc006, LPc028, LPc033, LPc067, ja LPc111) eristettiin potilaiden yliopistollisen sairaalan Pisa (Pisa, Italia), kuten aiemmin on kuvattu (17). Soluja viljeltiin RPMI-1640-media, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ja 1% penisilliini (50 IU /ml) ja streptomysiiniä (50 ug /ml) (Gibco, Gaithersburg, MD). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä 5% CO

2 75 cm

2 kudosviljelypulloon (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Saksa) ja talteen trypsiinillä-EDTA niiden eksponentiaalisesti kasvuvaiheessa . RNA uutettiin käyttäen Trizol-kloroformi-protokollan (Sigma, St. Louis, MO). RNA saannot ja puhtaus tarkistettiin mittaamalla optinen tiheys 260/280 nm Nanodrop® spektrofotometrillä. Pohjapinta ilmentyminen miR-211 arvioitiin qRT-PCR: llä, kuten edellä on kuvattu PDAC kudoksia. Monistusdatan normalisoitiin RNU6 ilmaisun, ja kvantifiointi suhteellinen ekspressio suoritettiin käyttämällä ACt menetelmää.

vaikutus miR-211 on kemosensitiivisyys arvioitiin MIA PaCa-2, ja LPc028 soluja, transfektoimalla nämä solut jossa esiaste ja antisense-oligonukleotidien (pre-miR-211 ja anti-miR-211) ostettiin Ambion-Applied Biosystems (pitoisuus ID, MC10168 ja MH10168, vastaavasti) 30 nM lopullinen pitoisuus. Solut maljattiin 5000 solua /kuoppa 200 ul: ssa RPMI, jossa on 10% FBS: ää ja 1% antibiooteilla. 24 tunnin kuluttua solut altistettiin 0,9 ui Oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) seerumittomassa väliaineessa, sekoitettiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 0,3 ui 6,25 uM miR-211 esiaste tai inhibiittori. Soluja inkuboitiin myös miRNA negatiiviset kontrollit (Ambion). Yön yli altistuksen väliaine poistettiin kuopista ja korvattiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää, ilman antibiootteja. Sitten solujen annettiin kasvaa vielä 48 tuntia lääkkeen väliaineessa tai käsiteltiin 1 uM gemsitabiinin, kuten edellä on kuvattu. Lisäohjaus kaivoja käytettiin RNA: n eristykseen, arvioida transfektiotehokkuuden.

Lopuksi alustavassa toiminnallisia analyysejä mahdollisia kohteita miR-211 ennustaa

TargetScan

, valitsimme ribonukleotidireduktaasia alayksikköä 2 (RRM2), joka on tärkeä solun kohde gemsitabiinin [25]. Näin ollen suoritimme RT-PCR-analyysi ekspression RRM2 transfektoiduissa soluissa ennalta miR-211 ja anti-miR-211, kuten edellä on kuvattu. Nämä PCR-reaktiot suoritettiin alukkeilla ja koettimella päässä Applied Biosystems Assay-on-Demand geeniekspressiotuotteen Hs0035724, käyttäen aikaisemmin validoitu menetelmä [15]. Monistukset normalisoitiin GAPDH, ja geeni-ilmentymisen kvantitaation suoritettiin käyttäen ΔΔCT laskelma, jossa CT on kynnys aikana; määrä kohdegeenin normalisoituivat GAPDH ja suhteessa kalibraattori (käsittelemätön kontrolli solut), annetaan 2

-ΔΔCT. Näytteet monistettiin kolmena kappaleena kanssa sopivaa ei-templaattikontrollien, ja variaatiokerroin oli 1% kaikkien rinnakkaisnäytteiden.

Tulokset

Ominaisuudet potilaista

Table 1 tiivistetään kliinis ominaisuudet kaikkien PDAC potilaat arvioitiin tässä tutkimuksessa. Useimmat potilaat olivat vaiheessa-T3 grade-2 kasvaimet, joilla on positiivinen imusolmukkeet, ja hermoa invaasio.

miRNA mikrosiruanalyysi suoritettiin 19 näytteiden läpäissyt RNA laatukriteeri. Nämä potilaat mukana 13 potilasta, joilla OS lyhyempiä kuin 1 vuosi (mediaani, 8,0, 95% CI, 5,4-10,6) ja 6 potilasta, jotka jäivät henkiin enemmän kuin 30 kuukautta (mediaani, 31,0, 95% CI, 30,6-31,4). Kaplan-Meier-käyrät näistä ryhmistä raportoidaan kuvassa S2.

Toinen ryhmä 60 potilasta käytettiin validointi kohortin, jossa mediaani ja DFS 20,9 ja 11,9 kuukautta, vastaavasti (kuva S3 että Kaplan-Meier alat). Tapahtuma-oli 66,7%, ja mediaani seuranta-ajan elossa olevien potilaiden oli 21,4 kuukautta. Tässä kohortissa OS oli merkitsevästi pidempi (p = 0,009) potilailla, kätkeminen grade 1/2 kasvaimet (mediaani, 25,2, 95% CI, 14,7-35,7) kuin potilailla, joilla oli asteen 3 PDACs (mediaani, 14,8, 95% CI, 11,3-18,3) tiedot tulosten mukaan potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa S1.

Mirna mikrosiruanalyysi: yleinen klustereiden

Kun analyyttisten menettelyjen normalisoitumista raakadataa mikrosirulla analyysi (kuvataan Kuvaus S1) teimme t-testiä analyysi, joka johti lista 170 miRNA, jotka osoittavat merkittäviä eroja ilmaisu kahden ryhmän välillä (p 0,05) (taulukko S2). Toimiminen hierarkkista klusterianalyysin me myöhemmin rakennettu etäisyyden matriisi käyttäen kaksisuuntaisia ​​Spearman korrelaatio testi, johtuen ei-normaali jakauma ilmaisun sisällä näytteitä. Tämä klusterin analyysi osoitti hyvää toisistaan ​​kaksi ryhmää näytteiden (short-OS vs. pitkän OS), joka perustuu merkittävästi eri miRNA (kuva 1).

Jotta suorittamiseksi hierarkkista ryhmäanalyysi rakensimme etäisyyden matriisi käyttäen kaksisuuntaisia ​​Spearman korrelaatio testi, johtuen ei-normaali jakauma ilmaisun sisällä näytteitä. Klusterin analyysi osoittaa hyvää toisistaan ​​kaksi ryhmää näytteiden perusteella merkittävästi eri miRNA. MicroRNA ekspressiotietojen keskittyivät 2 suuntaan (so mukaan miRNA ja potilaat). Punainen ja keltainen ovat matalia ja korkeita miRNA ilme, vastaavasti.

Mirna mikrosiruanalyysi: RELIEF ja iteratiivinen KEVENNYS

helpotus algoritmia käytettiin sen kokonaisen tietoaineiston,, kuten on kuvattu vuonna menetelmiä. Tämä algoritmi osoitettu tulokset jokaiselle miRNA mukaan, miten hyvin se syrjittyjen kahteen ryhmään näytteiden (esim näytteitä lyhyen OS

verrattuna

näytteitä pitkän OS potilasta). Tämä johti 10 parhaan kaikkein vaativimmillekin miRNA. Kuvassa S3 esittää ryhmäanalyysi perustuu näihin 10 miRNA, kun taas taulukossa 2 esitetään tämä ryhmä top 10 miRNA sekä niille määritellyt tulokset.

Kun tarkkailemalla miten pisteet jaettiin (kuva S4), valitsimme neljä ensimmäistä (miR-211, miR-4321, miR-1207-3p ja miR-326) joukossa tämä top 10 ja suorittaa klusterin analyysi.

Kuten esitetään kuviossa 2, tämä top 4 miRNA selvästi erottivat potilasryhmissä. Lukuun ottamatta yhdessä tapauksessa (S2), joka osoitti erittäin korkea ekspressio arvot kaikille tutkittu miRNA, kaksi pääryhmään x-akselilla vastaavat kahteen ryhmään (lyhyt /pitkä-OS). Erityisesti, koska värit heatmap osoittivat suhteellista ilmentymistä miRNA kaikissa näytteissä, havaitsimme kaksi ilmentymisen profiilit, se, jonka ilmentyminen oli pienempi potilailla, joilla on lyhyen OS (Mir-211, miR -1207-3p, miR-326) ja sellainen, jossa rakenteessa oli päinvastainen (mir-4321). Kääntäen, joilla on pitkään OS oli korkeammat ilmaus arvoja miR-211, miR-1207-3p, miR-326, ja alemman ilme arvot miR-4321.

Värit ovat normalisoituneet ja voidaan verrata vasemmalta oikealle.

sen vahvistamiseksi eniten erotteleva miRNA suoritimme ylimääräisen analyysin avulla iteratiivista helpotusta. Kuten havaitaan taulukosta S3, top 10 Mirs olivat samat, paitsi miR-1200 ja miR-766, joka korvasi miR-197 ja miR-1296. Kuitenkin sijoitusta iteratiivisen KEVENNYS tulokset osoittivat selkeämpi jako ylä- 4 ja pohjan 6 eniten erotteleva miRNA (kuva S6). Näin osoitimme, että top 4 miRNA ei painottuvat mitään erityistä näyte. Kuten raportoitu taulukossa 2, miRNA joka ilmestyi alkuun 4 käyttäen KEVENNYS lähestymistapaa esiintyi myös alkuun 4. iteratiivinen RELIEF analyysi viittaa siihen, että ilmaisun profiilia nämä 4 miRNA voidaan luotettavasti erottaa toisistaan ​​potilaat, joilla lyhyen OS ja joilla on pitkään OS.

Target ennuste alkuun miRNA ehdokkaat

identiteetti, kromosomaalinen sijainti ja lukumäärä kohdegeenien miRNA ehdokkaiden tunnistettu tutkimuksessamme on yhteenveto taulukossa 3. päästääkseen oivalluksia biologiseen reittejä potentiaalisesti säätelevät miRNA, me seuraavaksi suoritetaan kattavan vertailun ennustetun kohdegeenien meidän top 4 miRNA ehdokasta mukaan

TargetScan

ja

miRDB

. Tärkeää on, että

TargetScan

ennusteen noin 10% näistä geeneistä ennustettiin, joihin kohdistetaan 2 miRNA, jossa 13 geenien kohdistettu kolme miRNA ja yksi geeni kohteena kaikissa neljässä eri miRNA (taulukko S4).

analyysi ennustetekijöiden roolin miR-211 ja miR-4321 riippumattomalla kohortin PDAC potilaiden

RT-PCR-analyysi miR-211 ilmentymistä 60 itsenäistä PDAC näytteitä käytettiin validoida ennustetekijöiden merkitystä tämän miRNA. Tämä validointi ryhmä ei eronnut merkitsevästi kannalta kliinis ominaisuuksia verrattuna alkuperäiseen kohortin potilaista (taulukko 1).

ilmentyminen miR-211 oli havaittavissa kaikissa näissä näytteissä, ja potilaat alun perin luokiteltava mediaani ilmentyminen arvo miR-211 (12,8 au), mukaan Gaussin jakauma ilmaisun arvoja, kuten on kuvattu kuviossa S7.

Yllättäen miR-211 ilmentyminen vaihteli merkitsevästi luokka 1/2 ( N = 30) ja 3. asteen (N = 30) kasvaimia (P = 0,006 Wilcoxonin-rank-sum-testi). Sitä vastoin mitään eroa ei havaittu miR-21 ekspressiotasot mukaan muita kliinis parametrit (taulukko S5).

Vahva korrelaatio miR-211 ilmentymistilanne ja kliinisten tulosten osoitettiin. Korkea miR-211 ilmaisu ryhmä oli parempi ennuste kuin alhaisen ilmentymisen ryhmässä. Potilaat, joilla miR-211 lauseke alle mediaani (low miR-211) oli huomattavasti lyhyempi mediaani (14,8 kuukautta, 95% CI, 13,1-16,5 kuukautta) verrattuna potilaisiin, joiden miR-211 ilmaisu korkeampi kuin mediaani (mediaani OS, 25,7 kuukautta , 95% CI, 16,2-+35,6kuukausi, HR = 3,0, 95% CI, 2,1-8,9, P 0,001). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin DFS käyrät potilailla, joilla on miR-211 ilmentyminen edellä mediaani mediaani DFS 16,7, verrattuna 9,3 kuukautta potilailla, joilla on alhaisin miR-211 ilmentymisen (P = 0,004). OS ja DFS Kaplan-Meier-käyrät on esitetty kuvioissa 3A-B.

vastoin ilmaus miR-4231 ei korreloi tulokseen samalla kohortin potilaista (kuvio S8). Potilaat, joilla miR-4231 ilmaisun alle mediaani oli vain suuntaus kohti merkittävästi pidempi mediaani verrattuna potilaisiin, joiden miR-4231 ilmaisun yläpuolella mediaani (25,8 kuukautta, 95% CI, +18,2-+32,3kuukausi, vs. 16,7 kuukautta, 95% CI, 13,7-19,7kuukautta, P = 0,194). Vastaavasti, ei ole merkittäviä eroja havaittiin mediaanin DFS (13,0 kuukautta, 95% CI, +8,4-17,6kuukausi, vs. 10,0 kuukautta, 95% CI, 2,0-17,9 kuukautta, P = 0,581).

Kuitenkin, ottaen huomioon, että siellä oli hyvä korrelaatio ekspression miR-211 ja OS, kuten on esitetty kuviossa S8 (r = 0,724), olemme edelleen analysoineet miR-211 ilmentymisen dataa K-means klusterointi (k = 2). Kukin 60 näytettä siirrettiin yhteen kahdesta klustereiden (kuvio S9), joita verrattiin Kaplan-Meier -käyrät OS ja DFS. Nämä analyysit osoittivat merkittävää eroa (kuviot 3C-D).