Krooninen sairaus

tiivistelmä

α-tomatiini, tomaattia glykoalkaloidit, on raportoitu omaavan antibiootti ominaisuuksia ihmisen taudinaiheuttajia. Kuitenkin mekanismi sen kanteen leukemiaa jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa terapeuttista potentiaalia α-tomatiini vastaan ​​leukemiasoluja arvioitiin

in vitro

ja

in vivo

. Solujen elinkelpoisuus kokeet osoittivat, että α-tomatiini oli merkittäviä sytotoksisia vaikutuksia ihmisen leukemia syöpäsolulinjoissa HL60 ja K562, ja solujen havaittiin olevan anneksiini V-positiivisia /propidiumjodidia-negatiivinen vaihe solukuoleman. Lisäksi α-tomatiini aiheuttama sekä HL60 ja K562-solujen apoptoosin solussa cycle- ja kaspaasi-riippumattomalla tavalla. α-tomatiini altistuminen johti menetykseen mitochrondrial kalvon potentiaalia, ja tämä havainto oli sopusoinnussa havaittu aktivointi Bak ja Mcl-1 lyhyt muoto (Mcl-1s) proteiineja. Altistuminen a-tomatiini aiheuttanut myös vapauttaa apoptoosia indusoivan tekijän (AIF) alkaen mitokondriot tumaan ja alassäädetty surviviinin ilme. Lisäksi α-tomatiini inhiboi merkittävästi HL60 ksenograftin kasvaimen kasvua aiheuttamatta painonlaskua vakavissa sekamuotoinen immuunivajavuus (SCID) hiirillä. Immunohistokemiallinen testi osoitti, että vähensi kasvainten kasvua α-tomatiini hoidetuissa hiirissä oli lisääntyneen apoptoosin, joka oli yhteydessä lisääntyneeseen translokaatiota AIF tumassa ja laski surviviinin ilmaisun

ex vivo

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että α-tomatiini voi olla ehdokkaana leukemia hoitoon.

Citation: Chao MW, Chen CH, Chang YL, Teng CM, Pan SL (2012) α-tomatiini välittämä syövän vastaista aktiivisuutta

In vitro

ja

In vivo

kautta Cell Cycle- ja kaspaasi-Independent Pathways. PLoS ONE 7 (9): e44093. doi: 10,1371 /journal.pone.0044093

Editor: Ferenc Gallyas, University of Pecs Medical School, Unkari

vastaanotettu: 13 helmikuu 2012; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2012; Julkaistu: 06 syyskuu 2012

Copyright: © Chao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustukset National Science neuvoston Taiwan (NSC 99-2320-B400-008-MY3) ja (NSC 99-2628-B002-024-MY3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

α-tomatiini on glykoalkaloidit löytyy tomaatin (

Lycopersicon esculentum

). Se eristettiin ensin Fontaine

et al

, ja sen havaittiin olevan runsaasti vihreiden tomaatit (500 mg α-tomatiini /kg tuoreita hedelmiä) [1]; kuitenkin, se on suurelta osin huonontunut, kuten tomaatit kypsyvät (5 mg /kg) [2]. Antibiootti ja immunologisia vaikutuksia α-tomatiini on raportoitu [3], [4]. α-tomatiini on myös näytteillä antiproliferatiivista ja apoptoottista aktiivisuutta kautta inaktivointi phosphoinostide 3-kinaasi (PI3K) /AKT reitin tai ydinaseiden tekijä (NF) -κB aktivaation kiinteiden kasvainten solulinjat kuten maksa-, paksusuoli-, ja keuhkosyövän soluja [1], [5], [6]. Kuitenkin rooli α-tomatiini in leukemiasoluja ei tunneta.

Leukemia, joka on yhteinen hematologisten kasvain, on maligniteetti, joka vaikuttaa veren esiastesolujen luuytimessä. Epäkypsä tai epätäydellisesti eriytetty verisolujen kertyy luuytimessä ja korvata normaaleja verisoluja. Viime vuosina ilmaantuvuus ja kuolleisuus leukemia ovat lisääntyneet ja kemoterapia on ollut merkittävä strategian jatkamiseksi hoitoon ja parantamiseen leukemia. Kuitenkin kaikkein lopullinen ja tehokas hoito leukemia on luuydinsiirto. Kuitenkin, koska suuri uusiutumisriski leukemia, alhainen onnistumisprosentti luuydinsiirron, ettei erittäin selektiivisiä kemoterapiaa vaihtoehtoja, ja vakavia haittavaikutuksia sekä hoitomuodot, tutkijat edelleen etsiä ja kehittää lääkkeitä, jotka ovat valikoivampia ja vähemmän myrkyllisiä tehokkaaseen leukemian hoidossa [7].

Apoptoosi on eräänlainen ohjelmoidun solukuoleman ja apoptoottisen kaskadi voidaan käynnistää kaksi suurta väyliä, sisäiseen ja ulkoiseen polkuja [8]. Sisäisen reaktiotien, jota kutsutaan myös mitokondriaalisen reitin, voi laukaista sytokromi

c

vapautumista mitokondrioissa. Ulkoista reitti, jota kutsutaan myös kuoleman reseptori reitti, aktivoidaan syöttämällä reseptorien ligandin sitoutumisen. Kaspaasin aktivaatio on yhteinen piirre kahden tärkeimmän apoptoottisia reittejä. Kuitenkin, kaspaasi-riippumaton solukuolema on raportoitu, mikä on määritelty solukuoleman, joka ei liity kaspaasi aktivointi [9], [10]. Äskettäin, lisäksi tunnettu mitokondrion proteiineja, jotka on liitetty kaspaasin aktivaatio, jotkut mitokondrioiden proteiineja on havaittu aktivoivan kaspaasi-riippumaton solukuolema, kuten apoptoosia indusoivan tekijän (AIF), endonukleaasi G (Endo G), ja HtrA2 ( Omi).

surviviini on kaksitoimisen jäsen inhibiittorin apoptoosin proteiinin (IAP) -perheen, joka välittää solun eloonjäämistä ja valvontaa solusyklin etenemisen [11] – [13]. Se ei löydy normaalissa eriytetty kudoksissa, mutta se on yleensä yli-ilmentynyt ihmisen syövän kudoksissa, erityisesti leukemian kudoksissa [14] – [16]. Kun solut altistetaan ärsykkeille, kuten Fas /CD95, säteilyä tai kemoterapiaa, surviviini voi suojella niitä solukuolemaa. Lisäksi, surviviini voi estää kaspaasi-9: n suoraan, ja kaspaasi-3 ja -7 epäsuorasti sitoutumalla smac /Diablo [17]. Sen lisäksi rooliaan kaspaasiriippuvaisen reitin surviviiniperäiset on raportoitu vaikuttavan kaspaasin riippumattoman reitin tukahduttamalla AIF julkaisu, joka tarjoaa vaihtoehtoisen reitin solujen eloonjäämistä [12]. Surviviinispesifisiä ilme on myös säädellään ylöspäin G

2 /M vaiheessa lisääntyvien solujen [18]. Se on jäsen kromosomin matkustajan monimutkainen ja sillä on tärkeä rooli solun jakautumisen. Lisäksi monet muut tekijät, kuten Wnt /β-kateniinin, sytokiinien, AKT, ja NF-KB: n on raportoitu säätää ylös surviviinin ilmentyminen riippumattomaksi solusyklin [12].

Tämän tutkimuksen oli tutkia molekyylitason mekanismit aktiivisuutta α-tomatiini, joka eristettiin tomaatista, ja määrittää sen mahdolliseen rooliin leukemian hoidossa. Tuloksemme osoittavat, että α-tomatiini on syövän vastainen vaikutus, sekä

in vitro

ja

in vivo

. α-tomatiini altistuksen aiheuttama leukemiasolulinjoilla kuoleman riippumattomia solusyklin etenemisen ja kaspaasin aktivaatio. Kuitenkin se aiheutti Bak ja Mcl-1s aktivointi ja myöhemmin menetys kalvon potentiaalia, liipaisu AIF julkaisu. Se esti myös ilmaisua surviviinin sekä

in vitro

ja

in vivo

. Nämä havainnot viittaavat siihen, että α-tomatiini voi olla lupaava ehdokas lääke leukemian hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

α-tomatiini hankittiin Tokyo Chemical Industry Co., Ltd ja liuotetaan DMSO (dimetyylisulfoksidi), sitten pidettiin -20 ° C: ssa. RPMI 1640, naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä /streptomysiiniä hankittiin Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Doksorubisiini, Z-VAD-FMK, rodamiini 123, 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5 -diphenyltetrazolium, propidiumjodidia ja kaikki muut kemialliset reagenssit Tässä tutkimuksessa käytetyt ostettiin Sigma Chemical ( St. Louis, MO, USA). Anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit ja vasta-aineita kaspaasi-6 ja kaspaasi-7 hankittiin BD Bioscience (San Jos, CS, USA). Vasta-ainetta vastaan, kaspaasi-3-hankittiin IMGENEX (San Diego, CA, USA). Vasta-aineita kaspaasi 8 surviviiniperäiset, AIF, ja Bid ostettiin Cell Signaling (Beverly, MA). Vasta-aine aktiini hankittiin Millipore (Billerica, MA, USA). Vasta-ainetta vastaan, kaspaasi-9 hankittiin Epitomics (Burlingame, CA, USA). α-Tubulin, poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), Mcl-1, Bcl-2, Bak, Bcl-xl, HRP-konjugoitu anti-hiiri-anti-kani-ostettiin Santa Cruz (CA, USA).

Solulinjat

Ihmisen kroonisen myelooisen leukemian K562 solulinjassa ja akuutti promyelosyyttinen leukemia HL60 solulinja saatiin Bioresource Collection ja tutkimuskeskuksessa. Molemmat kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja pidettiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

solunelinkykyisyysmääritys

solujen elinkykyisyys määritettiin MTT-määrityksellä. Mitokondrioiden dehydrogenaasin elävissä soluissa vähentää 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi, MTT: tä (keltainen) formatsaaniksi väriaineita (lila). K562-solut (3 x 10

5 /ml), ja HL60-soluja (4 x 10

5 /ml) ympättiin 24-kuoppalevylle. Solut käsiteltiin α-tomatiini 24 tunnin ajan. Hoidon jälkeen lääkkeen, 100 ui MTT-liuosta (0,5 mg /ml PBS: ssä) kuoppaa kohti lisättiin 24-kuoppalevylle ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Lopuksi, 100 ui uuttopuskuria (0,1 M natriumasetaatti-puskuria) lisättiin levyn kuoppaa kohti liuottamiseksi formatsaanisakka väriaineet ja absorbanssi mitattiin 550 nm: ssä ELISA-lukijaa (Packard, Meriden, CT, USA).

Virtaussytometrianalyysi

ilmiön apoptoosin havaittiin fosfatidyyliseriini (PS) translokaatiota alkaen sisäkalvon ulompaan solun pinnalla. Ja leimattu anneksiini V voi sitoutua PS tunnistaa apoptoottiset solut. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin α-tomatiini aikana, solut kerättiin ja värjättiin propidiumjodidilla (PI, 0,5 ug /ml) ja anneksiini V-FITC: llä (25 ug /ml) liuosta 15 min huoneen lämpötilassa. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen analysoitiin FACScan -virtaussytometrillä ja CellQuest-ohjelmaa (Bectan Dickinson). DNA-pitoisuus voidaan analysoida solusyklin. Hoidon jälkeen α-tomatiini aikana määritettynä ajankohtana, soluja (5 x 10

5 /ml) otettiin talteen ja kiinnitettiin 70% (v /v) jääkylmää etanolia -20 ° C: ssa 30 minuutin ajan vähintään. Kiinnitetyt solut huuhdeltiin kahdesti fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), resuspensed 0,2 ml: ssa DNA-uuttopuskuria (0,2 M Na

2HPO

4-0,1 M citritic puskuria, pH 7,8) 30 minuutin ajan ja värjättiin PI liuosta (80 ug /ml propidiumjodidia, 100 ug /ml RNaasi A: n ja 1% Triton X-100 PBS: ssa) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tiedot analysoitiin FACScamlla Flow Cytometer ja CellQuest ohjelmistot (Bectman Dickinson).

mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia

mitokondrion kalvon potentiaalia seurattiin rodamiini 123. rodamiini 123, eräänlainen lipofiilisen fluorone väriaine negatiivinen ladattu, voidaan selektiivisesti imeytyä mitokondrion kalvon. Kun mitokondrion kalvon potentiaalia menetetään, rodamiini 123 ei voi imeytyä kalvo. Soluja käsiteltiin α-tomatiini varten osoitetun ajan. Rodamiini 123 (lopullinen konsentraatio 10 uM) lisättiin ennen kuin solut kerättiin ja niitä inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Sitten solut lopulta talteen, huuhdeltiin PBS: lla ja analysoitiin FACScan -virtaussytometrillä ja CellQuest ohjelmistot (Bectman Dickinson).

Western blot-analyysi

Hoidon jälkeen solut (10

6cells /ml) kerättiin talteen. Koko solupelletit pestiin kaksi kertaa PBS: llä, hajotettiin jääkylmässä lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä, 1 mM natrium- orthovandate ja 1 mM NaF) 30 minuutin ajan ja sen jälkeen sentrifugoitiin 13000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Uuttamisessa tumaproteiini, solupelletit hajotettiin puskurissa A (10 mM Hepes, pH 7,9, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,2 mM PMSF, 0,5 mM DTT: tä, dH

2O). Kun oli inkuboitu jäillä 15 minuutin ajan, solut sentrifugoitiin 2000 rpm 4 ° C: ssa 3 min ja sen jälkeen pelletit huuhdottiin puskurilla B (10 mM Hepes, pH 7,9, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 25% glyserolia, dH

2O). Lopuksi pelletit suspendoitiin uudelleen puskuriin C (20 mM Hepes, pH 7,9, 420 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 0,2 mM EDTA, 25% glyserolia, 0,2 mM PMSF, 0,5 mM DTT), 20 minuutin ajan jäillä ja sentrifugoitiin 13000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Proteiini kvantifioitiin BCA Protein Assay Kit (Thermo tieteellinen, Rockford, IL, USA). Western blot -analyysiä varten proteiini erotettiin elektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Sitten estää kalvon rasvaton maito 1 tunnin ajan ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen PBS: ssä 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä, membraani pestiin PBST: llä (0,1% Tween 20 PBS: ssä) ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten kalvo pestiin jälleen PBST ja lopuksi signaali havaittiin parannettu kemiluminesenssidetektiolla (Amersham, Buckinghamshire, UK).

Kasvain ksenograftimalleja

arvioimiseksi

vuonna vivo

antituumorivaikutuksen α-tomatiini, HL-60-solujen (10

8 solua /ml) injektoitiin 20 severe combined immuunivajavaisiin (SCID) hiiriä ihon alle. Kun keskimääräinen kasvaimen koko noin oli 100 mm

3, hiiret erotettiin kahteen ryhmään (yksi ryhmä 10 hiirtä) ja käsiteltiin sitten α-tomatiini (5 mg /kg), 5% DMSO: ta /5% Cremophor /90% D5W (5% glukoosia) intraperitoneaalisesti. Kun keskimääräinen kasvaimen koko oli suurempi kuin 2500 mm

3, hiiret tapettiin. Kasvaimet resektoitiin, punnittiin ja jäädytettiin formaliiniin immunohistokemiallisissa kokeissa. Kasvaimen koko mitattiin mittaamalla tulkilla (mm) ja ellipsoidipallolle kaava (LW

2/2, L: pituus, W: leveys). Kaikki toimenpiteet seurasi National Taiwan University Animal Käyttö ja hallintokomitea.

immunohistokemiallinen värjäys

parafinoidut kasvainkudoksista hiiristä leikattiin ja parafiini ksyleenillä. Levyt upotettiin eri pitoisuus alkoholia (100%, 95%, 75%, 50%, DDH

20) askel askeleelta nesteytyksen ja sitten 3% H

20

2 estää endogeenisen peroksidaasi. Sillä antigeeni haku upottaen diat kiehuvaan (95-100 ° C) sitraattipuskurissa (pH 6,0) 20 minuutin vaadittiin. PBS-pesun jälkeen objektilasit upotettiin estoliuoksessa (3% BSA: ta) huoneenlämpötilassa 30 min. Levyjä inkuboitiin laimennetun primaarisen vasta-aineen, surviviini tai AIF (Cell Signaling, Beverly, MA) 4 ° C: ssa yön yli. Huuhtelun jälkeen PBS: llä useita kertoja, sekundaarinen vasta-aine, HRP Polymer Konjugaatti Reagent (SuperPicture Polymer Detection Kit), lisättiin 10 minuutin ajan ja sitten DAB Kromogeeni 5 min. Jokainen inkubaatiovaiheen, kalvot seurasi pesu PBS: llä 5 minuutin ajan. Ja sitten, Mayerin hematoksyliinillä liuosta käytettiin counterstaining. Lopuksi objektilasit oli kuivattu, kuivattiin ilmassa ja asennettu. Hematoksyliini- ja eosiini värjäyksen (H 0,05.

Tulokset

α-tomatiini aiheuttama apoptoosin HL60 ja K562 leukemia solulinjoja

α-tomatiini koostuu steroidi-, kuten tomatidine, galaktoosia, glukoosia ja ksyloosia (Fig. 1A). Sytotoksisuutta α-tomatiini ensin määritettiin kaksi erilaista ihmisen leukemiasolujen, K562 (ihmisen kroonisen myelooisen leukemian) ja HL60 (ihmisen akuutti promyelosyyttinen leukemia). MTT-analyysi paljasti α-tomatiini oli vahva sytotoksisia vaikutuksia, jotka voisivat estää solujen selviytymistä HL60 ja K562 pitoisuudesta riippuvalla tavalla IC

50 1,92 ja 1,51 uM (kuvio. 1 B). Nämä tulokset esitetään myös muita solulinjoja (Fig. S1). Kuitenkin, α-tomatiini oli melko heikkoa sytotoksista vaikutusta lymfooman solulinjassa ja normaalit solut (Fig. S1 ja S2). Vahvista tilan solukuoleman aiheuttama α-tomatiini, PI ja anneksiini V kaksinkertainen värjäys tehtiin. Kuten kuviossa 1C on esitetty, noin 40% HL60-solujen käsiteltiin α-tomatiini 12 tunnin värjättiin anneksiini V, joka edustaa varhaisessa vaiheessa apoptoottisia soluja, ja 10% soluista oli värjäytynyt sekä PI: n ja anneksiini V, joka osoitti, myöhäisen vaiheen apoptoosin tai nekroosin. Hoidon jälkeen 24 h, 60% soluista oli alkuvaiheessa apoptoosin ja 20% soluista oli loppuvaiheessa. Nämä havainnot osoittavat, että α-tomatiini voi estää solujen kasvua ja indusoivat apoptoosia HL60 ja K562-solulinjojen.

(A) kemiallinen rakenne α-tomatiini. (B) Soluja käsiteltiin tai ei α-tomatiini 24 tuntia, ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen mitochrondrial MTT vähentämiseen aktiivisuuden määrityksessä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM vähintään kolmen määrityksen. *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001 kontrolliin verrattuna. (C) Virtaussytometrianalyysi solukalvojen anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäystä. Soluja inkuboitiin DMSO: ssa 12 tunnin ajan tai, kun läsnä oli 5 uM α-tomatiini 12 ja 24 tunnin ajan. Seuraavissa kokeissa, 0,1% DMSO: ta käytettiin kontrollina. Vahingoittumattomia soluja värjättiin negatiivisia anneksiini V-FITC /PI (alhaalla vasemmalla neljänneksessä). Inkubaation jälkeen 5 uM α-tomatiini 12 tunnin oli huomattava määrä apoptoottisia soluja, jotka värjätty positiivisia anneksiini V-FITC ja negatiivinen PI (alhaalla oikealla neljänneksessä). Data ilmaistaan ​​ainakin kolme erillistä määrityksen.

α-tomatiini ei vaikuttanut solusyklin jakautumisen

analyysi solusyklin vaiheen jakelu voi auttaa arvioimaan α-tomatiini n mekanismi toiminta; tarkkailla solusyklin jakautuminen sekä HL60 ja K562-solulinjojen, α-tomatiini käytettiin 10 uM 12, 24, ja 48 tuntia. Ei selvää solusyklin vaiheen muutoksia ei havaittu ajan suhteen riippuvainen altistuminen a-tomatiini (Fig. 2A ja 2B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että vaihe solusyklin varten HL60 ja K562 solulinjoissa ei muuttunut, kun α-tomatiini hoitoa. Muissa leukemian solulinjoja, α-tomatiini ei myöskään ollut vaikutusta solusyklin jakautuminen (Fig. S3). Aiempien tutkimusten solusyklin kertyminen G

2 /M vaiheessa havaittiin paklitakselilla [19]. Paklitakseli käytettiin positiivisena kontrollina. Virtaussytometria osoitti, että osuus solujen G

0 /G

1 vaihe väheni ja osa-G

1 väestö lisääntyi hoidon jälkeen solujen paklitakselin annoksella 10gM. Hoidon jälkeen 24 tuntia, verrattuna kontrolliryhmään solujen määrä solujen osa-G

1 vaihe kasvoi noin 15-kertaiseksi (kuvio. 2A). Nämä havainnot viittaavat siihen, että α-tomatiini ei vaikuttanut solusyklin jakautumisen ihmisen leukemiasolujen tutkittu.

(A) Ylempi kaista osoittaa HL60-soluja, joita oli käsitelty α-tomatiini (10 uM) ja osoitettujen aika; solusyklin jakautumisen arvioitiin FACScan-virtaussytometria-analyysillä. Pohja kaista, HL60 solut hoidettiin paklitakselilla (10 uM) varten ilmoitettuun aikaan, toimi positiivisena kontrollina. (B) K562-soluja käsiteltiin α-tomatiini (10 uM) ja ilmoitetun ajan. Data ilmaistaan ​​ainakin kolme erillistä määrityksen.

α-tomatiini solukuolema riippumaton kaspaasin aktivaation

Caspase aktivointi on tärkeä rooli sekä sisäiseen ja ulkoiseen apoptoottisia reittejä. Kaikista kaspaasien, kaspaasien aktivaatio-3, 6, ja-7 uskotaan olevan tärkein apoptoosireittiä. Näin ollen vahvistavat rooli kaspaasi-3 HL60 ja K562-soluja käsiteltiin α-tomatiini eri pitoisuuksina. Tulokset osoittivat, että kaspaasi-3 ei ole aktivoitu α-tomatiini (Fig. 3A ja 3C). Kuitenkin, paklitakseli (3 uM), käytettiin positiivisena kontrollina, aktivoitu kaspaasi-3. Sen lisäksi, että kaspaasi-3, kaspaasi-6, -7, -8, ja -9 olivat ilmeisesti ennallaan sen jälkeen, kun α-tomatiini hoitoa, vaikka sen jälkeen, kun altistus korkea pitoisuus α-tomatiini (5 uM) 24 tunnin ajan (Fig. 3A ja 3C). Sen varmistamiseksi, että kaikki kaspaasin aktivaatio oli mukana α-tomatiini aiheuttama solukuolemareittejä, yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä, z-VAD-fmk, käytettiin vahvistusta kokeissa. MTT-analyysi osoitti, että co-hoito HL60 ja K562-solujen kanssa z-VAD-fmk ja α-tomatiini eivät muuttaneet α-tomatiini solukuolema (Fig. 3B ja 3D). Lisäksi nämä samanlaisia ​​löydöksiä näytetään myös muita leukemiasolulinjoja (Fig. S4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että α-tomatiini indusoiman apoptoosin on riippumaton kaspaasin aktivaation leukemiasolulinjoja.

(A) HL60-soluja käsiteltiin α-tomatiini (5 uM) tai paklitakselia (3 uM) ja 24 hr ja kaspaasi-3, -6, -7, -8, ja -9 aktivoinnit havaittiin. Proteiinit erotettiin ja arvioitiin käyttäen Western blot-analyysi. Paklitakseli (3 uM) käytettiin positiivisena kontrollina. (B) HL60-soluja esikäsiteltiin 100 uM z-VAD-fmk: ssa 30 minuuttia ja käsiteltiin sitten α-tomatiini (5 uM) 24 tunnin ajan. Sytotoksisuus määritettiin MTT-määrityksellä. (C) K562-soluja käsiteltiin α-tomatiini (5 uM) ja kaspaasi-3, -6, -7, -8, ja -9 aktivoinnit havaittiin. (D) K562-soluja esikäsiteltiin 100 uM z-VAD-fmk: ssa 30 minuuttia ja käsiteltiin sitten α-tomatiini (5 uM) 24 tunnin ajan.

α-tomatiini vaikuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia ja liittyvät proteiinit

Koska mitokondriot tärkeä rooli sekä sisäiseen ja ulkoiseen apoptoosin polkuja, mitokondrion kalvon potentiaali mitattiin. HL60 ja K562-solut altistettiin a-tomatiini pitoisuutena 5 uM ilmoitettu kertaa (1, 2, 4, 8, ja 12 h) ja käsiteltiin rodamiini 123: ssa 30 minuuttia; ja sitten solut analysoitiin virtaussytometrialla. Kuviot 4A ja 4B esittävät kaistansiirtymäjärjestelmä ilmiö havaitaan inkuboinnin jälkeen 1 ja 2 tunnin että HL60 ja K562 solulinjoissa, vastaavasti; Näiden ilmiöiden muuttui merkittävästi 4 tuntia. Edellä mainittu osoittaa, että α-tomatiini vaikuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia. Ei vain HL60 ja K562-solujen, α-tomatiini aiheutti myös mitokondrion kalvon mahdollinen tappio muissa leukemiasoluja (Fig. S5).

mitokondrion kalvon potentiaalia kvantitoitiin virtaussytometrianalyysillä rodamiini 123. ( A) HL60 ja (B) K562-solulinjojen käsiteltiin 10 uM rodamiini 123 ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, kun läsnä oli 5 uM α-tomatiini. Vaaka-akselilla on esitetty suhteellinen fluoresenssin intensiteetti, ja pystyakseli osoittaa solujen määrä. Vihreä käyrä osoittaa ohjaus. Sininen käyrä osoittaa α-tomatiini käsiteltyjä soluja. Siirtyminen vihreän käyrän sinistä käyrä osoittaa tappiota mitokondrion kalvon potentiaalia. Tiedot ilmaistaan ​​vähintään kolmesta erillisen määrityksen.

Aikaisemmissa tutkimuksissa, Bcl-2-perheen osoitettiin ratkaiseva rooli mitokondrioissa, mukaan lukien mitokondrion kalvon potentiaalia sovittelu [20]. Siksi me tutkimme, α-tomatiini aiheuttamat muutokset mitokondrion kalvon potentiaalia, koska vaikutukset Bcl-2-perheen proteiinin ekspressiota. Vuonna HL60 ja K562-solut, Mcl-1 pitkä muoto (Mcl-1L) proteiini, joka välittää esto solujen apoptoosin, ei säädellä α-tomatiini; kuitenkin, ilmentyminen Mcl-1 lyhyt muoto (Mcl-1 s), joka indusoi solujen apoptoosia, kasvoi hoidon (Fig. 5A ja 5B). Kuitenkin, kuten on esitetty kuvioissa 5A ja 5B, ei ollut muutoksia Bcl-2 ja Bid-proteiinin tasot HL60 ja K562-solujen. Nämä havainnot viittaavat siihen, Bak ja Mcl-1 pelataan tärkeä rooli α-tomatiini aiheuttaman apoptoosin ihmisen leukemiasolujen.

(A) α-tomatiini aiheuttama Mcl-1s ja Bak up-asetukset (proapoptoottisten), mutta ei vaikuttanut Bcl-2 ja Bid-proteiinin tasot HL60 soluissa. (B) Kun K562-solut, α-tomatiini merkittävästi parannettu aktivointi Bak ja säädelty Mcl-1s; kuitenkin α-tomatiini eivät vaikuttaneet Bcl-2 ja Bid-proteiinin ilmaisuja. Molemmat solulinjat käsiteltiin 5 uM α-tomatiini varten ilmoitettu välein. Tiedot ilmaistaan ​​vähintään kolmesta erillisen määrityksen.

α-tomatiini aiheuttama AIF tumaansiirtymiseen ja estivät surviviinin ilmaisun

Edellinen havainnot ja tiedot esitetään tässä ovat paljastaneet, että α-tomatiini aiheuttamaa solukuoleman riippumaton kaspaasin aktivaatio [21] ja vaikuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia. Lisäksi on raportoitu, että läpäisevyys mitokondrion kalvon säädellään myös AIF. Näin ollen, AIF-solukuolema, joka ohittaa kaspaasin aktivaatio, voi olla mukana α-tomatiini indusoiman apoptoosin kautta. Kuvio 6A ja 6B esittävät α-tomatiini aiheuttama tumaansiirtymiseen vaihtoehtoisten molemmissa solulinjoissa in ajasta riippuva tavalla.

(A) HL60 ja (B) K562-soluja käsiteltiin ja ilman α-tomatiini ( 5 uM) 12 tunnin ajan, 18 tuntia, 24 tuntia, ja 30 tuntia. Sitten solut fraktioitiin ydin- komponentteja, ja proteiini ilmauksia AIF ja nukleoliinin (ydin- latauskontrollina) arvioitiin Western blot-analyysi. (C) HL60 ja (D) K562-soluja käsiteltiin α-tomatiini ilmoitettuina pitoisuuksina ja aikaa. Surviviini ja aktiini-proteiinin tasot, havaittiin Western blot -analyysillä. Data ilmaistaan ​​ainakin kolme erillistä määrityksen.

mukaan Carter

et ai.

, Monenlaisia ​​leukemiasolulinjoja liittyvät surviviini-esto, joka edistää solukuolemaa riippumatta solun cycle etenemistä [22]. Lisäksi, surviviini on osoitettu tukahduttaa AIF translokaatio solulimaan päässä mitokondrioita, jotka voisivat indusoida kaspaasi-riippumattoman apoptoottisen reitin [12]. Me tutkimme, α-tomatiini voisivat suoraan alas-säädellä Surviviiniproteiini taso, joka johtaa solun kuolemaan. Todellakin, surviviinin ilmentyminen alassäädetty molemmissa solulinjoissa ja muut leukemian solulinjoja on pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 6C ja 6D ja S6). Nämä havainnot osoittavat, että AIF translokaatio ja surviviinista eston olivat mukana α-tomatiini välittämää kaspaasi-riippumaton solukuolema.

Antituumoriaktiivisuus ja ilmaus AIF ja surviviiniperäisten kanssa α-tomatiini

in vivo

määrittämiseksi antituumorivaikutuksen tehosta α-tomatiini in

vivo

, SCID hiiriin injektoidaan subku- HL60 solut niiden oikeaan kylkeen. Kun tuumorin tilavuus oli 100 mm

3, hiiret jaettiin kahteen ryhmään: ohjaus (ajoneuvo) ja α-tomatiini ryhmissä (5 mg /kg, i.p., joka toinen päivä). Koe lopetettiin, kun keskimääräinen tilavuus kasvaimet saavuttivat 2500 mm

3. Kuvio 7A osoittaa, että α-tomatiini inhiboi kasvaimen kasvua ja sen liittyvät puute laihtuminen käsitellyissä hiirissä. Kasvaimet resekoitiin; yksi osa resektoitua kasvainten kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin immunohistokemiallista analyysia varten, ja toinen osa jauhettiin ja sitten upotetaan hajotuspuskuria. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin arvioida ilmaisuja AIF ja surviviinin,

ex vivo

. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H c, d, e ja f värjäytyminen AIF (ruskea); g, h, i ja j värjäytymistä Surviviinia (ruskea). c, d, g ja h ovat alle 200-kertainen suurennus; a, b, e, f ja j ovat alle 1000-kertaisella suurennuksella. (C) Western blot-analyysi suoritettiin AIF ja surviviinista ilmaisuja yhdessä aktiini latauskontrollina satunnaisesti valittujen kasvain kussakin ohjaus ja 5 mg /kg α-tomatiini hoitoryhmissä.

Keskustelu

α-tomatiini on suuri saponiini löytyy tomaatti, ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sillä on kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta kiinteitä kasvainsoluja [1], [5], [6]. Kuitenkin, molekyylimekanismi α-tomatiini toimintaa ei vielä ole määritelty leukemiasoluja. Esillä olevassa tutkimuksessa, α-tomatiini havaittiin inhiboivan eloonjäämisen leukemiasolujen konsentraatiosta riippuvalla tavalla (kuvio. 1B ja S1). Inhibitiota solujen eloonjääminen voi johtua solun kasvun estäminen tai solun sytotoksisuutta. Näin ollen, solusyklin jakautumisen tutkittiin edelleen käsittelyn jälkeen α-tomatiini. Tulokset osoittivat, että α-tomatiini ei vaikuttanut solusyklin etenemisen arvioidun leukemiasolulinjoja (Fig. 2 ja S3). Kuitenkin propidiumjodidi (PI) ja anneksiini V värjäys paljasti, että α-tomatiini edistänyt-leukemiasolulinjoilla apoptoosin varhaisesta myöhään vaiheiden (Fig. 1 C). Lisäksi, α-tomatiini hoito johti muutoksiin ekspression BCL-2-proteiinia perhe (Fig. 5). Merkittäviä mitokondrioiden hämminki (Fig. 4 ja S5) havaittiin, ja se on tämän jälkeen laukeaa AIF translokaatio tumaan ja esti surviviini ilmaisun johtaa leukemiasolujen apoptoosia (Fig. 6 ja S6).

Tämän tutkimuksen tulokset ei näkynyt α-tomatiini liittyviä muutoksia jakeluun solusyklin, jopa suurella α-tomatiini pitoisuus (10 uM). Kuitenkin tulokset PI-anneksiini V: kaksinkertainen värjäys ehdotti, että apoptoosi havaittiin johtui α-tomatiini.