Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime aikoina olemme havainneet, että

ATP5J

oli yli-ilmentynyt kudosnäytteitä sairastavien potilaiden peräsuolen syöpä. Kuitenkin kliininen merkitys ja toiminta yli-ilmentyminen

ATP5J

näillä potilailla on edelleen epäselvä. Tutkimme näitä kysymyksiä nykyisessä tutkimuksessa. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen

ATP5J

oli merkitsevästi korkeampi peräsuolen syövän kudoksen kuin vieruskudos, ja se oli myös merkitsevästi suurempi metastaattisen imusolmukkeisiin kuin ensisijainen syöpäkudoksessa (

P

0,05). Välinen korrelaatio

ATP5J

ilmaisun ja kasvaimen erilaistumiseen havaittiin, mutta mitään korrelaatiota sukupuoleen, ikään, T vaiheessa imusolmuke etäpesäke tai selviämistila havaittu. Down-regulation

ATP5J

ilmaisu heikennetty kyky solujen vaeltamiseen ja lisääntynyt herkkyys 5-fluorourasiilin (5-Fu) soluissa DLD1 solulinjan. Kääntäen, säätely ylöspäin

ATP5J

ilmaisua tehostettu solujen vaeltamiseen ja laski 5-Fu herkkyys, mikä viittaa siihen, että toiminta ATP5J kolorektaalisyövässä saattaa liittyä solujen vaeltamiseen ja 5-Fu herkkyys.

Citation : Zhu H, Chen L, Zhou W, Huang Z, Hu J, Dai S, et ai. (2013) yli-ilmentyminen

ATP5J

Gene korreloi Cell Migration ja 5-fluorourasiilia Herkkyys peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (10): e76846. doi: 10,1371 /journal.pone.0076846

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 18 helmikuu 2013; Hyväksytty: 31 elokuu 2013; Julkaistu: 04 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (30700970 ja 81272681), perustutkimus rahastojen Keski yliopistojen ja ohjelma Innovative Research Team Zhejiangin maakunnassa (2010R50046). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on toiseksi yleisin syöpä Yhdysvalloissa ja muissa kehittyneissä maissa [1,2], ja sen esiintyvyys kasvaa vuosi vuodelta kehitysmaissa [3,4]. Kuten tiedämme, syövän synty ja kehitys paksusuolisyövän käsittää sarjan monimutkaisten prosessien nämä liittyy useita geenejä ja vaiheita. Vaikka yhä useammat geenejä, on raportoitu kirjallisuudessa [5-7], löytää uusia geenejä, jotka saattavat liittyä syövän synnyn, kehityksen, diagnosointiin tai hoitoon kolorektaalisyövän jatkuu. Siksi etsimme Sage tietokantaan ja vahvisti geenin ehdokkaita kiinnostuksen RT-PCR (RT-PCR). Loppujen lopuksi tunnistettu geeni,

ATP5J

, joka oli yli-ilmentyy peräsuolen syöpä.

komponentti F

0, ATP5J on proteiini sijaitsee mitokondrioissa joka on lipidejä liukoinen osa ATP-syntetaasin [8]. Edeltäjä ATP5J koostuu 108 aminohaposta, ja se on keritty 32 aminohapon [9]. Tuote, joka sisältää jäljellä olevan 76 aminohappoa säilytetään mitokondrioita energian siirtoa [9]. Perinteisesti ATP5J on ajateltu takaisin välistä epäorgaanisen fosforin ja ATP, sekä toimintaa ATPaasi, joka on estää oligomysiini [10]. Viimeaikainen tutkimus on kuitenkin osoittanut, että ATP5J jakautuu laajalti pinnalle verisuonten endoteelisolujen [11,12]. Näin ollen, se voi myös erittyä vereen ja kierrätetään yhdistyvät β-alayksikön ATP-syntetaasin sijaitsee pinnalla verisuonten endoteelisolujen. Tämän jälkeen, toiminnan fosfolipaasi A2 voidaan inhiboida aktivoitumisen liittyvien signalointireitin, joka seuraa estyminen prostaglandiinisynteesin, joka edistää verisuonten supistumista [12]. Recenetly, jotkut kirjallisuus ovat osoittaneet, että

ATP5J

geeni on yli-ilmentynyt sarjassa syöpiä, kuten munuaissyöpää ja maksasyövän [13,14]. Kuitenkin toiminta yliekspressoitujen

ATP5J

syövät vieläkään ei ole dokumentoitu.

mukaan käyttöön ihmisen proteiinin ATLAS (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000154723 /normaali), ATP5J proteiini voidaan ekspressoida monissa normaaleissa kudoksissa tai elimissä, mukaan lukien paksusuolen ja peräsuolen. Alustavien tiedot vahvistavat myös tätä ilmiötä. Vielä tärkeämpää on, meidän tiedot osoittivat, että

ATP5J

oli yli-ilmentyy kolorektaalisyöpä verrattuna normaaliin kudokseen. Tavoitteena nykyisen oli tutkia kliinistä merkitystä ja toiminta yli-ilmentyminen

ATP5J

peräsuolen syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että

ATP5J

oli yli-ilmentynyt kudosnäytteitä potilailla, joilla peräsuolen syöpä ja että oli korrelaatio

ATP5J

ilmaisun ja kasvaimen erilaistumista. Lisäksi yli-ilmentyminen

ATP5J

parannettu solujen vaeltamiseen ja indusoitu vastus 5-fluorourasiilin (5-FU) on peräsuolen syövän solut.

Materiaalit ja menetelmät

Collection tuoreen kudosnäytteiden

tutkimus hyväksyi Sir Run Run Shaw sairaala ja Zhejiangin yliopisto eettisen komitean (NO.20100823). Tuore syöpä- kudosnäytteet saatiin suoraan toiminnasta yksilöitä 72 peräkkäisen potilailla, joille oli tehty kirurginen asemointia varten ensisijaisen satunnaista peräsuolen adenokarsinoomat laitoksella peräsuolen Kirurgian Sir Run Run Shaw sairaala, Hangzhou, Zhejiang, Kiina, syyskuun 2010 maaliskuu 2011 . Kirjallinen suostumus kudoksen keräys saatiin kaikille potilaille ennen niiden kirurgisia toimenpiteitä. Mikään näistä potilaista oli ollut ennen leikkausta kemoterapiaa tai sädehoitoa. Viereinen kudokset kerättiin yli 5 cm: n päässä syöpäkudoksen.

Potilaat ja kliiniset tiedonkeruu

Parafiinisektioista näytteenotto yhteensä 79 potilasta, joilla ehjä kliinisiä tietoja, joilla oli diagnosoitu kolorektaalisyöpään vahvistuminen heinäkuun 2006 ja kesäkuun 2007 sairaalassamme kerättiin immunohistokemiallista värjäystä. Keskimääräinen seuranta näistä potilaista oli 52,6 kuukautta, ja kokonaiselossaoloaika oli 73,4% viime seurannassa. Näistä 79 tapauksessa syöpäkudoksen ja suhteellinen normaalisti viereiseen kudokseen paria tutkittiin 51 tapauksessa, ja kudosnäytteitä metastasoitunut imusolmukkeet tutkittiin 26 tapauksessa. Kaikki osat valmistettiin immunohistokemia dioja, joita käytettiin verrattaessa

ATP5J

ilmaisun eri kudoksissa.

Solut ja soluviljelmä

Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa DLD1, RKO, SW620, SW480 ja Colo320 ostettiin Institute of Cell Research Shanghaissa, Kiinassa. Normaali ihmisen fibroblastisolulinjan (NHFB) saatiin Global Bioresource Center American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Soluja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 1% glutamiinia ja 1 x antibioottia antimykoottiseosta (Invitrogen, Beijing Office, Peking , Kiina). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2, ja se voidaan käyttää RT-PCR-analyysi. Lisäksi DLD1 sekä SW620-soluja voitaisiin myöhemmin käytetään useita muita kokeita.

käänteistranskriptiolle PCR

tuore kudosnäytteistä 100 ug homogenoitiin käyttämällä hiomakoneen nestemäisellä typellä seuraa lyysissä TRIZOL reagenssilla (Invitrogen Beijing Office, Peking, Kiina). Viljellyt solut mainitaan edellä olivat suoraan hajotettiin käyttäen TRIZOL reagenssia hoidon jälkeen. RNA uutettiin noudattamalla valmistajan ohjeita. Yksi mikrogramma RNA: ta kustakin näytteestä käänteistranskriptoituneet cDNA käyttämällä satunnaisia ​​heksameerejä käänteistranskriptioalukkeita (Applied Biosystems Shanghai Office, Shanghai, Kiina). Sitten tyypillinen polymeraasiketjureaktio (PCR) varten

ATP5J

geenin suoritettiin. Ihmisen

GAPDH

geeniä käytettiin sisäisenä kontrollina normalisointia mRNA määrästä. Sekvenssit alukkeet olivat seuraavat: 5′-TCAGCCGTCTCAGTCCATTT-3 ’ja 5′-CCAAACATTTGCTTGAGCTT-3’ ja

ATP5J

; 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ’ja 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ ja

GAPDH

.

immunohistokemiallinen värjäys

Immunovärjäys suoritettiin käyttäen MaxVision kit (Maixin Biol, Fuzhou , Kiina). Lyhyesti, 4 um: n paksuisia leikkeitä leikattiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettujen kudosten lohkoja, joka on asennettu polylysiini päällystetty dioja, vahat ksyleenissä, ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen läpi etanolia ratkaisuja. Jälkeen deparaffinization, levyt käsiteltiin 3% vetyperoksidilla metanolissa liuoksessa 10 minuuttia sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus, sitten antigeeni-haku käsittely suoritettiin 121 ° C: ssa (autoklaavi) 5 minuuttia 10 mM natriumsitraattia (pH 7,4) . Epäspesifinen siteet blokattiin käsittelemällä dioja 10% normaalia vuohen seerumia 10 minuuttia. Sen jälkeen levyt inkuboitiin ATP5J vasta-aineella (Cell Applications, San Diego, CA, 1: 8000 laimennos) yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavaksi kalvot inkuboitiin yksi tippa MaxVision reagenssia 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Värin kehittyminen suoritettiin käyttäen 0,05% diaminobentsidiinillä ja 0,03% vetyperoksidilla 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 5 minuutin ajan. Lopuksi objektilasit vastavärjättiin 1% Meyerin hematoksyliinillä. Negatiivisena kontrollina, kudosleikkeiden hoidettiin normaalin seerumin sijasta ATP5J vasta-aineen.

arviointi värjäämällä

Kaikki kohdat pisteytettiin sokkona valomikroskoopilla. Solut, joissa selkeä rakenne ja ruskea-keltainen rakeita, jotka olivat korkeammat kuin taustalla katsottiin positiivisiksi; muuten solut pidetään negatiivisina. Kutakin levyä, 5-10 suurentavan kentät (x 400) tutkittiin. Sitten objektilasit sijoitettiin mukaan positiivisten solujen prosenttiosuuden: 0 (alle 5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), tai 4 (76- 100%). Samalla dioja pisteytettiin mukaan värjäytymisen intensiteetti: 1 (kellertävä), 2 (ruskea-keltainen), tai 3 (ruskea) [15]. Lopullinen pistemäärä laskettiin summana näiden kahden tulokset.

Western blot-analyysi

Solut pestiin kylmällä PBS: llä ja alistettiin lyysi Laemmlin lyysipuskuria. Yhtä suuret määrät lysaattia erotettiin käyttämällä 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), ja sitten siirrettiin Hybond tehostetun kemiluminesenssin (ECL) kalvoja (Amersham Bioscience, Englanti). Membraanit blokattiin sitten PBS: llä, joka sisälsi 5% vähärasvaista maitoa ja 0,05% Tween-20: ssa 1 tunnin ajan tai yön yli 4 ° C: ssa, pestiin kolme kertaa PBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (PBST), ja inkuboitiin ATP5J vasta-aineen vähintään 1 tunti huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBST: llä jälleen, membraaneja inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja kehitetään kemiluminesenssidetektiolla kittiä (ECL kit, Amersham Bioscience, Englanti). Kanin anti-humaani ATP5J-vasta-aine hankittiin Cell Applications. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Plasmidin ekspressoi

ATP5J

pOTB7 plasmidi, joka sisältää

ATP5J

sekvenssi hankittiin Invitrogen (Clone ID 3357779).

ATP5J

sekvenssi kloonattiin s △ E1sp1A plasmidia käyttämällä EcoRI /XhoI-entsyymeillä. Sitten se digestoitiin edelleen ja kloonattiin pcDNA3.1 (+) plasmidiin käyttäen BamHI /HindⅢ entsyymien saamiseksi uusi plasmidi nimettiin pcDNA3.1 (+) /ATP5J. Sen jälkeen kun ekspressio

ATP5J

oli varmistettu, tämä uusi plasmidia käytettiin seuraavaksi osa tutkimusta.

Cell transfektio ja vakaa pesäkkeiden valinta

transfektion jälkeen solut olivat maljattiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 1×10

5 solua kuoppaa kohti, ja niiden annettiin kasvaa yön yli, jolloin 90-95% konfluenssiin. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin seoksella 0,8 ug ATP5J shRNA plasmidia (Origene, USA), pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmidi, tai negatiivinen kontrolli plasmidin (Origene, USA) ja 2 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 100 ul: ssa seerumia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuottaa stabiilisti transfektoitujen solujen transfektion jälkeen vastaava plasmidi, 10 ug /ml puromysiiniä (Roche, Mannheim, Saksa) lisättiin 48 tunnin ja väliaineen (DMEM + 15% FBS). Solut jätettiin selektiivisellä alustalla 2 viikkoa; Tämän jälkeen ne trypsinoitiin ja viljeltiin uudelleen selektiivisellä alustalla lisäystarkoituksiin.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elävyys määritettiin käyttäen MTT-määritystä (3- (4,5 dimetyylitiatsol- 2yyli) -2 , 5 difenyylitetratsoliumbromidia; Sangon, Shanghai, Kiina). Lyhyesti, solut (5×10

3 per kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille ja tarkkailu sarjan ajankohtina. Sitten 100 ui MTT-liuosta (10 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja inkubointia jatkettiin 4 tuntia, ennen kuin väliaine poistettiin. Seuraavaksi 100 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) levitettiin jokaiseen kuoppaan vielä 10 minuuttia. Lopuksi arvo OD

570 nm määritettiin; Tämä arvo edustaa solujen elinkykyä. Kukin koe suoritettiin neljänä rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kahdesti.

Cell klonogeenisten määritys

1000 Soluja viljeltiin 10-cm: n maljoihin normaali elatusaineeseen inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa 14 päivää. Yksittäiset pesäkkeet ( 50 solua pesäkettä) kiinnitettiin ja värjättiin liuoksella, joka sisälsi 0,25% kristalliviolettivärjäys ja 20% etanolissa 20 minuutin ajan. Pesäkkeet laskettiin käyttäen Optimas ohjelmiston (Media Cybernetics LP, Silver Spring, MD, USA). Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti.

Virtaussytometria määrityksessä

Solut trypsinoitiin ja pestiin kerran kylmällä PBS: llä. Sitten solut kiinnitettiin kylmällä 70% etanolilla yön yli 4 ° C: ssa. Kolmekymmentä minuuttia ennen kuin ne analysoitiin, propidiumjodidi (PI) värjäys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16-18]. Virtaussytometria määritykset suoritettiin Core Lab Sir Run Run Shaw sairaala.

haavanparantumis- määritys

Solun muuttoliikettä tutkittiin käyttämällä scratch arpeutumisprosessit määrityksessä. Solut (5×10

5 per kuoppa) siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Solut käsiteltiin 10 ug /ml mitomysiini C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 3 tunnin ajan, pestiin PBS: llä, sitten yksinkertaisesti haavoittuneen kanssa pipetin kärjen. Tuore täyteen alustaa lisättiin, ja solujen annettiin sulkea haavan 48 tuntia tai vähemmän. Valokuvia saman haavan kanta otettiin vastaavana ajankohtina. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Cell migraatiokokeessa

Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM: iin, joka sisälsi 1% FBS: ää, jonka tiheys on 1×10

6 solua /ml. Kaikkiaan 100 ui solususpensiota maljattiin 24-kuoppaisille Transwell (Costar, Corning, NY). DMEM (600 ui), joka sisälsi 10% FBS pantiin alempaan kammioon. Inkuboitiin 24 tuntia, solut jäljellä ylemmässä kammiossa poistettiin varovasti pumpulipuikolla, ja kalvo leikattiin pois käyttöympäristön veitsellä. Puoleinen alempaan kammioon värjättiin 0,05% kristalliviolettivärjäys, ja kiinnittyneet solut laskettiin valomikroskoopilla. Koe toistettiin kolme kertaa.

Tilastollinen

korrelaatio

ATP5J

ilmaisun ja kliiniset piirteet arvioitiin käyttäen korrelaatioanalyysiin, ja eroja ryhmien arvioitiin käyttäen Wilcoxonin Hyväksytty-paria testi tai ANOVA käyttämällä SPSS15.0 ohjelmistoa (SPSS, Inc., Chicago, USA).

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ATP5J

oli yli-ilmentynyt kliinisissä peräsuolen syöpä kudoksiin

Sage tietokannassa (http: //cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer) etsittiin erilaisia ​​kandidaattigeenejä ne olivat ilmennetty eri kolorektaalisyövässä. Useita mielenkiintoisia geenejä tunnistettiin, kuten tetraspanin TM4-C, oligophrenin 1, ATP5J, transmembraaninen glykoproteiini A33 esiaste, DHRS9, sytidiinideaminaasi, uroguanyliini, ja dual-spesifisyys fosfataasi 1. Kuitenkin meidän ensisijainen tulokset RT-PCR osoitti, että vain uroguanyliini oli vähentää ja että

ATP5J

oli yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä (kuvio 1A). Muut geenit olivat ennallaan tai havaita meidän kokeessa (tuloksia ei ole esitetty). Koska ilmaus uroguanyliini ja sen tehtävä paksusuolen syöpä on selvennetty aiemmassa raportissa [19], mutta ei

ATP5J

geeni, jälkimmäinen valittiin ainutlaatuinen tavoite tutkimuksessamme.

(A) RT-PCR tulokset

ATP5J

ja

uroguanyliini

geenejä. (B) immunohistokemiallinen värjäys tulokset viereiseen kudokseen ja syöpäkudoksessa. (C) immunohistokemiallinen värjäys tulokset vieruskudos, syöpä kudos, ja metastaattisen imusolmukekudoksesta.

Vahvista ilmentymisen

ATP5J

kolorektaalisyövässä, me edelleen analysoineet ilmaus

ATP5J

mRNA: RT-PCR: llä tuoretta kasvainkudoksissa ja viereisten normaaleissa kudoksissa päässä 72 peräkkäisen potilaille (taulukko 1). Tulokset osoittivat, että positiivinen prosenttiosuudet RT-PCR

ATP5J

kudoksissa kolorektaalisyövän potilaista saavutti noin 54,17%, mikä oli samankaltainen paksusuolensyöpä ja peräsuolen syöpä. Kuitenkin ilmaus

ATP5J

oli huomattavasti korkeampi ja peräsuolen syövän kudoksen kuin normaalin kudoksen joukossa PCR-positiivisten potilaiden (taulukko 1,

P

0,01). Meidän immunohistokemiallinen värjäys johtuu parafiinileikkeillä toisen 51 potilasta mainitut

Potilaat ja kliiniset tiedonkeruu

jakso osoitti samanlaisen tuloksen, mutta jolla on korkeampi positiivinen suhde (kuvio 1 B ja taulukko 1,

P

0,05). Edelleen immunovärjäyty- tulokset osoittivat myös, että

ATP5J

ilme oli huomattavasti korkeampi metastaattisessa imusolmukkeisiin kuin ensisijainen syöpäkudoksessa (kuvio 1 C ja taulukko 2,

P

0,05).

ATP5J kunnossa

asia NO.

Positiivinen tapauksissa

Positiivinen tapauksissa ”jakautuminen ATP5J ilmentyminen kasvainkudoksessa vs. vieruskudos

P

arvo

T

*

*

T =

T

MRNA PCR7239 (54,2%) 32 (82,1%) 6 (15,4%) 1 (2,6%) 0.01Protein IM

* 5149 (96,1%) 32 (65,3%) 15 (30,6%) 2 (4,1%) 0.05Table 1. kunto ATP5J ilmaisun peräsuolen kasvain ja viereiseen kudokseen.

* T: kasvain; V: vieressä; IM: immunohistokemiallisella värjäyksellä CSV Lataa CSV ATP5J in MLN

*

Case NO.

MLN T

MLN = T

MLN T

P

arvo

Positive25 (96,2%) 12 (46,2%) 8 (30,8%) 5 (19,2%) 0.05Negative1 (3,8%) – 1 (3,8%) Taulukko 2. kunto ATP5J ilmaisun peräsuolen kasvain ja metastaattinen imusolmukkeiden solmut.

* MLN: metastaattinen imusolmukkeiden CSV Lataa CSV

Korrelaatio yli-ilmentyminen

ATP5J

ja kliinisiä piirteitä sairastavien potilaiden peräsuolen syöpä

analysoida suhdetta yli -ilmaisu on ATP5J ja kliinisiä patologisia ominaispiirteitä peräsuolen syöpäpotilaiden, parafiinileikkeillä 79 potilasta, jotka mainitaan osassa

potilaat ja kliiniset tiedonkeruu

, kerättiin. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin näillä dioja ja tulokset laskettiin, kuten edellä mainittiin. Näiden tulokset,

ATP5J

ilmaisua voitaisiin jakaa kahteen joukkoon: heikko (≤4) ja vahva ( 4). Sitten korrelaatio analyysi tehtiin SPSS-ohjelmistot; tulokset on esitetty taulukossa 3. Niistä lueteltu kliiniset piirteet, vain eriytyminen oli korrelaatio

ATP5J

ilme. Sukupuoli, ikä, T vaiheessa imusolmuke etäpesäke sekä selviämistila ei osoittanut korrelaatiota

ATP5J

ilme. Nämä tulokset osoittivat, että

ATP5J

ilmentymistä hyvin eriytetty kasvaimia oli heikompi kuin huonosti tai kohtalaisesti eriytetty kasvaimet (

P

0,05) B Variable

Asia NO.

Heikko

Strong

P Vaule

GenderFemale358270.281Male441529Age 65 yr286220.271≤65511734T stageT1,2196130.789T3,4601743DifferentiationWell4116250.045Poor /moderate38731Histologic LNM

* Absent3612240.408Present431132Survival statusSurvival5818400.538Died21516Table 3. Korrelaatio ATP5J ilmaisun ja patients’clinical ominaisuuksia.

* LNM: imusolmukemetastaaseja CSV Lataa CSV

havaitseminen

ATP5J

ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjaa

Se oli vaikea selventää taustalla funktio ATP5J kolorektaalisyövässä riippuen vain kliiniset analyysit. Enemmän molekyylibiologisia tutkimuksia tarvita tähän tarkoitukseen. Siksi meidän huomiota siirtynyt kolorektaalisyövän potilaita solulinjoja. Ymmärtää ilmentymisen

ATP5J

kolorektaalisyövässä solulinjoissa, viisi ja peräsuolen syövän solulinjat kerättiin (DLD1, RKO, SW620, SW480, ja Colo320), ja normaalin ihmisen fibroblasti (NHFB) käytettiin normaalista solujen valvontaa. Ensin kerätään mRNA tuotetta näistä solulinjoista ja suoritettiin RT-PCR: llä, kuten aikaisemmin on kuvattu. Nämä tulokset osoittivat, että ATP5J mRNA yli-ilmentyy kaikissa paksusuolisyövän solulinjoja, mutta ei NHFB (kuvio 2A). Sitten suoritettiin Western-blottauksella proteiinin näytteitä näistä solulinjoista. Tulokset osoittivat samanlainen ilmiö. ATP5J proteiini yli-ilmaistu neljä koolonsyöpäsolulinjoissa (paitsi RKO) verrattuna NHFB (kuvio 2B). Näiden tulosten perusteella, olemme lähinnä valitsimme DLD1 soluja seuraavan osa tutkimusta; DLD1 osoitti kohtalaisesta

ATP5J

ilme, joka oli kätevä tarkkailemalla alassäätöä sekä ylös-säätely geenin ilmentymisen samassa solulinjassa käyttäen molekyylitekniikkaa.

(A) RT-PCR-tulokset ATP5J mRNA. (B) Western blotting tulokset ATP5J proteiinia.

Down-regulation

ATP5J

ilmaisu heikennetty solujen vaeltamiseen ja kasvoi 5-Fu herkkyyttä DLD1 soluissa

Ensimmäinen meidän alassäädetty

ATP5J

ilmentymistä DLD1 soluissa pysyvin transfektio plasmidilla ilmentävien shRNA kohdistaminen ATP5J. Jälkeen pesäkkeiden valinta, Western-blottaus suoritettiin (kuvio 3A). Ilmentyminen ATP5J oli alassäädetty dramaattisesti klooni 4 ja hieman vuonna klooni 9. Valitsimme klooni 4 jatkotutkimuksiin ja määritellyt sen ATP5J shRNA /4. Samaan aikaan, klooni 2 valvonnan shRNA käytettiin vektorisäätö (Vector), ja villityypin DLD1 (WT) käytettiin mock-ohjaus.

(A) Western blot tulos ATP5J proteiinin eri kloonien DLD1 solu sen jälkeen, kun vakaa transfektion samalla ATP5J shRNA plasmidi. (B) haavan paranemista määritys WT, Vector, ja ATP5J shRNA /4 DLD1 soluja. Tiedot ovat yksi kolmesta vastaavia kokeita (alkuperäinen suurennos: x100). (C) muutto WT, Vector, ja ATP5J shRNA /4 DLD1 soluihin määritettiin käyttäen 24-Transwell järjestelmä. Kuvat vaeltaneet solut otettiin 24 tunnin kuluttua kylvö (alkuperäinen suurennos: x100). Tulokset edustavat yhtä kolmesta samanlaisia ​​kokeita. (D) kvantitatiivinen analyysit kolme solumigraation määrityksissä. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD. *

P

0,05; (E) apoptoottinen suhteet WT, Vector, ja ATP5J shRNA /4 DLD1 solujen käsittelyn jälkeen 50 umol /l 5-Fu ja 3 päivää. Tulokset edustavat yhtä kahdesta samanlaisesta kokeesta. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD. *

P

0,05.

tulokset MTT-määritystä, solukierron virtaussytometrialla, tai klooni muodostusta klonogeeniset määrityksessä eivät paljastaneet eroja solujen selviytymisen keskuudessa WT, Vector ja ATP5J shRNA /4 ryhmää (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin tiedot arpeutumisprosessit määritys osoitti, että solut ATP5J shRNA /4 ryhmä otti 48 tuntia sulkea naarmu haava, kun taas solut WT ja Vector ryhmät ottivat 48 tuntia parantua haavan samankokoisia (Kuvio 3B). Tämä tulos viittaa siihen, että alas-säätely

ATP5J

heikennettyä kykyä soluvaelluksen DLD1 soluissa. Kvantifioimiseksi vaikutuksen

ATP5J

alassäätöä solun muuttoliikettä, vielä migraatiokokeessa suoritettiin. Tulosten perusteella ylimääräinen testi osoitti, että määrä siirtynyt solujen ATP5J shRNA /4 ryhmässä oli merkittävästi vähentynyt verrattuna sekä WT ja Vector ryhmiä (kuvio 3C ja 3D,

P

0,05).

lisäksi halusimme arvioida vaste syöpäsolujen syövän hoidon jälkeen ATP5J ilmentyminen oli muuttunut. Tätä tarkoitusta varten valitsimme 5-fluorourasiilin (5-Fu) seuraavan tutkimuksen, koska se on usein käytetty anti-metaboliitti kemoterapeuttisen lääkkeen peräsuolen syöpä. Tuloksemme osoittivat, että apoptoottisen suhde ATP5J shRNA /4 ryhmässä oli suurempi kuin sekä WT ja Vector ryhmien käsittelyn jälkeen 50 umol /l 5-Fu ja 3 päivää (kuvio 3E, P 0,05). Tämä tulos viittaa siihen, että alas-säätely

ATP5J

lisäsi herkkyyttä DLD1 solujen 5-Fu.

edelleen varmistamiseksi funktio ATP5J toisessa solulinjassa, me kaatanut

ATP5J

ilmentymisen SW620-soluissa käyttäen samassa plasmidissa kuten yllä on mainittu. Sen jälkeen pesäkkeen valinta tunnistimme yhden kloonin, jossa

ATP5J

ilmentyminen dramaattisesti alassäädetty; Olemme nimenneet sen ATP5J shRNA /3 (kuvio 4A). Tulokset sekä apoptoosin havaitsemiseksi ja solujen elinkelpoisuuden määritykset ehdotti, että ATP5J shRNA /3 johdettu ryhmä SW620-soluissa oli herkempi 5-Fu verrattuna WT ja Vector ryhmien käsittelyn jälkeen 50 umol /l 5-Fu ja 3 päivää (kuvio 4B ja 4C,

P

0,05). Tämä tulos on yhdenmukainen aikaisempien tietojemme kanssa, mistä DLD1 soluja ja edelleen vahvistaa toimintaa ATP5J paksusuolen syöpäsoluissa.

(A) Western blot tulos ATP5J proteiinin eri klooneja SW620 solun jälkeen stabiilin transfektion samalla ATP5J shRNA plasmidi. (B) apoptoottinen suhde WT, Vector, ja ATP5J shRNA /3 SW620-soluissa, sen jälkeen käsittelemällä 50 umol /l 5-Fu ja 3 päivää. (C) Solujen elinkelpoisuus määrityksissä WT, Vector, ja ATP5J shRNA /3 SW620-soluissa, sen jälkeen käsittelemällä 50 umol /l 5-Fu ja 3 päivää. Tulokset edustavat yhtä kahdesta samanlaisesta kokeesta. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD. *

P

0,05.

Up-regulation

ATP5J

ilmaisua tehostettu solujen vaeltamiseen ja laski 5-Fu herkkyyttä DLD1 soluissa

Seuraavaksi halusimme vahvistaa tuloksemme käyttäen päinvastainen tila, jossa

ATP5J

ilmentyminen ylempänä säädelty. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmidi transfektoitiin stabiilisti DLD1 soluihin. Jälkeen pesäkkeiden valinta, Western-blottaus suoritettiin (kuvio 5A). ATP5J ilme oli säädelty dramaattisesti kloonien 2, 3, ja 4. Emme satunnaisesti Valitsimme kloonit 2 ja 4 jatkotutkimuksiin ja määritellään ne ATP5J /A2 ja ATP5J /A4, vastaavasti. Samaan aikaan, klooni 7 ohjauspaneelista plasmidia käytettiin vektorisäätö (Vector) ja villityypin DLD1 solut (WT) käytettiin mock-ohjaus.

(A) Western blot tulos ATP5J proteiinin DLD1 solut sen jälkeen, kun vakaa transfektion pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmidi. (B) haavan paranemista määritys WT, Vector, ATP5J /A2, ja ATP5J /A4 soluja. Tiedot ovat yksi kolmesta vastaavia kokeita (alkuperäinen suurennos: x100). (C) Migrations WT, Vector, ATP5J /A2, ja ATP5J /A4-solut analysoitiin käyttämällä 24-Transwell järjestelmä. Kuvat vaeltaneet solut otettiin 24 tunnin kuluttua kylvö (alkuperäinen suurennos: x100). Tulokset edustavat yhtä kolmesta samanlaisia ​​kokeita. (D) kvantitatiivinen analyysi kolmen solujen kulkeutumiseen määrityksissä. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD. *

P

0,05. (E) apoptoottinen suhteet WT, Vector, ATP5J /A2, ja ATP5J /A4-solujen hoidon jälkeen 50 umol /l 5-Fu ja 3 päivää. Tulokset edustavat yhtä kahdesta samanlaisesta kokeesta. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD ja *

P

0,05.

Tiedot koskevat solujen eloonjäämistä, solusyklin, ja klooni muodostuminen tuotti samankaltaisia ​​tuloksia kuin edellä on esitetty. Eroa ei havaittu joukossa WT, Vector, ATP5J /A2, ja ATP5J /A4 ryhmät (tuloksia ei ole esitetty). Arpeutumisprosessit testi osoitti, että solut ATP5J /A2 ja ATP5J /A4 ryhmät ottivat 44 tuntia sulkea naarmu haava, kun taas solut WT ja Vector ryhmät ottivat 44 tuntia parantua haavan samankokoisia ( kuvio 5B). Tämä tulos viittaa siihen, että säätely ylöspäin

ATP5J

parannettu soluvaelluksen DLD1 soluissa. Lisäksi solujen kulkeutumiseen määrityksessä osoitti, että määrä siirtynyt solujen ATP5J /A2 ja ATP5J /A4 ryhmien lisääntyi merkitsevästi verrattuna WT ja Vector ryhmiä (kuvio 5C ja 5D,

P

0,05). Samaan aikaan, käsittelyn jälkeen 50 umol /l 5-Fu ja 3 päivää, apoptoottisen suhteet ATP5J /A2 ja ATP5J /A4 ryhmät oli merkittävästi alhaisempi kuin WT ja Vector ryhmät (kuvio 5E, P 0,05), mikä osoittaa, että säätely ylöspäin

ATP5J

aiheuttama DLD1 soluja vastustamaan 5-Fu.

keskustelu

tutkimuksessa selvitettiin tilan

ATP5J

ilmaisun peräsuolen syövän potilaille, ja tuloksemme osoittivat, että

ATP5J

oli yli-ilmentynyt näillä potilailla. Tämä tulos oli päinvastainen, että Sage tietokantaan. Se voi johtua eron otoskoko sekä otoksen valintaa bias. Saamiemme tietojen, oli useita erilaisia ​​ehtoja ATP5J ilmentymisen kolorektaalisyövässä, yksi heistä väheni. Lisäksi otoskoko käyttämä tietokanta oli hyvin pieni. Joten se voidaan ymmärtää, että meillä oli erilainen johtopäätös ATP5J ilmentymistä peräsuolen syöpä. Lisäksi meidän tuloksia saatiin sekä mRNA ja proteiini tasoilla ja olisi sen vuoksi olla vakuuttava.

Lisäksi tulokset osoittivat, että erottelua korreloi

ATP5J

ilme. Julkaistun kirjallisuuden, kasvaimen erilaistumiseen oli ennusteen tekijä potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [20,21]. Tämän perusteella,

ATP5J

ilmaisua voidaan korreloi selviytymisen tila, mutta meidän tiedot eivät osoitti tämän korrelaatiota. Muita, tuloksemme osoittivat myös, että

ATP5J

ilme oli suurempi metastaattisen imusolmukkeisiin verrattuna vastaavan ensisijaisen syöpäkudoksessa, mutta sillä ei ollut mitään korrelaatiota imusolmuke etäpesäke. Ero saattaa johtua liikaa hallitsemattomia tekijöitä kliinisesti, pikemminkin kuin olosuhteet molekyylibiologista tutkimuksia, jotka kontrolloitiin tarkasti. Voisi olla myös aiheuttama pieni koko osallistui potilaita ja tarvitsevat tutkimuksen suuret näytteitä. Riippumatta tämän erimielisyyden, meidän edelleen tuloksia perspicuously osoittivat, että alas-säätely

ATP5J

ilmaisu heikennetty solujen vaeltamiseen ja kasvoi 5-Fu herkkyyttä DLD1 soluissa.