Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteasomin estäjä bortetsomibi (Velcade) on lupaava uusi aine virtsarakon syövän hoitoon, mutta indusoituvaa cytoprotective mekanismit voivat rajoittaa sen mahdollisuuksia tehoa. Käytimme koko genomin mRNA: n ilmentymisen profilointi vaikutusten tutkimiseksi Bortetsomibin stressin indusoima geeni-ilmentymisen paneelin ihmisen virtsarakon syövän solulinjat. Bortetsomibi aiheuttama voimakas säätelyä indusoituvan HSP70 isoformeja HSPA1A ja HSPA1B isomuotoa Hsp72 vuonna 253J BV ja SW780 (HSPA1A

korkea) soluja, mutta vain indusoi HSPA1B isoformi UM-UC10 ja UM-UC13 (HSPA1A

matala) solut. Bortetsomibi stimuloi sitoutuminen heat shock factor-1 (HSF1) on HSPA1A promoottorin 253JB-V, mutta ei UM-UC13-soluissa. Metylaatiospesifinen PCR paljasti, että HSPA1A promoottori metyloitavaa HSPA1A

alhainen solulinjoja (UM-UC10 ja UM-UC13), ja altistuminen kromatiinin demetyloiva agentti 5-atsa-2′-deoksisytidiini palautettu HSPA1A ilme. Yliekspressio Hsp72 edistetään bortetsomibi vastus UM-UC10 ja UM-UC13 soluissa, kun taas ohimenevä knockdovvn HSPA1B edelleen herkistynyt näiden solujen bortetsomibille, ja altistuksen HSF1 estäjä KNK-437 edistänyt bortetsomibi herkkyyttä 253J B-V soluja. Lopuksi shRNA välittämää vakaa knockdovvn Hsp72 in 253J B-V edistänyt herkkyys bortetsomibiin

in vitro

ja tuumoriksenografteissa

in vivo

. Yhdessä tuloksemme tarjota proof-of-concept käyttää Hsp72 estäjiä edistää bortetsomibi herkkyys virtsarakon syöpien ja viittaavat siihen, että valikoiva kohdentaminen HSPA1B voisi tuottaa synteettisiä kuolleisuutta kasvaimia, jotka näytetään HSPA1A promoottori metylaatio.

Citation: Qi W White MC, Choi W, Guo C, Dinney C, McConkey DJ, et al. (2013) esto Inducible Heat Shock Protein-70 (Hsp72) Parantaa Bortetsomibi-solukuolema in Human virtsarakon syövän solut. PLoS ONE 8 (7): e69509. doi: 10,1371 /journal.pone.0069509

Editor: Kevin Robert Kozak, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, Yhdysvallat

vastaanotettu 11 joulukuuta 2012 mennessä; Hyväksytty: 10 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 18 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Qi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat MD Anderson SPORE in Genitourinary Cancer (P50 CA091846), Cancer Center Support Grant (CA016672), ja Proteasome esto ja ER Stress (R01 CA127494). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai perparation käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että lisää proteiinisynteesiä (käännös) on ratkaisevaa neoplastisen transformaation. Seurauksena tästä kasvusta, syöpäsolut näyttävät olevan erityisen herkkiä tekijöille estämällä poistaminen yhdistettyjen tai väärin laskostuneen proteiineja tuotetaan normaalia sivutuotteena proteiinisynteesiä. Proteasomista on keskeinen rooli vapaassa vahingoittuneiden proteiinien ja proteasomiestäjät indusoida kasvainsolun kuoleman suurelta osin kautta proteiinien aggregaatiota ja proteotoxicity. Kuitenkin soluja suojaava mekanismeja voimistuvan proteasomin esto, rajoittaa vaikutuksia syöpäsolujen kuolemaa [1], [2], [3]. Näin ollen, on mahdollista, että kasvaimia, joilla on puutteellinen (s) näissä cytoprotective mekanismit ovat erityisen herkkiä proteasomiestäjät. Jos asianomaisen cytoprotective mekanismeja voidaan tunnistaa, se voi olla mahdollista tunnistaa näiden kasvainten takautuvasti. Vaihtoehtoisesti voi olla mahdollista kehittää hoitomenetelmiä, jotka häiritsevät näiden cytoprotective mekanismien kautta edistää proteasomin estäjä herkkyys kasvaimissa, jotka muutoin olisivat vastustuskykyisiä tämän luokan lääkkeitä.

Lämpöshokki indusoi myös proteiinien aggregaatiota ja proteotoxicity lämmön shock proteiinit (HSP: t) edistää lämmönkestävyys estämällä sopimaton stressin aiheuttama proteiinien aggregaatiota, avustaminen asianmukaisesti uudelleenpoimuttumisen denaturoidun proteiinien, ja tarvittaessa edistää niiden hajoaminen [4], [5], [6]. Jäsenet Hsp70 perhe ovat kaikkein erittäin konservoituneita proteiineja evoluutiossa ja kriittisiä rooleja näissä prosesseissa [7]. Merkittävä jännitys-indusoituva jäsen Hsp70 kaperonia perheen kutsutaan Hsp72, ja sitä koodaa kaksi geeniä, HSPA1A ja HSPA1B, jotka tuottavat Hsp72-isoformien, jotka jakavat kaikki paitsi kaksi aminohappoa, ja arvellaan olevan toiminnallisesti tarpeeton [8]. Hsp72 ilmentymistä ohjataan nopeaa käyttöönottoa heat shock factor-1 (HSF1), transkriptiotekijä, joka sitoutuu useita erityisiä vaste-elementit sijaitsevat hsp72-isoformi promoottorit ja promoottorit muiden lämmön aiheuttamaa cytoprotective chaperones [9]. Hsp72 on erittäin homologinen 78 kDa glukoosin säätelemä proteiini (HSPA5, GRP78 /BiP), joka on keskeinen rooli koordinoinnissa aktivointi avatulla proteiinivaste (UPR) ja on myös aiheuttama proteasomiestäjät [10]. Hsp72 ilmentyy korkeilla tasoilla pahanlaatuisissa kasvaimissa eri alkuperää [11], [12], edistää syöpäsolujen eloonjäämistä [13], [14]. Tärkeää on, Hsp72 on myös voimakkaasti indusoi proteasomiestäjät [15], [16].

Aikaisemmassa tutkimuksessa raportoitiin, että noin puolet ihmisen virtsarakon syövän solut ovat resistenttejä sytotoksisille vaikutuksille bortetsomibihoidon

vuonna vitro

[17]. Täällä, käytimme geeniekspressioprofilointi tutkia cytoprotective mekanismeja, jotka edistävät bortetsomibille vastus, ja totesi, että Hsp72 on yksi voimakkaasti aiheuttama geenien mRNA-tasolla seuraavat bortetsomibilla altistuksen. Kuitenkin olemme huomanneet, että Hsp72 ilmaisu on isoformi-spesifinen osajoukko virtsarakon syövän solujen (UM-UC10 ja UM-UC13) seurauksena promoottorin metylaation HSPA1A isoformin. Nämä solut lisääntynyttä ilmentymistä HSPA1B isoformin siten, että perus- ja bortetsomibilla aiheuttama Hsp72-proteiinin pitoisuudet ovat samanlaisia ​​kuin solulinjoissa, jotka ilmentävät sekä A1A ja A1B isoformeja (253JB-V ja SW780). Olemme myös ilmoittaa, että tukahduttaminen Hsp72 induktion tehostetun bortetsomibihoitoon solukuolema sekä 235JB-V ja UM-UC10, ja yli-ilmentyminen Hsp72 suojattu UM-UC10 ja UM-UC13 soluja bortetsomibihoidon aiheuttamaa sytotoksisuutta. Kaiken riippumatta siitä mikä isoformin synnyttää Hsp72-proteiinin ilmentymisen, meidän tiedot osoittavat, että tukahduttaminen Hsp72 induktio lisää bortetsomibin herkkyyttä, ja tuetaan edelleen kehittämistä HSF1 ja Hsp72-inhibiittorit lisätä bortetsomibi herkkyys virtsarakon syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja reagenssit

Virtsarakon syöpä solulinjat saatiin MD Anderson Virtsarakon syövän SPORE Cell Line Repository ja ylläpidetään MEM, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Omega Scientific, Tarzana, CA). Aitouden kaikki solulinjoissa vahvistettiin talletuksen DNA-sormenjälkien, ja niiden identiteetit rutiininomaisesti vahvistettiin aikana kokeiluja MD Anderson Ominaista Cell Line Core [18]. Solulinja 253-JB-V, [19] UMUC-10, [20] ja UMUC-13 [20] eristettiin potilaista, joilla uroteelisyöpä. SW780 on alunperin hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) on Biocompare.com. Bortetsomibi hankittiin ChemieTek (IN, USA). Sillä

in vitro

kokeissa bortetsomibi liuotettiin DMSO: hon varastossa pitoisuutena 10 mM, steriloitiin suodattamalla 0,22 um: n ruiskun suodattimen, erillä säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Ennen käyttöä, kaluston laimennettiin väliaineessa haluttuun pitoisuuksia. Injektiota varten hiiriä, bortetsomibi liuotettiin suolaliuokseen, joka sisälsi 10 mg /ml mannitolia juuri ennen käsittelyä.

elinkykyyn määritykset

Solut altistettiin bortetsomibiin, kerätään ilmoitettuina ajankohtina trypsinoimalla, ja suspendoitiin uudelleen 500 ui PBS: ää. Viisikymmentä ui PBS: ää, pH 7,4, joka sisälsi 100 ug /ml propidiumjodidia (PI) lisättiin uudelleensuspendoituja soluja, ja PI-otto (osoittaa solukuolemaa) analysoitiin välittömästi virtaussytometrialla (FACS) on Cytomics FC 500 CXP Software (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA

trypaanisiniekskluusiolla, solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä, värjättiin 0,4% trypaanisinisellä (Invitrogen), ja solut laskettiin hemosytometrillä. koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Microarray Analyysit

Microarray kokeet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21] vähäisin muutoksin. RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol Reagent (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY ), jota seurasi puhdistus, jossa RNeasy Mini sarjat (Qiagen, Germantown, MD). RNA: ta käytettiin synteesiin biotiini-leimattua cRNA, joka oli valmistettu käyttäen Illumina RNA-monistus kit (Ambion /Life Technologies), ja sen jälkeen hybridisoidaan Illumina ihmisen HT12 (Illumina, Inc., Hayward, CA) sirut. Pesty sirut skannattiin BeadStation 500x (Illumina) ja signaalin intensiteetin määrällisesti BeadStudio (Illumina). Heatmap tehtiin käyttämällä Cluster 3.0 ja Java Puunäkymäikkuna päässä Eisen Lab (https://www.eisenlab.org/eisen/). Microarray aineisto löytyy Gene Expression Omnibus, hakunumero GSE46132.

mRNA Extraction, käänteistranskriptio ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

mRNA louhinta ja käänteinen transkriptio suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22 ]. RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen), ja cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen SuperScript III Ensimmäisen Strand Synthesis System for RT-PCR: llä (Invitrogen). Real-time PCR for HSPA1A, HSPA8, HSPB1, DNAJB1 ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) suoritettiin käyttäen StepOne reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems /Life Technologies). Taqman Alukesarjat varten HSPA1A (Hs00359163_s1), HSPA1B (Hs00271244_s1), pan-HSPA1A HSPA1B (Hs00271229_s1), HSPA8 (Hs03045200_g1), HSPB1 (Hs03044127_g1), DNAJB1 (Hs00428680_m1), ja GAPDH (4333764F) hankittiin Applied Biosystems. Vahvistusta protokolla koostui yksi sykli 50 ° C: ssa 2 min, yksi sykli 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C: ssa 60 s, ja transkripti kvantitoitiin käyttäen vertaileva C

T -menetelmä. Tuloksena tiedot analysoitiin StepOne ohjelmistoja ja ilmaistiin keskiarvona suhteet (suhteellinen ilmaus hallita) ± SE, ja GAPDH toimi sisäisen kuormituksen valvonta.

Solujen käsittely 5-atsa-2′ deoksisytidiini (5-AzdC) B

solut maljattiin alhaisella tiheydellä (-5 x 10

4 solua /kuoppa) 6-kuoppaisilla levyillä ja niiden annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten solut altistettiin 5 uM 5-AzdC liuotettiin 50% etikkahappoa ja 5 päivää. Bortetsomibi (30 nM) lisättiin sitten sopiviin kuoppiin 6 tuntia ennen sadonkorjuuta päivänä 5, ja solut kerättiin RNA: n eristämistä. 5-AzdC saatiin Sigma.

DNA Metylointi Analyysi

Genominen DNA eristettiin käyttämällä genomista DNA: eristäminen (Qiagen). DNA (1 ug) muutettiin natriumbisulfiitin avulla EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Bisulfiitti-modifioitu DNA saatettiin sitten metylaatiospesifinen PCR (MSP). Alukkeet, joita käytetään MSP suunniteltiin käyttäen Methprimer. Aluke asetetut muunnetun metyloitua DNA oli 5′-TGTTTTTTTTATTCGGATTAGTTAAC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCACCTACTCGCTAAAACTACGTA-3’ (reverse); Aluke asetetut muunnetun metyloitumattoman DNA oli 5’TTTTTTTTATTTGGATTAGTTAATGT -3 ’(eteenpäin) ja 5’CCCACCTACTCACTAAAACTACATA -3’ (taaksepäin). PCR-protokolla sisälsi aluksi inkuboitu 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 35 sykliä 95 ° C 30 s, 49 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 40 s, ja sen jälkeen yksi sykli 72 ° C: ssa 10 min. MSP-PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. Täysin metyloitu kontrolli-DNA ja metyloitumaton kontrolli-DNA käytettiin kontrolleina.

immunoblottauksella

Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja lyysattiin puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na-

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM beeta-glyserofosfaatti, 1 mM Na-

3VO4, 1 ug /ml leupeptiiniä ja 1 mM PMSF: ää. Koko-solu-uutteita (20 ug kokonaisproteiinia) tehtiin natriumdodekyylisulfaatti-10% polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraanit tutkittiin ensin joko monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen Hsp72 (SPA-810, Stressgen /Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY), HSF1 (SPA-901, Stressgen /Enzo) tai ihmisen beeta-aktiini (Sigma, St. Louis , Mo.), ja sitten asianmukaiset piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla toisen vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). Immunodetektio suoritettiin käyttäen ECL (Amersham, Piscataway, NJ) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Kromatiini Immunosaostaminen

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) suoritettiin siru-IT ™ Express entsymaattinen kit, ja siru -IT ™ Control Kit (Active motiivi) mukaan valmistajan protokollaa. Ohjaus ja bortetsomibin käsitellyn 253JB-V ja UM-UC13 soluja (1,5 x 10

7 kukin) kiinteään 8 minuuttia huoneenlämmössä ja sheared entsyymidigestiolla 10 minuuttia. Leikatussa kromatiinin tuotti nauhojen välillä 200-1500 bp, kuten visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. DNA sitoutuu HSF1 saostettiin anti-HSF1-vasta-aine (Stressgen /Enzo, SPA-901). Monistamaan HSF1 sidottu HSPA1A promoottorin, saostunut DNA saatettiin reaaliaikaisen PCR: llä käyttäen TaqMan® Gene Expression Master Mix Custom TaqMan® Gene Expression Assay alukkeita (ABI), joka vastaa HSF1-sitova alue HSPA1A promoottorin ( -10–180) [23], [24]. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI StepOne kanssa seuraavissa olosuhteissa: 5 minuuttia 50 ° C: ssa; 10 minuuttia 95 ° C: ssa; sitten 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 60 sekunnin ajan. Esitetyt tiedot edustavat tuloksia kolmesta eri ChIP kokeiluja ja normalisoitiin reaktiot suoritettiin 1% panos. Päätepiste PCR-reaktiot suoritettiin myös, kuten aiemmin on kuvattu [25], vahvistaa reaaliaikainen PCR-tuloksia. Normaali IgG-vasta-ainetta käytettiin verrokkina.

Molecular Modulation of Hsp72 Expression

Lentivirusvektorit pLKO.1 perustuvia konstrukteja TRCN0000008762 ja TRCN0000008757 erityisesti kohdistettu Hsp72-geenin ostettiin Open Biosystems, Inc. tyhjän pLKO.1 vektoria käytettiin kontrollina. Rekombinanttivirukset tuottanut kalsiumfosfaattitransfektiolla of HEK293T solujen käyttämällä standardimenetelmiä. Päivänä 2-3 post-kulttuuri, 253J-BV-soluja inkuboitiin shRNAs ja polybreenin (6 ug /ml) 16~24 tuntia, ja transdusoidut solut valittiin 1 ug /ml puromysiiniä. Ohimenevää hiljentäminen Hsp72 UM-UC10-soluissa, soluja inkuboitiin 6 tai 24-kuoppaisilla levyillä 72 tunnin ajan joko ei-kohdistuksen (D-001206-14-20), siHSPA1A (L-005168-00), tai HSPA1B (L-003501-00) siRNA rakentaa alkaen Dharmacon /Thermo Scientific, Waltham, MA. Lipofectamine RNAiMAX transfectionreagent (Invitrogen) käytetään parantamaan siRNA toimituksen mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä yli-ilmentyminen Hsp72, Precision LentiORF RFP ohjaus (OHS5832) ja Precision LentiORF yksittäisiä kloonin HSPA1A (OHS5897-100998480) ostettiin Open Biosystems, Inc. Transdusoidut solut valittiin 5 ug /ml blastisidiinia ja FACS-lajittelu GFP-positiivisten solujen .

Lysosomaalinen Integrity määritykset

Solut (~1-2 x 10

5) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten solut altistettiin bortetsomibihoitoon 24 tuntia. Sen jälkeen lääkehoidot, 100 nM LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probes /Life Technologies, Grand Island, NY) lisättiin soluihin 30 minuuttia ennen sadonkorjuuta. Solut trypsinoitiin, pestiin kerran PBS: lla, ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen PBS: ään, ja fluoresenssi mitattiin käyttämällä Beckman Coulter FC500 virtaussytometrillä.

Vieraslajisiirteen Studies

nainen kateenkorvattomia nude-hiiriä hankittiin National Cancer Institute (NCI-Frederick). Hiiret majoitettiin ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa hyväksytyissä tiloissa American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care ja voimassa olevien määräysten ja standardien Yhdysvaltain Department of Agriculture, United States Department of Health and Human Services. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Teksasin yliopiston M. D. Anderson Cancer Center Animal Care ja Käytä komitea (ACUF Protocol # 11-00-12734). Hiiriä seurataan päivittäin, myös viikonloppuisin ja pyhinä, jossa eutanasia suoritetaan käyttämällä CO2, jos jokin seuraavista: kasvaimen suurempi kuin 1,5 cm, 20% laihtuminen, uupumus, kyvyttömyys saada ruokaa ja /tai vettä, labored hengitys, kyyryssä ryhti, vatsan turvotus vastaa raskaana hiiri, tai hoitoa seurauksena kasvaimen kasvua.

Nude hiiriä (NIH, 6 viikon ikäisille) ympättiin ihonalaisesti (sc) 2 x 10

6 253J BV transdusoitujen solujen kanssa HSPA1A shRNA konstrukti (253JB-V.KDHsp72) tai ei-kohdistuksen ohjaus konstrukti (253JB-V.NT) (10 hiirtä /ryhmä). Kun kasvaimet tuli kouraantuntuva (5~7 päivää), hiiret satunnaistettiin valvoa tai hoitoryhmissä. Hiirille i.v. (Häntälaskimoon) joka toinen viikko 1 mg /kg bortetsomibi keittosuolaliuoksessa, joka sisälsi 10 mg /ml mannitolia tilavuudessa 100 ui tai 100 ui fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 10 mg /ml mannitolia ajoneuvon ohjaus. Mittaharppimittauksilla pisimmistä kohtisuorassa kasvain halkaisijat tehtiin kahdesti viikon kuluttua hoidon aloittamisesta, ja volyymit kasvaimia lasketaan kaavalla: W * W * L /2 (jossa W ja L edustaa poikittainen halkaisija, ja pisin pitkittäinen) . H 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Differential induktio HSPA1A vuonna Virtsarakon syövän solut

Valitsimme neljän edustavan ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa ( 253J BV, SW780, UM-UC10, ja UM-UC13) karakterisointiin molekyylitason biologisten mekanismien jotka määräävät solujen vastata proteasomin estäjä bortetsomibi. Ensin vahvisti, että solulinjat olivat heterogeenisiä suhteessa niiden herkkyys bortetsomibiin indusoimaa solukuolemaa määritettiin käyttäen propidiumjodidivärjäys ja FACS-analyysillä (PI-FACS) mitata plasmamembraanin menetys eheyden (Fig. 1A). Sitten käytetään koko genomin mRNA: n ilmentymisen profilointi (Illumina Platform) tunnistaa geeniekspressiomalleja liittyvän lääkkeen herkkyys ja /tai resistenssin. Bortetsomibi indusoi voimakkaan säätelyä koodaavan mRNA: n suuret indusoituvaa isoformia Hsp72 (HSPA1A) mahdollisimman bortetsomibihoidon kestävä solulinja (253J B-V), mutta ei kaikkein huumeiden herkkä viiva (UM-UC13) (Fig. S1). Olemme vahvistivat nämä tulokset käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä, joka osoittaa, että HSPA1A mRNA indusoitua voimakkaasti bortetsomibia 253JB-V ja SW780-soluja (~25-60 kertaiseksi käsittelemättömään tasoa), kun taas ilmentyminen kasvoi vain hieman indusoi (~2- 4 kertaiseksi käsittelemättömän tasoilla) UM-UC10 ja UM-UC13 soluja (Fig. 1 B). Olemme myös huomanneet hyvin alhainen pohjapinta HSPA1A mRNA: n ekspression UM-UC10 ja UM-UC13 soluja (~50-250 kertaa pienempi kuin 253JB-V ja SW780) ja nämä erot pahensi kun bortetsomibia altistuksen niin että HSPA1A ekspressiotasot olivat ~1000-3000 kertaisesti pienempi UM-UC10 ja UM-UC13 soluissa kuin 253JB-V ja SW780 (Fig. 1 B). Kuitenkin immunoblottauksella paljasti vertailukelpoisia Hsp72-proteiinin tasoa kaikissa 4 solulinjoissa (Fig. 1 C).

. Vaikutukset Bortetsomibin solukuolemaan. Virtsarakon syöpäsolulinjoista (253JB-V, SW780, UM-UC10, UM-UC13) inkuboitiin kanssa tai ilman 100 nM bortetsomibilla 24 tuntia ja PI /FACS käytettiin määrittämään solujen kuolemaan. Mean ± SEM, n = 3. B. Vaikutukset Bortetsomibin mRNA- ilmentyminen Hsp72 isoformin HSPA1A. Solut altistettiin 30 nM bortetsomibin 6 h ja HSPA1A mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. RQ = suhteellinen määrä (GAPDH). Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM (N≥3) C. Vaikutukset Bortetsomibin on Hsp72-proteiinin tasoja. Soluja inkuboitiin 16-18 tuntia 30 nM bortetsomibin (nM), ja Hsp72 tasot mitattiin kokosolulysaateista immunoblottauksella. Blots edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

HSPA1B Isoformi Kompensoi Menetys HSPA1A Expression in UM-UC10 ja UM-UC13 Cells

Hsp72 koodaa kaksi riippumatonta geneettistä lokusta (HSPA1A ja HSPA1B), jotka tuottavat erittäin homologinen proteiini tuotteita. Siksi tunnettu HSPA1B ilmaisun HSPA1A

alhainen soluja. Käytimme spesifisiä alukkeita kaksi isoformia Hsp72, HSPA1A ja HSPA1B, sekä alukkeen tunnustetaan sekä (pan) isoformien vertailua varten. Meidän data paljasti, että HSPA1A

alhainen soluja (UM-UC10, UM-UC13) oli korkeampi ilmentyminen HSPA1B isoformin lähtötilanteessa kuin ei HSPA1A-korkea-soluja (253JB-V, SW780) (Fig. 2A). Lisäksi HSPA1B ilmentyminen vahvemmin jälkeen aiheutunut bortetsomibi altistuminen HSPA1A

alhainen solujen linjat, jotka puuttui A1A isoformin (Fig. 2B). Tärkeää on, ilmentyminen mitattuna yleiseurooppalaisen pohjamaali oli samanlainen kaikissa neljässä solulinjoissa, jotka vahvistavat immunoblottaus tiedot (Fig. 1 C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että lisääntynyt HSPA1B ilmaisu kompensoi puute HSPA1A ja osuus oli Hsp72-proteiinin ilmentymistä UM-UC10 ja UM-UC13 soluissa.

. Perusilmennystä HSPA1A ja HSPA1B isoformit kaikkien neljän solulinjat. B. Bortetsomibi indusoima HSPA1A ja HSPA1B kaikkien neljän solulinjat. Spesifisiä alukkeita kunkin isoformin, sekä yleiseurooppalainen pohjamaali, joka tunnustetaan sekä isoformit, käytettiin mittaamaan ilmentymisen kvantitatiivinen RT-PCR. Arvot edustavat keskiarvoa ± SE (n = 2). RQ = suhteellinen määrä (GAPDH).

puute HSPA1A indusoitavuus UM-UC10 ja UM-UC13 Cells johtuu Promoottori Metylointi

Heat shock factor-1 (HSF1) aktivointi ohjaa globaali kuumuus iskuvastetta ja stressin aiheuttama säätelyä Hsp72 [28]. Sen testaamiseksi HSF1 ilmentymistä vaikuttavat erot HSPA1A ilmaus keskuudessa solulinjat, mittasimme HSF1 mRNA ja proteiini tasoilla 253JB-V (HSPA1A

korkea) ja UM-UC13 (HSPA1A

matala) soluja. Havaitsimme vaatimaton eroja tyvi- ja BZ aiheuttama HSF1 mRNA-tasojen välillä 253JB-V ja UM-UC13 soluissa; Erityisesti, 253JB-V osoitti 2-kertainen nousu HSF1 tasoilla, kun lääkkeen altistumista, kun taas UM-UC13 osoitti vain ~1.3 kertaiseen kasvuun, mutta oli 2-kertainen HSF1 mRNA: n ilmentymisen lähtötilanteessa kuin ei 253JB-V (Fig. 3A, vasen paneeli). Kuitenkin proteiinin tasot esiintyi oleellisesti sama molempien solutyyppien (Fig. 3A, oikea paneeli). Lisäksi muita HSF1 tavoitteita indusoituu voimakkaasti, mukaan lukien edellä mainitut HSPA1B (Fig. 2) ja DNAJB1 (Hsp40) (Fig. S2) UM-UC10 ja UM-UC13-soluissa viittaa siihen, että ei ollut yleistä vikaa endogeenisen HSF1 aktivaation nämä solut. Siksi perusteltu, että UM-UC10 ja UM-UC13 solut saattavat olla niin erityiset vika (t) HSF1-välitteisen HSPA1A promoottori. Tämän mukaisesti ajatuksen, kromatiinin immunoprecipiation (chip) paljasti, että 253J BV solut hallussaan korkeampia HSF1 sitoutumisen HSPA1A promoottori lähtötilanteessa ja seuraavan bortetsomibilla altistuksen kuin teki UM-UC13 (~ 2-kertainen ja -5 kertaa suurempi, tässä järjestyksessä) (Fig. 3B). Taitteen-induktio HSF1 sitoutumisen bortetsomibilla oli ~9-kertainen vs. ~ 4-kertaisesti 253JB-V ja UM-UC13, vastaavasti. Analyysi HSPA1A promoottorin avulla UCSC Genome Browser paljasti, että se sijoittuu CpG saari, joka on metyloitu muissa syöpäsolulinjoissa (Fig. S3). Käyttäen metylaatiospesifinen PCR: ää varmistimme, että HSPA1A promoottori voimakkaasti metyloitu UM-UC10 ja UM-UC13 mutta ei 253J B-V tai SW780-soluja (Fig. 3C), joka mahdollisesti oli viallinen bortetsomibilla aiheuttama HSPA1A induktio. Suoraan testata tätä mahdollisuutta, selvitimme vaikutuksia histoni metyylitransferaasi inhibiittori 5-atsa-2′-deoksisytidiini perustason ja bortetsomibiin aiheuttama HSPA1A mRNA tasot UM-UC10 ja UM-UC13 soluissa. Inhibiittori aiheuttama suuri nousu sekä perus- että proteasomin estäjän aiheuttama HSPA1A tasoilla bortetsomibin herkkien solulinjoissa (Fig. 3d). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kromatiinin metylaatio vastaa viallisen HSPA1A induktio havaittiin UM-UC10 ja UM-UC13-soluissa.

. Expression of HSF1. 253J B-V ja UM-UC13 virtsarakon syöpä solulinjoja altistettiin bortetsomibille 12 tuntia ja HSF1 mRNA (vasen paneeli) ja proteiinin tasot (oikea paneeli) mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: lla ja immunoblottaus, vastaavasti. Arvot edustavat keskiarvoa ± SE (n = 2); blots edustavat ainakin kahden itsenäisen kokeen. B. Kromatiini immunosaostus (chip) analyysi HSF1 sitoutumisen HSPA1A promoottori. Huomaa, että perus- ja bortetsomibilla aiheuttama HSF1 sitova pieneni huomattavasti vuonna bortetsomibin herkkä UM-UC13 soluissa. Mean ± SEM, n = 3. * P 0,05 C. Selective metylaatio HSPA1A promoottorin bortetsomibin herkkä ihmisen virtsarakon syöpäsoluja. Metylaatiospesifinen PCR: ää käytettiin arvioimaan kromatiinin metylaatio huumeiden herkkiä (UM-UC10, UM-UC13) ja lääkeresistenttejä (253J B-V, SW780) solulinjat, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. m, metyloitu; u, metyloimattomia. m /u-suhteet laskettiin densitometrisesti. Tiedot edustavat ainakin kahden itsenäisen kokeen. D. DNA metyylitransferaasi inhibiittori 5-atsa-2′-deoksisytidiini palauttaa HSPA1A ilmentymistä bortetsomibi-herkkien solujen. Soluja inkuboitiin 5 uM 5-AzdC varten 5 päivää ja sitten niitä inkuboitiin kanssa tai ilman 30 nM bortetsomibilla 6 h, ja HSPA1A ilmentyminen mitattiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM, n = 3. RQ = suhteellinen määrä (GAPDH).

modulaatio HSPA1A ja HSPA1B Ekspressio HSPA1A

alhainen Solut

Koska UM -UC10 ja UM-UC13 puuttui HSPA1A ilmaisua, me tutki korvaamalla HSPA1A isoformin edistäisi bortetsomibilla vastus. Tilanteen korjaamiseksi olemme vakaasti yli-ilmentynyt HSPA1A sekä UM-UC10 ja -UC13 soluja käyttäen lentivirusvektorilla. HSPA1A mRNA ilmentyminen vahvistettiin käyttämällä qRT-PCR ja Hsp72 kokonaisproteiinin kasvaa immunoblottauksella (Fig. 4A). HSPA1A yli-ilmentävät solut ja tyhjän vektorin Transdusoimattomia soluja altistettiin sitten bortetsomibiin, ja olemme havainneet, että yli-ilmentyminen vähentää merkittävästi bortetsomibihoidon indusoimaa solukuolemaa (kuvio. 4B). Toisaalta, koska UM-UC10 ja -UC13 solut näyttivät olevan pelkkiin HSPA1B mRNA: n Hsp72-proteiinin ilmentymisen, me arveltu, että nämä solut voivat olla erityisen alttiita kohdentaminen HSPA1B. Tämän testaamiseksi käytimme siRNA ohimenevästi hiljentää HSPA1B in UM-UC10 soluissa. Analyysi pudotus tehokkuutta paljasti, että kaupallisesti saatavilla siRNA: t eivät voi kohdistaa yksittäisten isoformien (ts siHSPA1A vaiennetaan HSPA1B) (Fig. 4C). Kuitenkin yhdistelmä siHSPA1A ja siHSPA1B sekvenssit saatiin paras (mutta ei täydellinen) yleistä pudotus on A1B isomuodon sekä RNA: n ja proteiinin taso (Fig. 4C). Käyttämällä tätä strategiaa, olemme vahvistaneet, että saarto HSPA1B induktion herkistynyt UM-UC10 solujen bortetsomibiin (Fig. 4D).

. Vaikutukset täytäntöön HSPA1A ilmentymisen vaikutus HSPA1A mRNA ja Hsp72 kokonaisproteiinin tasoilla UM-UC10 ja UM-UC13 soluissa. Solut stabiilisti transdusoitu lentiviruksen HSPA1A ekspressiokonstrukti, ja HSPA1A mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Mean ± SEM, n = 3. RQ = suhteellinen määrä (GAPDH). Proteiini mitattiin kautta immunoblottauksella. Blots edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta. B. Vaikutukset HSPA1A ilmentymisen vaikutus bortetsomibiin aiheuttamaa solukuolemaa. Solut, jotka oli transdusoitu tyhjällä vektorilla (NT) kanssa tai HSPA1A ekspressiokonstruktin altistettiin 30 nM bortetsomibin 24 tuntia ja solukalvon eheyden mitattiin trypaanisinistä otto. (Läsnäolo RFP vuonna ilmentämiskonstruktin esti käytämme PI /FACS solukuoleman määritys.) Keskiarvo ± SEM, n = 3. *, P 0,02. C. knockdovvn HSPA1B in UM-UC10 soluissa. Vasen paneeli, knockdown hyötysuhteet siRNA vastaan ​​HSPA1A, HSPA1B tai molempia isoformeja mitattuna kvantitatiivisen RT-PCR altistuksen jälkeen 30 nM bortetsomibin 6 tuntia. RQ = suhteellinen määrä (GAPDH). Oikea paneeli, vastaava knockdovvn Hsp72-proteiinin tasot ero siRNA sekvenssit altistuksen jälkeen 30 nM BZ 14 tuntia. Tiedot edustavat kahden riippumattoman kokeen. D. vaikutus HSPA1B Knockdown on bortetsomibiin aiheuttama solukuolema UM-UC10 soluissa. Sen jälkeen 72 h Knockdown, solut altistettiin 30 nM bortetsomibin 24 h ja solukuoleman mitataan PI /FACS-analyysi. Arvot edustavat keskiarvoa ± SE (n = 3). * P 0,01.

Hsp72 induktio Estää Bortetsomibi aiheuttama solukuolema

suoremmin selvittää bortetsomibihoidon aiheuttama Hsp72 säätelyä edistetään vastus, olemme vakaasti pudotti Hsp72 in 253JB-V bortetsomibihoidon-resistentit solut käyttäen lentiviraalinen shRNA vektorin (Fig. 5A). Baseline HSPA1A mRNA tasot alenivat yli 75% soluissa, mutta shRNA välittämää tukahduttaminen HSPA1A mRNA (Fig. 5A. Yläpaneeli) ja Hsp72-proteiinia (kuvio. 5A, alempi paneeli) oli vähemmän vaikuttava seuraavat Bortetsomibialtistus, oletettavasti koska proteasomin estäjä tuotti niin vahva säätelyä Hsp72. Kuitenkin, vakaa Hsp72 pudotus merkittävästi parannettu bortetsomibihoidon aiheuttama plasmamembraanin menetys eheyden mitattuna propidiumjodidilla sisäänoton (kuvio. 5B). Aiemmat tutkimukset todettiin, että Hsp72 induktio palvelee cytoprotective toimintoa integroidun stressivaste (ISR) stabiloimalla lysosomeihin [29]. Näin ollen emme verrattiin Bortetsomibin on lysosomaalisen eheyden 253JB-V transdusoitujen solujen kontrollivektorilla (253JB-V NT) tai KD9 HSPA1A-spesifinen shRNA konstrukti. Bortetsomibi juurikaan ole vaikutusta lysosomaalisen eheyden 253JB-V NT soluissa, mutta indusoi vahvat, pitoisuudesta riippuvainen menetys lysosomaalisen eheyden 253JB-V-KD9 soluissa (kuvio 5C). injektio.