Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimukset ovat ehdottaneet mahdollinen korrelaatio vastikään havaittuja E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla etusormi proteiini 146 (RNF146) ja kasvainten kehittymiseen. Kuitenkin vasta nyt, tutkimuksia RNF146 pitänyt rajoittaa poly (ADP-ribosyl) ation ja ubikitiinipromoottori ligaatio, kun taas rooli RNF146 kasvaindiagnostiikassa on harvoin raportoitu. Esillä olevassa tutkimuksessa, rooli RNF146 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) tutkittiin. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen RNF146 lisättiin kliinisissä keuhkosyövän näytteitä ja solulinjoissa. RNF146 ilmentyminen korreloi kasvaimen kokoa, erilaistuminen tasolla imusuonten etäpesäkkeiden pTNM lavastus, ja ennusteen potilaiden vaiheessa I. RNF146 ilmentyminen korreloi negatiivisesti ak- siini ilme mutta korreloi positiivisesti ydinvoiman ilmaus β-kateniinin NSCLC kudoksissa. RNF146 vaimentua ilmentymistä ak- siini keuhkosyövän solulinjat ja indusoi ilmentymistä ja ydinvoiman jakelu β-kateniinin. N yli-ilmentyminen RNF146 NSCLC solulinjoissa nostivat cyclinD1, sykliini, ja CDK4, edistänyt solusyklin G

0 /G

1-S siirtymiä, ja säännelty soluproliferaatiota. Yliekspressio RNF146 johti ilmen- tymisen lisääntymisen tasoa matriksin metalloproteinaasien 2 ja 7 ja parantaa keuhkosyöpäsolua invasiivisuus, tapahtumat, joiden välittämä klassisen Wnt /β-kateniinin signalointireitin. Yhteenvetona tiedot tässä tutkimuksessa osoittavat, että RNF146 säännelty kehittymistä ja etenemistä NSCLC tehostamalla solujen kasvua, invaasio, ja selviytyminen, viittaa siihen, että RNF146 voi olla mahdollinen hoito tavoite NSCLC.

Citation: Gao Y, Song C, Hui L, Li Cy, Wang J, Tian Y, et ai. (2014) yli-ilmentyminen

RNF146

in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä Parantaa leviämisen ja invaasion Kasvaimet kautta Wnt /β-kateniinin Signaling Pathway. PLoS ONE 9 (1): e85377. doi: 10,1371 /journal.pone.0085377

Editor: Tanya V. Kalin, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 syyskuu 2013; Hyväksytty: 26 marraskuu 2013; Julkaistu: 14 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science Foundation of China (nro 30972967 ja 30973502), Specialized Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen korkeakoulutusalueen (nro 20092104110018), Program for Liaoningin Erinomainen Talents yliopistossa ja Liaoningin maakunnan tiede ja teknologia suunnitelma ohjelma (nro 2012225072). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

E3 ubikitiinipromoottori ligaasit tärkeä rooli säätelyssä solujen toimintoja kuten solujen lisääntymisen, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Ne voivat myös olla muita toimintoja, jotka riippuvat näiden henkilöllisyyden alustoille. Esimerkiksi, jos E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla tavoitteena onkogeenin hajoamiselle, voidaan katsoa kasvainsuppressorigeenin. Vastaavasti, jos E3 uniquitin ligaasia heikentää kasvainsuppressorigeenin proteiiniin, se voidaan pitää onkogeeni. Monet proteiinit, jotka sisältävät RING-finger domeenit joilla on ubikitiini-ligaasiaktiivisuutta, joista jotkut osallistuvat kasvainten synnyssä ja kasvainmetastaasin. Hiljattain tunnistettu E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla etusormi proteiini 146 (RNF146) vuorovaikutuksessa poly (ADP-riboosi) (PAR) kautta PAR sitova motiivi on Trp-Trp-Glu (WWE) domain.

RNF146

-geeni sijaitsee ihmisen kromosomissa 6q22, 33 [1]. RNF146 on hermosoluja suojaava aktiivisuus johtuu sen eston Parthanatos sitoutumisen kautta PAR [2]. RNF146 voivat helpottaa DNA: n korjaukseen solukuolemaa vastaan ​​aiheuttama DNA: ta vaurioittavien aineiden tai γ-säteilytys [3]. Vastauksena soluvaurioita, RNF146 siirtyy tumaan ja parantaa ubikitinaatio ja hajoaminen eri nukleoproteiiniantigeenit, jotka osallistuvat DNA-vaurioiden korjaukseen. Lisäksi, kuten poly (ADP-ribosyyli) ation (PARsylation) ohjatussa E3 ubikitiini-ligaasia, RNF146 säätelee Tankyrase riippuvainen hajoamista ak- siini ja säätelee positiivisesti Wnt-signalointireitin [1].

Wnt signalointia reitti on erittäin aktiivinen keuhkosyövän soluja, mikä johtaa metastaasien ja näiden solujen [4]. Wnt signalointi voi poikkeavasti aktivoida erilaisilla mekanismeilla, ja tärkein tehtävä on estää proteo- β-kateniinin, jota ohjataan fosforylaatio [5]. Vapaa β-kateniinin voi tulla tumaan ja aktivoi kohdegeenien Wnt. Vakaan tilan tasot ak- siini ovat erittäin tärkeitä, koska tämä rakennustelineet proteiini aloittaa muodostumista β-kateniinin hajoamiseen monimutkainen. Tutkijat ovat osoittaneet, että siirto PAR jäämiä ak- siini katalysoi Tankyrase johtaa PARsylation on ak- siini [1], [6]. RNF146 osallistuu hajoamisen PARsylated ak- siini kautta PAR sitova motiivi. Tämä vuorovaikutus johtaa tuhoutumiseen β-kateniinin hajoamiseen monimutkainen yhdistämisestä solunsisäisen β-kateniinin, ja lisääntynyt signalointi kautta Wnt-reitin [1].

Huolimatta monista tutkimuksia RNF146, sen täsmällinen rooli kasvainten synnyssä on epäselvä . Esillä olevassa tutkimuksessa, roolit RNF146 keuhkosyövässä tutkittiin.

Materiaalit ja menetelmät

NSCLC Kudosnäytteiden

Ensisijainen NSCLC näytteitä ja kontrollisilkkipaperia kerättiin 133 potilasta . Normaali keuhko otettiin näytteitä keuhkokudoksesta yli 5 cm syöpä resektio päällä. Menettelyt tapahtui neljännessä Affiliated sairaala China Medical University. Potilaat eivät saaneet säteilyä tai kemoterapiaa ennen leikkausta. NSCLC lavastus perustui TNM luokittelu pahanlaatuisia kasvaimia, seitsemäs painos [7]. Elinaika laskettiin toiminnasta päivä kuoleman kautta arviointiin uusiutumisen ja etäpesäke tai kunnes viime seurannan tasalla. Tuoreet näytteet jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kokeita varten, joihin liittyy ihmisen kudoksia, hyväksyntä on saatu Institutional Review komitean Kiinan Medical University. Kirjallinen suostumus annettiin mukaan Helsingin julistuksen.

Vasta-aineet ja reagenssit

kanin anti-humaani RNF146 polyklonaalinen vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge Science Park). Anti-ak- siini ja anti-β-kateniinin vasta-aineet hankittiin BD Transduction Laboratories (San Jose, CA, USA). Anti-CyclinA, anti-CyclinB, anti-CyclinD1, ja anti-pRB vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology, Inc. (Boston, MA, USA). Anti-CDK4, Anti-CDK6, Anti-TIMP-1, Anti-sykliini, siAxin, siβ-kateniinin, ja siTCF4 oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineita RhoA, RhoB, RhoC, ja Rock1 olivat Proteintech (Chicago, IL 60612, USA). Vasta-aineita CDK2, P21, matriksimetalloproteinaasi 2 (MMP2), MMP7, ja MMP-9 olivat Neomarkers (Palo Alto, CA, USA). Anti-P27 ja anti-P53 olivat Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, USA). Rekombinantti yli-ilmentymisen plasmidit pEX4-hRNF146 ja pGPHI-shhRNF146 ja ohjaus tyhjä plasmidit rakennettiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Immuunihistokemialliset sekundaarinen vasta-kit hankittiin Dako (Kööpenhamina, Tanska).

Solulinjat ja Cell Culture

normaali keuhkoputken epiteelisolujen linja HBE, ihmisen keuhkojen adenokarsinooman solulinjoja A549 ja H1299 olivat hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ihmisen NSCLC solulinjat LK2, LH7, LTE, ja SPC ostettiin Shanghai Cell Bank of Kiinan Academy of Science. Solulinjoja viljeltiin Kaighn n muuttaminen Hamin F-12 Medium, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 tai Dulbeccon modifioidussa Eagle’s-F12 -alustassa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 yksikköä /ml streptomysiiniä (Sigma, St. Louis, MO, USA) 37 ° C: ssa 5% CO

2.

immunohistokemiallinen värjäys

Parafiinisektioista joiden paksuus 4 um, valmistettiin ja immunohistokemiallisesti värjättiin Envision kuten aiemmin on kuvattu [8] – [9]. Parafiininäytteet inkuboitiin anti-RNF146 (1:100), anti-ak- siini (1:200), ja anti-β-kateniinin (1:200) vasta-aineita, 4 ° C: ssa yön yli. PBS-inkuboitu näytteitä käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Kaksi patologia lääkärit arvioinut värjäys tuloksia puolikvantitatiivinen mittakaavassa. Viisi suurta suurennosta kentät valittiin satunnaisesti kussakin osassa, ja 100 kasvainsolujen kunkin alan laskettiin arvioimiseksi voimakkuus ja kantomatka RNF146 värjäystä. Negatiivinen tulos annettiin pistemäärä 0 (ei värjäystä), vaaleankeltainen värjäys kirjattu 1, keltainen pisteytettiin 2, ja syvän ruskea värjäytyminen nauhoitettiin 3. Prosenttiosuus tulokset jaettiin seuraavasti: 5 %, 0; 5-25%, 1; 26-50%, 2; 51-75%, 3; ≥75%, 4. Kaksi itsenäistä tulokset kerrottiin yhteen saamiseksi potilaan väritys kerroin, joka oli luokiteltu ”alhaisen ilmaisulla” väritys kerroin 4 ja ”korkea ilmaisulla” väritys kertoimen ≥4. Ak- siini ja β-kateniinin, pisteytettiin kuten edellä on kuvattu [8] – [9].

Cell transfektio

Solut maljattiin 24-kuoppalevyille noin 50% konfluenssiin ja transfektoitiin plasmidilla tai siRNA 24 tuntia myöhemmin. Transfektio keuhkosyövän solulinjat A549 ja LTE suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeita. Sillä kotransfektiokokeissa, 1-1,5 ug kotransfektoidaan tai tyhjän vektorin ja 45 pmol siRNA lisättiin transfektioseos. 5 tunnin jälkeen 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, täydellistä alustaa lisättiin transfektioseos. Transfektiotehokkuutta määritettiin Western blot.

RT-PCR-määritys

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen) ohjeiden mukaisesti TAKARA RNA PCR Kit (Takara, Dalian, Kiina) . GAPDH ilmaisu toimi sisäisen valvonnan. Alukesekvenssit olivat: RNF146: eteenpäin: 5′-GGACGTCGCAGGAAGATTAAG-3 ’ja reverse: 5′-CAATGGAGGTGTCTGGTGCT-3′; Ak- siini: eteenpäin: 5’-GACTTGCTGGACTTCTGGTT-3 ’ja reverse: 5′-TGTACTTTCGGTAGATGGCT-3′; p-kateniinin: eteenpäin: 5’-CTAAACAGGAAGGGATGGAAG-3 ’ja reverse: 5′-ACAGATGGCAGGCTCAGTGAT-3′; GAPDH: eteenpäin: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3 ’ja reverse: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3’. PCR tuotteet RNF146 (376 emäsparia), ak- siini (109 emäsparia), β-kateniinin (221 emäsparia), ja GAPDH (153 emäsparia) monistettiin 30 PCR sykliä.

Western Blot

Solut hajotettiin puskurissa, joka sisälsi 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotiniinia, ja 1 mM PMSF: ää. Kokonaisproteiinia kerättiin, ja 60 ug erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). Proteiinit PVDF-kalvot estettiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween (PBST), inkuboitiin primaaristen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineita huoneen lämpötilassa 2 tunnin ajan. Membraanit kehitettiin parannettu kemiallinen neste (ECL) (Thermo Fisher Scientific), ja tulokset tallennettiin käyttäen kuvantamiseen järjestelmä (UVP Inc., Upland, CA, USA). Proteiinin ekspressiotasot arvioitiin käyttäen β-aktiini latauskontrollina.

Immunofluoresenssivärjäys

Soluja kasvatettiin lasipeitelevyihin kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja käsiteltiin 0,2% Triton X-100. PBS-pesun jälkeen solut estettiin immunisoimattomista eläimistä seerumin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla anti-RNF146 (1:100), anti-ak- siini (1:100), ja anti-β-kateniinin (1:100) 4 ° C: ssa yön yli. Negatiiviset ja positiiviset kontrollit olivat mukana kaikissa kokeissa. Soluja inkuboitiin FITC tai TRITC-leimatut sekundääriset vasta-aineet (1:100, Chemicon, USA), 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. PBS-pesun jälkeen, soluja inkuboitiin 0,1% 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Invitrogen) 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Solut pestiin PBS: llä ja niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla.

MTT-määritys

Transfektoidut solut ja valvonta-solut maljattiin 96-kuoppalevyille 10

3 solua per kuoppa ja viljeltiin 24 tuntia. Soluproliferaatiota havaittiin solujen laskenta Kit-8-liuosta (Dojindo, Gaithersburg, MD) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) toistettiin 4 peräkkäisenä päivänä. Optinen tiheys mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (Spectra Thermo, Männedorf, Sveitsi) absorbanssilla 550 nm: ssä.

Haavan paranemista määritys

Kukin kuoppa 6-kuoppaiselle levylle siirrostettiin 5 x 10

5 soluja, viljellään 24 tuntia, ja raaputettiin keihäänkärki. Solut pestiin PBS: llä ja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Näytteet kerättiin ja valokuvat otettiin 0, 6, 12 ja 24 tuntia. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa ja keskiarvo-arvot laskettiin.

Transwell

Solususpensiot 100 ui, joka sisälsi 2,5 x 10

6 solua /ml, lisättiin ylempään kammioon transwell-insertin, ja 600 ui alustaa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia pantiin alempaan kammioon. Polykarbonaatti mikrohuokoinen kalvo, jonka halkaisija on 8 um erottaa ylemmän ja alemman kammioihin. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa 6 tuntia. PBS-pesun jälkeen solut kiinnitettiin metanolilla huoneen lämpötilassa 15 minuuttia. Lopuksi käsitellyt solut värjättiin hematoksyliinillä, valokuvia otettiin ja värjättiin solut laskettiin. Mitata invasiivisen solujen kapasiteetin, esijäähdytettyyn alustaa ilman seerumia ja matrigeelin (BD Biosciences, USA) sekoitettiin tilavuussuhteessa 01:07 ja lisättiin ylempään kammioon. Tilavuus seoksen neste oli 100 ui. Soluja käsiteltiin 3 tuntia huoneenlämpötilassa, ja tuloksia saatiin, kun soluja viljeltiin 24 tunnin ajan.

Cell Cycle määritys

Solut ympättiin 5 x 10

6 solua per 6 cm viljelymaljalla, viljeltiin 12 tuntia, ja transfektoitiin. Solut synkronoitu seerumistarvaatio 20 tuntia. Soluja pidettiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% seerumia, 24 tunnin ajan. Solut kerättiin ja fiksoitiin kylmässä 70% etanolia. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin 0,1 mg /ml RNaasiA (Roche Indianapolis, IN) 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja käsiteltiin 5 mg /ml propidiumjodidia 30 minuutin ajan. Lopuksi käsitellyt solut analysoitiin virtaussytometrialla.

Tilastollinen analyysi

Tietokannat perustettiin Excelillä. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen SPSS17.0. Väliset suhteet ilmaisua RNF146, ak- siini, β-kateniinin, ja kliiniset ja patologiset tekijät arvioitiin

χ

2

testi ja Fisherin testiä. Kaplan-Meier selviytymisen käyrät ja Log-rank käytettiin havaitsemaan ja arvioimaan eroja. Muut tiedot vertailtiin

t

-testi. Tiedot kolmen erillisen kokeen näytettiin

± s

.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

RNF146 yliekspressio NSCLC

ilmentymisen tutkimiseksi RNF146 NSCLC, 20 pariksi NSCLC ja ei-syöpäkudoksessa kerättiin, ja RT-PCR: llä ja Western blot käytettiin analysoimaan RNF146 mRNA ja proteiinin ilmentyminen tasolla, vastaavasti. Expression of RNF146 mRNA: n ei-pienisoluisen keuhkosyövän näytteissä oli korkeampi kuin ei-syöpä keuhkojen kudoksiin (

P =

0,030) (kuvio 1A). Tulokset Western blot ja immunohistokemiallisella värjäyksellä vahvistaneet RNF146 proteiinin ilmentyminen lisääntyi NSCLC (

P =

0,014,

P =

0,000) (kuvio 1 B), sopusoinnussa RT-PCR tuloksia. Ilmentyminen RNF146 analysoitiin myös, että HBE ja NSCLC solulinjoissa. Eri ekspressiotasoja RNF146 havaittu joukossa NSCLC solulinjoissa (kuvio 1C). Ilmentyminen RNF146 mRNA ja proteiini sekä HBE ja LK2 (suomuinen) solulinjat olivat alhaiset. Ilmentyminen RNF146 proteiinin LTE (adenokarsinooma) ja LK2 (suomuinen) solulinjat olivat maltillisia, ja ilmentymistä RNF146 proteiinin A549 ja H1299 (adenokarsinooma) solulinjat olivat korkealla. Tiedot osoittivat, että ilmentyminen RNF146 lisättiin kliinisen NSCLC näytteet ja keuhkosyövän solulinjat.

Detection mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä RNF146 20 NSCLC ja kontrollinäytteiden RT-PCR: llä (A) ja Western blot (B). T: kasvainnäytteestä; N: Hyväksytty normaaleissa kudoksissa; M: Marker. (C) mRNA ja proteiini ilmentymistä RNF146 että HBE solulinjassa ja ihmisen NSCLC solulinjoissa LK2, LH7 (levyepiteelikarsinooma syöpä), H1299, LTE, A549, ja SPC (adenokarsinooma). GAPDH ja β-aktiini toimi sisäisen valvonnan. (D) Expression ja jakelu RNF146 in NSCLC immunohistokemiallisesti. D1, RNF146 ei ollut esitetty normaalissa keuhkoputkien ja keuhkorakkuloiden epiteelin. D2, RNF146 ilmaistiin sytoplasmassa keuhkosyövän soluja ja heikkoa RNF146 ekspressiota havaittiin viereisen keuhkoputkien epiteelin. D3 ja D5 osoitti heikkoa RNF146 värjäytymistä hyvin eriytetty levyepiteelisyöpä ja adenokarsinooma. D4 ja D6 osoitti vahvaa RNF146 värjäytymistä huonosti eriytetty levyepiteelikarsinooma ja adenokarsinooma. (E) välinen suhde RNF146 ilmaisun ja ennusteen NSCLC potilaiden. E1 osoittivat korrelaation RNF146 ilmaisun ja ennusteen vaiheen I potilaista (

P

0,05). E2 ja E3 välillä ei RNF146 ilmaisun ja ennusteen vaiheen II ja vaiheen III potilaat (

P

0,05).

tutkia roolia RNF146 NSCLC pidemmälle, suhteita proteiinin ilmentymisen ja kliinisiä patologisia ominaisuudet analysoitiin. Oli väliset korrelaatiot ilmaus RNF146 ja kasvaimen kokoa (

P

= 0,044), histologinen tyyppi (

P =

0,005), huono eriyttäminen (

P

= 0,002) , lymfaattinen etäpesäkkeitä (

P

= 0,009), ja pTNM vaiheessa (

P

= 0,015). Kuitenkin RNF146 ilmentyminen ei korreloi iän tai sukupuolen NSCLC potilaiden (taulukko 1, kuvio 1 D). Lisäksi Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että yli-ilmentyminen RNF146 korreloi selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita I vaiheessa (

P

= 0,016). Ei ollut mitään korrelaatiota RNF146 ilmaisun ja elinaika kaikilla potilailla (

P =

0,616) tai niille potilaille, joilla on vaiheen II (

P

= 0,437), tai vaiheen III NSCLC (

P =

0,520) (kuvio 1 E).

Expression of RNF146, ak- siini, ja Nuclear jakelu β-kateniinin

Koska E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla, RNF146 säätelee Tankyrase -riippuvaisella hajoamista ak- siini ja positiivisesti säätelee Wnt-signalointireitin [1]. Tutkia suhdetta RNF146, ak- siini, ja β-kateniinin, ilmaukset ak- siini ja β-kateniinin 133 NSCLC näytteissä havaittiin immunohistokemiallisella menetelmiä ja korrelaatiot proteiinien laskettiin. RNF146 oli negatiivinen korrelaatio ak- siini lauseke (

P =

0,003), mutta se ei korreloi vähentyneen ilmentymisen β-kateniinin kalvoja tai lisääntyneen ekspression β-kateniinin sytoplasmassa (

P =

0,524). Korkea RNF146 ekspressio korreloi positiivisesti ydin- β-kateniinin värjäytymistä (

P =

0,047) (taulukko 2, kuvio 2A).

(A) Expression ja jakelu RNF146, ak- siini, ja β kateniinin in NSCLC immunohistokemiallisesti (x 200). Vahva ak- siini ilmaisun ja solukalvoissa β-kateniinin korreloi alhaisen ilmentymisen RNF146 vuonna adenokarsinooma (A1). Matala ak- siini ilmaisun ja sytoplasminen ja ydinvoima-ilmentyminen β-kateniinin löydettiin levyepiteelikarsinooma syövissä korkean ilmentymisen RNF146 (A2 ja A3). Expression ja jakelu RNF146, ak- siini ja β-kateniinin havaitaan (B) RT-PCR: llä, (C) Western blot, ja (D) immunofluoresenssi. Solut transfektoitu tyhjällä vektoreilla toimivat kontrolleina.

LTE solulinjat transfektoitiin väliaikaisesti pEX4-RNF146 yli-ilmentyminen plasmidista tai ohjaus pEX4 tyhjällä plasmidilla. Kokeet vahvistivat, että RNF146 oli voimistunut. A549 ja H1299 solulinjat transfektoitiin ohimenevästi RNF146-shRNA1, RNF146-shRNA2 tai valvoa shNC, ja vahvistivat, että RNF146 ilmentyminen väheni (kuvio 2C ja kuvio S1A). Lisäksi ekspressiotasot ak- siini ja β-kateniinin analysoitiin RT-PCR: llä, Western blot, ja immunofluoresenssilla. Yli-ilmentyminen tai knock-alas RNF146 ei vaikuttanut mRNA ekspressiotasot ak- siini ja β-kateniinin (Kuva. 2B). Kuitenkin Western blot tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen RNF146 LTE keuhkosyövän soluja esti proteiinin ekspression ak- siini ja lisääntynyt ilmentyminen β-kateniinin (kuvio. 2C). Immunofluoresenssilla edelleen vahvisti, että yli-ilmentyminen RNF146 laski sytoplasmisen ekspression ak- siini ja lisääntynyt ilmentyminen β-kateniinin sytoplasmassa ja tumassa. Sitä vastoin vähentää ilmentymistä RNF146 lisäsi ekspressiota ak- siini sytoplasmassa ja vähentynyt ilmentyminen β-kateniinin sytoplasmassa ja tumassa (kuvio. 2D).

ilmentäminen RNF146 ja leviämisen Lung Cancer Cells

tutkia roolit RNF146 soluproliferaatioon, LTE ja A549-soluja transfektoitiin plasmideilla, kuten edellä on kuvattu, ja solujen lisääntyminen havaittiin MTT-määritystä. Verrattuna kontrolliryhmään ja ryhmä transfektoitiin tyhjällä plasmidilla, yliekspressio RNF146 tehostaa merkittävästi soluproliferaation LTE soluissa, kun taas knockdovvn RNF146 esti soluproliferaation A549 ja H1299 soluja (kuvio 3A ja kuvio S1B). Solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla, ja tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen RNF146 pieneni prosenttiosuus G

0 /G

1 vaiheen LTE-soluissa ja prosenttiosuus kasvoi ja S-vaiheen soluja. Sen sijaan, knockdovvn RNF146 A549 ja H1299-solujen prosenttiosuus kasvoi solujen G

0 /G

1 vaiheen ja vähensi solujen prosenttiosuus S vaiheessa (kuvio 3B ja kuvio S1C).

(A) MTT soluproleferaatiomäärityksessä yliekspressioon RNF146 ja shRNA välittämä knockdovvn RNF146. **

P

0,05. (B) vaikutukset RNF146 solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla. (C) havaitaan solukierron proteiinin ilmentymisen Western blot.

Western blot Tulokset paljastivat myös, korrelaatioita välisiä RNF146 keuhkosyövän soluihin ja ekspressiota solusyklin liittyviä säätelyproteiineja, mukaan lukien cyclinD1, sykliini ja CDK4 (kuvio 3C). Tulokset osoittivat, että RNF146 säännellä ilmaus cyclinD1 ja sykliini ja säännelty solusyklin etenemisen indusoimalla G

0 /G

1-S siirtyminen.

RNF146 Expression ja Invasion of Lung Cancer Cells

yli-ilmentyminen ja knockdovvn RNF146 vaikutti solumigraatioon ja invaasiota kyvyt NSCLC soluja. Haavan paranemista ja siirtokuoppaan kokeet osoittivat, että yli-ilmentyminen RNF146 tehostetun solumigraation ja hyökkäyksen LTE soluissa, ja että knockdovvn RNF146 laski solumigraation ja hyökkäyksen A549-soluja (kuvio 4A, B, C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin H1299-soluissa, joissa RNF146 ilmentyminen oli kulunut loppuun (kuvio S2, S3). Proteiinit liittyvät maahanmuuttoon ja invaasio havaittiin myös Western blot. Ilmentymistasojen MMP2 ja MMP7 nostettiin LTE-soluja, jotka yli-ilmentyvän RNF146, kun taas taso RhoA, RhoB, RhoC, Rock1, ja TIMP-1 olivat ennallaan. Lisäksi tasot MMP2 ja MMP7 pieneni merkittävästi, kun RNF146 ilmentyminen pudotettiin (kuvio 4D).

(A) Haavan paranemista määritys LTE soluissa yli-ilmentävät RNF146 ja A549-soluja käsiteltiin shRNA-1 kohdistaminen RNF146. Histogrammi näyttää prosenttiosuudet siirtynyt solujen kaavittu alueilla (alhaalla). (B-C) analyysi solumigraation ja invaasion kyky Transvvell- määrityksessä. Histogrammi osoittaa kuinka monen tai tunkeutuu soluihin. (D) Western blot muuttoliikkeen ja invaasion liittyneet proteiinit. β-aktiini toimi sisäisen valvonnan.

RNF146 säädelty ilmentäminen cyclinD1 ja MMP7

Ehdotimme RNF146 säännelty solumigraation ja hyökkäystä epäsuorasti säätelemällä kohde-geenin transkription kautta ak- siini /β-kateniinin signalointia. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me pudotti RNF146 soluissa käsitelty siRNA kohdistaminen ak- siini. Olemme havainneet, että tasot cyclinD1, sykliini, ja MMP7 talteen verrattuna soluihin käsiteltiin shRNF146 yksinään (kuvio 5A). Yliekspressio RNF146 yhdessä siRNA pudotus on β-kateniinin ei aiheuttanut tasoa cyclinD1, sykliini tai MMP7 lisätä, kun taas MMP2 tasot kasvoi edelleen (kuvio 5B). Knockdown endogeenisen TCF-4 LTE-soluissa yhdistettynä yli-ilmentymisen RNF146 ei aiheuttanut tasoa cyclinD1 ja MMP7 lisätä (kuvio 5C). Kuitenkin, kun RNF146 ja TCF-4 tippuu alas A549-soluja samanaikaisesti, ilmaus cyclinD1 ja MMP7 laski enemmän dramaattisesti (kuvio 5D). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että RNF146 todennäköisesti säädellä ilmentymistä cyclinD1 ja MMP7 Wnt /β-kateniinin signalointireitin.

(A) tasot cyclinD1 /E ja MMP2 /7 A549-soluja hoidon jälkeen shRNA suunnattu RNF146 ja siRNA suunnattu ak- siini. (B) tasot cyclinD1 /E ja MMP2 /7 LTE jälkeen yli-ilmentyminen RNF146 ja pudotus on β-kateniinin. (C ja D) tasot cyclinD1 ja MMP7 havaittiin jälkeen knockdown endogeenisen TCF-4 LTE ja A549-soluja yliekspressioon tai knockdovvn RNF146.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että RNF146 yliekspressoitui NSCLC kudoksessa verrattuna viereiseen normaaliin keuhkojen kudoksia. RNF146 ekspressiotaso korreloivat useissa kliinisissä patologisia tekijöitä, kuten kasvaimen koko, erilaistuminen tasolla imusuonten etäpesäkkeiden pTNM lavastus, ja ennusteen potilaiden I vaiheessa, jotka ovat tärkeitä tekijöitä, jotka ovat mahdollisia keuhkosyövän maligniteetti. Nämä tiedot viittaavat siihen, että yliekspressio RNF146 NSCLC voi parantaa etäpesäke keuhkosyöpää, ja että RNF146 saattaa olla merkki huonosta ennusteesta I vaiheessa NSCLC.

Tuloksemme ovat sopusoinnussa havaintojen kaksi viimeaikaiset raportit [10 ] – [11], että RNF146 voi olla mukana kasvainten kehittymisen. Gold

et al.

Löysivät rintasyövän riskiä geenin juutalainen Ashkenazi väestö sijaitsee 6Q 22.33 on genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa. Tämä sijainti sisälsi kaksi geeniä,

RNF146

ja enoyyli CoA hydrataasia verkkotunnuksen, joka sisältää 1 [11]. Toinen tärkeä havainto oli, että RNF146 vuorovaikutuksessa PARsylated ak- siini kautta PAR sitova motiivi, mikä ak- siini hajoamista ja positiivinen säätely Wnt-signalointireitin. Nämä tulokset saatiin uutta näyttöä mahdollisesta roolista RNF146 kasvaimen kehitykseen [1], [6]. On todettu, että vastikään havaittuja RNF146 alustoille perus leusiinivetoketjupeptidit ydin- tekijä 1 (BLZF1) ja syöpäalttiutta ehdokas 3 (CASC3) osallistuvat kasvainten kehittymiseen ja solujen lisääntymistä [12] – [13]. Nämä raportit viittaavat siihen, että RNF146 ehkä tärkeä rooli kasvainten muuttamalla geenien ilmentyminen tai alentavasti kohdeproteiinien.

Wnt-signalointireitin vaikuttaa geenien ilmentyminen ja solujen vaeltamiseen. Koska merkittävä molekyylin Wnt-signalointireitin aktivaatio, ak- siini osallistuu muodostumista ak- siini /glykogeenisyntaasikinaasi 3β (GSK-3β) /adenomatoottisen polypoosin coli (APC) /Kaseiinikinaasi I (CKI) hajoaminen monimutkainen, mikä parantaa hajoamista β kateniinin ja estää kasvaimen leviäminen, invaasio, ja etäpesäkkeiden [14] – [15]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ak- siini on merkittäviä rooleja NSCLC [14]. Ak- siini ilmentyminen on osoitettu estävän leviämisen ja invaasion keuhkosyövän soluja [9]. Soluliman vakauttaminen ja kertymistä ydin- β-kateniinin, tärkeä signaali muuntimen, ovat tärkeitä prosesseja Wnt signaalitransduktion.

Huomasimme, että RNF146 oli negatiivinen korrelaatio ilmaus ak- siini ja korreloi positiivisesti ydin- ilmaus β- kateniinin. Immunofluoresenssivärjäyksellä osoitti, että RNF146 säännelty jakelun ja ydinvoiman kertymistä β-kateniinin. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ydin- β-kateniinin ilmentymistä johtaa menetykseen soluadheesion. Lisäksi tämä proteiini lisäsi kohdegeenien transkriptiota, mukaan lukien c-myc, cyclinD1, VEGF, ja MMP7, vuorovaikutuksessa T-solun tekijän /imukudoksen tehostajana tekijä, mikä johtaa leviämisen ja metastaasin kasvainsolujen [16] – [ ,,,0],17]. Esillä olevassa tutkimuksessa, RNF146 säännelty ak- siini ja β-kateniinin Wnt-signalointireitin, joka osoittaa, että RNF146 vaikuttaa leviämisen ja invaasion kasvainsoluissa.

MTT ja solusyklin kokeet osoittivat, että RNF146 paitsi säännelty soluproliferaatiota ja solusyklin etenemisen, mutta vaikuttaa myös ekspressiotasot proteiinien, jotka liittyvät solusyklin. Sykliini D1 pääasiassa säätelee G

1 vaihe etenemistä [18], ja sykliini E tehostaa G

1 /S siirtyminen [19] – [20]. Sykliini D1 voi vuorovaikutuksessa CDK4 /6 ja parantaa transkription alavirran geenien [18]. Näin ollen voidaan päätellä, että RNF146 ohjaa kasvaimen leviämisen säätelemällä solukierron.

tiedot osoittivat myös, että RNF146 vaikutti muuttoliikkeen ja hyökkäys keuhkojen syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että RNF146 on useita toimintoja. Naarmutustestin ja siirtokuoppaan määrityksen tulokset osoittivat, että RNF146 tehostettu muuttoliike ja hyökkäys keuhkojen syöpäsoluja. MMP hajoavat eri proteiineja soluväliaineen häiritä kudoksen esteitä kasvainsolun invaasiota, ja avainrooleja hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden kasvainten [21]. Tiedot tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että MMP2 ja MMP7 säädeltiin RNF146. Hajoaminen soluväliaineen ja luuta jonka MMP2 ja MMP7 on osoitettu olevan läheistä sukua NSCLC ja metastaasit [22] – [23]. Tiedot viittaavat siihen, että RNF146 voisi säädellä maahanmuuttoa ja hyökkäys keuhkosyöpien säätelemällä MMP2 ja MMP7.

Ennen Tutkimuksessamme roolit RNF146 että Wnt-signalointireitin rajoittuivat hajoamista ak- siini ja edistäminen ydin- yhdistäminen β-kateniinin. Koska β-kateniinin vuorovaikutuksessa TCF-4 jälkeen se siirtyy tumaan [16] – [17], me arveltu, että RNF146 voisi säädellä solujen lisääntymisen ja hyökkäystä epäsuorasti säätelemällä kohdegeenin transkription kautta ak- siini /β-kateniinin. Meidän kokeet osoittivat, että RNF146 ei pelata sääntelyn rooli loppupään proteiineja cyclinD1, sykliini, ja MMP7 soluissa kanssa knockeddown ak- siini ja β-kateniinin. Vastaavasti yli-ilmentyminen tai knockdovvn RNF146 ei aiheuttanut muutoksia kohdennetun proteiinin tasot kun TCF4 joka pudotettiin. **

P

0.05.

doi:10.1371/journal.pone.0085377.s003

(TIF)

Acknowledgments

We