Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka inaktivoivat lukukehysmutaatioita

Transforming kasvutekijä beeta-reseptorin tyypin 2

(

TGFBR2

) geeni pidetään kuljettajat Mikrosatelliittimarkkerien epävakaa (MSI) peräsuolen kasvainten synnyssä, välillisiä korjauksilla alavirran kohde proteomiin ei ratkaista täysin. Soveltamalla click-se kemia proteiinin merkintöjä lähestymistapa yhdistettynä massaspektrometrian on MSI peräsuolen syövän malli solulinja tunnistimme 21

de novo

synteettisiä proteiineja ekspressoidaan eri upon rekonstruoitu TGFBR2 ilme. Yksi ehdokas geeni, TGF-ß perheenjäsenen kasvuerilaistumistekijä-15 (GDF-15), osoitti TGFBR2 riippuvaisen transkription säätelyä aiheuttaen solun sisäinen ja ulkoinen proteiinin tasot. Uutena TGFBR2 kohdegeenin se voi luoda yhteyksiä TGF-ß haara ja BMP /GDF haara Smad-välitteisen signaloinnin.

Citation: Lee J, Fricke F, Warnken U, Schnolzer M, Kopitz J, Gebert J (2015) ennastus TGFBR2 välittämän Signaling Syyt lisääntymisen merkkejä GDF-15 HCT116 peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 10 (6): e0131506. doi: 10,1371 /journal.pone.0131506

Editor: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 25 helmikuu 2015; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2015; Julkaistu: 26 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Taloudellinen tuki annettiin Deutsche Forschungsgemeinschaft (GE592 /6-2) ja JK ja JG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) voi syntyä kolme suurta polkuja, tunnettu kromosomi epävakaus [1], CpG-saarekkeen hyper-metylaatio fenotyyppi [2] ja mismatch korjaus (MMR) -puutos [3, 4]. Kasvaimia, jotka ovat menettäneet normaalin MPR toiminta sellaista korkeatasoista Mikrosatelliittimarkkerien epävakaus (MSI) yleensä tunnustettu lisäys /deleetiomutaatioiden lyhyellä mononukleotidi toistoja (mikrosatelliitit) sijaitsee koodaus ja ei-koodaavan geenin alueita. Yli 90% MSI paksusuolen ja peräsuolen syöpiä ovat hankkineet somaattisia lisäys /deleetiomutaatiot koodaus mononukleotidi repeat (A10) eksonissa 3

Transforming kasvutekijä beeta-reseptorin tyypin 2

(

TGFBR2

) geeni johtaa translaation lukukehyksen ja heikentynyt reseptorin signalointi [5, 6]. TGFBR2 proteiini on seriini-treoniini-kinaasi, joka sitoutuessa sen ligandin TGF-SS1, antaa kanoninen Smad-välitteistä signalointia, [7]. TGF-ß signalointi on keskeinen rooli normaalia toimintaa paksusuolen epiteelisolujen mutta sen roolia kasvainten synnyssä näyttää olevan kiistanalainen [8, 9]: alkuvaiheessa kasvaimen kehitystä, TGF-ß toimii klassisen tuumorisuppressoriproteiinia [10] , kun taas se edistää EMT, muuttoliike ja etäpesäkkeiden myöhemmissä vaiheissa syövän etenemisen [11]. Nämä ilmeisesti paradoksaalista biologiset ominaisuudet määritetään suuri määrä kohde proteiinien, joiden ilmentymistä säädellään TGF-ß-riippuvaisella tavalla [12].

Useimmat näistä

bona fide

alavirtaan tavoitteet TGF-ß signalointi on todettu seulonnat transkriptiotasolla taas tutkimukset keskittyvät TGF-ß-riippuvainen proteomic muutoksia kolorektaalisyöpäkasvainsoluja ovat melko rajalliset ja proteomiikka ekspressioprofiileja ei aina olla peräisin transcriptome malleja. Vaikka TGF-ß-signalointireitin on jo laajalti tunnettu, sen vaikutus proteiinin ilmentymiseen dynamiikka, jotka vaikuttavat biokemiallinen /proteomic fenotyyppi koolonkarsinoomasoluissa ei ole vielä täysin tutkittu.

Koska kasvainsolut yleensä ja MSI kasvainsolujen ovat hankkineet rajoitetun määrän kuljettajan mutaatioita, jotka edistävät kasvaimen kehitystä joukossa useita merkityksettömiä matkustajan mutaatioiden, rajaaminen monimutkaisten proteomic muuttuu tietyn kuljettajan mutaatioita on suuri haaste. Jotta ymmärtää, miten toimintahäiriön yhden jäsenen TGF-ß signalointireitin, The TGFBR2, muuttaa solun proteomic ja glycomic maiseman MSI peräsuolen syövän soluja, olemme aiemmin perustettu MSI solulinjassa malli, joka mahdollistaa doksisykliini (Dox) – säännelty käyttökuntoon TGFBR2 ilmaisun ja signaalitransduktion käytettäessä isogeenisestä taustalla [13].

Käyttämällä tätä HCT116-TGFBR2 malli solulinja yhdessä napsautuksella kemia lähestymistapa erityistä eristämiseen

de novo

proteomi [14] ja myöhemmin massaspektrometriaa (MS) analyysi, tunnistimme rajoitetun määrän proteiineja, jotka osoittautui äskettäin ilmaista tai jonka synteesi poistetaan heti TGFBR2 ilme. Yksi näistä ehdokas tavoitteet, kasvua ja erilaistumista tekijä-15 (GDF-15) osoitti TGFBR2-riippuvaisen transkription säätelyä, joka korreloi kohonneeseen solunsisäisen ja erittyvän proteiinin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että GDF-15 on TGF-ß-reagoiva geenin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

solulinjat kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Life Technologies , Karlsruhe, Saksa), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Life Technologies, Karlsruhe, Saksa), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Life Technologies, Karlsruhe, Saksa) käyttäen vakio-olosuhteita. Sukupolven doksisykliini-indusoituva HCT116-TGFBR2 solukloonien on raportoitu aiemmin [13]. Lyhyesti, villityypin

TGFBR2

geeni integroitiin kolorektaalisyöpä solulinjaa HCT116, joka satamat bialleelisen inaktivoiva

TGFBR2

lukukehysmutaatioita käyttäen rekom- välittämää kasetti vaihto (RMCE) johtaen kahden itsenäisen solussa kloonit, # 5 ja # 22, joilla on erilaiset irtonumeromyynti integraatio sivusto.

metabolinen leimaus

metabolinen leimauskokeiden, 4×10

6 solua ympättiin kolmena rinnakkaisena 10 cm levyt. Seuraavana päivänä väliaine vaihdettiin ja soluja kasvatettiin joko puuttuessa tai läsnä ollessa 0,5 ug /ml doksisykliiniä (Sigma, Taufkirchen Saksa). Kun 11 tuntia, solut pestiin PBS: llä (Life Technologies, Karlsruhe, Saksa), kasvatettiin 30 min metioniini-RPMI 1640-alustassa (Sigma, Taufkirchen Saksa) ja sen jälkeen inkuboitiin 10 ng /ml TGF-SS1 (Cell Signaling, Danvers, USA) ja leimausreagenssi (40 uM L-Azidohomoalanine (AHA) tai 4,625 MBq [

35S] -L-metioniini) läsnä tai poissa ollessa Dox 4 h (proteiini lysaattia) tai 24 h (erittyviä proteiineja ). Kontrollina tunnistaa vain AHA-leimattujen vasta syntetisoitujen proteiinien, soluja kasvatettiin kolmena kappaleena ilman AHA ja läsnä ollessa 200 ug /ml sykloheksimidiä (CHX), estäjä-proteiinin biosynteesin. Analysoimiseksi vaikutus GDF-15 pSmad2 signalointi, 100 ng /ml ihmisen rekombinantti-GDF-15 (G3046, Sigma, Taufkirchen, Saksa) lisättiin soluihin 1 tunti. Solut pestiin 3 x PBS: llä, kerätään ja sentrifugoidaan vähintään 10 minuutin ajan 1000 g: llä 4 ° C: ssa PBS: ssä, joka sisälsi 1 x proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Mannheim, Saksa). Solupelletit suoraan suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin. Medium radioaktiivisen-leimatut solut kerättiin 24 tunnin kuluttua, sentrifugoitiin 1000 g: llä 4 ° C: ssa vähintään 10 minuutin ajan, ja supernatantti saatettiin GDF-15 immunosaostus.

Valitse-IT Reaction

Kun metabolinen AHA merkintöjä (C10102; Life Technologies, Karlsruhe, Saksa), solupelletit hajotettiin 100 ul: lla 1% SDS: ää 50 mM Tris-HCl, pH 8, johon on lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta, sonikoitiin 30 s ja inkuboitiin vähintään 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pyörittäen, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Kun oli sentrifugoitu 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan 12000 g, proteiinipitoisuus määritettiin Bradford-määritys (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Saksa). 200 ug proteiinia käytettiin reagoida 40 uM biotiini Alkyynialkoholit DMSO: ssa (B10185, Life Technologies, Karlsruhe, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen kun metanoli /kloroformi (4: 1) saostuminen, sakat liuotetaan uudestaan ​​200 ul RIPA-puskuria, sonikoitiin 30 s ja pyöritetään yön yli 4 ° C: ssa. Poistamiseksi lisoitumatonta materiaalia, proteiini näyte sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 20 minuutin ajan 12000 g. Sitten supernatantti inkuboitiin rotaattorin 80 ui lietettä streptavidiinipäällystettyjen magneettiset helmet (Dynabeads MyOne Streptavidin T1, Life Technologies, Karlsruhe, Saksa), joka oli pesty 3 x PBST: llä (PBS /0,01% Tween 20). 2 tunnin jälkeen 4 ° C: ssa, helmet pestiin 3 x 1 ml PBST: llä, joka sisälsi 2% SDS: ää, jota seuraa lopullinen pesut PBS: lla ja 40 mM ammoniumbikarbonaattia.

massaspektrometrianalyysissä

massaspektrometrialla näytteet valmistettiin ja analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, proteiini helmien vähenivät, alkyloidut trypsinysed 37 ° C: ssa yön yli. Lisäyksen jälkeen TFA näytteestä analysoitiin nanoLC ESI-MS /MS LTQ Orbitrap XL massaspektrometriin (Thermo Scientific, Karlsruhe, Saksa). MGF-tiedostoja tuottamat Xcalibur ohjelmisto (Thermo Scientific, Karlsruhe, Saksa) käytettiin tietokantahakuihin kanssa MASCOT hakukoneen (Matrix Science; versio 2.4) vastaan ​​SwissP- tietokanta (SwissP- versio 2013_02 (539165 sekvenssit; 191456931 jäämät)) kanssa taksonomian asetettu ihmisen. Ehdokas-proteiinit luokiteltiin ilmentyvät differentiaalisesti (TGFBR2-puutteellinen tai taitava) jos havaitaan vähintään yksi kolmesta biologisen toistolla jokaisessa kummankin solun klooneja (# 5 ja # 22), mutta ei vanhempien HCT116-Tet-On-soluja.

Quantitative Real Time (qRT) -PCR

1 ug kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) ja käänteistranskriptio Oligo-dT-alukkeita ja SuperScript II käänteiskopioijaentsyymiä mukaan valmistajan protokollan (Life Technologies, Karlsruhe, Saksa). Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen PowerSYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa) ja alukkeina TGFBR2 (for: 5′-CGGCTCCCTAAACACTACCAA-3′, rev: 5′-AACAAATTGGACTAATCCGGA-3′) ja GDF-15 (for: 5′-AAGATTCGAACACCGACCTC-3′, 5′- AGAGATACGCAGGTGCAGGT-3′). Kolmena rinnakkaisena eri cDNA näytteet (- /+ Dox) analysoitiin StepOnePlus termo-PCR-laitteessa (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa) käyttäen seuraavaa ohjelmaa: 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Tiedot analysoitiin StepOne Software v2.1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa). Geenien ilmentyminen normalisoitiin ilmentymisen viite-geenin

Hydroxymethylbilane syntaasi

(

HMBS

) (for: 5′-CACCACAGGGGACAAGATTC-3′, rev: 5`-GTGAACAACCAGGTCCACTTC-3′).

Western blot -analyysi

RIPA-proteiinin lysaatit ja Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [13]. Immunoblottausta, 30-60 ug proteiinia käytettiin. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin seuraavasti: hiiren anti-TGFBR2 (sc-17799; Santa Cruz, Dallas, USA; 1: 500, 4 ° C, yön yli); Hiiren anti-ß-Actin (klooni 4, MP Biomedicals, Solon, USA; 1: 20000, RT, 30 min); kanin anti-GDF-15 (HPA011191; Sigma, Taufkirchen Saksa, 1: 500, 4 ° C, yön yli); kanin anti-fosfo-Smad2 ja kanin anti-Smad2 (Ser465 /467) ja (86F7); Cell Signaling, Danvers, USA; 1: 1000, 4 ° C, yön yli). Blotteja inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: ssä sekundaarisia vasta-aineita: lampaan anti-hiiri-IgG HRP: tä (1: 5000, GE-Healthcare, Munchen, Saksa) tai vuohen anti-kani-IgG HRP: tä (1: 2500, Promega, Madison, USA ). Toteaminen suoritetaan joko standardimenetelmällä käyttämällä Amersham Hyperfilm ECL tai ChemiDoc MP System (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Saksa).

GDF-15 Immunosaostaminen (IP) B

Kun [

35S] -L-metioniinia merkintöjä (American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, USA), solupelletti suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan RIPA-puskuria, joka sisälsi 2x proteaasiestäjäseostabletit. Proteiini lysaatit saatu edellä kuvatulla tavalla. GDF-15 immunosaostus, 0,3 ml lysaattia, joka sisälsi 1,8 mg proteiinia tai 5 ml viljelmäsupernatanttia pyöritettiin 1,5 ug GDF-15-vasta-ainetta (HPA011191; Sigma, Taufkirchen, Saksa) ja 2x proteaasiestäjäseostabletit yön yli 4 ° C: ssa. 25 ui proteiini-A /G-agaroosin liete (Oncogene Science, Uniondale, USA) pestiin 3 x RIPA-puskurilla ja inkuboitiin sitten lysaatin tai viljelmän supernatantista, ja vasta-aineen 2 h pyörittämällä 4 ° C: ssa. Helmet pestiin 5x 500 ui RIPA-puskurilla ja eluoitiin 2 x 200 ui 1x SDS-näytepuskuria (106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris-Base, 2% SDS, 10% glyseroli, 0,51 mM EDTA) 99 ° C: ssa 5 min nopeudella 800 rpm. Näytteet sekoitettiin sitten 10 ml: aan tuikeseosta ja laskettiin käyttäen nestetuike- analysaattori (TRI-CARB 2900TR, Packard, PerkinElmer, Waltham, USA).

proliferaatiotestillä

10

3-soluja siirrostettiin sextuplicate 96 kaivoon päivää ennen lisäämistä seuraavat reagenssit: 0,5 ug /ml Dox, 10 ng /ml ihmisen rekombinantti-TGF-SS1 ja 100 ng /ml ihmisen rekombinantti-GDF-15. 6 päivän jälkeen, MTS lisääntymismäärityksissä suoritettiin CellTiter 96 Aqueous kit (Promega, Madison, USA) valmistajan ohjeita. Spektrofotometriset mittaukset suoritettiin käyttäen GENIOS mikrolevylukijaa (Tecan Group Ltd., Männedorf, Sveitsi) ja absorbanssi arvo solun elatusainetta oli vähennettiin absorbanssiarvot näytteitä.

Tulokset ja keskustelu

3.1. Tunnistaminen

de novo

syntetisoitiin TGFBR2 riippuva kohdeproteiinit

varmistamiseksi TGFBR2 riippuvaa asetusta, olemme aiemmin luotu malli solulinja, tässä kutsutaan HCT116-TGFBR2 [13]. Lyhyesti, HCT116-solulinja on mutatoitu niin alleelit

TGFBR2

johtaa ilman täyspitkän proteiinin. Kaksi kehitettyä HCT116-TGFBR2 solulinjoissa (klooni # 5 ja # 22) sisältää kuitenkin yhden kopion integroitu villiä tyyppiä

TGFBR2

geeni, joka ilmentyy ainoastaan ​​läsnäollessa doksisykliini (Dox). Aika-tietenkin analyysi paljasti, että 11-12h Dox hoidossa nämä solut olivat riittävästi saavuttaa huippunsa tasolla TGFBR2 proteiinin (S1 kuvio).

määrittämiseksi TGFBR2 riippuvainen

de novo

Proteome, molemmat HCT116-TGFBR2 klooneja (# 5 ja # 22) altistettiin ligandille TGF-SS1 läsnäollessa (TGFBR2 taitava) tai puuttumisen (TGFBR2-puutosta) doksisykliinin ja orastavan proteiinit leimattiin metabolisesti metioniinin korvike L- Azidohomoalanine (AHA). Jälkeen click-se-välitteisen biotinylaatio, leimatut proteiinit vangittiin streptavidiini-päällystetyt magneettiset helmet ja analysoitiin massaspektrometrialla. Jotta huomioon proteiineja, jotka osoittavat epäspesifistä sitoutumista helmiin tai proteiineja, jotka sijaitsevat

a priori

kaupallisesti saatavilla streptavidiini-päällystettyjä helmiä, sama koe suoritettiin ilman leimausreagenssista (-AHA) [14]. Ainakin 480

de novo

synteettisiä proteiineja havaittiin keskimäärin molemmissa solukloonien (S1 taulukko) ja molemmissa olosuhteissa (-Dox: TGFBR2 puutosta; + Dox: TGFBR2 taitava) stimuloitaessa TGF-SS1 und siten pysyi vaikuta TGFBR2 ilmentymisen tila (taulukko 1). Lisäksi soluja kasvatettiin läsnä ollessa translaation inhibiittorin sykloheksimidin (CHX) tunnistaa bona fide

de novo

synteettisiä proteiineja (merkitty tähdellä S1 taulukko). Jopa 56 proteiineihin havaittiin myös hallita kasvatettujen solujen puuttuessa AHA, noin 10 kertaa pienempi kuin määrä proteiinien tunnistettu läsnäollessa AHA etiketin, mikä vahvistaa erityispiirteenä bioorthogonal merkintöjen lähestymistapaa. Vertaileva analyysi TGFBR2 riippuvan

de novo

proteomin paljasti 21 ehdokasta, jotka havaittiin ekspressoituu differentiaalisesti joko TGFBR2 puutteesta tai TGFBR2 taitava soluissa, mutta ainakin yksi kolmesta samanlaiset näytteet ja kunkin sekä solukloonit. Proteiini esiintyminen molemmissa solukloonien käytettiin vahvin valintaperusteena, koska joidenkin vaihteluista proteiinin esiintyminen joukossa triplikaattinäytteet. Erityisesti, 12/21 proteiinit yksinomaan tapahtui TGFBR2-deficent soluissa, kun taas jäljellä olevat proteiinit (9/21) havaittiin yksinomaan TGFBR2 taitava soluja, joilla on rekonstruoitu TGF-ß signalointia (taulukko 2). Mukaan GO aikavälin luokitus, ilmentyvät eri proteiinit liittyvät olennaiset soluprosesseissa kuten immuniteetti (1B59), signaalin siirtoon (ASM, CSN3, DOCK8, GDF-15, TGFBR2), proteiini muutos (siru, PP2AA), transkriptio (DTD2, RBM42, T2FA, TE2IP, TFAM, UBF1) ja proteiini liikenne (ERP29, RB6I2, HGS, TMEM9). Vain muutama näistä proteiineista ovat tiettävästi liitetty TGF-ß /Smad signalointireitistä (ASM, CHIP, HGS, PP2AA, SYNE2, GDF-15), mutta suoraa sääntelyä niiden ilmentymisen TGFBR2 reseptorin koolonkarsinoomasoluissa ei ole on osoitettu. Koska kokeellinen strategiassa niiden esillä olevassa tutkimuksessa keskityttiin kartoittaa uudet synteettisiä proteiineja, meidän ehdokas luetteloon ilmentyvät eri proteiinien edustavat todennäköisimmin mahdollisia uusia

bona fide

tavoitteita TGFBR2-välitteisen signaloinnin MSI HCT116 peräsuolen syöpäsoluja .

on selvää, joitakin tunnettuja loppupään tavoitteet kanoninen TGF-ß /Smad signalointi kuten Smad7 [15], SERPINE [16] tai JUNB [17] puuttuvat listalta differentiaalisesti ilmaisi ehdokas proteiineja. Useat syyt voivat selittää tätä rajoitusta: Ensinnäkin, meidän valintakriteerit ehdokas proteiinien perustuivat differentiaalikaavojen ainakin yksi näyte kussakin molempien solukloonien joka ei ehkä selittää vaihtelut proteiiniekspressiossa Näistä kaksi solulinjaa klooneja. Esimerkiksi JUNB ja CSK1 [18], toinen kasvun vaimennin ja TGF-ß kohdegeenin epiteelisolujen, ei palvelukseen lista differentiaalisesti ilmaisi ehdokas proteiineja, koska ne havaittiin vain yhdessä klooni TGFBR2-taitavia ja TGFBR2 puutteesta solut, vastaavasti. Toiseksi, meidän kokeellinen strategia oli suunniteltu paljastamaan vain

de novo

synteettisiä proteiineja selkeät rajoittamisen ilmaisun tilan TGFBR2 signaalinmuuntajana ja määrällisiä muutoksia proteiinien tasojen päälle TGFBR2 saattamisen ja siten saattaa selittää, miksi jotkut ehdokkaat saattavat olla karannut havaitseminen. Vaihtoehtoisesti puute havaitseminen voi johtua eroista liittymistehokkuutta metioniinin ja analogisen AHA ja /tai saattaa myös riippua määrä metioniinijäännösten joka todella täyttyvät kussakin proteiinia. Kolmanneksi, TGF-SS1 ligandi altistuminen rajoittui lyhyessä ajassa 4 tuntia, joka ei välttämättä riitä aiheuttamaan havaittavaa joidenkin juuri syntetisoidun TGF-SS1 kohdeproteiinit [19]. Lopuksi varoitus, emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että eräät ehdokkaat tunnistettu tässä tutkimuksessa todellisuudessa eivät edusta

de novo

synteettisiä proteiineja pelkästään niiden yhdistyksen

bona fide

TGFBR2 proteiinien kohdentamiseksi proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia. Tärkeintä on kuitenkin, me yksiselitteisesti tunnistaa TGFBR2 proteiinia itseään molemmissa klooneja meidän TGFBR2-rekonstruoitu malli solulinja, joka tukee voimakkaasti pätevyyttä meidän kokeellisen lähestymistavan.

3.2. TGFBR2 riippuvainen ekspressio GDF-15

joukossa

de novo

syntetisoida proteiineja, erityisesti indusoituu TGFBR2-rekonstruoitu soluissa, olemme tunnistaneet kasvua ja erilaistumista tekijä 15 (GDF-15). Samanlainen TGF-ß itse, GDF-15 voi esiintyä toisistaan ​​poikkeavia toimintoja syöpäsoluissa [20]. Esimerkiksi, se voi toimia tuumorisuppressorina ja laukaista apoptoosin yli-ilmennetään HCT116-soluissa [21], mutta se löytyy myös kohonneeseen myöhäisessä vaiheessa syöpiä viittaa sen hyödyllisyys markkerina syövän etenemisen [22]. Sen analysoimiseksi TGFBR2 reagoiva geenien tarkemmin keskityimme GDF-15 yhtenä potentiaalisena kandidaattigeenifragmenttikloonien koska se ei vielä tiedetä, onko TGF-ß sytokiineihin voidaan säännellä TGFBR2 riippuvaisesti kolorektaalisyövässä soluja.

Ensimmäiseksi tutkimme sääntely GDF-15 ilmentymisen transkriptio tasolla. TGFBR2 taitava ja TGFBR2 puutteesta HCT116-soluja altistettiin TGF-SS1 kahden eri ajanjaksoja (2 h ja 4 h) ja GDF-15-mRNA: n ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR-analyysi (kuvio 1A). Stimulaation TGF-SS1 2 h aiheutti noin kaksi-kertainen GDF-15-transkriptin tasot sekä HCT116-TGFBR2 kloonien verrattaessa TGFBR2 taitava versus TGFBR2-vajaiden solujen. Tämä induktiokerroin väheni hieman noin 1,5-kertaiseksi, kun ligandi valotusajan jatkettiin (4 h). Vanhempien HCT116-Tet-On ohjaus solut eivät näytä Dox-riippuvainen korjauksilla GDF-15 ilmentyminen joka sulkee pois mahdolliset epäspesifiset vaikutukset myönnettyjä doksisykliini. Sen lisäksi TGF-SS1 riippuvia ilmentyminen muuttuu, myös havaittu ero GDF-15 ilmentyminen keskuudessa HCT116-TGFBR2 klooneja. Erityisesti kertainen GDF-15 transkriptipitoisuuksissa oli aina vähemmän kloonin 22 verrattuna kloonata 5. Todennäköisesti, tämä saattaa johtua siitä, että eri integraation sivustoja

TGBFR2

siirtogeenin nämä kloonit [13 ].

(A) voimistuvan transkriptipitoisuuksissa GDF-15: n läsnä ollessa Dox käyttäen reaaliaikaista qRT-PCR-analyysillä. (B) Western blot-analyysi GDF-15-proteiinin ilmentymistä kokonaisproteiinin lysaatit (30 ug) TGF-SS1 stimuloitujen solujen (4 h). Expression of GDF-15 kasvaa, kun TGFBR2 ilmaistaan ​​(+ Dox) molemmissa solukloonien mutta ei vanhempien Tet-On solulinjassa. TGF-SS1 signalointi osoitetaan lisääntynyt pSmad2 tasoilla TGFBR2 ilmentävien kloonien. Lisäksi sykloheksimidin (CHX) vähentää ilmentymistaso GDF-15. ß-Actin ja Smad2 toimi latauskontrollina.

Näiden lisäksi transkription muutosten, tutkimme onko GDF-15-proteiinin tasot ovat myös moduloidaan TGFBR2 ilmentymistilanne mallissamme järjestelmässä. Kokosoluliuotteista valmistettiin Dox-käsitellyn ja käsittelemättömän HCT116-TGFBR2 klooneista ja HCT116-Tet-On-ohjaus soluissa, sen jälkeen TGF-SS1 altistus (4 h) ja tutkittiin Western blot -analyysillä (kuvio 1B). Yhteisymmärryksessä transkription tietojen käyttökuntoon ligandin laukaisi TGFBR2 signalointi aikaansai GDF-15-proteiinin tasot molemmissa solukloonien taas ß-aktiini pysyivät muuttumattomina. HCT116-Tet-On-ohjaus solut eivät näytä Dox-riippuvia muutoksia GDF-15 ilmentyminen. Lisäksi lisäämällä Sykloheksimidin (+ CHX) vähensi ilmentymistä GDF-15 merkittävästi TGFBR2 ilmentävää solua klooni # 5 vastakohtana ß-aktiini tai Smad2 proteiineja, jotka pysyivät CHX kestävä. Nämä havainnot vahvistavat

de novo

synteesiä GDF-15 ja voimakkaasti tukemaan proteomiikka tulokset (taulukko 2). Lisääntynyt pSmad2 tasoilla käyttökuntoon TGFBR2 (+ Dox) vahvistetaan, että tämä malli järjestelmä pystyy saamaan aikaan asianmukainen Smad signalointi.

Jotta vahvistaa havaittujen muutosten GDF-15-proteiinin ilmentymistä tarkemman ja kvantitatiivisesti teimme metabolisen leimauskokeeseen käyttämällä [

35S] -L-metioniini. Proteiinit radioaktiivisesti leimatun samoissa olosuhteissa kuin AHA leimauskokeeseen mutta leimattu GDF-15-proteiini immunosaostettiin sitten ja laskettiin käyttäen nestetuike- analysaattori (kuvio 2). Noin 2,5-3-kertainen nousu solunsisäisen GDF-15-proteiinin tason havaittiin sekä klooneja Dox-käsiteltyjen HCT116-TGFBR2 solujen yhteydessä TGF-ß stimulaatio verrattuna perustason ilmentymistason saman kasvatettujen solujen puuttuessa Dox ( kuvio 2A). Koska GDF-15 voi toimia parakriinisellä ja autokriinisellä tavalla, analysoimme myös määrä [

35S] -L-metioniinia leimatun erittyy GDF-15-proteiinia GDF-15 immunosaostuksella viljelyalustasta (kuvio 2B). Käyttövalmis TGFBR2-välitteistä signalointia sekä solukloonien johti merkittävään kasvuun eritetyn GDF-15: n kaltainen proteiini nousu solunsisäisiä tasoja. Emo Tet-On-solulinja ei osoittanut mitään muutoksia juuri syntetisoidun GDF-15 ilmentyminen ei ole proteiinin lysaateissa tai solun viljelyalustaan ​​(tuloksia ei ole esitetty). Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat siihen, että TGFBR2 riippuva lisääntynyt ilmentyminen GDF-15 näyttää välitetään vaikutuskohta solunulkoisessa ympäristössä.

[

35S] -L-metioniinia käytettiin metabolisen merkinnöistä ja myöhemmin immunosaostus solunsisäisten GDF-15 total lysaatit (A) tai erittyy GDF-15 soluviljelyalustasta (B). Soluja stimuloitiin TGF-SS1 4 h (A) ja 24 h (B).

GDF-15 tiedetään esiintyvän eri muodoissa [23]: pro-peptidi on proteaasi hajottaa tuottaa kypsää bioaktiivista proteiinia. Kypsän GDF-15-proteiinin tiedetään erittyvän, mutta tämä on myös raportoitu, että pro-peptidi [24]. Vasta-aine, joita käytetään meidän immunosaostuskokeissa pystyy tunnistamaan pro-peptidi, mutta ei sitoudu kypsä muoto. Siksi haluamme korostaa, että tuloksemme sovelletaan pro-peptidi versio GDF-15, joka vielä voidaan liittää kypsä muoto tai voidaan lohkaista ja itsenäisesti tunnustettu. Sen selventämiseksi, onko kypsä muoto vaikuttaa samassa määrin muita vasta-aineita tarvitse testata.

Jotta testata vaikutuksia GDF-15 solujen kasvuun ja signalointi, teimme runsaudenmäärityksessä ja pSmad2 Western blot -analyysi käyttäen ihmisen rekombinantti-GDF-15-proteiinia (kuvio 3). TGF-SS1 tai GDF-15 Lisäksi yksin laski leviämisen nopeus kuitenkin kasvua estävä vaikutus tuli näkyvämpi kun molemmat sytokiineja lisättiin samanaikaisesti verrattaessa TGFBR2 ilmentävien (+ Dox) ja TGFBR2-puutosta (-Dox) solujen HCT116- TGFBR2 # 5 (kuvio 3A). Leviämisen vanhempien Tet-On-solulinja ei muuttunut lainkaan stimuloimalla tahansa sytokiini- ja – /+ Dox kaikki yhdistelmät (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi olemme tutkineet Ulkoisten lisäksi GDF-15 Smad signalointi. Rekombinantti GDF-15 yksinään voivat edistää pSmad2 ilmentymisen TGFBR2 ilmentävät solut (+ Dox), mutta ei TGFBR2-vajaiden solujen (-Dox) (kuvio 3B). Koska yhdistelmä-GDF-15 ja TGF-SS1 ligandi ei pSmad2 havaittu, kun taas stimulaatio TGF-SS1 yksin osoittivat in kasvuun pSmad2 tasolla TGFBR2-taitavia soluissa. TGF-SS1 ja GDF-15 lisäksi näytetään voimakkain fosforyloidun Smad2 tasolle, joka on mukaisesti havaittu alennettua leviämisen nopeudella, kun molemmat ligandit lisättiin samanaikaisesti (kuvio 3A). Tämä on, että tietomme, ensimmäinen raportti, joka osoittaa fosforylaatio Smad2 GDF-15 on TGFBR2 riippuvaisella tavalla ihmisen peräsuolen syövän soluja. Kontekstissa syövän ja taudin etenemisen jossa TGFBR2 on ei-toiminnallinen, lasku GDF-15 ilmentyminen voi johtaa kasvun etu verrattuna villityyppiin, TGFBR2-ilmentäviä soluja, simuloidaan pikemminkin ei-syöpä fenotyypin. Kun Western blot-analyysi on myös osoittanut, että TGF-SS1 yksin tason nostaminen pSmad2 ilmentymisen puuttuessa TGFBR2 verrattuna stimuloimattomiin soluihin (kuvio 3B). Tämän perustason of pSmad2 havaittiin vanhempien HCT116-Tet-On ja TGFBR2 ilmentävää solua klooni ja hyväksyy edellisessä julkaistu teos [13]. On yksi raportti mahdollisista sääntelyä GDF-15 mRNA TGF-SS1 [25]. Toistaiseksi tämä on todettu vain makrofagien ja ei ole todisteita vielä noin TGFBR2 riippuva sääntely GDF-15 ilmentyminen muissa kudoksissa tai sairauksia, kuten peräsuolen syöpä. Kuitenkin muut tutkimukset antavat jonkin verran kokeellista näyttöä varten päinvastainen tilanne, eli että GDF-15 vaikuttaa TGF-ß signalointi. Esimerkiksi hiirissä viittaavat siihen, että GDF-15 voi toimia mahdollisena ligandina TGFBR2 [26]. Lisäksi GDF-15 näyttää moduloivan TGFBR2 fosforylaation tai signalointia, kuten on osoitettu rotan pikkuaivojen rae neuronien [27]. Nämä havainnot eivät välttämättä ristiriidassa meidän havaintoja vaan saattaisi merkitä mahdollinen palaute GDF-15 TGFBR2-välitteistä signalointia.

(A) Proliferaatiomääritys näkyy keskimäärin kuusi rinnakkaista. (B) Western blot-analyysi TGFBR2 riippuvaisten pSmad2 tasoilla. HCT116-TGFBR2 # 5-soluja käsiteltiin puuttuessa ja läsnä ollessa ihmisen rekombinantti TGF-SS1 (10 ng /ml) ja GDF-15: ssa 1 h. Smad2 toimi sisäisenä latauskontrollina.

Koska GDF-15 on sekä pro- ja anti-kasvain toimintaa riippuen solu- ja microenvironmental yhteydessä tuloksesta TGFBR2 riippuvaisen GDF-15 yli-ilmentymisen ja lisääntynyt eritys on vaikea ennustaa. Tuore tutkimus osoitti, että kiertävä GDF-15 liittyy suurempi riski CRC ja steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID) voivat alentaa riskiä [28]. Kiistanalaisella olemassa julkaisuja osoittavat, että nämä NSAID indusoi GDF-15, joka sitten johtaa apoptoosin HCT116-soluissa [21, 29], joka on yhtä mieltä havaintojen teimme tässä tutkimuksessa: TGFBR2 saattamisen edustaa pikemminkin villityyppisen tilanne joka GDF-15 ilmentyy korkeammilla tasoilla, kun taas kasvaimen tilassa (TGFBR2 puutos) vähemmän GDF-15 ilmentyy ja erittyy sekä kasvaimen solut voivat välttyä apoptoosin.

Mitä tyypin II reseptoreita, jotka transduce signaalit aikaansaama superperheen TGF-ß /luun morfogeneettisen proteiinin (BMP) /aktiviinilla ligandeja, proteomiikka tiedot johdettu TGF-SS1 stimuloi ja TGFBR2-käyttövalmiiksi solujen esillä olevassa tutkimuksessa mahdollistavat suoran vertailu proteomiikka tiedot saatu edellisessä työstä on aktiiviinimolekyylien A-kannustanut ja ACVR2 käyttövalmiiksi saattamista soluissa. Verrattuna

de novo

proteomiin HCT116-ACVR2 soluihin [14], ei ole päällekkäisyyttä kanssa ilmentyvät eri joukko kandidaattigeenejä tunnistettu HCT116-TGFBR2 soluissa. Vaikka molemmat reseptorit kuuluvat samaan perheeseen tyypin II signaalimuunta- ja lähettävät signaaleja kautta yhteinen Smad välittäjänä proteiineja kanoninen koulutusjakson, havaitun puutteen päällekkäisyys saattaa osittain johtua sitoutumisesta eri ligandeihin.

Kaiken käyttäen hyvin tunnettu malli, jonka avulla indusoituvan ilmentymisen merkittävä tekijä paksusuolen tumorigeneesin käytettäessä isogeenisestä taustalla tunnistimme joukko

de novo

syntetisoitiin ehdokas proteiineja, joiden ero ekspressio näyttää säänneltävä TGFBR2-riippuvaisella tavalla. Näistä ehdokkaista tunnistimme TGF-ß-superperheen jäsen GDF-15 mahdollisena uusi kohde, jonka mRNA, solunsisäinen ja erittyvä proteiini tasot voimistuvan kun TGFBR2 saattamisen. Tämä TGFBR2-GDF15 yhteys voisi olla yksi osa sääntelyn silmukka, joka liittyy myös aiemmin kuvattu GDF-15-TGFBR2 link [27].