Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

nenänielusyöpä (NPC) on erikoinen Epstein Barrin virus (EBV) -associated maligniteetti, joka on yleistä Etelä-Aasiassa. Peptidyyli-prolyyli

cis-trans

isomeraasin NIMA-vuorovaikutuksessa 1 (PIN1) isomeroi erityiset fosforyloitua aminohappotähdettä, mikä tekee siitä tärkeän säädin solujen eloonjäämisen ja apoptoosin. Tässä tutkimuksessa selvitettiin panos PIN1 NPC kasvainten synnyssä ja PIN1: n mahdolliseen rooliin terapeuttisena kohteena.

Methods

ilmentymistä PIN1 tutkittiin paneelia NPC solulinjojen, ksenografteissa ja ensisijainen kasvaimia. Toiminnallinen roolit PIN1 NPC solut selvitetty, että knockdown ja yli-ilmentyminen PIN1 in

in vitro

ja

in vivo

nude-hiirten mallien siRNA ja lenti-viruksen transfektiota, vastaavasti. Antituumorivaikutukset on PIN1 estäjän Juglone NPC soluissa arvioitiin myös.

Tulokset

paljasti johdonmukaisesti yliekspressio PIN1 lähes kaikissa EBV-NPC solulinjoissa, ksenografteissa ja ensisijainen kasvaimia. PIN1 tukahduttaminen kykeni estämään sykliini D1 ilmentyminen ja aktivoimalla kaspaasi-3 in NPC-soluissa. Se säätää positiivisesti NPC solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumisen ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Estyminen PIN1 tukahdutti kasvaimen kasvun

in vitro

ja

in vivo

.

Johtopäätökset

Tämä tutkimus osoittaa kasvaimia synnyttävän roolia PIN1 NPC tuumorigeneesiprosessin ja osoittaa, että sen yliekspressio voi parantaa kasvainsolujen kasvua kautta säätelyä cyclinD1. Meidän havainnot ilmoittaa kehittää uusia hoitoja kohdistaminen PIN1 NPC potilaille.

Citation: Xu M, Cheung CC-M, Chow C, Lun SW-M, Cheung ST, Lo KW (2016) yli-ilmentyminen PIN1 Parantaa syöpä kasvu ja aggressiivisuus sykliini D1 Induktio EBV-Associated nenänielusyöpä. PLoS ONE 11 (6): e0156833. doi: 10,1371 /journal.pone.0156833

Editor: Pierre Busson, Gustave Roussy, FRANCE

vastaanotettu: 08 lokakuu 2015; Hyväksytty: 21 toukokuu 2016; Julkaistu: 03 kesäkuu 2016

Copyright: © 2016 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Kiinan University of Hong Kong (Focus Investigation kaavio-A), ja Hong Kong Research Grants neuvosto – GRF ( 470413, 470312, 471211), CRF (CUHK8 /CRF /11R), AoE NPC (AoE /M-06/08), Teema-Based Research Scheme (T12-403 /11 ja T12-401 /13-R).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nenänielusyöpä (NPC) on erottuva tyyppi pään ja kaulan syöpä, joka syntyy epiteelin solut kattavat pinnan ja limakalvon nasopharynx. Tämä maligniteetti on tapahtunut huomattava etninen tausta ja maantieteellinen jakauma, ja on erityisen yleistä Etelä-Kiinassa, jossa lähes kaikki tapaukset nonkeratinizing karsinoomat liittyy EBV-infektio [1, 2]. Tämä yhdessä EBV, lisäksi on olemassa useita geneettisiä poikkeavuuksia [3], lisää monimutkaisuutta NPC tutkimusta. Heikkoja tuloksia saavutetaan tavanomaisilla kemosädehoidon potilailla, joilla on edennyt paikallista alueellista sairauksien ja kaukaisia ​​etäpesäkkeitä sisältyy terapeuttinen haaste [4]. Kun otetaan huomioon korkea uusiutumisen ja etäpesäkkeiden hinnat, se on äärimmäisen tärkeää, että vaihtoehtoisia hoitomenetelmiä haetaan ja kehitetään.

Syöpä kehitys edellyttää monimutkaista joukko poikkeavien signalointireittien joka pohjimmiltaan johtaa hallitsemattomaan soluproliferaatioon ohjaa proline- suunnattu fosforylaatio [5]. PIN1 on erittäin konservoitunut entsyymi, joka sitoutuu ja isomeroituu erityisiä fosforyloidun seriini- tai treoniinitähde edellisen proliini (Ser /Thr-Pro) sidoksia. Se indusoi konformaatiomuutoksia tiettyjen proteiinien että nopea muutoksia niiden ominaisuudet, kuten katalyyttinen toiminta, solunosasijaintia, proteiini-proteiini vuorovaikutusten ja vaihtuvuus [5, 6]. Siten PIN1 pidetään tärkeänä säädin solujen prosesseissa, kuten solusyklin säätelyssä, solun signalointi, transkription ja silmukoinnin, DNA-vaurioita vasteita, solujen selviytymisen ja lääkeresistenssi [5, 7, 8].

Apart alkaen, että on tärkeää PIN1 moduloinnissa aktivoinnin eri signalointimolekyylien, se on myös osoitettu vakauttamiseksi viruksen onkoproteiineja, kuten ihmisen T-solu-leukemia-viruksen tyyppi I Tax-proteiini [9]. Lisäksi PIN1 on raportoitu olevan osallisena toimintaan useiden virusten, mukaan lukien Kaposin sarkooma liittyvä herpesvirus [10], ihmisen immuunikatovirus tyyppi I [11, 12] ja hepatiitti C-viruksen [13]. Kiinnostavaa kyllä, se on myös osoitettu olevan vuorovaikutuksessa EBV koodata proteiinia [14], vaikka tietoa sen roolista EBV-maligniteetti on osoittautunut niukka.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli valaista roolia PIN1 kehittämisessä NPC joka on johdonmukaisesti liittyy EBV-infektio. Tutkimalla vaikutukset PIN1 ilmaisun EBV-NPC, me paljasti sen panos kasvainsolujen kasvua ja kasvaimen kehittymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, ksenografteissa ja primaarikasvainten

kolme NPC solulinjoja C666-1 (luonnollisesti EBV-, erilaistumaton tyyppi NPC) [15], HK1 (EBV-negatiivinen, hyvin erilaistunut tyyppinen NPC) [16], HK1-EBV (HK1 tartunnan EBV) [17], kuolemattomaksi normaali nenänielun epiteelin solulinjojen (NP69 ja NP460) [18] perustettu meidän laboratorioissa käytettiin tässä tutkimuksessa. Kohdunkaulan syövän solulinja HeLa saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Kaksi EBV-positiivisten NPC ksenografteissa-ksenotransplantaatiolla 666 [15], xeno-2117 [19], C15 ja C17 [20] otettiin myös. Xen-666 ja ksenotransplantaatiolla 2117 perustettiin meidän NPC ryhmä kuten aiemmin on kuvattu [15, 19]. C15 ja C17 saatiin professori Pierre Busson joka määritteli nämä ksenografteissa [20]. Sillä immunohistokemiallinen (IHC) värjäys tutkimuksessa 70 arkistointia formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotetut (FFPE) ensisijainen NPC koepalat rekrytoitiin kudospankin Department of Anatominen ja Cellular patologia Prince of Wales sairaalan, Kiinan University of Hong Kong (CUHK ). Tutkimuksen protokolla hyväksyi Clinical Research eettiselle toimikunnalle CUHK. Kaikki näytteet olivat histologisesti arvioitiin erilaistumaton tai huonosti eriytetty karsinoomia ja vahvistettu olevan EBV-positiivinen, määritettynä eber

in situ

-hybridisaatio [21]. Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1.

Transfektio ja lääkehoitoja

HK1, HK1-EBV, C666-1 ja HeLa-soluja viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia ja 1% L-glutamiinia (Life Technologies). NP69 soluja viljeltiin keratinosyyttien seerumia (KSFM) naudan aivolisäkkeen tiivisteet ja rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (Invitrogen). Kaikki soluja inkuboitiin kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Kaksi Äänenvaimennin Valitse validoitu siRNA kohdistaminen PIN1 (siPin1 544 ja siPin1 545) ja universaali negatiivinen kontrolli siRNA (Life Technologies) transfektoitiin transientisti C666-1 käyttäen Lipofectamine

TM 2000 Transfection Reagent (Invitrogen) valmistajan mukaan protokollia. Solut kerättiin ilmoitettuina ajankohtina tarkempaa analysointia varten. MG132 (Calbiochem) levitettiin HK1 ja NP69 soluja (10 ja 15 uM ja 5 ja 10 uM, tässä järjestyksessä) tutkia proteasomin hajoamista PIN1. PIN1 estäjä Juglone (Calbiochem) käytettiin tutkittaessa vaikutusta PIN1 estoa C666-1 soluja (2, 4, 6 ja 8 pM). Käsitellyt solut otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Määrittämään IC50 Juglone, solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin eri Juglone annoksilla (0,03-20 uM) 24 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus määritettiin sitten WST-1-määritystä.

vakaiden PIN1-yliekspressoivassa solulinjoissa

pCDH ja pCDH-PIN1 plasmidit olivat lahja, jalomielinen lahjoitus tohtori Roberta Pang, Department of Surgery, The University of Hong Kong. Lentiviruksen järjestelmää käytettiin luomaan vakaa PIN1-yli-ilmentyy NP69 solulinjassa. PCDH lentivirusvektoriannos pakattiin käyttäen kolmannen sukupolven lentivirus järjestelmä mukaan Lenti Aloitussarja valmistajan protokollien (System Biosciences). Virussupernatanttia (elatusaineet) kerättiin 293TN tuottajalta soluista 48 tuntia transfektion jälkeen. Virus (joiden pCDH tai pCDH-PIN1 vektori ja 10 ug pPACKH1-plasmidia mix) kerättiin ja transdusoitiin TransDuxand osaksi NP69 soluihin. PIN1 ilmentyminen varmistettiin kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) ja Western-blottauksella. Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP), toimittaja ilmentyminen visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla läsnäolon varmistamiseksi transdusoidun DNA.

Käänteinen transkriptio (RT) ja kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) B

RNA-näytteet valmistettiin by TRIZOL ja fenoli-kloroformiuutolla tehtiin käänteistranskriptiotuotteiden käyttäen MultiScribe käänteistranskriptaasi (Invitrogen). Saatu cDNA käytettiin reaaliaikaista qPCR kautta SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), mukaisesti valmistajan protokollia. Käytetyt alukkeet tässä tutkimuksessa luetellaan taulukossa 2. PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems). Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Ilmaisu kohdegeenien normalisoitui vastaan ​​taloudenhoito geeni β-aktiini käyttäen 2

[- ΔΔCT] menetelmällä.

Western blotting

Proteiini Näytteet erotettiin mukaan niiden koot elektroforeesilla, ja sitten sähkölaitteita siirrettiin nitroselluloosakalvolle käyttäen Bio-Rad Trans-Blot cell. Nitroselluloosakalvolle inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 5% rasvatonta maitoa tai 5% naudan seerumin albumiinia. Sitten membraania inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundäärisiä vasta-aineita. Kohdeproteiineja havaittiin kemiluminesenssi-substraatteja (GE Life Science) ja tuottama signaali havaittiin röntgenfilmeille (Kodak). Kalvot tutkittiin vasta-aineita ihmisen PIN1 (Calbiochem), ACTIN (Santa Cruz), sykliini D1 (Lab Vision), β-kateniinin, c-Jun, c-Jun (Ser73) ja c-Jun (Ser63) (Cell Signaling ).

immunohistokemiallinen värjäys

FFPE näytteet leikeltiin (4 pm), de-paraffinized ja nesteytyksestä myöhempää immunovärjäyksen. Sen jälkeen antigeeni haku, endogeeninen biotiini aktiivisuus estyi normaalia seerumia ja leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita (anti-PIN1, Calbiochem) kosteassa kammiossa. HRP-leimattua sekundaarista vasta-ainetta levitettiin osiin ja lopuksi 3,3′-diamino-bentsidiiniä (DAB) substraatti on haettu värin kehittymistä. PIN1 ilmaisun ja lokalisointi visu- punaisella ja nucleuses vasta- värjättiin hematoksyliinillä, joka ilmestyi sininen. Objektilasit Sitten kuivattu ja peitettiin Per- mountilla kiinnitysväliaine (Fisher Scientific).

kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys

apoptoosia käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen solujen havaittiin käyttämällä CaspACEAssay

TM mukainen järjestelmä valmistajan protokollien (Promega). Wells kaksoiskappaleissa sisältävä tyhjä (ei solu-uute), negatiivinen kontrolli (ote käsittelemättömät solut), indusoi apoptoosin (otteet PIN1 estäjä käsiteltyjä soluja) ja soluja käsiteltiin kaspaasiestäjä (otteet PIN1 inhibitor- ja Z-VAD-FMK kaspaasi-inhibiittori-käsitellyt solut) olivat mukana kokeissa. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja absorbanssi kehittyneet värit mitattiin aallonpituudella 405 nm Perkin Elmer 1420 Multilabel Counter Victor 3 (Perkin Elmer). Kaspaasin erityinen aktiivisuus laskettiin valmistajan ohjeita.

WST-1 ja BrdU määritykset

solujen lisääntymistä reagenssi WST-1 (Roche) käytettiin määrittämään nopeus soluproliferaation in treated- ja ei-käsiteltyjen solujen. Käsitellyt solut ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 3000-8000 solua kuoppaa kohti. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin välein 24 tunnin WST-1, jatkuvasti, 5 päivää. Absorbanssi kussakin kuopassa mitattiin aallonpituudella 450 nm ja normalisoidaan käyttäen aallonpituudella 690 nm, havaitsee Victor 3 (Perkin Elmer). Solulisääntyminen myös mitattuna DNA sisällyttäminen sisällä lisääntyvissä soluissa käyttämällä BrdU määritystä (Cell Proliferation ELISA, BrdU kolorimetriset Kit, Roche).

Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä

Käsitellyt ja non -käsitellyssä solut levytettiin pehmeässä agarissa (base agaroosi: 1,8% agaroosia KSFM; top-agaroosi: 0,9% agaroosi esisekoitetaan soluilla; 2 ml päällekkäin KSFM medium) arvioimaan kasvun kiinnityskohdassa riippumattomalla tavalla. Levyjä inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa kuukauden ajan. Pesäkkeet saatiin näkyviin käyttäen 0,1% p-iodonitro tetratsolium violetti (INT) värjäys (Sigma-Aldrich), ja sitten laskettiin.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

käsitellään ja ei-käsiteltyjen solujen ympättiin at 8×10

3 solua kuoppaa kohti (C666-1) tai 1×10

3 solua kuoppaa kohti (NP69) otetaan 6-kuoppaisille levyille. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO

2 21-28 päivää. Pesäkkeet muodostunut kiinnitettiin metanolilla ja visualisoida sininen käyttämällä Giemsa (Sigma-Aldrich) värjäys. Pesäkkeet, jotka sisältävät yli 50 solut laskettiin.

In vivo

tuumorigeenisyystesti

Valaistaan ​​

in vivo

kasvaimia aiheuttavasta vaikutuksesta PIN1, NP69 soluja (käsitelty siRNA: illa on PIN1 tai vektorisäätö) inokuloitiin subkutaanisesti kylkiin BALB /c-nude-hiiriin (nu /nu) (4 hiirtä ryhmää kohti). Kaikki hiiret nukutettiin 2,2,2-tribromietanoli (Avertin) ennen siirrostusta. Matrigel (BD Bioscience) käytettiin siirrostuksen prosessi NP69. Hiiriä tarkastetaan päivittäin kasvaimen muodostumisen ja koon kasvainten muodostettu kirjattiin. Määrittämään kasvaimen vastainen vaikutus PIN1 estäjä

in vivo

, Juglone (0 mg /kg, 0,5 mg /kg, 1,5 mg /kg) injektoitiin intraperitoneaalisesti nude-hiiriin istutettiin C666-1 lusiferaasin solut, kun kasvaimet olivat saavuttaneet oikean kokoisiksi. Kasvaimen koko kirjataan päivittäin, ja lusiferaasi-suola injektoitiin nude-hiiriin päivinä 0, 6 ja 8 seurata muutoksia kasvaimen koon kautta IVIS

TM 100 Imaging järjestelmän. Kaikki hiiret lopetettiin lopussa kokeiden katkaisemalla kaula ja kasvaimet säilyivät lisäanalyysiä varten. Ei hiiret olivat sairaita, kuolleet tai vaaditaan lopettamisperusteet Tämän tutkimuksen aikana. Eettinen hyväksyntä saatiin yliopiston koe-eläintoimikunnan eettisen komitean (AEEC), CUHK, ja eläin lisenssin hyväksyi Hongkongin hallitus, Department of Health.

lusiferaasireporttiterilla määritys

C666 -1-solut 60% konfluenssiin 96-kuoppaisen levyn kotransfektoitiin kanssa FR-TK-Luc-plasmidi, PIN1 siRNA ja reportteriplasmidilla. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut lyysattiin 1X passiivinen hajotuspuskuria (Promega). Lysaatit siirrettiin sitten 96-kuoppaiselle levylle ja Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin käyttäen Dual Luciferase Reporter Kit (Promega) valmistajan mukaan protokollia. Lusiferaasisignaali mitattiin Victor 3 (Perkin Elmer) kanssa tai ilman automaattista injektioita. Tulokset ilmaistiin suhteena Firefly lusiferaasin aktiivisuuden Renilla lusiferaasiaktiivisuutta.

signalointireitin array

Cancer 10 Pathway Reporter lusiferaasiksi Kit (SA Biosciences) käytettiin määrittämään signalointireittiin poikkeavuuksien käsitellyssä soluissa. Lyhyesti, reportteri plasmidit on Cignal Finder Array Plate resuspendoitiin ja sekoitettiin 0,8 ui Fugene HD reagenssia (Roche) 100 ul OPTI-MEM (Invitrogen). Transfektion kompleksin annettiin muodostua huoneenlämpötilassa 20 minuuttia. Käsitellyt solut otettiin sitten talteen ja reverse-transfektoitiin reportteriplasmidilla, jonka tiheys on 1.5X10

4 solua kuoppaa kohti. Dual-lusiferaasireportteri määritys suoritettiin 24 tunnin kuluttua inkubaation.

Tilastollinen

Kaikki kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja tulokset esitetään keskiarvona kanssa keskivirheen keskiarvon (SEM) . Student t-testiä käytettiin määrittämään tilastollista merkitystä, jossa on

P

-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

yli-ilmentyminen PIN1 NPC primaarikasvainten ja tuumorilinjoja

käyttäminen immunohistokemiallisella värjäyksellä, havaitsimme yliekspressio PIN1 on 70/70 (100%) NPC primaaristen kasvainten, verrattuna viereiseen normaaliin nenänielun epiteeliä (kuvio 1A). PIN1 yliekspressio osoitettiin myös paneelia EBV-positiivisten NPC solulinja (C666-1) ja ksenograftit (C15, C17, ksenotransplantaatiolla 2117 ja ksenotransplantaatiolla 666) Western-blottauksella, kun taas vain heikko PIN ilmentymistä havaittiin kuolemattomaksi normaalissa nenänielun epiteelin solulinjoja (NP460 ja NP69) (kuvio 1B). Huolimatta dramaattinen väheneminen PIN1 proteiinin ilmentymistä kuolemattomaksi normaalissa NPC soluissa, ei ilmeisiä eroja

PIN1

mRNA transcriptions ei havaittu normaalin NP solulinjojen ja NPC kasvaimia. Tämä havainto viittaa siihen translaation jälkeistä sääntelyä PIN1 normaaleissa nasopharyngeal soluissa.

(A) IHC värjäys käytettiin havainnollistamaan yli-ilmentymisen PIN1 edustavissa NPC primaarikasvainten (NPC1-NPC4). Kaikki tapaukset olivat EBV-positiiviset erilaistumaton karsinoomia. NPC1, NPC3 ja NPC4 ovat peräisin potilaista vaiheen 3 tauti. NPC2 on potilaalta, jolla vaihe 2 NPC. Vahva PIN-signaalit havaittiin kasvaimen solut, jotka on merkitty keltainen ”

*”. Viereisen normaalin epiteelin toimi kontrollina, jossa heikko PIN1 signaalit havaittiin. Punaiset nuolet osoittavat normaalia nenänielun epiteelin. (B) ilmentäminen PIN1 NPC tuumorilinjoja, ksenograftit ja ikuisti normaalit NP soluihin, havaitaan qRT-PCR (ylempi paneeli) ja Western blot (alempi kuva). Sillä qRT-PCR,

PIN1

transkription NP460 käytettiin referenssinä. Suhteellinen ilmentyminen

PIN1

selostukset oli merkitty kuten kertainen ero viitearvon. p-aktiini käytettiin lastaus normalisointia. Vastaavasti, ACTIN käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta Western blot-analyysi. Heikko PIN1 ilmaisun NP69 ja NP460 ehdotti, että downregulation PIN1 mukana translaation jälkeisiä sääntelyä.

Voit selvittää mekanismi translaation jälkeisen asetus PIN1 proteiineja, HK-1 ja NP69 hoidettiin proteasomin estäjä MG132 (karbobentsoksi-Leu-Leu-leucinal). Western blot tulokset osoittivat lisääntynyt PIN1 proteiinin ilmentymistä sekä HK1 ja NP69 solujen jälkeen MG132 hoidon (S1 Kuva). Tämä osoittaa, että PIN1 proteiinin ilmentymistä säätelee proteasomin hajoamisen.

johdonmukainen yli-ilmentyminen PIN1 viittaa sen mahdollisen onkogeeninen roolia NPC kehittämisessä. Tutkia sen kasvaimia synnyttävän toiminnon, siRNA: t ja PIN1 estäjää Juglone käytettiin määrittämään vaikutuksen PIN1 tukahduttaminen NPC solujen kasvuun. Myöhemmin vaikutukset PIN1 ilmentymisen solun kasvuun ja tuumorigeneesiä tutkittiin normaaleissa nenänielun epiteelisolujen (NP69) transfektoitu PIN1 ilmentävällä vektorilla.

PIN1 säätelee NPC solujen kasvua ja sykliini D1 ilmaisun

vaikutus PIN1 knockdown NPC solujen kasvuun tutkittiin transfektoimalla C666-1 soluja PIN1-erityisiä siRNA (siPin1 544 ja siPin1 545). Kuvio 2A ja 2B esittävät selvästi downregulation

PIN1

mRNA ja proteiini C666-1cells transfektoitu siPIN1. Tulokset WST-1 määrityksessä osoitti havaittavaa kasvua inhibition siPIN1-transfektoitujen C666-1 soluissa, verrattuna kontrolliin (kuvio 2C). Lisäksi pesäkemuodostuksen kyky on pienentynyt huomattavasti siPIN1-transfektoiduissa C666-1 (kuvio 2D). Nämä havainnot osoittavat, että PIN1 ilmaisu säätelee NPC solujen kasvua. Tulokset BrdU määrityksen paljasti merkitsevän vähenemisen DNA-synteesiin PIN1 pudotus NPC-soluissa (kuvio 2E). Tärkeää on, että ilmaus solusyklin säädin sykliini D1 tukahdutettu PIN1 pudotus C666-1-soluissa (kuvio 2B). Kotransfektiojärjestelmää pCMV-cyclinD1, sykliini D1-ilmentävällä vektorilla, jossa siPIN1, palautettu sykliini D1 ilmentymisen, solujen lisääntymistä, DNA-synteesi ja pesäkkeiden muodostuminen kyky C666-1 soluissa verrattuna siRNA-käsiteltyjen solujen (S2 kuvio) . Tämä viittaa siihen, että PIN1 säätelee NPC solujen kasvua moduloivan sykliini D1 ilmentymisen.

PIN1 suppression estää solujen kasvua, DNA-synteesi, pesäkkeiden muodostumisen kyky ja sykliini D1 ilmentymisen NPC-soluissa (A) qRT-PCR: n ja (B) Western blot käytettiin downregulation of PIN1 transkription ja proteiinin ilmentymistä PIN1 siRNA: ita (siPIN1 544 ja siPIN1 545) hoidetun NPC-solujen ja C666-1, vastaavasti. Näissä PIN1 pudotus soluissa, vähennetään sykliini D1 ilmentyminen havaittiin. ACTIN käytettiin lastaus valvonta Western blot-analyysi. (C) WST-1 määritys paljasti kasvun estämistä NPC transfektoiduissa soluissa siPin1 544 ja siPin1 545. (D) Pesäkkeenmuodostusta kyky merkittävästi vaimentaa PIN1-vaiennetaan C666-1 soluissa. Edustavia kuvia pesäkkeiden muodostaman siRNA-käsiteltyjen ja kontrolli solut näkyvät. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testi, jossa

P

-arvo alle 0,05 katsottiin merkitseväksi (*

P

0,05, **

P

0,01). (E) BrdU määritystä käytettiin paljastaa merkittävän estämällä DNA-synteesin PIN pudotus NPC soluja.

PIN1 estäjä indusoi kaspaasi-3 ja pienentää kasvaimen kokoa

PIN1 estäjä, Juglone, käytettiin selvittämään vaikutuksia PIN eston NPC soluissa

in vitro

ja

in vivo

. WST-1 määritys osoitti, että puolet maksimaalisesta estävä pitoisuus (IC50) Juglone varten C666-1 ja HK1 oli 6 ja 10 uM, tässä järjestyksessä (kuvio 3A). Tämä havainto osoittaa, että C666-1 soluja korkea PIN1 ilme ovat alttiimpia Juglone hoitoon. PIN1 estäjä Juglone tukahdutti sykliini D1 ilmentyminen C666-1 soluissa (kuvio 3B, vasen paneeli).

in vivo

vaikutus PIN1 estäjän sykliini D1 tukahduttamisesta varmistettiin lisäksi sisäisen kasvaimen injektion Juglone osaksi C666-1 nude-hiirissä malleissa (kuvio 3B, oikea paneeli). Juglone hoito myös merkittävästi parannettu kaspaasi-3 aktiivisuutta C666-1 soluissa kontrolleihin verrattuna (kuvio 3C). Tulokset viittaavat siihen, että Juglone estää solujen kasvua ja indusoi apoptoosia NPC-soluissa.

(A) HK-1 (vasen paneeli) ja C666-1 (oikea paneeli) käsiteltiin PIN1 inhibiittorin Juglone 24 tuntia määrittää lääkeannoksen herkkyyttä. IC50-arvot C666-1 ja HK1 soluja 6 uM ja 10 uM, vastaavasti. (B) ekspressio sykliini D1 tukahdutettiin Juglone annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta ei merkittäviä muutoksia β-kateniinin ilmentymistä ei havaittu. Ilmaisu sykliini D1 ja β-kateniinin että Juglone saaneilla C-666 ksenograftimallia tutkittiin Western blot. Alennettu ilmentyminen sykliini D1 havaittiin kasvain, joka oli saanut Juglone hoitoa. PIN1 esto johti tukahduttamiseen sykliini D1 sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja siellä oli vaatimaton väheneminen β-kateniinin tasolla

in vivo

malli . (C) C666-1 solut osoittivat merkitsevästi korkeampi kaspaasi-3: n aktiivisuuden jälkeen Juglone hoidon verrattuna niiden käsittelemättömän tai DMSO-käsitellyn kollegansa. Tämä osoittaa, että PIN1 esto voidaan aktivoida kaspaasi apoptoottisen väylän NPC soluissa. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testi,

P

-arvo alle 0,05 katsottiin merkitseväksi (*

P

0,05, **

P

0.01).

Kuva 4A ja 4B osoittavat

in vivo

antituumorivaikutus of Juglone NPC soluissa. ROI määrä oli suuresti pienentynyt käsitellyillä hiirillä Juglone, verrattuna kontrollien (kuvio 4A). Kuten kuviossa 4B on esitetty, kasvaimen kokoa hiirissä, käsiteltiin Juglone väheni merkitsevästi, verrattuna kontrolliin (kuvio 4B). Merkittävä tuumorin kasvun havaittiin hiirissä, joita käsiteltiin 1 mg /kg ja 1,5 mg /kg Juglone.

(A) käyttö

in vivo

kuvantamisen, kasvaimen kasvun lusiferaasin-merkityn C666-1 paljastettiin hoidon jälkeen eri annoksia Juglone (ROI laskee miljoonasosaa fotonien sekunnissa). Lusiferaasisignaali lisääntyi kontrolliryhmässä käsittelemättömän kasvaimia aikana Juglone hoidon. Kun hiiret, joita käsiteltiin Juglone eri annoksina (0,5, 1 ja 1,5 mg /kg), jatkuvasti alemmat lusiferaasi signaalit havaittiin aikana 8 päivän hoitojakson aikana. (B) Merkittävä Tuumorin kasvun eston on osoitettu hiirillä, joita hoidettiin 0,5, 1 ja 1,5 mg /kg Juglone. Neljä nude-hiiriä käytettiin kussakin tutkimusryhmän. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testi, jossa

P

-arvo alle 0,05 katsottiin merkitseväksi (*

P

0,05, **

P

0,01).

PIN1 indusoi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua nenänielun epiteelisolujen

kasvaimia aiheuttavasta vaikutuksesta PIN1 yli-ilmentymisen edelleen tutkittiin kuolemattomaksi nenänielun epiteelisolulinja (NP69) transfektoiduista kahdella PIN1 jäljittelee (pCDH-CMV-MCS-EF 1-copGFP-PIN1 /”Pin1 1 #” ja ”Pin1 2 #”). Yli-ilmentyminen

PIN1

transkriptien ja proteiineja havaittiin PIN1-transfektoiduissa NP69-soluja (kuvio 5A). Kuvio 5A esittää korkea transfektiotehokkuus PIN1-ekspressoivien transfektoitujen solujen GFP.

(A) yli-ilmentyminen PIN1 havaittiin NP69 transfektoiduissa soluissa Pin1 ilmentävien lenti-virusvektorit (Pin1 1 # ja Pin1 2 # ) mukaan qPCR (vasen paneeli) ja Western blot (keskimmäinen paneeli). Edustavia kuvia PIN1-transfektoitujen solujen Kirkas (oikea yläpaneeli) ja fluoresenssi kentän (oikea alapaneeli) esitetään. Transfektiotehokkuus seurattiin GFP: n ilmentymisen. (B) Enhanced ankkurista riippumaton kasvu pehmytagarmääritykset in NP69 solujen PIN1-yliekspressio, verrattuna kontrolli soluihin (vasen yläpaneeli, pesäkkeitä 6-kuoppalevyillä, vasen alapaneeli, pesäkkeitä mikroskoopilla, oikea paneeli, keskimääräinen datan histogrammissa ). (C-D) ei merkittävää vaikutusta PIN1 ilmentymisen vaikutus solujen kasvuun ja pesäkkeen muodostumista kyky havaittiin immortalisoidut nenänielun epiteelisoluihin NP69, jonka WST-1 ja pesäkemuodostusta, vastaavasti. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Studentin t-testi, jossa

P

-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin merkitseväksi (*

P

0,05).

yli-ilmentyminen PIN1 on N69-soluissa merkittävästi indusoi kiinnittymisestä riippumatonta solujen kasvua pehmeässä agarissa määrityksissä (kuvio 5B). Määrä muodostuneiden pesäkkeiden pehmeässä agarissa by PIN1 ilmentäviä NP69 soluissa oli merkittävästi suurempi kuin Vektorisäätö. Kuitenkin PIN1 yliekspressio ei indusoi solujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista kyky NP69 soluissa (kuvio 5C ja 5D).

PIN1 yliekspressio aktivoi MAPK /JNK-reitin

Reportteri lusiferaasianalyysissä paljasti, että MAPK /JNK-signalointireitin merkittävästi aktivoituu NP69-soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti PIN1, verrattuna transfektoitu vektorilla (kuvio 6A). Aktivointi lovi, p53 ja NF-KB reittejä havaittiin myös PIN1-ilmaisi NP69 soluissa, vaikka se ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Sen lisäksi sykliini D1, Western blotting vahvisti säätely sekä c-Jun ja fosforyyli-c-Jun (Ser63 ja Ser73) on NP69 pysyvästi transfektoitujen solujen PIN1 (kuvio 6B). Tämä havainto viittaa siihen, että PIN1 indusoi kasvua nenänielun epiteelisolujen aktivoimalla MAPK /JNK-reitin.

(A) Käyttäen Cancer 10 Pathway Reporter lusiferaasianalyysissä, merkittävää aktivoitumista MAPK /JNK-signalointireitin havaittiin kahdessa vakaasti PIN1-overxpressing NP69 solulinjoissa (NP69lenti-PIN1 1 # ja NP69lenti-PIN1 2 #). Näiden PIN1-ilmentävien solujen aktiivisuus oli myös kohtalaisen aktivoitu NOTCH, P53 /DNA-vaurioita ja NF-KB reittejä. (B) Western blot-analyysi osoitti, että ylösajon c-Jun, fosforyloitu c-Jun (Ser63 ja Ser73) ja sykliini D1 vakaa PIN1-transfektoitujen NP69 soluissa. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Studentin t-testi, jossa

P

-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin merkitseväksi (*

P

0,05).

keskustelu

tuoreessa tutkimuksessa, Lu

et al

. osoittivat yhdistyksen PIN1 promoottorin polymorfismien ja riski NPC [22]. Nykyisessä tutkimuksessa, tarjoamme toiminnalliset todisteita merkityksestä PIN1 yli-ilmentymisen NPC kasvainten synnyssä. Osoitamme, että PIN1 tukahduttaminen inhiboi

in vitro

ja

in vivo

kasvaimen kasvua NPC soluissa, kun taas sen yliekspressio indusoi kiinnittämisestä riippumaton kasvu nenänielun epiteelisolujen. Havainnot viittaavat siihen, että PIN1 yli-ilmentyminen edistää NPC tuumorigeneesiin, ja että sen esto voi olla mahdollisia terapeuttisia strategia EBV-NPC.

PIN1 on tärkeä entsyymi, joka sitoutuu fosforyloitu Ser /Thr-Pro-motiiveja ja katalysoi cis /trans-isomerointi proliini-sisältävät peptidit [5]. Yli-ilmentyminen PIN on raportoitu ihmisen eri kasvaintyypeissä, mukaan lukien rinta- [23], ruokatorven [24], eturauhassyöpä [25] ja peräsuolen syövän [26, 27]. Tässä tutkimuksessa, konstitutiivinen PIN1 yli-ilmentyminen havaittiin EBV-NPC kasvainsoluja, mutta PIN1 proteiini tuskin havaittu EBV-negatiivisten nenänielun epiteelisolujen. Koska

PIN1

transkriptio on samanlainen sekä NPC ja normaali NP-solut, PIN-yli-ilmentyminen kasvainsoluissa säätelee transkription jälkeisen mekanismeja. Tuore tutkimus kertoi, että PIN1 ilmentymistä säätelee kasvaimen tukahduttava miRNA miR-296-5p eturauhassyövässä [28]. Kuitenkin poikkeava mir-296-5p ilmentymistä havaitaan harvoin NPC [29]. Palauttaminen PIN ilmaisun MG132 saaneilla NP soluissa viittaa siihen, että prosessi proteasomaalisten hajoaminen on tärkeä mekanismi säätelyssä PIN1 toiminto. Basu

et al

. osoitti, että proteasomaalisten hajoaminen PIN1 oli ratkaiseva sen vuorovaikutusta BCL2 ja kasvainsolun eloonjäämistä [30]. Yhdessä nykyisen havaintojen puute tai riittämätön proteasomaalisten hajoaminen voi olla mahdollinen mekanismi selittää PIN1 kerääntymisen EBV-NPC, joka myöhemmin auttaa kasvainsolun eloonjäämistä. Meidän äskettäisessä tutkimuksessa, me paljasti vuorovaikutus EBV piilevä proteiinin EBNA1 kanssa PIN1 NPC soluissa (julkaisematon data). Kuitenkin sitoutuminen ei estänyt proteasomaalisten hajoamista PIN1.