Krooninen sairaus

tiivistelmä

co-estävä reseptori Ohjelmoidun Death-1 (PD-1) supistetaan immuunivastetta ja estää autoimmuniteetin kuitenkin kasvaimet hyödyntää tämän reitin paeta immuuni tuhoa. Kostimulatorista reseptori OX40 ylössäädellään T-solujen aktivaation jälkeen ja lisää niiden kloonilaajenemisen, selviytyminen ja sytokiinien tuotantoa harjoittavalle. Vaikka antagonistista anti-PD-1 tai agonistinen anti-OX40 vasta-aineet voivat edistää hylkäämisestä useiden hiiren kasvaimia, jotkut huonosti immunogeeniset kasvaimet olivat tulenkestävä tähän hoitoon. Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme antituumorivaikutuksia ja mekanismit kombinatorisista PD-1 salpaus ja OX40 aktivoituminen hiiren ID8 munasarjasyövän mallissa. Vaikka yksittäiset anti-PD-1 tai OX40 mAb hoito oli tehotonta kasvaimen suojaa 10 päivän perustettu ID8 kasvain yhdistettynä anti-PD-1 /OX40 mAb hoito inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvulta 60% hiiristä kasvainta 90 päivän kuluttua kasvaimen inokulaation . Kasvain suojaus liittyi systeeminen immuunivaste muistilla ja antigeenispesifisyyteen ja tarvittavat CD4

+ solujen ja CD8

+ T-soluja. Anti-PD-1 /OX40 mAb-hoito lisäsi CD4

+ ja CD8

+ solujen ja laski immunosuppressiivinen CD4

+ FoxP3

+ säätelijä-T (Treg) solut ja CD11

+ Gr 1

+ myelooisen suppressorisolut (MDSC), synnyttää merkittävästi suurempi osuus molempien efek- CD4

+ ja CD8

+ solujen Treg ja MDSC in vatsaonteloon; Kvantitatiivinen RT-PCR-data osoitti lisäksi induktion paikallisen immunostimulatorisen miljöössä anti-PD-1 /OX40 mAb hoitoon. Pernan CD8

+ T-solut yhdistettiin mAb käsiteltyjen hiiret tuottivat suuria määriä IFN-γ kun kasvaimen antigeenistimulaatiota ja näytteillä antigeenispesifisten sytolyyttinen aktiivisuus. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus testaa antituumorivaikutukset yhdistetyn anti-PD-1 /OX40 mAb hiiren munasarjasyövän mallissa, ja meidän tulokset antavat perusteet kliinisissä kokeissa munasarjasyöpä immunoterapia käyttämällä tätä yhdistelmää mAb.

Citation: Guo Z, Wang X, Cheng D, Xia Z, Luan M, Zhang S (2014) PD-1 Blockade ja OX40 laukeaminen synergistisesti Suojaa tuumorikasvun hiirimallissa munasarjasyöpään. PLoS ONE 9 (2): e89350. doi: 10,1371 /journal.pone.0089350

Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 10 marraskuu 2013; Hyväksytty: 20 tammikuu 2014; Julkaistu: 27 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Free tutkija projekti Shengjing Hospital (No.200806). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Taustaa

Munasarjasyöpä (OC) on kaikkein vaarallisin maligniteetti naisilla, joilla 22280 uutta tapausta ja 15460 kuolemantapausta arvioitu Yhdysvalloissa vuonna 2012 [1]. Korkeilla kuolleisuutta OC johtuu pääasiassa pitkälle edennyt taudin diagnoosin. Alkuvaiheen syöpiä voidaan parantaa jopa 90%: lla nykyisillä lääkkeillä [2], mutta suhdeluku laskee merkittävästi pitkälle sairaus noin 30% potilaista, joilla pitkälle OC hengissä 5 vuotta tämän alustavan diagnoosin [3]. Standardi munasarjojen syöpä on kirurginen debulking seurasi platina-taksaani kemoterapian [4]. Vaikka useimmat potilaat reagoivat kemoterapiaa aluksi, suurin osa niistä on lopulta uusiutumisen ja kuolee tautiin. Siksi uusia strategioita tarvitaan kiireellisesti parantaa tuloksia munasarjasyöpä.

Kertyvät näyttö viittaa siihen, että immunoterapia pitäisi olla tehokkaita OC hoidossa [5]. Ensinnäkin, OC-solut ilmentävät monia kasvaimeen liittyviä antigeenejä, joita vastaan ​​immuunivasteita on havaittu [6] – [10]. Toiseksi tutkimukset uranuurtajana Coukos ja työtovereiden osoittavat kasvaimen immuunivaste on kriittinen tekijä kliinisten tulosten potilaiden OC tukee läheinen korrelaatio selviytymisen näistä potilaista ja kasvaimen tunkeutuminen CD3

+ T-solujen suuri selityksin kliininen näytteiden [11]. Kolmanneksi, vaikka OC on tuhoisa tauti, etäpesäkkeitä usein rajoitettu vatsaontelo, jossa kasvain mikroympäris- on suoraan saatavilla, mikä poistaa tarpeen systeemistä kuljettamista varten immunostimulatorisen hoitoja [12]. Huolimatta runsaasti todisteita OC immunoterapian, kliininen menestys immuuni-pohjainen hoitomuotojen OC on yleensä ollut vaatimatonta [13].

Ohjelmoitu Death 1 (PD-1) proteiini on keskeinen coinhibitory reseptorin T-solujen kanssa rakenne on samanlainen, että CTLA-4, mutta joilla on erilainen biologinen funktio ja ligandin spesifisyys [14]. PD-1 toimii pääasiassa perifeerisissä kudoksissa, joissa T-solut voivat kohdata immunosuppressiivista PD-1-ligandien PD-L1 (B7-H1) ja PD-L2 (B7-DC), joka on ilmaistu tuumorisolut, stroomasolut, tai molempia [15], [16]. Blockade välisen vuorovaikutuksen PD-1- ja PD-L1 tehostaa T-solun immuunivasteiden in vitro ja välittää prekliinisissä antituumoriaktiivisuus [16] – [18]. PD-L1 on ensisijainen PD-1-ligandi, joka on säädelty kiinteissä kasvaimissa, jossa se voi estää sytokiinien tuotannon ja sytolyyttinen aktiivisuus PD-1

+ kasvainta infiltroituneen CD4

+ ja CD8

+ T-solujen [14], [19]. Nämä ominaisuudet tekevät PD-1 /PD-L1-reitin lupaava intervention kohde kasvain immunoterapian, joka on varmentanut äskettäin raportoidut tulokset kahdesta kliinisestä tutkimuksesta osoittavat mAbien spesifinen PD-1- ja PD-L1 laukaista vaikuttava antituumorivaikutus in ei- pienisoluinen keuhkosyöpä, melanooma ja munuaisten syöpä täysin regression saavutettu joillakin potilailla [20] – [22].

OX40 (aka CD137) on kostimulatorista molekyyliä, joka kuuluu TNF-reseptoriperheen ilmaisi pääasiassa aktivoitu efektori-T (T eff) solujen ja naiivi säätelijä-T-solujen [23]. Ligaatio OX40, pääasiassa CD4

+ T-soluja, aktivoi NF-KB: n reitin ja ajan säätelee antiapoptoottisten molekyylien Bcl-2-perheen, joka johtaa T-solujen klonaalisen ekspansion, aktivointi, muisti, ja sytokiinin tuotanto [24] – [26]. OX40 sitoutumista CD4

+ FoxP3

+ Treg solujen johtaa laajentumista, deaktivointi tai solukuolema riippuen paikallisista miljöö [27] – [30]. Koska OX40 liipaisu voi voimakkaasti stimuloida T-soluja ja mahdollisesti estää /poistaa säätelevien T-solujen, OX40 agonistit on tutkittu useissa prekliinisissä kasvainmuodoista [31] – [34] ja anti-ihmisen OX40 monoklonaalinen vasta-aine arvioidaan parhaillaan kliinisissä kokeissa (Kliinisten tutkimusten rekisterinumerot NCT01303705, NCT01416844, NCT01862900, NCT01644968 ja NCT01642290).

Vaikka antagonisti PD-1 tai agonistinen OX40 vasta-aineet voivat edistää hylkääminen joidenkin hiiren kasvaimia kuitenkin heikosti immunogeenisiä kasvaimia, kuten ID8 munasarjasyöpä eivät reagoi vasta-hoito yksinään [35]. Oletimme, että yhdistetty PD-1 saarto ja OX40 aktivointi edistäisi antituumorivaikutuksen immuniteetin. Tässä käytetään ID8 hiiren munasarjasyövän mallissa, osoitamme, että yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb hoito suppressoi merkitsevästi 10 päivää perustettu vatsakalvon ID8 kasvaimen kasvua, mikä johtaa 60% käsitellyistä hiiristä kasvaimen free 90 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen injektion jälkeen. Lähempi tarkastelu paljasti, että yhdistetyn anti-PD-1 /OX40 mAb näkyvästi lisäsi efektori-T-solujen ja vaimennetaan immunosuppressiivinen solujen kasvaimen sivustojen systeemisen antigeeni-spesifisen CTL-vasteen.

Methods

Hiiret

Nainen C57BL (6-8 vk) hankittiin päässä Animal Experimental Center of China Medical University. Eläinten käyttö hyväksyttiin Institutional Review Board of China Medical University

Cell Culture

ID8, klooni MOSEC munasarjakarsinooman C57BL /6 alkuperä oli lahja Dr. George Coukos ( University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) [36]. Hiiren B16-melanoomasoluja, TC1 keuhkosyöpä ja T-solujen lymfooma EL4-solut hankittiin ATCC (Manassas, VA). Kasvainsoluja viljeltiin täydellisessä DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ennen solujen suspensioita valmistettiin ja siirretty hiirillä. EL4-soluja ja pernasoluja pidettiin täydellisessä väliaineessa RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 25 mM HEPES, 2 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

Monoclonal Antibodies ( mAb: t) B

terapeuttinen anti-OX40 (klooni OX-86, Catalog #: BE0031), anti-PD-1 (klooni RMT3-23; Catalog # BE0115), anti-CD4 (klooni GK1,5; Catalog #: BE0003-1), anti-CD8 (klooni 2.43, Catalog #: BE0061), anti-NK1.1 (klooni PK136, Catalog #: BE0036) ja valvonta rotan IgG2a-mAb (klooni 2A3, Catalog #: BE0089) hankittiin alkaen BioXcell (West Lebanon, NH). Käytetyt vasta-aineet virtaussytometriaa varten hankittiin Tianjingin Sungene (Tianjingin, Kiina) ja eBioscience (San Diego, CA).

Eläinkokeet

Hiiret (5 tai 10 hiirtä /ryhmä) injektoitiin intraperitoneaalisesti (ip), 1 x 10

6 ID8 solua 0,1 ml: ssa PBS: ää. Päivinä 10, 14 ja 18 tuumorin istuttamisen jälkeen kukin hiiri sai i.p. injektio 200 ug ohjaus, anti-PD-1, anti-OX40 tai anti-PD-1 /OX40 mAb 200 ul: ssa PBS: ää. Hiiret punnittiin kahdesti viikossa ja tarkistaa päivittäin varten kliinisiä turvonnut vatsa osoittaa Askites muodostumista sekä näyttöä myrkyllisyydestä kuten hengitysvaikeuksia, liikkuvuus, laihtuminen, ripuli, kyyryssä ryhti, ja epäonnistuminen syömään kun histopatologia tehtiin tärkeimpien elinten (eli, maksan, munuaisten, suolistossa, keuhkoissa, ja paksusuolen). Sen jälkeen hoitokäytännön, hiiret tapettiin, kun he kehittivät vatsaonteloon sekä oli painonnousu 30%. Vatsakalvon kasvain massat kerättiin ja punnittiin, selviytyminen kunkin hiiren tallennettiin ja kokonaiselossaolo laskettiin.

immuunimuisti arviointi, yhdistetty (2 erillisellä kokeella) 12 pitkään elossa hiiriä (90 vuorokauden kuluttua ensimmäisestä kasvain injektio) yhdistetyistä anti-PD-1 /OX40 terapian ryhmässä tai samanikäisiin naiivi hiiret (joka toimi kontrollina) altistettiin ip tai ihon alle (s.c.) 1 x 10

6 ID8 soluja tai 1 x 10

6 syngeneeisissä mutta antigeenisesti erilainen TC1 soluja. Kolme kohtisuorassa halkaisijat s.c. kasvaimet mitattiin joka toinen päivä käyttäen paksuus ja kasvainten tilavuudet laskettiin seuraavan kaavan mukaan: 1/2 x (pituus) x (leveys)

2. Hiiret tapettiin, kun ne näyttivät kuolemaisillaan tai niiden kasvaimet saavuttivat 10 mm halkaisijaltaan. Selviytymisen kunkin hiiren kirjattiin ja elinaika on laskettu.

ehtyminen lymfosyyttien osajoukot, hiiriin ruiskutettiin i.p. 500 ug mAb vastaan ​​CD8, CD4, tai NK1.1, 1 päivä ennen ja kahden päivän kuluttua kasvaimen haaste, jonka jälkeen injektio 200 ug välein 5 päivä koko kokeen ajan. Teho-soluja tuhoavan varmistettiin värjäämällä ääreisverivalkosolut varten tiettyjä osia sen jälkeen, kun väheneminen (tuloksia ei ole esitetty).

arviointi vatsakalvon immuunisolujen (PIC) B

Hiiret, jotka oli transplantoitu i.p. jossa ID8 solut lopetettiin 7 päivää sen jälkeen kun ne oli käsitelty kontrolli, tai yhdistettyjä mAb yhdistelmä kuvattu eläinkokeissa. Saada PIC, 3 ml PBS: ää injektoitiin vatsaonteloon hiirien ID8 kasvaimia heti eutanasia, niiden vatsa oli hierotaan ja neste poistettiin, suodatettiin 70 uM solusiivilän (BD Biosciences), pestiin ja immuunijärjestelmän solut eristettiin hiirellä lymfosyyttien eristäminen puskuria (Cedarlane, Burlington, Ontario) seuraten valmistajan ohjeita ja useimmat tuloksena solujen ( 95%) oli CD45-postive immuunisolujen vahvistama virtaussytometrianalyysillä (kuva S1).

virtaussytometristä värjäystä, yhden solun suspensiot PIC pestiin FACS-värjäys ja inkuboitiin hiiren Fc-reseptorin sitoutumisen estäjä (eBioscience) 10 minuuttia ennen värjäystä mAb (Tianjingin Sungene) vastaan ​​hiiren CD45 (klooni 30-F11), CD3 (klooni 145-2C11), CD4 (klooni GK1,5), CD8 (klooni 53-6.7), CD19 (klooni eBio1D3), CD11 (klooni M1 /​​70) ja Gr-1 (klooni RB6-8C5), CD44 ( klooni 1M7) ja CD62L (klooni MEL-14) 30 minuutin ajan. Solunsisäistä värjäystä FoxP3 (klooni FJK-16: n, eBioscience), solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja värjättiin sen jälkeen, kun ohje Cytofix /Cytoperm kit (BD Bioscience). Virtaussytometria suoritettiin käyttäen FACSCalibur (BD Biosciences) ja väestön immuunisolujen valittiin avaintamalla CD45-positiivisia soluja. Aineisto analysoitiin käyttämällä Flow Jo ohjelmistoa (Puu Star, Ashland, OR). Kaikki virtaussytometrillä kokeet suoritettiin vähintään 3 kertaa.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, GA), ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen SuperScript III käänteistranskriptaasi (Invitrogen). Lauseke kiinnostavia geenejä analysoitiin PIC päivänä 7 kolmannen injektion jälkeen mAb. Alukkeet kaikkien geenien testatuista sisäinen valvonta GAPDH, syntetisoitiin Invitrogen, Shanghai, Kiina. Primer sekvenssit olivat follows:GAPDH:For:5′-GTGGAGATTGTTGCCATCAACG-3′,Rev:5′-CAGTGGATGCAGGGATGATGTTCTG-3′;T-bet:For:5′-CGGTACCAGAGCGGCAAGT-3′, Rev: 5′-AGCCCCCTTGTTGTTGGTG-3 ’; FoxP3: For: 5’-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3 ’, Rev: 5′-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3′; IFN-γ: For: 5’-AAAAACCTAAAAAATCTAAATAACT-3 ’, Rev: 5′-ATCAACAACAACTCCTTTTCCACTT-3′; IL-10: For: 5’-CTCTTACTGACTGGCATGAGG-3 ’, Rev: 5′-CCTTGTAGACACCTTGGTCTTGGAG-3’. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin kautta ABI PRISM 7500 Real-Time PCR systerm (Applied Biosystems), 1 x SYBR Green Universal PCR Mastermix (Takara). Transkriptipitoisuuksissa laskettiin 2-ΔΔCt menetelmä, normalisoitu ilmaus GAPDH, ja ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna ohjaus.

analyysi IFN-γ ja IL-10 tuotantoa PIC

Hiiret injektoitiin ip 1 x 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin injektoitiin kolmasti 4 päivän välein 200 ug ohjaus tai anti-PD-1 /OX40 mAb. Seitsemän päivää viimeisen mAb injektio, yhdistettiin PIC (2 x 10

6 /kuoppa) kerättiin käsitellyistä hiiristä stimuloitiin sitten 50 ng /ml PMA: ta ja 1 ug /ml ionomysiinillä 6 tuntia ennen analysointia IL 10: n ja IFN-γ erityksen viljelmän supernatanteissa Mouse IFN-γ /IL-10 Quantikine-ELISA Kit ohjekirjan mukaisesti (R kaikkea GenScript, Nanjing, CA) 3 päivää. IFN-γ supernatanteissa määritettiin Mouse IFN-γ Quantikine-ELISA Kit (R Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) plus sekundaarinen vasta-aine tai sekundäärinen vasta-aine yksinään käytettiin positiivisena tai negatiivisena kontrollina. Suhteet fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) positiivisista kontrolli tai seerumi rahalaitosten negatiivisesta kontrolli laskettiin.

Tilastot

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 5. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan tilastollinen ero kahden ryhmän välillä ja yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertaamaan kolme tai useampia ryhmiä. Eloonjäämisluvut analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja arvioidaan log-rank testi Bonferroni korjaus. Merkittäviä eroja vastaanotettiin p 0,05.

Tulokset

Yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb indusoi synergistisen antituumorivaikutus in ID8 on kasvain

arvioitiin tuumorin vastaista tehokkuutta yhden tai yhdistetty anti-PD-1 ja anti-OX40 mAb C57BL /6-hiirissä, ip 10 päivää aikaisemmin, 1 x 10

6 ID8 soluja. Käsittelemättömät hiiret ja hiiret käsiteltiin kontrolli mAb kehitetty askites noin 30 päivän kuluttua tuumorin istuttamisen ja piti uhrata kuten aiemmin on kuvattu [38]. Kuten kuviossa 1A on esitetty, joko kerta-mAb oli vain vähän vaikutuksia kasvuun 10 päivää perustettu ID8 kasvaimen johtaa askites muodostuminen lähes samaan aikaan kuin käsittelemättömän tai kontrolli-mAb: llä käsitellyissä hiirissä; kuitenkin, yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb hoito lisäsi merkittävästi eloonjäämisaste hiiriä 60% (6 10 hiirtä) hiirten kasvaimen vapaa (vahvistettu laparotomiaa) 90 päivän kuluttua kasvaimen injektion (p 0,001 yhdistettynä mAb verrattuna yhden tai valvontaa mAb), ja jopa hiiret menehtyivät kasvaimen kasvu oli myös merkittävästi pidentynyt keskimääräinen eloonjäämisaika (MST) verrattuna kontrolli tai yhden mAb käsiteltyihin hiiriin (kuvio 1 B, MST 30.90, 34.00, 34.00and +75,75päivä valvontaa, anti- PD-1, anti-OX40 ja anti-PD-1 /OX40 ryhmä; p 0,001 yhdistettynä mAb verrattuna yhden tai valvontaa mAb). Paino kasvainmassoja hiirille on yhdistetty mAb myös huomattavasti vähentynyt verrattuna kontrollista tai yhden mAb käsiteltyihin hiiriin (kuvio 1 C). Toistuminen kokeilun tulokset ovat samanlaisia ​​(tuloksia ei ole esitetty). Näissä eläinkokeissa, emme noudata mitään ilmeistä toksisuutta kuten painon tai hiustenlähtö hiirillä, jotka saivat yhden tai yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb. Lisäksi olemme myös ei havaittu ilmentymistä PD-1 ja OX40-molekyylit ja niiden ligandit PD-L1 /PD-L2 ja OX40L pinnalla ID8 munasarjasyöpäsoluja (tietoja ei ole esitetty), lukuun ottamatta sitä mahdollisuutta, että inhibitio ID8 kasvaimen kasvua

in vivo

suoraan välittyy anti-PD-1 tai anti-OX40 mAb.

, hiiret (10 hiirtä ryhmässä) istuttaa ip 1 x 10

6 ID8 soluja 10 päivää, ennen kuin käsiteltiin kolmesti 200 ug ohjaus, anti-PD-1, anti-OX40 ja anti-PD-1 /OX40 mAb 4 päivän välein ja elinaika hiirten oli kirjataan. B, keskimääräinen elinaika hiirten kasvaimen kasvuun laskettiin. C, The vatsakalvon kasvain massat punnittiin kun hiiret lopetettiin Jokainen piste edustaa jokaisen hiiri. D, Pitkäaikainen elossa (90 päivän kuluttua ensimmäisen kasvainhaasteelle) hiiriä (4 hiirtä ryhmää kohti) 2 mAb hoitoryhmässä, altistettiin ID8 solujen i.p. tai s.c. tai syngeenisellä etuyhteydettömien TC1 soluja istutetut s.c., ja sitten eloonjäämisaste hiirten kirjattiin. E, Hiiret (5 hiirtä ryhmää kohti), käsiteltiin yhdistetyn anti-PD-1 /OX40 mAb injektoitiin myös anti-CD4, anti-CD8, anti-NK1.1, tai ohjaus mAb 500 ug kutakin mAb per hiiri 1 päivä ennen ja kahden päivän kuluttua kasvaimen haasteen jälkeen syötettiin 200 ug välein 5 päivää sen jälkeen keston kokeissa. Kasvain käsittelemättömät hiiret olivat negatiiviset (UNT). Eloonjäämisaste hiirillä rekisteröitiin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen lukuun ottamatta D ja E, jotka oli yhdestä kokeessa. *** P 0,001 yhdistettynä mAb vs kontrolli tai yhden mAb käsiteltyjen hiirten A-C; *** P 0,001, s.c. tai i.p.ID8 vs s.c.TC1 C; * P 0,05, ohjaus tai NK1.1 vs UNT, CD4 tai CD8 D.

Hiiret hylättiin ID8 solujen jälkeen yhdistelmähoito olivat resistenttejä myöhemmälle uusintatartuntapotentiaalista i.p. tai s.c. samalla solulinjan mutta ei s.c. toisiinsa liittymättömiä TC1 keuhkosyövän soluja (kuvio 1 D). Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmähoito aiheuttaa erityistä ja pitkäkestoinen antitumor immuunivasteen hoidetuissa hiirissä. Lymfosyyttien osajoukko ehtyminen kokeet osoittivat, että kasvain suojaa anti-PD-1 /OX40-mAb: t oli riippuvainen CD4

+ ja CD8

+ T-soluja, kuten poistamalla CD4

+ tai CD8

+ T-solut mutta ei NK-solut täysin kumosi antituumorivaikutuksen myönnetty anti-PD-1 /OX40 mAb hoitoon (kuvio 1 E).

Yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb käsittely lisää merkittävästi suhteet sekä CD4 ja CD8 T solujen Treg ja MDSC

tutkia mekanismeista synergiaa PD-1 saarto ja OX40 aktivointia, olemme analysoineet vaikutuksia yhden tai yhdistetty mAb kasvaimen infiltroituneen vatsakalvon immuunisolujen (PIC) kerätään käsitellyistä hiiristä 3 tai 7 päivää viimeisen mAb injektion. Verrattuna kontrolli tai yhden mAb yhdistettynä mAb huomattavasti prosenttiosuudet efektorisolujen CD4

+ FoxP3

– (keskiarvo valvontaa, anti-PD-1, anti-OX40 ja anti-PD-1 /OX40 ryhmä: 8,24%, 8,20%, 8,70%, 18,78% päivänä 3 ja 7,66%, 8,02%, 12,22%, 22,80% päivänä 7; p 0,05) ja CD8 + (keskiarvo 6,62%, 6,74%, 7,20%, 23,24% päivänä 3 ja 5,88, 7,22, 12,90, 29,26 päivänä 7; p 0,01) T-solujen ja väheni taajuus CD11

+ GR-1

+ myelooinen johdettuja suppressorisolut (MDSC; keskiarvo 12,58% , 10,86%, 13,62%, 6,53% päivänä 3 ja 14,58%, 10,28%, 14,20%, 3,28% päivänä 7; p 0,05 ja 0,01 päivää 3 ja 7 vastaavasti) PIC päivänä 3 käsittelyn jälkeen ja muutosten tuli näkyvämpi päivänä 7 käsittelyn jälkeen (kuva 2A-D); ei kuitenkaan muutosta prosenttiosuus CD4

+ FoxP3

+ säätelijä-T-solut (Treg) havaittiin yhdistettiin mAb käsitellyillä hiirillä kahdessa ajankohtina arvioida. Nämä vastakkaisia ​​muutoksia efek- ja immunosuppressiivisten solut johti merkitsevästi koholla suhde molempien efek- CD4

+ ja CD8

+ T-solujen Treg ja MDSC in vatsaonteloon hiirien saivat yhdistelmähoitoa mAb hoitoa (kuvio 2E-H) . Mitä tulee yksittäisten mAb hoitoon, OX40 sitoutuminen merkittävästi kohonnut prosenttiosuutta CD4

+ FoxP3

+ Treg (1,01%, 0,93%, 1,33%, 1,03% päivänä 3 ja 1,07%, 0,84%, 1,84%, 0,97% 7. päivänä; p 0,05 päivänä 7) vaatimaton korotus efektorisolujen CD4

+ FoxP3

– ja CD8 + T-solut päivänä 7 käsittelyn jälkeen; kuitenkin, yksi PD-1 saarto lievästi heikennetty tasot immunosuppressiivista Treg ja MDSC sisään vatsaonteloon. Totesimme kasvu absoluuttinen määrä koko immuunisolujen 2 mAb käsitellyistä hiiristä kahdessa ajankohtina analysoitu (keskiarvo (x 10

6 /hiiri): 3.5, 3.7, 3.8, 5.6 päivänä 3 ja 3.7, 3.8, 4,0, 6,2 päivänä 7; p 0,05) ja muutokset absoluuttinen määrä kunkin osajoukon kehitys oli samanlainen niiden prosenttiosuudet (tuloksia ei ole esitetty).

hiiret (5 hiirtä ryhmää kohti) injektoitiin ip 1 x 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin injektoitiin kolmasti 4 päivän välein 200 ug ohjaus, yhden tai yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb. Kolme tai seitsemän päivää myöhemmin, vatsakalvon pesut hoidettujen hiirien analysoitiin virtaussytometrialla koostumuksen eri immuuni alaryhmiä. Prosenttiosuudet CD4

+ FoxP3

– T-solujen, CD8

+ T-solujen, CD4

+ FoxP3

+ Treg ja CD11

+ GR-1

+ MDSC vuonna CD45

+ vatsakalvon immuunisolujen esitetään A, B, C ja D vastaavasti jokaisen piste edustaa dataa kustakin hiirestä. Suhteet sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solujen Treg ja MDSC näkyvät E, F, G ja H vastaavasti jokaisen piste edustaa dataa kustakin hiirestä. Tiedot edustavat 2 itsenäisestä kokeesta, * P 0,05, ** P 0,01.

Lisätietoja fenotyypin analyysi osoitti, että merkittävästi lisääntynyt prosenttiosuus CD44

+ CD62L

– efektori /muisti (keskiarvo valvontaa, anti-PD-1, anti-OX40 ja anti-PD-1 /OX40 ryhmä: 9,4%, 10,3%, 14,0%, 33,4%, ja 18,6%, 21,6%, 26,2%, 53,0% ja CD4 ja CD8 solujen; p 0,01 sekä solut) ja CD44

+ CD62L

+ keskusmuistia (35%, 40,9%, 42,8%, 54,2%, ja 37,7%, 36,7%, 34,6%, 36,9 % CD4 ja CD8-solut; p 0,05 CD4-solujen) soluja havaittiin vatsakalvon CD4 + ja CD8 + T-solujen anti-PD-1 /OX40 mAb käsitellyissä hiirissä verrattuna valvonnan tai yhden mAb käsiteltyihin hiiriin (kuvio 3A, B ), jonka PIC sisälsi korkeamman naiiveja CD4

+ ja CD8

+ T-soluja (48,2%, 44,1%, 37,2%, 9,73%, ja 32,7%, 33,6%, 27,1%, 6,3% CD4 ja CD8-solut; p 0,01 molempien solujen) kanssa CD44

-CD62L

+ fenotyyppiä (kuvio 3C). Edustaja pistekuvaajat oli kuvassa 3D.

Hiiret (5 hiirtä ryhmää kohti) injektoitiin i.p. 1 x 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin injektoitiin kolmasti 4 päivän välein 200 ug ohjaus, yhden tai yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb. Seitsemän päivää myöhemmin, ilmentymistä CD44 ja CD62L peritoneaalidialyysia CD4

+ ja CD8

+ T-solujen käsiteltyjen hiirten analysoitiin virtaussytometrialla. Taajuudet CD44

+ CD62L

– efektori /muisti, CD44

+ CD62L

+ muisti-ja CD44

-CD62L

+ naiivi solujen vatsakalvon CD4

+ ja CD8

+ T-solujen on esitetty A, B ja C vastaavasti. Edustaja pistekuvaajat esitetään D ylhäältä, keskeltä ja alhaalta paneelien näyttämiseen isotyypin, CD44 ja CD62L värjäytymistä aidatulla CD4

+ ja CD8

+ T-soluissa. Tiedot edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta, * P 0,05, ** P 0,01.

Yhteenvetona, nämä tulokset osoittavat, että samanaikainen PD-1 salpaus ja OX40 laukeaminen luo suurempi osuus efektori-T-solujen immunosupressiivisille solujen vatsaonteloon käsiteltyjen hiirten, joka edustaa siirtymä normaalisti ehkäisevästä kasvaimen miljöön enemmän stimuloiva tila, joka on salliva immuunivälitteiseen kasvaimen tuhoamista.

Yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb käsittely edistänyt paikallisen immunostimuloiva mikroympäristö

edelleen tueksi siirtyminen kasvain microenvironment, tutkimme seuraavaksi ilmentymistä immuuni liittyvien geenien vasta eristetyssä PIC päivinä 3-7 jälkeen mAb hoidon. Käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR, liittyvät tekijät immuuniaktivaatiota (T-bet ja IFN-γ) ja ne, jotka liittyvät immunosuppressiivinen /sääntelytoiminnan (FoxP3 ja IL-10) arvioitiin niiden suhteelliset ekspressiotasot. Päivänä 3 käsittelyn jälkeen, ajankohtana, jolloin se lisää lentovuoroja T efektorisolujen havaittiin, transkriptipitoisuuksissa T-bet ja IFN-γ geenejä paranee dramaattisesti yhdistetyssä hoitoryhmässä (kuvio 4A, B). Sen sijaan, geeni-ilmentymisen immunosuppressiivisten sytokiinien IL-10 oli huomattavasti vähentynyt, kun taas FoxP3 geeni säilyi ennallaan (kuvio 4C, D), joka oli yhdenmukainen muutos Treg ja MDSC PIC. Muutos on ilmentymisen T-bet: n, IFN-γ: n ja IL-10-geenien oli nopeampaa päivänä 7 käsittelyn jälkeen. Perustuvat suhteet stimuloivan-to-säätelygeenillä selostukset (suhteet sekä T-bet /FoxP3 ja IFN-γ /IL-10), päättelimme, että yhdistelmähoito edistänyt paikallista immuniteettia aktivoiva kasvain mikroympäristölle (kuvio 4E, F ). Yhden OX40 liipaisu kohtalaisesti lisääntynyt ilmentyminen kaikki neljä geenit, ei kuitenkaan korkeus sekä T-bet /FoxP3 ja IFN-γ /IL-10 suhteilla.

Hiiret (5 hiirtä ryhmää kohti) injektoitiin i.p. 1 x 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin injektoitiin kolmasti 4 päivän välein 200 ug ohjaus, yhden tai yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb. Kolme tai seitsemän päivää myöhemmin, ilmentymistä Th1-liittyvän T-bet: n ja IFN-γ-geenit että immuunivastetta FoxP3 ja IL-10-geenien PIC hoidettujen hiirten analysoitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Ilmentymistä T-bet: n, IFN-γ, FoxP3 ja IL-10-geenien on esitetty A, B, C ja D vastaavasti. Suhteet sekä T-bet /FoxP3 ja IFN-γ /IL-10 on esitetty E ja F vastaavasti. Vasta eristettyjä PIC päässä käsitellyistä hiiristä stimuloitiin 50 ng /ml PMA: ta ja 1 ug /ml ionomysiinillä 6 tunnin ajan (kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät) ja supernatantit arvioitiin tasoja IL-10 (G) ja IFN-γ (H ). Tiedot ilmaistiin M ± SEM 5 hiiren ja edustava 2 itsenäisestä kokeesta, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Jotta muutokset IFN -γ ja IL-10-RNA-ekspressio korreloi muutoksiin proteiinitasolla, PIC eristettiin päivinä 3-7 hoidon jälkeen ja stimuloitiin in vitro ennen analyysiä IFN-γ: n ja IL-10-erityksen tasojen ELISA: lla. Erityisesti, PIC eristetty 3 ja 7 päivää aloittamisen jälkeen yhdistetty mAb-hoidon merkitsevästi korkeampi IFN-γ-proteiinin ja alhaiset IL-10 sytokiinin verrattuna kerätty ohjaus tai mAb-käsitellyistä hiiristä on nämä samat ajankohtina (kuvio 4G , H).

Yhdistetty anti-PD-1 /OX40 mAb hoito sai aikaan antigeeni-spesifisen CTL-vasteen

ID8 ilmentävät Mesothelin, hyvin tunnettu vasta kasvaimen antigeeni [38], me korjattu splenosyyteillä käsitellyistä hiiristä, ja sama määrä pernasolua viljeltiin, kun läsnä oli 10 ug /ml H-2Db-rajoitettua Mesothelin peptidi (aminohappo 406-414), tai ohjaamaan HPV-E7-peptidiä (aminohapot 49 -57) ja 3 päivää ja analysoitiin IFN-γ tuotannon viljelmäsupernatanteista ELISA: lla. Verrattuna valvonnan tai yhden mAb-käsiteltyjen hiirten pernasoluja yhdistetyistä mAb-käsiteltyjen hiiret tuottivat merkittävästi korkeampi IFN-γ kun stimuloitiin Mesothelin peptidi (P 0,01; kuvio 5A). Ei lisääntynyt IFN-γ eritys havaittiin pernasoluja kaikkien ryhmien hiirten, kun ne stimuloitiin ohjaus HPV-peptidiä, jotka osoittavat induktion Mesothelin immuunivasteen hiirissä, saivat yhdistelmähoitoa mAb hoitoa. Arvioimme lisäksi sytolyyttinen aktiivisuus pernasolujen valvonta- tai yhdistettynä mAb käsitellyissä hiirissä. Pernasoluja stimuloitiin uudelleen UV-säteilytettyjen ID8 soluja 4 päivää ennen CTL-määritykset suoritettiin käyttämällä EL4-soluja pulssitettiin Mesothelin tai HPV-E7 peräisin peptidin kohdesoluihin. Kuten kuviossa 5B ja 5C, splenosyytit anti-PD-1 /OX40 käsitellyt hiiret osoittivat merkittävästi korkeampia sytotoksinen vaikutus EL4 solujen pulssitettiin Mesothelin mutta ei HPV-E7-peptidiä.