Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keratinosyyttien kasvutekijän reseptorin (KGFR) on jatkos muunnelma FGFR2 geenin ilmaistu epiteelisoluissa. Aktivointi KGFR on avaintekijä säätelyssä elintoimintoja epiteelisolujen, kuten proliferaatiota, erilaistumista ja haavan paranemista. Korjauksilla KGFR signalointi on liitetty patogeneesiin eri epiteelikasvaimissa. Se on ollut myös arveltu, että sen ligandi, KGF, voisi edistää vastustuskyvyn 5-fluorourasiilin (5-FU) in epiteelisyövissä ja tamoksifeenia estrogeenin-positiivisten rintasyöpiä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Sirna transfektoitiin ihmisen keratinosyyttisolulinjan (HaCaT), rintasyöpä solulinjaa (MCF-7) ja keratinosyyttien primäärisestä viljelmästä (KCS) indusoimaan selektiivinen downregulation KGFR ilmaisun. Vahva ja erittäin spesifinen väheneminen KGFR ilmentymisen havaittiin sekä RNA (vähennys = 75,7%,

P

= 0,009) ja proteiinin taso. KGFR vaiennetaan solut osoittivat alennettua vastata KGF hoitoa, jota arvioidaan mittaamalla proliferaationopeus (14,2% vs. 39,0%: n ohjaus solujen,

P

0,001) ja solumigraation (24,6% vs. 96,4%: n ohjaus solut,

P

= 0,009). Valetransfektoiduissa MCF-7-soluissa, KGF ehkäisee kapasiteetti 5-FU estää solujen proliferaatiota, kun taas KGFR vaiennetaan soluissa KGF heikosti häiritsee 5-FU antiproliferatiivinen vaikutus (11,2% vs. 28,4% ohjaus- solujen,

P

= 0,002). Kapasiteetti 5-FU aiheuttaa solukuoleman kumotaan samanaikaisella käsittelyllä KGF, kun taas KGFR vaiennetaan soluissa 5-FU tehokkaasti indusoi solukuolemaa jopa yhdistellä KGF, määritettynä arvioimalla solujen elinkelpoisuus. Samoin kyky tamoksifeenin estää MCF-7 ja KCS lisääntymistä on suuresti vähennetty KGF hoitoa ja on täysin kunnostettu vuonna KGFR vaiennetaan soluissa (12,3% vs. 45,5% kontrollisolujen,

P

0,001) .

Johtopäätökset /merkitys

Nämä havainnot viittaavat siihen, että selektiivinen esto KGF /KGFR reitti voi tarjota hyödyllinen väline parantaa tehoa hoitostrategioiden tiettyjen epiteelikasvaimet.

Citation: Rotolo S, Ceccarelli S, Romano F, Frati L, Marchese C, Angeloni A (2008) vaiennettu keratinosyyttikasvutekijäksi Receptor Palauttaa 5-fluorourasiilin ja tamoksifeenin tehoa koskevat Responsive syöpäsoluja. PLoS ONE 3 (6): e2528. doi: 10,1371 /journal.pone.0002528

Editor: Stefan Maas, Lehigh University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 14, 2008; Hyväksytty: 27 toukokuu 2008; Julkaistu: 25 kesäkuu 2008

Copyright: © 2008 Rotolo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustusta MIUR, Cofin 2005 ja Lazion avustus myönnetään Progetto di Ricerca Finalizzata 2005. Rahoittajat eivät olleet suoraan tai välillisesti ota osaa suunnittelussa tai tutkimuksen tekemiselle missään osassa.

Kilpailevat edut : kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keratinosyyttien kasvutekijän reseptori (KGFR /FGFR2-IIIb) on tyrosiinikinaasi proteiini, joka kuuluu perheeseen fibroblastikasvutekijän reseptorit (FGFR: ää). KGFR edustaa silmukoinnin transkriptio variantti FGFR2 geenin ja ilmentyy epiteelisolujen eri elimiin. Vaihtoehtoisesti liitetystä isoformin, joka tunnetaan nimellä FGFR2-IIIc, on havaittu soluissa mesenkymaalisten linjojen [1], [2]. KGFR avainasemassa valvonnassa epiteelisolujen kasvua ja erilaistumista, suorittamalla sen biologiset vaikutukset parakriinisellä tavalla [3] kautta sitoutuu voimakkaasti sen ligandit, nimittäin keratinosyyttikasvutekijäksi (KGF /FGF7), FGF10 ja FGF22 [4 ]. Joukossa, KGF toimii paitsi voimakas mitogeeni ensisijaisen ihmisen keratinosyyttejä, mutta myös edistää niiden erilaistumista ohjelma [5] ja suojaamalla niitä apoptoosin induktion [6], [7]. Lisäksi KGF osallistuu sekä kokeellisen [8], [9] ja

in vivo

[10] haavan paranemista kuvaavissa malleissa, stimuloiva migraatio keratinosyyttien [11], [12] ja houkutella uudelleenjärjestely aktiinisytoskeletonin, siis lisäämällä epiteelisolujen liikkuvuuden [13].

Viime aikoina on ollut kasvavaa kiinnostusta mahdollisesta roolista korjauksilla KGF /KGFR signalointia epiteelin kasvainten synnyssä. Lisääntynyt KGFR mRNA: n ilmentymisen on havaittu laaja valikoima on epiteelialkuperää olevia tuumoreita, kuten keuhko-, paksusuoli-, maha-, haima- ja eturauhassyövissä. Joissakin tapauksissa, kuten voimistunutta ilmentymistä näyttää liittyvän solun transformaatio ja, ehkä, maligni kehittyminen [14]. Lisäksi KGF hallinto on osoitettu lisäävän solun liikkuvuus in estrogeenireseptorin (ER) -positiivinen rintasyöpäsoluja [15], [16], jotka mahdollisesti osallistuvat rintasyövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [17] ja parantaa invasiivisia potentiaalia mahasyöpä solulinjat, jotka yliekspressoivat KGFR [18].

Muut tutkimukset johtivat oletuksen, että KGF voidaan käyttää antiapoptoottisten aktiivisuus tiettyjen syöpäsolujen sekä apoptoosin inhibitio aiheuttama kemoterapeuttinen lääkeaine 5-fluorourasiilin (5-FU ) [19] – [22]. Kehitys syöpäsolujen resistenssi perinteisille kemoterapia-aineiden, kuten 5-FU, havaitaan usein ja on yhä merkittävä este onnistuneen syövän hoitoon ja näkyvä syy kasvaimen uusiutumisen kemoterapian jälkeen [23].

Lisäksi on ehdotettu, että muutokset reiteistä liittyy FGF: t ja vastaaviin reseptoreihinsa voisi edustaa yksi resistenssimekanismeihin tamoksifeenin, joka lopulta kehittyy monia ER-positiivista rintasyöpää, [24] – [27]. Kuitenkin tämän hypoteesin ei ole täysin varmistettu ja erityistä roolia suuri perhe FGF: t on kaukana ymmärretään.

Lähestymistapa perustuu valikoivaan downregulation osallistuvien proteiinien soluprosesseissa korreloi kasvaimen etenemistä edustaa lupaava raja syövän hoitoon. Transfektio erityisiä pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) on tehokas keino saavuttaa geenispesifistä pudotus, ja se edustaa voimakas terapeuttinen strategia hoitoon useiden sairauksien, kuten virusinfektiot, neurologiset häiriöt ja syöpä [28].

yksinomainen tavoite spesifisyys siRNA vastaan ​​sairaudelle relevantit mRNA: t on välttämätön edellytys hyödyntämiseen tämän teknologian. Tässä tutkimuksessa olemme valikoivasti vaimentua KGFR mRNA ja proteiinin ilmentyminen kolmessa epiteelin solulinjoissa, HaCaT keratinosyyttejä, MCF-7 rinta- syöpäsolujen ja ensisijaisen viljellyt keratinosyytit (KCS), jonka uuden lähestymistavan siRNA suunnittelu, joka perustuu hyödyntämiseen Dicer endonukleaasilla alustan 27-mer dsRNA laukaista RNA-interferenssi (RNAi). Tämä tekniikka tarjoaa parannetun tehon ja pidemmän keston RNAi verrattuna perinteisiin 21-mer siRNA: t, jolloin käyttö pienempiä pitoisuuksia RNAi kohdesoluissa, joka vähentää huomattavasti sivuvaikutuksia. Lisäksi se mahdollistaa kohdentaminen sivustoja, jotka reagoivat huonosti tukahduttaminen 21-mer siRNA [29].

Analysoimme vaikutukset KGFR siRNA ominaisuuksiin bio-parametrit, kuten solujen elinkelpoisuuteen, jakaantumiseen, apoptoosin ja muuttoliike testatuista solulinjoista. Lopuksi arvioitiin, onko downregulation KGFR ilmentyminen kykenee inhiboimaan 5-FU: n ja tamoksifeenin vastuksen aiheuttama KGF soluviljelmissä.

Tulokset

inhibitio KGFR mRNA: n ilmentymisen, jonka siRNA: illa

ei ole olemassa selkeitä sääntöjä siRNA kohdesivustoon valinta spesifisten mRNA-sekvenssien. Kuitenkin yhden ainoan mRNA-sekvenssin eri siRNA-molekyylit osoittavat dramaattista vaihtelua tehokkuuden kannalta ja spesifisyys geenien. Täällä käytetään laboratorio- ja Internetissä oleviin ohjelmiin, mukaan aiemmin kuvattujen kriteerien (https://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html), voidaan valita kolme siRNA sekvenssit suunnattu FGFR2 geeniä. On tunnettua, että sama geeni koodaa kahta vaihtoehtoista transkriptien, joka on nimetty KGFR /FGFR2-IIIb ja FGFR2-IIIc, jotka eroavat varten erilaiset venyttää 49 aminohappoa niiden solunulkoisen domeenin ja näyttää eri ligandia sitovia ominaisuuksia. Näin ollen toteuttaa tietyn pudotus on KGFR transkriptin, valitsimme siRNA: t sekvenssien kohdennetut sisällä eksonin 8 FGFR2-geenin, joka on saumattu ainoastaan ​​KGFR isoformin (Fig. 1A). Kaikki siRNA: t sekvenssit merkittiin BLAST haun varmistaa, ettei ollut merkittävää homologiaa muiden geenien. Kuten koskee suhteellinen ekspressio kahden FGFR2 isoformien meidän kokeellisissa malleissa, HaCaT-solujen on aiemmin osoitettu ilmaista FGFR2-IIIc variantti FGFR2 kaksi kertaluokkaa pienempi määrä kuin FGFR2-IIIb silmukointivariantti [30]; MCF-7-solujen, aiemmin osoitettu ilmentävän molempia isoformeja [31], olemme osoittaneet, että FGFR2-IIIb ilmentyminen on huomattavasti korkeampi kuin FGFR2-IIIc (11-kertainen kasvu) (Fig. 1 B). Kyky jokainen on suunniteltu siRNA ja yhdistetyssä sarja kolmen duplekseja erityisesti alentamispolitiikka KGFR mRNA, vaikuttamatta ilmentymisen FGFR2-IIIc isoformi, määritettiin MCF-7 ja HaCaT-soluja. Lyhytaikaisissa transfektioissa käytettiin tuottamaan kullekin siRNA ja soluja inkuboitiin liposomaalisen pelkällä vektorilla (vale transfektio) käytettiin kontrollina. Optimaalinen pitoisuus siRNA transfektioon oli kokeellisesti määritetty olevan 5 nM (dataa ei esitetty), sopusoinnussa viime havainnot ilmoitettu myrkyllisiä mekanismit, off-tavoite vaikutuksia ja stimulaation indusoiman immuunivasteen suuria annoksia synteettisiä RNAi

in vitro

ja

in vivo

[32]. Kyky eri siRNA: iden määrän vähentämiseksi on KGFR mRNA arvioitiin Q-RT-PCR: llä. MCF-7-solut myös arvioitiin spesifisyys suunniteltu siRNA: iden. KGFR ja FGFR2-IIIc mRNA-tasot normalisoitiin β-aktiini-mRNA: n tasoja. 48 h transfektion jälkeen, MCF-7-soluissa, jotka on transfektoitu yhdistettiin joukko siRNA-1, -2 ja -3 ilmaisi tilastollisesti merkittävä pienennetyn määrän KGFR mRNA verrattuna mock-transfektoituja soluja (0,243-kertainen, pieneneminen = 75,7%,

P

= 0,009) (Kuva. 2A). Vähemmän ilmeistä vaikutusta saatiin transfektoimalla yksilön dupleksit: siRNA-1 (0,613-kertainen, pieneneminen = 38,7%,

P

= 0,168), siRNA-2 (0,405-kertainen, pieneneminen = 59,5%,

P

= 0,068) ja siRNA-3 (0,406 kertainen, vähennys = 59,4%,

P

= 0,061) (Kuva. 2A). Sitä vastoin ei yksittäinen siRNA eikä siRNA-altaan havaittu mitään estovaikutusta FGFR2-IIIc mRNA tasolla (siRNA-1: 0,902 kertainen, vähennys = 9,8%,

P

= 0,71; siRNA-3: 0,914 kertaiseksi, vähennys = 8,6%,

P

= 0,36; si-RNA-3: 0,943 kertainen, vähennys = 5,7%,

P

= 0,52; siRNA-allas: 1.028 kertaiseksi, ero = 2,8%

P

= 0,85) (Fig. 2B).

(A) Kaaviokuva että vaihtoehtoista silmukoinnin FGFR2-IIIc ja KGFR /FGFR2-IIIb. Insertti (*) raportoi cDNA-sekvenssi (nukleotidit 1590-1698), joka vastaa koko eksonin 8, jossa sekvenssit suunnattu kolmen siRNA: t (harmaat laatikot). (B) tasot KGFR ja FGFR2-IIIc-mRNA: n ilmentyminen määritettiin Q-RT-PCR: llä, ja normalisoitiin p-aktiinin mRNA-tasot. KGFR mRNA MCF-7-solut määritettiin kertaisesti suhteessa FGFR2-IIIc mRNA. Käyrä osoittaa kvartiiliväli kolmen itsenäisen kokeen (laatikot), niiden keskiarvo (vaakasuora pisteviiva pylväät) ja 95%: n luottamusväli (CI) (viikset). Kaksipuolinen Studentin

t

testiä käytettiin vertaamaan KGFR vs. FGFR2-IIIc ilmaus: *

P

0,001. Oheisessa taulukossa raportit tarkoittaa ekspressiotaso, Standard Error (SE), ja 95%: n luottamusväli kullekin määritettiin näytteen.

(A, B) MCF-7-solut valetransfektoidut tai transfektoitu 5 nM siRNA -1, -2, -3, tai joiden yhdistetty joukko niitä, ja kokonais-RNA uutettiin 48 h transfektion jälkeen. Tasot KGFR (A) ja FGFR2-IIIc (B) mRNA: n ekspressio määritettiin Q-RT-PCR: llä, ja normalisoitiin p-aktiinin mRNA-tasot. KGFR (A) tai FGFR2-IIIc (B) mRNA: n siRNA-transfektoiduissa soluissa määritettiin kertaisesti suhteessa, että ilmaistu mock-transfektoiduissa soluissa. Kutakin käsittelyä varten, kaaviot osoittavat kvartiiliväli kolmen itsenäisen kokeen (laatikot), niiden keskiarvo (vaakasuora pisteviiva pylväät) ja 95%: n luottamusväli (CI) (viikset). Kaksipuolinen Studentin

t

testiä käytettiin vertaamaan siKGFR transfektoidut versus mock-transfektoituja soluja: *

P

= 0,009. Oheiset taulukot raportoi tarkoittaa ekspressiotaso, Standard Error (SE), ja 95%: n luottamusväli kullekin määritettiin näytteen.

Siksi kaikki myöhemmät kokeet suoritettiin transfektoimalla siRNA-allas, joka vastaa yleisesti hyväksytty kriteerit siRNA tehokkuus ( 70%: n vähennys kohde-mRNA). Lisäksi, koska allas on ominaista suuri spesifisyys KGFR isoformin, sitä kutsutaan kuin siKGFR muualla käsikirjoituksen.

Aika tietysti siRNA-välitteisen KGFR hiljentäminen

arvioimiseksi keston ja tehon KGFR hiljentämisen, suoritimme kokeet, on HaCaT-soluja, jotka on transfektoitu siKGFR, määrän määrittämiseksi KGFR mRNA: n Q-RT-PCR: llä 6, 24, 48, 72 ja 96 h transfektion jälkeen (kuvio. 3A). Vähentäminen KGFR mRNA: n ilmentymisen havaittiin 24 h transfektion jälkeen, verrattuna mock-transfektoituja soluja (1,127 vs. 2,730-kertainen, ero = 58,7%,

P

0,001), kun taas täysi teho saavutetaan 48 ja 72 h (1,127 vs. 4,779 kertaiseksi, ero = 76,4%,

P

0,001 ja 1,079 vs. 4,463 kertaiseksi, ero = 75,8%,

P

0,001, vastaavasti) transfektiosta . 96 h transfektion jälkeen, voimakas lasku KGFR ekspressiota havaittiin myös valvonta. Kuitenkin transfektoiduissa soluissa, downregulation KGFR ilmaisun oli edelleen merkittävä (1,215 vs. 1,963 kertaiseksi, ero = 38,1%,

P

= 0,017). Perusteista aikaa kurssin tulokset ja mukaan aiempien raporttien osoittavat, että huippu KGFR proteiinin ilmentyminen saavutetaan 72 tunnin kuluttua nälkään [30] päätimme suorittaa kaikki myöhemmät kokeet 72 tunnin seuraavissa siKGFR transfektion.

(A) HaCaT-solut valetransfektoidut tai transfektoitu 5 nM siKGFR, ja kokonais-RNA uutettiin transfektoiduista soluista 6, 24, 48, 72 ja 96 h myöhemmin. Tasot KGFR mRNA: n ilmentymisen määritettiin Q-RT-PCR: llä, ja normalisoitiin p-aktiinin mRNA-tasot. Määrä KGFR mRNA kussakin aikapisteessä ilmaistiin kertainen KGFR mRNA-tasolla suhteessa 6 h ajankohtana. Kunakin ajankohtana, graafi näyttää kvartiiliväli kolmen itsenäisen kokeen (laatikot), niiden keskiarvo (vaakasuora pisteviiva pylväät) ja 95%: n luottamusväli (viikset). Oheisessa taulukossa raportit tarkoittaa ekspressiotaso, Standard Error (S. E.), ja 95%: n luottamusväli kunkin analysoitiin näytteestä. Kaksipuolinen Student: n

t

testiä käytettiin vertaamaan siKGFR transfektoitiin versus mock-transfektoituja soluja: *

P

0,001 (24 h); **

P

0,001 (48 h); †

P

0,001 (72 h); ‡

P

= 0,017 (96 h). (B) HaCaT solut valetransfektoidut tai transfektoitu 5 nM siKGFR. 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin 20 ng /ml KGF: ää 48 tunnin ajan. Tasot KGFR mRNA: n ilmentymisen määritettiin Q-RT-PCR: llä, ja normalisoitiin p-aktiinin mRNA-tasot. Määrä KGFR mRNA ilmaistiin taitteeseen KGFR mRNA-tasojen suhteen käsittelemättömän mock-transfektoituja soluja. Kaavio ja taulukkoraportti samaa sarjaa tiedot kuin (A) kunkin analysoitiin näytteestä.

P

arvot määritettiin käyttäen kaksipuolista Studentin

t

testi: *

P

= 0,003 versus käsittelemättömien mock-transfektoituja soluja; **

P

= 0,018 versus KGF saaneilla mock-transfektoituja soluja. (C) HaCaT-solut transfektoitiin ja käsiteltiin kuten kohdassa (B), ja tasot KGFR proteiinin ilmentymisen määritettiin Western blot -analyysillä käyttämällä polyklonaalista anti-bek vasta-aine. Sama blot koettimena tubuliinin kontrollina yhtäläisten lastaus. Määrä KGFR proteiinin arvioitiin densitometrisellä analyysillä; arvot edustavasta kokeesta standardoitu tubuliiniin tasolle ilmaistuna kertainen KGFR proteiinin suhteen käsittelemättömän mock-transfektoituja soluja ja raportoidaan kuvaaja.

alassäätely KGFR mRNA ja proteiini ilmentyminen siRNA in KGF-käsiteltyjen HaCaT solujen

tiedetään, että hoito epiteelisolujen KGF aiheuttaa useita tapahtumia, kuten solujen lisääntymisen ja erilaistumisen sitoutumalla KGFR ja sisäistämisen reseptorin kytketty vähentämiseen tason KGFR mRNA ilmaisun . Siten tutkimme vaikutus siKGFR transfektion soluviljelmissä läsnäollessa 20 ng /ml KGF. mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot testattiin Q-RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä. Terävä lasku KGFR mRNA havaittiin transfektoiduissa soluissa siKGFR verrattuna mock-transfektoituja soluja (0,232-kertainen, pieneneminen = 76,8%,

P

= 0,003) (Fig. 3B). Läsnä KGF, havaitsimme downmodulation ilmaus KGFR myös mock-transfektoiduissa soluissa. Kuitenkin KGFR mRNA esto siRNA oli ilmeistä (0,265 vs. 0,598 kertaiseksi, vähennys = 55,7%,

P

= 0,018) (Kuva. 3B). Samassa koesarjassa tasot KGFR proteiinin ilmentymisen analysoitiin myös Western blotilla. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, KGFR ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt siKGFR-transfektoiduissa soluissa verrattuna mock-transfektoituja soluja. Densitometri-analyysi vahvisti, että siKGFR vähensi proteiinin ilmentyminen, sekä käsittelemätöntä ja KGF käsiteltyjä soluja, yli 50% suhteessa mock-transfektoiduissa soluissa (0,47-kertainen verrattuna 1 kertainen, vähennys = 53% ja 0,20 vs. 0,73 kertainen, vähennys = 72,6 %, tässä järjestyksessä) (Graph Fig. 3C).

siRNA-välitteinen downregulation KGFR estää soluproliferaatiota ja solumigraatio aiheuttama KGF

arvioida biologiset vaikutukset KGFR hiljentämisen selvitimme siKGFR kyky vaikuttaa KGF-indusoitua proliferaatiota suorittamalla lulisäkasvumäärityksessä on HaCaT solulinjassa. Plated solut transfektoitiin siKGFR ja kasvatettiin 48 h vakio väliaineessa täydennettynä tai ei 20 ng /ml KGF. Solujen proliferaatio määritettiin laskemalla positiivisten solujen Ki67-antigeeni, joka tunnistaa pyöräily soluja, ja raportoidaan graafisesti positiivisten solujen prosenttiosuuden (Fig. 4A). Kuten odotettua, ja mock-transfektoituja soluja, havaitsimme kasvu HaCaT-soluissa leviämisen jälkeen KGF hoidon, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (39% vs. 13,6%, 2,9-kertainen lisäys,

P

0,001). Vaimennussäätely KGFR ilmaisun erityisillä siRNA lähes kokonaan poisti KGF vaikutus HaCaT soluihin leviämisen, joiden leviämisen nopeudella taustan tasolle (14,2% vs. 39%, 2,7 kertainen ero,

P

0,001) (kaavio kuvio . 4A).

(A) Proliferaatiomääritys. HaCaT soluja, kasvatettu peitinlaseista olivat valetransfektoidut tai transfektoitu 5 nM siKGFR. 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin 20 ng /ml KGF: ää 48 tunnin ajan. Sitten solut kiinnitettiin ja altistettiin immunofluoresenssianalyysillä kanssa polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu Ki67 (punainen). Kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. Asteikko bar, 10 mikrometriä. Tumat tehtiin näkyviksi käyttämällä 4 ’, 6-diamido-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI). Prosenttiosuus Ki67-positiivisten solujen määritettiin laskemalla Ki67-positiivisten tumien verrattuna kokonaismäärä ytimien kymmenen eri alueilla otetaan satunnaisesti kolmesta eri kokeissa, jotka on ilmaistu keskiarvona ± 95%: n luottamusväli ja ilmoitetaan kuvaaja.

P

arvot määritettiin käyttämällä Studentin

t

testi: *

P

0,001 versus käsittelemättömien mock-transfektoituja soluja; **

P

0,001 versus KGF saaneilla mock-transfektoituja soluja. (B, C) haavan paranemista määrityksessä. HaCaT (B) ja MCF-7 (C) transfektoitiin, kuten (A). 48 h transfektion jälkeen, solu-vapaa alue (haava) otettiin käyttöön konfluentteja viljelmiä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Soluja käsiteltiin tai ei ole 50 ng /ml KGF: ää ja annettiin kulkeutua 24 h ennen valokuvauksen faasikontrastimikroskopialla. Kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. Mittaviivat 10 pm. Solumigraation arvioitiin uudelleenmetsitys alkuperäisen haavan solujen: prosenttiosuus talteen alue mitattiin kuva-analyysin ja arvot kuvaajat ovat keskimäärin kolme levyä jokaisen kunnon ± 95% CI.

P

arvot määritettiin Studentin

t

testi: (B) *

P

0,001 versus käsittelemättömien mock-transfektoituja soluja; **

P

0,001 versus KGF saaneilla mock-transfektoituja soluja. (C) *

P

= 0,035 versus käsittelemättömien mock-transfektoituja soluja; **

P

= 0,009 versus KGF saaneilla mock-transfektoiduissa soluissa.

sitten analysoi vaikutusta KGFR hiljentäminen solun maahanmuuttoa, toinen monimutkainen ja tiukasti säänneltyä soluprosessi voimakkaasti indusoi by KGF hoito. Tätä varten suoritimme haavan paranemista määrityksessä. 48 h transfektion jälkeen, jossa siKGFR solun vapaan alueen otettiin käyttöön yksikerroksiset HaCaT-soluja, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Solut, joita käsiteltiin tai ei ole 50 ng /ml KGF: ää, pitoisuus on ilmoitettu olevan tehokkaampia tässä määrityksessä [34], annettiin kulkeutua reunasta haavan 24 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, haavan sulkemisen saatiin lähes valmiiksi 24 h kuluttua ensimmäisestä haavoittumisen in KGF saaneilla mock-transfektoituja soluja, kun taas käsittelemättömät mock-transfektoiduissa soluissa osoitti rajoitettu muuttoliikkeen suhteen T0 (96,4% vs. 23,1%, 4,2 kertainen lisäys,

P

= 0,035) (kuvio Fig. 4B). Transfektio siKGFR esti merkitsevästi solujen vaeltamiseen indusoi KGF (Fig. 4B) ja sen jälkeen vähensi talteen alueella 96,4%: n ohjaus solujen 24,6%, 3,9-kertainen ero,

P

= 0,009) (kaavio kuvio . 4B).

sama haavan paranemista määritys suoritettiin myös MCF-7-rintasyöpäsolujen, joiden tiedetään olevan herkkiä KGF kannalta motiliteetin [15], ja samankaltaisia ​​tuloksia (Fig. 4C). KGF hoito edistänyt vahvan kannan uudelleen, verrattuna hoitamattomiin mock-transfektoituja soluja (83% vs. 29,6%, 2,8 kertainen lisäys,

P

0,001). Vuonna KGFR vaiennetaan soluissa, KGF muuttoliikkeelle oli lähes lakkautettiin, verrattuna ohjata soluja (25,4% vs. 83%, 3,3 kertainen ero,

P

0,001) (kuvio Fig. 4C).

Nämä tulokset viittaavat siihen, KGFR hiljentäminen estää tehokkaasti KGF biologisia vaikutuksia, kuten solujen lisääntymisen stimuloituminen ja muuttoliike, joko HaCaT keratinosyyteissä tai rintasyövän epiteelisolujen.

KGFR hiljentäminen estää palauttaminen solun leviämisen aiheuttama KGF, kun 5-FU stimulaatio

Usein, syövän solut kehittävät resistenssin yhteisiä kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten 5-FU, mikä haastava kemoterapian tehokkuutta [23]. Tutkiakseen roolin KGFR perustamisessa resistenssin 5-FU, me ohimenevästi pudotti KGFR ilmentymisen siRNA MCF-7 rintasyöpä solulinjassa.

Transfektio siKGFR suoritettiin läsnä ollessa tai ilman 20 ng /ml KGF: ää, 25 ug /ml 5-FU tai niiden yhdistelmää. Ensin arvioidaan tehokkuutta KGFR hiljentäminen analysoimalla sekä mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot.

Kuten kuviossa. 5A, käsittely KGF mock-transfektoiduissa soluissa vähentää ilmentymistä KGFR mRNA käsittelemättömiin soluihin verrattuna, riippumatta läsnä oli 5-FU: n soluviljelmissä (0,555-kertainen, pieneneminen = 44,5%,

P

= 0,170, ja 0,545-kertainen, pieneneminen = 45,5%,

P

= 0,183, vastaavasti). Lisäksi 5-FU yksin huonosti vaikuttaa KGFR mRNA: n ilmentymisen (0,911-kertainen, pieneneminen = 8,9%,

P

= 0,711). In siKGFR-transfektoiduissa viljelmissä, havaitsimme vahvaa vaikutusta mRNA: n ilmentymisen (0,133-kertainen, pieneneminen = 86,7%,

P

= 0,039), ja pienet muutokset vasteena läsnäolo tai puuttuminen KGF ja /tai 5 -FU. Nämä tiedot vahvistivat, että MCF-7-solut reagoivat samalla tavalla HaCaT soluihin vastauksena KGFR hiljentäminen. Lisäksi saadut tulokset RNA tasolla vahvistettiin analysoimalla proteiinin ekspression, kuten on esitetty kuviossa. 5B. Erityinen siRNA merkittävästi vähentynyt KGFR proteiinin käsittelemättömissä soluissa sekä in KGF ja /tai 5-FU-käsitellyissä soluissa, 60% -70% suhteessa sama kohtelu mock-transfektoiduissa soluissa (kaavio kuvio. 5B).

(A) MCF-7-solut valetransfektoidut tai transfektoitu 5 nM siKGFR. 48 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin 20 ng /ml KGF: ää, 25 ug /ml 5-FU tai KGF plus 5-FU: ssa 24 tuntia. Tasot KGFR mRNA: n ilmentymisen määritettiin Q-RT-PCR: llä, ja normalisoitiin p-aktiinin mRNA-tasot. Määrä KGFR mRNA: siKGFR-transfektoiduissa soluissa ilmaistiin kertainen taso KGFR mRNA suhteessa käsittelemättömän mock-transfektoiduista soluista. Kutakin käsittelyä varten, graafi näyttää kvartiiliväli kolmen itsenäisen kokeen (laatikot), niiden keskiarvo (vaakasuora pisteviiva baaria), ja 95%: n luottamusväli (viikset). Oheisessa taulukossa raportit tarkoittaa ekspressiotaso, Standard Error (S. E.), ja 95%: n luottamusväli kunkin analysoitiin näytteestä.

P

arvot määritettiin käyttämällä Studentin

t

testi: *

P

= 0,039 versus käsittelemättömien mock-transfektoituja soluja. (B) MCF-7-solut transfektoitiin ja käsiteltiin kuten kohdassa (A), ja määrä KGFR proteiinin arvioitiin Western blot -analyysillä anti-bek polyklonaalista vasta-ainetta. Tubulin toimi latauskontrollina. Määrä KGFR proteiinin arvioitiin densitometrisellä analyysi: arvot edustavasta kokeesta standardoitu tubuliiniin tasolle ilmaistuna kertainen KGFR taso suhteessa käsittelemättömän mock-transfektoituja soluja ja raportoidaan kuvaaja.

seuraavan suoritetaan proliferaatiomääritys MCF-7-soluissa, jotka on transfektoitu siKGFR tai mock-transfektoiduista ja kasvatettiin 48 tuntia standardissa elatusaineessa, johon on tai ei ole KGF, 5-FU tai niiden yhdistelmää, kuten edellä. Soluproliferaatiota arvioitiin laskemalla positiivisten solujen Ki67-antigeenin, ja raportoidaan graafisesti positiivisten solujen prosenttiosuuden (Fig. 6A). Lisäksi MCF-7 löydettiin lisäys solujen proliferaation jälkeen KGF hoidon, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (34,8% vs. 19,5%, 1,8-kertainen lisäys,

P

= 0,004). Kuten odotettua, hoito 5-FU paljasti antiproliferatiivinen vaikutus (6,0% vs. 19,5%, 3,3-kertainen ero,

P

0,001), joka oli lähes kokonaan kumottu yhtäaikainen käsittely KGF (28,4% vs. 6,0%, 4,7 kertainen ero,

P

0,001). KGFR downregulation siRNA lähes lakkautetaan KGF proliferatiivinen vaikutus, sekä yksin ja yhdessä 5-FU (15,7% vs. 34,8%, 2,2 kertainen ero,

P

0,001 ja 11,2% vs. 28,4%, 2,5 kertainen ero

P

= 0,002, tässä järjestyksessä) (Fig. 6A).

(A) MCF-7-soluja, kasvatettu peitinlaseista olivat valetransfektoidut tai transfektoitu 5 nM siKGFR ja 48 tuntia myöhemmin ne on käsitelty tai ei ole 20 ng /ml KGF: ää, 25 ug /ml 5-FU tai KGF plus 5-FU. 24 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin ja altistettiin immunofluoresenssianalyysillä anti-Ki67 polyklonaalista vasta-ainetta. Tumat tehtiin näkyviksi käyttämällä 4 ’, 6-diamido-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI). Solujen lisääntyminen arvioitiin prosentteina Ki67-positiivisten ytimien vs. kokonaismäärä ytimien kymmenessä eri aloilla otetaan satunnaisesti kolme eri kokeita, ilmaistu keskiarvona ± 95%: n luottamusväli ja raportoidaan kuvaaja.

P

arvot määritettiin käyttämällä Studentin

t

testi: *

P

= 0,004 ja **

P

0,001 versus käsittelemättömien valetransfektoidun solut; ***

P

0,001 vs. 5-FU-käsitellyn mock-transfektoituja soluja; †

P

0,001 versus KGF saaneilla mock-transfektoituja soluja; ‡

P

= 0.002 vs. KGF plus 5-FU-käsitellyn mock-transfektoituja soluja. (B) MCF-7-solut transfektoitiin ja käsiteltiin kuten kohdassa (A), ja Western blot -analyysi fosforylaation aseman ERK suoritettiin käyttäen fosfospesifisiä ERK monoklonaalinen vasta-aine (p-ERK). Veren kokonaiskolesterolia ERK arvioitiin imeyttämällä kanssa ERK2-spesifistä vasta-ainetta. , Joista aktivoitiin ERK arvioitiin densitometrisellä analyysi: arvot edustavasta kokeesta standardisoitiin yhteensä ERK tasolle ilmaistuna kertainen p-ERK lausekkeen suhteessa käsittelemättömän mock-transfektoituja soluja ja raportoidaan kuvaaja.

tiedetään, että ERK /MAPK-reitin on tärkeä rooli solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Siksi teimme Western blot -analyysin arvioida ERK aktivointi, käyttämällä vasta-aineita joko spesifisiä fosforyloidun muodon molekyylin tai suunnattu yhteensä ERK. Kuten odotettua, valetransfektoiduissa soluissa ERK aktivaation merkittävästi aiheuttama KGF hoito (7,5-kertainen). Sitä vastoin 5-FU pystyi tason alentamiseksi fosforyloituu ERK (2,5-kertainen), joka oli lähes täysin kunnostettu antamalla KGF yhdessä 5-FU (6,5-kertainen). In siKGFR-transfektoituja soluja, mukaan edellä esitetyt tulokset, stimuloivaa vaikutusta KGF on ERK-fosforylaatio suuresti estyy (2-kertainen) (Fig. 6B).

Lisäksi arvioimme solujen elinkelpoisuuden kristallivioletilla värjäämällä, ja sen myöhemmät absorbanssi 570 nm, joka heijastaa vaihtelut solujen määrä. 48 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin KGF, 5-FU tai niiden yhdistelmää: ssa 24 tuntia, kuten edellä on kuvattu. Sitten jäljellä olevat solut kiinnitettiin ja värjättiin 1% kristallivioletilla (Fig. 7A). Vertasimme vaikutusta KGF ja 5-FU solujen määrä, katsomalla vaikutus KGFR hiljentäminen tässä prosessissa. In mock-transfektoituja soluja KGF hoito lisäsi solujen määrä (1,55-kertainen), 5-FU aiheuttama lasku elävien solujen (0,45-kertainen), kun taas läsnä KGF, 5-FU ollut tehokasta (1,49-kertainen). Toisaalta, in siKGFR-transfektoiduissa soluissa, 5-FU solukuolema, kuten odotettua (0,56-kertainen), kun taas käsittely KGF ei pystynyt indusoimaan kasvua solujen lukumäärän (0,91-kertainen). Tässä tapauksessa 5-FU säilyttää kyky määrittää solukuolemaan myös läsnä KGF (0,49-kertainen) (Graph Fig. 7A).

(A) MCF-7-solut valetransfektoidut tai transfektoitu 5 nM siKGFR ja 48 tuntia myöhemmin ne on käsitelty tai ei ole 20 ng /ml KGF: ää, 25 ug /ml 5-FU tai KGF plus 5-FU. 24 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin, värjättiin 1% kristallivioletilla ja analysoitiin absorbanssi 570 nm: ssä. Arvot edustavasta kokeesta ilmaistiin suhteessa optisen tiheyden ja ilmoitetaan kuvaaja. (B) MCF-7-soluja, kasvatettu peitinlaseilla, transfektoitiin ja käsiteltiin kuten kohdassa (A). 24 tunnin kuluttua, ne kiinnitettiin ja altistettiin immunofluoresenssianalyysillä vasta-aineen kanssa suunnattu katkaistun muodon kaspaasi-3. Tumat tehtiin näkyviksi käyttämällä 4 ’, 6-diamido-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen arvioitiin laskemalla katkaistun kaspaasi-3-positiivisten tumien verrattuna kokonaismäärä ytimien kymmenen eri alueilla otetaan satunnaisesti kolmesta eri kokeissa, jotka on ilmaistu keskiarvona ± 95%: n luottamusväli ja ilmoitetaan kuvaaja. Tubulin toimi latauskontrollina.