Krooninen sairaus

tiivistelmä

löytäminen uusi peptidi biomarkkereita mahasyövän ihmisen seerumeista, jotka voidaan toteuttaa osaksi kliinisesti mahdollista ennusteen menetelmä seurantaa mahasyöpä. Tutkimme seerumi peptidomin kahdesta eri biorepositories. Ensin palveluksessa C8-käänteisfaasinestekromatografialla lähestymistapa näytteen puhdistukseen, jonka jälkeen massaspektrometrialla analyysi. Ne levitetään seeruminäytteistä syöpää vapaa ohjaimet ja mahasyövän potilaiden eri kliinisiä vaiheissa. Sitten luonut bioinformatiikan analyysi putki ja tunnistettu peptidi allekirjoitus erotteleva mahan adenokarsinooma potilaita syöpää vapaa valvontaa. Matrix laserdesorptio /-ionisaatio Flight (MALDI-TOF) tulokset 103 näytteistä löytyi 9 allekirjoitus peptidejä; ennustevälineillä tarkkuus 89% koulutukseen asettaa ja 88% vuonna validointi asetettu. Kolme erotteleva peptidien löysi olivat fragmentteja Apolipoproteiinit C-I ja C-III (apoC-I ja C-III); me edelleen määrällisesti niiden seerumissa sekä CA19-9 ja CRP työllistää kvantitatiivinen kaupalliset kliiniset analyysit 142 näytettä. Apoc-I ja apoC-III kvantitatiivisia tuloksia korreloi MS tuloksiin. Sitten palveluksessa apoB-100-normalisoitu apoC-I ja apoC-III, CA19-9 ja CRP tuottaa sääntöjä mahasyöpä ennustamiseen. Koulutukseen, käytimme seerumit yhdestä arkistosta, ja validointi, käytimme seerumit toisesta arkistosta. Prediction tarkkuus 88,4% ja 74,4% saatiin koulutuksessa ja validointi sarjoiksi, vastaavasti. Seerumin apoC-I ja apoC-III yhdistää muita kliinisiä parametreja voidaan käyttää pohjana muotoiltaessa diagnostisen pisteet mahasyöpä potilaita.

Citation: Cohen M, Yossef R, Erez T, Kugel A, Welt M, Karpasas MM, et ai. (2011) Serum Apolipoproteiinit C-I ja C-III pelkistetään Mahasyöpä Potilaat: Tulokset MALDI-Based peptidomin ja Immuno-Based Kliiniset määritykset. PLoS ONE 6 (1): e14540. doi: 10,1371 /journal.pone.0014540

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 22 marraskuu 2010; Julkaistu: 18 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Cohen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli edellyttäen, että Euroopan yhteisö (FP6 GLYFDIS 037661). RNTech SAS Ranskassa on todettu niin rahoittajana johtuu siitä, että JT ja HB ovat /olivat työntekijöitä tämän yrityksen; panokset JT ja HB määritellään lopullinen hyväksyntä versio julkaistaan, ja ne eivät osallistuneet panoksen ja kehittely, tai tietojen hankinnan, tai analysointiin ja tulkintaan tietojen tai laaditaan käsikirjoitus. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Se, että kaksi entistä tai nykyistä työntekijöille RNTech SAS Ranskassa laatijat käsikirjoituksen ei muuta noudattamista kaikkien PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaalien yksityiskohtaisena online opas tekijöille.

Johdanto

Kuolleisuus monien syöpien eivät ole muuttunut dramaattisesti Viimeisten 20 vuoden aikana [1]. Varhainen havaitseminen osoitettiin parantaa tehoa syövän hoidossa, mutta tunnistus on usein mahdollista vain sen jälkeen, kun ulkonäkö ensimmäisen kliinisiä oireita, jotka joissakin syövissä tapahtuu liian myöhään onnistuneen intervention. Tämä johtuu suurelta osin ilman spesifisiä ja herkkiä testejä, jotka mahdollistavat varhaisen seulonnan ja seuranta syöpä todetaan. Näin ollen löytö uusia kasvaimen biomarkkereiden pidetään yhä kriittinen parantamiseksi syövän hoidossa. Viime vuosikymmenen aikana, monet tutkimukset ovat keskittyneet biomarkkereiden löytö. Yksi lupaavimmista lähteistä biomarkkereiden löytö on ihmisen verestä, erityisesti seerumista ja plasmasta, joka voi heijastaa monia tapahtumia kehossa, reaaliajassa. Silti, huolimatta valtava ponnisteluista, vain hyvin pieni määrä plasman proteiineihin ovat osoittautuneet olla diagnostista arvoa [2] – [5]. Usein nämä biomarkkerit eivät yksin ja mukana muita testejä seurantaan ja diagnosointiin. Useimmat heistä eivät ole spesifisiä ja herkkiä riittävän laajakuva diagnoosi [6], [7].

Yksi mahdollinen lähde romaani syöpä biomarkkereiden on peptidomin. Syy siihen, miksi keskittyen seerumin peptidit perustuvat todisteet siitä, että syövän muodostumisen ja kehitys edellyttää muutoksia proteiinien ja peptidien ”aineenvaihdunta, ja parempi saatavuus menetelmiä seulontaan koko peptidomin. Mitä syövän kehityksen, muutoksia voi esiintyä joukko välisen ja solun peptidejä edustettuna veressä peptidomin, joka voi olla nimenomaan syöpä vaiheessa ja niillä on siten diagnostista potentiaalia [2], [4], [ ,,,0],5]. Mitä Detection Technology, viimeaikaiset edistysaskeleet MS teknologian voitava havaita satojen peptidien muutamasta mikrolitraa seerumia [8], [9]. Todellakin, edellinen veri peptidomin tutkimuksissa raportoitu joukko allekirjoituksen peptidien seerumin, jotka olivat erottaa terveet syöpäpotilaista (tarkistetaan [5]). Tämä osoitettiin eturauhasen, virtsarakon, rinta- ja kilpirauhas- syövän Villanueva

et al

[10], [11]. He kertoivat 61 allekirjoitusta peptidejä, jotka erottaisivat terveitä yksilöitä 3 erilaista syöpäpotilailla. Vaikka kaikki nämä peptidit ja /tai niiden fragmentit ovat yleensä löytyy seerumista, erot määrä terveiden ja sairaiden yksilöiden havaitaan. Vaikka nämä tulokset osoittavat potentiaalia, joka peptidomin profiilit ovat syövän diagnosointiin, se on vielä osoittaneet, että tämä lähestymistapa voidaan ulottaa löytää biomarkkereita soveltuu varhaisen diagnoosin ja yhdenmukainen valvonta. Ensinnäkin kyky nämä seerumit peptidin biomarkkerit erottaa potilaiden valvontaa oli enimmäkseen osoitettu potilailla, joilla on erittäin kehittyneitä tai etäpesäkkeitä. Lisäksi luotettavuutta näiden biomarkkereiden on kyseenalaistettu; hallitsematon muuttujia, enimmäkseen johtuu eroista näytteiden käsittely, käsittely protokollat ​​ja data-analyysi, on osoitettu dramaattisesti muuttaa Näiden määritysten tulokset [11] – [19]. Laittamalla suuri painoarvo näytteen ottamisen, esikäsittelyä, MS signaalinkäsittelyn ja tilastollisia analyysejä vankempi ja toistettavia tuloksia voidaan saavuttaa [18], [20], [21].

Tässä työssä olemme keskittyneet on löytää joukko allekirjoituksen peptidejä, joilla voi olla diagnostista arvoa mahasyöpä. Saavuttaakseen tämän, käytimme kolmea eri seerumin lähteestä mukana mahasyöpä potilaita eri vaiheissa. Tiukka protokolla seerumin keräämiseen ja käsittelyyn sovellettiin [18], käyttäen yhtenäinen menettely peptidin louhinta ja MALDI-TOF lukemat, modifioidun analyysi putki. Yhdessä parannettu putki sallittu tunnistamiseksi peptidin rakenteessa, jossa erotetaan toisistaan ​​syövän ja kontrollinäytteiden. Nämä tulokset tukevat alkuperäisen ja uuden sera kolme tunnistettu piirteitä kuvio, apoC-I (kaksi ominaisuutta) ja apoC-III, käyttäen immunoblottaus perustuvia määrityksiä. Sitten palveluksessa seerumin apoC-I ja apoC-III yhdistää CRP ja CA19-9 markkereita syrjiä mahan adenokarsinooma potilaita syöpää vapaa valvontaa.

Materiaalit ja menetelmät

Serum korjuun ja käsittely

Seerumit saatiin kahdesta kaupallisista lähteistä. 79 seeruminäytteitä ennen leikkausta mahasyöpä potilaita ja 33 seeruminäytteitä syöpää vapaa verrokit (mukaan lukien 10 gastriitti potilasta) kerättiin RNTech (Pariisi, Ranska) Romaniassa. Sera muoto syöpä ja ei syöpäpotilasta otettiin jälkeen paasto yön yli seuraavalla tavalla: 5 ml verta otettiin osaksi vacuette seerumiputkeen (Cat # 456005, Greiner Bio One, Kremsmuenster, Itävalta) ja jätettiin hyytyä noin 30 minuuttia, jonka jälkeen putkea sentrifugoitiin 3000 rpm: llä on Hettich EBA 20S sentrifugilla (Hettich Ag, Tuttlingen, Saksa) 5 minuuttia huoneen lämpötilassa. Erotettu seerumi jaettiin 1 ml: n steriileihin kryogeenisen putkia (Nalgene, Rochester, NY, USA) ja pakastettiin välittömästi (-70) ° C: ssa. 22 ennen leikkausta mahasyöpä seerumit ja 21 ohjaa kerättiin Asterand Yhdysvalloissa (Detroit, MI, USA) seuraavalla tavalla: 10 ml verta otettiin osaksi BD vacutainer SST plus muoviputken (kissa #BEC 367985, BD , San Jose, CA, USA). Putkea sekoitettiin kääntelemällä se 5 kertaa ja jätettiin hyytyä noin 30 minuuttia pystysuorassa asennossa. Tämä vaihe seurasi sentrifugointi on 1,100-1,300 g 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Erotettu seerumi jaettiin 1 ml: n steriileissä kryogeeniset putkiin (Nalgene) putket ja pakastettiin välittömästi (-70) ° C. Sillä Asterand lähde, paasto tietoja ei kerätty millään verta imee pankkiinsa. Seeruminäytteitä molempien yhtiöiden kuljetettiin kuivajäässä ja varastoitiin (-70) ° C heti saapumisen. Seeruminäytteet sulatettiin jäillä noin puolitoista tuntia, 50 ui jaettiin lo-bind putket (Eppendorf, Hampuri, Saksa) ja välittömästi uudelleen jäädytettiin (-70) ° C. Kaikki näytealikvootteja säilytettiin (-70) ° C: ssa, kunnes käsittely. Kolmas lähde seerumit saatiin laboratoriossamme 12 syöpää vapaa Israelin valvontaa. Verta otettiin putken brändin käyttämien RNTech (Cat # 456005, Greiner Bio One) ja seerumin käsittely seurasi menettelyä RNTech. Seerumeista saatu laboratoriossamme otettiin ilman paastoa yksilöitä. Sekä RNTech ja Asterand yritykset ovat perustaneet ja jota harjoitetaan niiden toimintaa seuraavia säädöksiä ja eettisiä standardeja, toteuttaa paikallisella, kansallisella, Euroopan, Yhdysvaltojen ja International (YK) sääntöjä ja suosituksia erityisesti sitä sovellettaisiin biologista materiaalia kerääminen ja käsittely ja tutkimuksen tulos hyväksikäyttöä. Tämä sisältää sekä kirjallisen suostumuksen kunkin potilaan edistää biologisten ja tietopankki, ja kirjallinen tutkimus luvan eettisen komitean Jokaista kliinistä instituutin osaltaan näytteiden yritysten pankit.

Serum näytteen käsittely ja valmistelu MS- MALDI lukeminen

Jokainen seerumi näyte käsiteltiin kahden tai kolme toistoa (identtisistä eriin ja eri random päivinä). Peptidit uutettu helmiä päällystetty C8, pestään, eluoidaan, sekoitetaan CHCA matriisi, ja talletettu MALDI tähyslevyn. Sera käsiteltiin rinnakkaisnäytteiden ja kerrostettu MALDI levy kaksoiskappaleet. Katso yksityiskohtaiset kuvaukset löytyvät File S1.

Tietojen analysointi MALDI tuloksia

Tietojenkäsittely suoritettiin kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa, jonka intensiteetti matriisi tehtiin raaka ASCII-tiedostoja MALDI-TOF lukemat kaikista seerumeista näytteestä lähteistä käyttämällä uusien näytteiden, kohdistamalla, ja m /z piikit havaitseminen kuvatulla Villanueva

et al

[21]. Toisessa vaiheessa, koneoppimista käytettiin määrittämään erotteleva malli, joka voidaan luokitella potilaita. Tätä tarkoitusta varten kuvatun menetelmän Villanueva

et ai

[21] on modifioitu kuten alla on kuvattu. Modifioitu putki perustuu täysin avoimen lähdekoodin ohjelmistoja ja lisätietoja on kuvattu bioinformatiikan osiossa File S1.

(1) toisinto summaus ja ominaisuus suodatin vaiheet lisättiin harkita nollia erikoistapauksissa. Meidän alkuperäinen matriisi sisälsi huomattavan määrän nolla-arvojen eri piirteitä eri näytteissä. Johtuen yleisestä rajoittamisesta MALDI tekniikkaa, huomattava osa näistä nolla-arvojen voisi edustaa puuttuvat arvot pikemmin kuin todellisesta nollasta intensiteettiä. Osittain poistamaan tämä rajoitus luemme jokaisen näytteen rinnakkaisnäytteiden ja lasketaan keskimääräinen intensiteetti, välittämättä nolla intensiteetti lukemat. Tämän rinnakkaisnäytettä summattu saadulle matriisi sisälsi vielä huomattavan määrän nolla-arvojen. SVM-pohjainen malleja voitaisiin luokitella mukaan nolla-arvot edustavan puuttuvia arvoja eikä todellisesta nollasta intensiteettiä. Siksi me suodatetaan ominaisuuksia, jotka oli edelleen nolla-arvot ainakin yksi näytteistä. Mikään näistä poistettu ominaisuuksista oli selvä etusija on nolla tietylle kliinisen ryhmätyö. Tuloksena osamatriisi käytettiin koneoppimisen luokitus.

(2) Uusi lähestymistapa ominaisuus valinta parametroinnin kehitettiin. Määritelmät SVM perustuva analyysi alun perin seuraavasti: RNTech vatsa vs. RNTech ohjaus, Asterand vatsa vs. Asterand ohjaus. Mann-Whitney p-arvo laskettiin kullekin piikin, kliinisen määritellyt ryhmät analyysiä varten. Sitten käytimme Mann-Whitney p-arvot ja huippuintensiteetit kuin cutoffs valita osajoukko toiminnot (piikit) ja käyttö koneoppimisen kokeita. Intensiteetti sulku ei suodata pois näytteet, joissa ainakin yksi keskimääräinen lukema oli intensiteetti yläpuolella katkaisu piikin testattu. Suodattimen arvot optimoitu parhaan suorituskyvyn SVM-pohjainen luokittelijoiden (tuottama LIBSVM, lineaarinen kernel) mukaan kymmenkertaiseksi cross validointi kaksivaiheisella protokollaa. Ensimmäinen askel määrittämä haku valikoimia ja väliajoin sekä suodattimet ja iteroimalla yli kaikki yhdistelmät. Sitten toinen vaihe valitun yhdistelmän arvoja, joka antoi parhaan suorituskyvyn ja pienimmän useita ominaisuuksia.

(3) normalisointi askel lisättiin valvoa rajat näyte ja rajat kokeilu harhat. Sillä sera lähteet ”vertailu ja valinta ominaisuuksia osoittavat samanlaisia ​​suuntauksia molemmista lähteistä, rajat lähde normalisoituminen intensiteetin suoritettiin käyttäen R toiminto” quantile ”määritellä 9 kynnysarvoja

X

1

.

9

jotka jakavat skaalata arvot valvontaa luokkia 10 quantiles.

Muita bioinformatiikan menetelmiä annetaan File S1.

Immuno perustuva kaupallinen ja kliinisen määrityksiä varten eri apolipoproteiinit

Apoc-III ja apoB-100 tasot mitattiin Immunoturbidometry on Olympus 400 autoanalyzer, käyttäen K-määritys sarjat (cat # KAI-006 ja 6142, Kamiya Biomedical, Seattle, WA, USA) kuten aiemmin on kuvattu [22]. Talon ELISA apoC-III on kuvattu File S1. ApoC-I-tasot testattiin käyttämällä AssayMax Ihmisen apolipoproteiini C-I ELISA-kitillä (Assaypro, St. Charles, MO, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistettu ihmisen apoC-I standardit sisältyy sarjaan.

Tulokset

käyttö MS perustuva menetelmä tunnistamiseksi seerumin peptidien allekirjoitus mahasyövän

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että hyvin -designed ja huolellisesti kontrolloituja seerumit peptidomics voi erottaa tiettyjä syöpää kantavia potilaita ja ei-syöpä hallinta perustuu erottuva malleja allekirjoituksen peptidien seerumissa [10], [11]. Olemme tutkineet, onko nämä tulokset voidaan toistaa mahasyöpä ja onko tällainen erottelu on riittävä analysointia varten seerumeista eri lähteistä. Ensin analysoidaan seerumin peptidi profiileja 62 potilaalla on mahasyöpä eri vaiheissa sekä 41 kontrolliseerumeita terveistä vapaaehtoisista. Nämä seerumit saatiin kahdesta lähteestä: (i) RNTech, yritys, joka kerätään seerumit Bukarestissa, Romaniassa ja (ii) Asterand, yritys, joka kerätyt seerumit Yhdysvalloissa. Kullekin lähteelle, seerumit kerättiin yhden standardin kliinisen protokollan. Protokollat ​​olivat verrattavissa esim. tyyppi putki, hyytymisaika ja ensimmäisen jäädyttäminen seerumeista (katso menetelmät), mutta veri poistoputkien olivat erilaiset. Ikäjakauma, sukupuoli, ja kliiniset ominaisuudet 103 yksilöiden mukana tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1 ja yksityiskohtaisemmin File S1. Yhteenveto kliinisistä vaiheista mahasyöpä johdettujen seerumia molempien lähteiden annetaan taulukossa 1. Näytteenkäsittelymenetelmien kuluttua alkuperäisen keräämisen oli yhtenäinen, joihin liittyy 2 pakastaa ja sulattaa syklit saavuttaa alkuperäisen varastointia ja myöhempää aliquoting peptidin louhinta ja MS-analyysia. Kaikki 103 seeruminäytteet käsiteltiin manuaalisesti mutta identtisesti käyttämällä yksi askel taaksepäin-faasin uutolla. Seeruminäytteet ja näyte rinnakkaista käsiteltiin ja lukea satunnaisesti eri päivinä välttää valmistuspäivää liittyvän bias. Kaikki seerumit valmistelu ja laskeuman suoritettiin samassa yksilössä. Samoin kaikki MALDI lukemat suoritettiin samalla teknikko. MALDI-TOF instrumentin herkkyys seurattiin rutiininomaisesti ja jatkuvasti kalibroida kaikki lukemat.

Analyysi MS-pohjainen sera peptidomin paljasti 9-peptidi allekirjoitus, jotka erottavat mahan adenokarsinooma potilaiden syövän ilmaiseksi valvontaa

Yhteensä 637 massa piikit (toiminnot) tunnistettiin 103 tutkittu näytteitä. Tulokset MALDI muutettiin matriisin, joka sisältää signaalin voimakkuudet 637 massa piikit (ominaisuuksia) kullekin tutkituista seeruminäytteistä kanssa rinnakkaista kustakin näytteestä (katso menetelmät, bioinformatiikka). Vaikka valvomatta hierarkkinen klusterointi käyttää kaikkia ominaisuuksia ei erotella syöpä ja ei-syöpä näytteitä, PCA analyysi kaikista ominaisuuksia kunkin sera lähteen eriytetty syövän ja ei-syöpä näytteistä (kuviot S1-S3). Tämä viittaa siihen, että ominaisuus suodatus ja valinta on välttämätöntä ennen työllistää koneoppimisen-luokituksessa. Siksi (i) sovelletaan ominaisuus suodatus ja valinta askel ja (ii) käytetty Mann-Whitney p-arvot ja huippuintensiteetit kuin cutoffs valita osajoukko toiminnot (piikit) ja käyttö koneoppimisen kokeita. (Katso menetelmät, bioinformatiikka). Sitten analysoitiin kussakin lähteessä (RNTech ja Asterand) onko potilaiden seerumeista ja valvonta voitaisiin erillään. Saimme hyviä tuloksia kullekin yhdestä lähteestä luokittelijoiden; SVM-pohjainen luokittelijoiden RNTech ja Asterand oli 90,0% ja 93,0% ennustettu tarkkuudet, vastaavasti, mukaan kymmenkertaisesti rajat validointi opetusjoukolla (taulukko 2A). Random sekoitus ryhmäläisten johti paljon suurempi p-arvot (esim. 0,8) ja alhainen ennustettu tarkkuus koulutettu malleissa kutakin seerumia lähde. Tämä osoitti merkitys kliinisten tilojen luokittelun kahteen kliinisesti määriteltyihin ryhmiin kussakin sera lähde. Kuitenkin yhdestä lähteestä luokittelijoiden eivät toimi hyvin toisen lähteen näytettä, ennustavat oikein kliininen tila vain 35/60 näytteistä (Asterand päällä RNTech) ja 25/43 (RNTech päällä Asterand) (taulukko 2A). Siksi lähde harhaa of peptidomin on merkittävä vaikutus tarkkuuteen ennustuksen.

kyvyttömyys mallien koulutettu yhdestä lähteestä riittävästi ennustaa kliininen olosuhteissa lukemia muista lähteestä (taulukko 2A) on parempi Esitettyyn tarkkailun ominaisuudet valitun lähteen erityisiä luokittelijoiden (taulukko 3). Jotkin ominaisuudet, jotka toimivat hyvin yhteen lähteeseen osoitti vastakkainen suuntaus toisella lähteestä. Toiset olivat tärkeitä luokitusta yhdestä lähteestä, mutta oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta muihin. Nämä havainnot johtivat meidät vertaileva analyysi tietoja molemmista lähteistä. Teimme rasiakuvaajien kaikille huippuintensiteetit mukaan kliinisen ryhmille. Nämä tonttien osoittivat, että verrattaessa ohjaus ja syövän intensiteetit kunkin toiminnon sisällä lähde, havaittua suuntausta voi vaihdella välillä lähteistä (esim. M /z 1520, kuvio 1A). Jopa silloin, kun kehitys oli sitkeästi molemmista lähteistä, intensiteetti arvot voivat olla erilaiset (esim. M /z 6431; RNTech yli Asterand, kuvio 1 B). Jotta voidaan luoda ennustusmallin, meidän oli (i) discard source-tiettyjä ilmiöitä, ja (ii) lisätään normalisointi askel, joka vähentäisi vaikutusta eri sykealueilla jossa suuntaus säilyi.

ja B edustaa ei-normalisoitu huippuintensiteetit; C ja D edustavat intensiteetti seuraavat quantile normalisointi mukaan valvonnan kunkin seerumeista lähteen (katso menetelmät). Rn, RNTech; Kuten, Asterand.

käyttö sekoitetun aineisto kanssa Mann-Whitney p-arvo katkaisu ominaisuuksien hallintaan voisi hävitä source-tiettyjä ilmiöitä. Peaks joka osoitti epätasaista eri lähteistä eivät ole merkittäviä seka asetettu kliinisen ryhmään perustuvaa erottelua; ominaisuus 1520 ilmentää vastakkainen suuntaus lähteiden välillä, valittiin yhdestä lähteestä luokittelijan (kuvio 1A, taulukko 3). Siksi osaltaan puutteesta onnistuneen suorituskyvyn yhdestä lähteestä luokittelija toisaalta lähteestä (taulukko 2A). Kuten odotettua, tämä ominaisuus ei valittu mikään malli, joka perustuu yhdistetylle asetettu. Loimme sekoitettu data käyttöön kun satunnaisesti poistamalla 21 mahasyöpä näytteitä sekoitettu training set ja käyttää nämä 21 poistettiin näytteitä vahvistettavaksi. Lisäksi käytimme 12 syöpää vapaa ohjaus kerätyistä näytteistä laboratoriossamme itsenäisenä ohjaus validointi asetettu. Mallia valittu sopusoinnussa suurin ennustettu tarkkuus mukaan kymmenkertaista cross validointi, kuten ennenkin. Paras pisteytys malli sekoitettua asetettiin käyttäen 9 ominaisuuksia (Mann-Whitney p-arvo suodatin 0,044) ja oli ennustettu tarkkuus 84,1% mukaan kymmenkertaisesti rajat validointi opetusjoukolla. Mikä tärkeintä, se ennustaa 10/12 Israelin valvontaa. Kuitenkin tämä luokittelija ennustaa puutteellisesti (13 21) 21 poistaa sekoitetun mahasyöpä käytettyjen näytteiden validointi.

Siksi vaikutuksen vähentämiseksi lähteisiin liittyviä eroja intensiteetin tasoja, suodattimen suorituskykyä ominaisuus valinta oli tehostettu ottamalla käyttöön kvantiili normalisointi askel. Tämä normalisointi suoritettiin tarkastuksia kunkin seerumeista lähteen riippumatta muista lähteistä (katso menetelmät, bioinformatiikka). Sillä ominaisuudet, kuten m /z 6431, jossa on jatkuva kehitys molemmista lähteistä, tämä vaihe korjattu intensiteetti bias (kuvio 1 D). Todellakin, 6431 ominaisuus ei valittu ei-normalisoitu mix-pohjainen luokittelija. Kuitenkin, se valittiin normalisoitu yhdistelmä-luokitin (taulukko 3). Silti, ominaisuuksia, kuten m /z 1520 vastakkaiset suuntaukset molemmista lähteistä, tämä vaihe ei voinut muuttaa suuntausta, odotetusti (kuvio 1 C).

Testasimme kvantiili normalisointia vaikutuksesta soveltamalla sitä ennen keskimäärin ja ominaisuuksien hallintaan. Paremmin arvioida ennustetarkkuus käytimme Matthews Korrelaatiokerroin (MCC) toimenpide. MCC käytetään koneoppimisen mittana laadun binary (kaksi luokka) luokituksia ja palauttaa arvon välillä -1 ja +1. Kerrointa +1 edustaa täydellinen ennustus, 0 keskimääräinen satunnainen ennustaminen ja -1 käänteisen ennuste. MCC pidetään yleisesti tasapainoinen toimenpide, jota voidaan käyttää, vaikka luokat ovat erikokoisia. Olemme näin laskettu MCC eri luokitusta kokeita osoittaakseen vaikutuksen, että normalisointi oli luokituksesta. Tulokset on esitetty taulukossa 2. Huomaa, että ilman normalisointi, MCC oli suhteellisen korkea koulutukseen asetettu, mutta osoitti keskinkertaista tasoa validoinneista setti (taulukko 2). Normalisoituminen vaihe saatiin samanlainen korkea MCC arvot koulutus- ja validointi sarjaa (taulukko 2). Normalisoituminen askel ohjata rajat source bias ei kumonnut tarvetta koneoppimisen perustuva luokittelija määritellä erotteleva malli; PCA kahden lähteen sekoitettu normalisoitu aineistoja johti jälleen huono erottaminen mahasyöpä ja vertailunäytteet (kuva S4).

Immuno-pohjainen validointi ominaisuuksia, jotka edustavat apoC-I ja apoC-III

luokittelija johtui sekoitettu tietojoukko, seuraavien kvantiili normalisointi askel, palveluksessa 9 piirteet (taulukko 2). Kolme 9 ominaisuuksia mukana apolipoproteiinit: apoC-III (ominaisuus 9443) ja apoC-I (toiminnot 6431 ja 6629, taulukko 3). Edelleen todentamiseksi MALDI-pohjainen tuloksiin, ensin kehittäneet ELISA-testi laadulliseen havaitsemiseen apoC-III seerumissa (katso menetelmät) ja testataan kaikki seeruminäytteitä Asterand ja RNTech. Tulokset ELISA seurasi suuntaus MALDI tuloksia (kuvio 2A, B); Intensiteetti apoC-III oli merkittävästi korkeampi kontrolliryhmissä verrattuna syövän ryhmiä sekä seerumeissa lähteistä. Olemme edelleen määritetään korrelaatio apoC-III ELISA ja 9443 MALDI tuloksia kutakin näytettä; ELISA ja MALDI Tulokset osoittivat merkittävää korrelaatiota (p 0,0001, Kendallin juoksi korrelaatio tau). Sitten lähetetään seerumit alikvootteja lähes kaikista näytteistä (sama freeze state) ulkoiseen kliininen laboratorio immunoturbidity perustuva kvantitatiivinen määritys apoC-III [22]. Tulokset saatiin mg /dl (kuvio 2C), ja kuten edellä, määrä apoC-III oli merkittävästi korkeampi kontrolliryhmien sekä seerumeista lähteistä.

Boxplot esityksiä MALDI ominaisuus 9443 (A), kvalitatiivinen ELISA-määritys ja apoC-III (B) ja kvantitatiivinen immunoturbidity-pohjainen määritys apoC-III (C). For A, yksiköt edustavat MALDI-pohjainen intensiteetit seuraavat quantile normalisointi mukaan valvonnan kunkin seerumeista lähteen (katso menetelmät). B, yksiköt edustavat OD suhde apoC-III ELISA seuraavat normalisointi keskimääräiseen valvonnan kunkin seerumeista lähteen. C, yksiköt edustavat apoC-III pitoisuus seerumeissa. For RNTech (Rn), * p-arvo 0,0001 A ja B, ja 0,05 C. Asterand (As), * p-arvo 0,01 A ja B, ja = 0,06 C; Wilcoxonin summa testi jatkuvuutta korjaus (vaihtoehtoinen hypoteesi: todellisen sijainnin muutos on suurempi kuin 0).

Voit tarkistaa apoC-I MALDI tuloksia, käytimme kaupallisen kvantitatiivinen ELISA kit, joka sisältää apoC-I standardien ja tunnistaa sekä 6431 ja 6629 variantteja apoC-I. Tulokset saatiin ug /ml (kuvio 3B), ja sen jälkeen malli havaittiin MALDI tulokset (kuviot 1D ja 3A); Intensiteetti apoC-I oli merkittävästi korkeampi kontrolliryhmissä verrattuna syövän ryhmiä sekä seerumeissa lähteistä. Arvioida spesifisyyden apoC-I ja apoC-III vähentäminen seerumeista mahasyöpä-laakeri potilailla, me analysoitiin apoB-100 tasoa. Näytteet analysoitiin apoC-III ulkoisessa kliinisessä laboratoriossa analysoitiin rinnakkain apoB-100 tasot käyttäen immunoturbidity perustuva kvantitatiivinen määritys. Tulokset saatiin mg /dl (kuvio 3C), eikä merkittävää suuntausta välillä ohjaus ja mahasyöpä kantavia ryhmiä. Siksi voisimme hyödyntää apoB-100 tulokset normalisoi tekijä bioinformatiikan analyysi määrällisen apoC-I ja apoC-III tulokset (kuviot 3C, 3B, 2C, vastaavasti).

Boxplot esitykset MALDI ominaisuus 6629 (A), kvantitatiivinen ELISA määritys apoC-I (B) ja kvantitatiivinen immunoturbidity-pohjainen määritys apoB-100 (C). For A, yksiköt edustavat MALDI-pohjainen intensiteetit seuraavat quantile normalisointi mukaan valvonnan kunkin seerumeista lähteen (katso menetelmät). B ja C, yksiköt edustavat apoC-I ja apo-B 100 pitoisuus seerumeissa, vastaavasti. For RNTech (Rn), * p-arvo = 0,002 A ja 0,0001 B. Asterand (As), * p-arvo 0,05 A ja = 0,001 B; Wilcoxonin summa testi jatkuvuutta korjaus (vaihtoehtoinen hypoteesi: todellisen sijainnin muutos on suurempi kuin 0).

Analysoimme kliinisesti apoC-I, apoC-III ja apoB-100 lisänäytteitä mahasyöpä potilaita ja syöpää vapaa ohjaimet (RNTech lähde, samassa jäädytys-tilassa; mukaan lukien 10 gastriitti potilasta syöpää vapaa valvontaa; huomata Taulukko 1 koko otoksen numerot). Olemme myös analysoitu kliinisesti CA19-9 ja CRP kaikille näytteille (samat freeze-tilassa). Sitten käytetään Clementine 10,0 ohjelmiston RNTech näytteiden arvioimiseksi, onko sääntöjen perusteella apoB-100-normalisoitu CI ja C-III, CA19-9 ja CRP seerumissa voidaan luokitella välillä sera valvonta- ja mahasyöpä ryhmien RNTech lähteellä koulutus lähteenä. Kun otetaan huomioon kaikki 4 parametrien tuotti paremman ennusteen tarkkuus verrattuna yhdistelmä alle 4 parametrit (kuvio 4 ja tietoja ei ole esitetty). Prediction tarkkuus opetusjoukolla oli 88,4%. Käytimme RNTech saatu sääntöjä varten Asterand lähteen ja ennustearvon oli 74,4% (kuvio 4). Sekä koulutus ja validointi herkkyys oli erinomainen (87/90 yhdistetty), mutta spesifisyys oli epätarkempi (37/52 yhdistetty).

(A) tarkkuus ennusteen tuottaman päätös puita avulla (1) apoC- I /apoB-100 ja apoC-III /apoB-100; (2) CRP (ug /ml) ja CA19-9 (U /ml); ja (3) apoC-I /apoB-100, apoC-III /apoB-100, CRP (ug /ml) ja CA19-9 (U /ml) yli koulutus asettaa RNTech ja testaus asettaa Asterand. (B) Päätös puu käyttäen 4 varustelu apoC-I /apoB-100, apoC-III /apoB-100, CRP (ug /ml) ja CA19-9 (U /ml).

keskustelu

viime vuosina melkoisesti kuvaavat raportit MS-tunnistettu seerumin biomarkkerit /allekirjoitukset syöpää valtioita väärässä [5], [18]. Eri lähteistä bias kuvattiin myös otoksen valinnasta, esikäsittelyä, lukeminen ja analysointi [18], [20], [21]. Poistettaessa bias-osatekijät, osoitettiin, että SELDI-TOF MS koko seerumi proteomic profiloinnin IMAC pinta ei luotettavasti havaitsemaan eturauhassyövän [23]. Siksi kirjoittajat ehdottivat, että on epätodennäköistä, että massaspektrometrialla lähestymistapaa käyttäen käsittelemätöntä seerumia olisi erotella miesten ja ilman eturauhassyövän [24]. Toisaalta, muut viimeaikaiset MALDI-TOF perustuvat tutkimukset, jotka välttää bias-vaikuttaneet tekijät ja työssä yhden askeleen sera menetelmin tunnistettu erotteleva biomarkkereiden allekirjoituksia eri syöpiä, kuten eturauhassyöpä [11].

Tässä tutkimuksessa hyväksyimme askeleen sera prosessointia identifiointiin peptidomin-pohjainen allekirjoitus erottaa seerumista peräisin mahan adenokarsinooma potilaista. Teimme kohtuullisin keinoin välttämään aiemmin raportoitu bias vaikuttaneet tekijät [18]. Analysoimme seerumit kaksi biorepositories. Havaitsimme, että vaikka seerumit käsittelystä, MALDI lukeminen ja analyysi ovat samat, peptidomin analyysi vääristyneinä sen biorepository. Sen lisäksi, että sosiaalis-maantieteelliset erot (Romania ja USA lähteenä näytteiden RNTech ja Asterand, vastaavasti), lähde liittyvää harhaa voi johtua tuotemerkin veren ulosottoputki, käytetään eri biorepositories.

sitten käytettiin sekoitettua näytettä asettaa kahdesta seerumeista lähteistä ominaisuuksien hallintaan ja lisäsi rajat lähde normalisointi askel kompensoimiseksi lähde puolueellisuudesta. Huomasimme, että (i) käyttö sekoitetun aineisto kanssa Mann-Whitney p-arvo katkaisu ominaisuuksien hallintaan voisi hävitä source-ominaisuudet, ja (ii) kvantiili normalisoinnin askel auttaa valitsemaan (varten koneoppimisen) osittain yhtäpitävät ominaisuudet , jossa trendit ovat yhdenmukaisia ​​lähteiden välillä, mutta intensiteetti tasot ovat erilaiset lähteet. Tarve normalisointi käsiteltäessä näytteitä eri lähteistä, oli jo esitetty microarray-pohjainen korkea suoritusteho teknologiaan [25].