Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksia pegyloidun interferoni-a2a (PEG-IFN-a2a) kasvuun ihmisen maksan syöpäsoluja.

Methods

vaikutus PEG-IFN-a2a proliferaatioon 13 maksasyövän solulinjoja tutkittiin

vitro

. Soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi 0-4,194 ng /ml PEG-IFN-a2a, ja sen jälkeen 1, 2, 3 tai 4 päivää viljelyn, morfologisia havainnointia ja kasvun määritys suoritettiin. Jälkeen maksasolusyövän (HCC) soluja (HAK-1B ja KIM-1) istutettiin nude-hiiriin, erilaisten annosten PEG-IFN-a2a annettiin ihonalaisesti hiirille kerran viikossa 2 viikkoa, ja kasvaimen tilavuus, paino, ja histologia tutkittiin.

tulokset

PEG-IFN-a2a inhiboivat 8 ja 11 solulinjoja on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla, vastaavasti, vaikka 50%: n kasvua estävät konsentraatiot 7 mitattavissa solulinjojen päivänä 4 olivat suhteellisen korkeat ja vaihteli välillä 253 ng /ml 4431 ng /ml. Eri tasoilla apoptoosin induktion vahvistettiin 8 solulinjoissa. PEG-IFN-a2a indusoi annoksesta riippuvaisen laskun kasvaimen tilavuus ja paino, ja merkittävä lisäys apoptoottisten solujen kasvain. Ihonalaisen kliininen annos kroonisen C-hepatiitin (3 ug /kg, 0,06 ug /hiiri) oli tehokkain ja aiheutti noin 30-50% vähennys kasvaimen tilavuuden ja painon verrattuna kontrolliin.

Johtopäätökset

Vaikka

vitro

antiproliferatiivisia vaikutuksia PEG-IFN-a2a olivat suhteellisen heikkoja, PEG-IFN-a2a aiheuttama voimakas anti-kasvain vaikutuksia HCC-soluissa

vivo

. Tietojen perusteella on mahdollista, kliininen käyttö PEG-IFN-a2a ehkäisyyn ja hoitoon HCC.

Citation: Kusano H, Akiba J, Ogasawara S, Sanada S, Yasumoto M, Nakayama M, et al. (2013) pegyloitu interferoni-a2a Antimikrobiainetta leviämisen ihmisen maksan Syöpäsolut

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 8 (12): e83195. doi: 10,1371 /journal.pone.0083195

Editor: Diego Calvisi, Institut für Pathologie, Greifswaldin, Saksa, Saksa

vastaanotettu: 19 elokuu 2013; Hyväksytty: 10 marraskuu 2013; Julkaistu: 12 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Kusano et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Sarah Cousins ​​Memorial Fund, Boston, Massachusetts, ja jonka Grant-in-Aid alkaen terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Interferonit (IFN) ovat eri sytokiinien, jotka on tuotettu isännän soluissa, kuten leukosyyttien, vastauksena tulehdus. Koska IFN hallussaan antiviraalinen aktiivisuus, antiproliferatiivinen aktiivisuus ja eri immuunivastetta sääteleviä, interferonihoitoa hoidetaan kroonista virushepatiitin tai tiettyihin syöpiin kuten pahanlaatuisen melanooman, immuunikadon liittyvä Kaposin sarkooma ja jotkut hematopoieettisia maligniteetteja [1,2]. Lain ym osoitti myös, että yhdistelmä-IFNa on hyödyllistä pidentää eloonjäämisennustetta leikkaushoitoon maksasolusyövän (HCC) [3]. Lisäksi jotkut tutkimukset osoittivat interferonihoitoa saattavat estää joko esiintymisen tai uusiutumisen jälkeen alkuperäisen parantavaa hoitoa HCC, kuten maksaresektio ja radiotaajuisen ablaatio, potilaan kroonista virushepatiitin [4-7]. Tämä syöpä ennaltaehkäisevä vaikutus IFN pidetään lähinnä tulokset niiden antiviraalinen vaikutus ja siitä johtuva tukahduttaminen tulehdusta, ja saattaa johtua niiden suora antituumorivaikutus kliinisesti havaittavissa HCC samoin. Yksityiskohtainen mekanismi antituumorivaikutusta IFN kuitenkin edelleen epäselvä.

Pegyloitu interferoni-a2a (PEG-IFN-a2a) ja pegyloitua interferoni-α2b (PEG-IFN-α2b), joita käytetään potilaiden hoitoon, joilla on krooninen hepatiitti C-viruksen (HCV) tai B-virus (HBV) infektio, muutetaan IFN joilla on pitempi puoliintumisaika seerumissa kehon kuin pegyloimaton muotoja IFN, joten ne voidaan antaa potilaille vain kerran viikossa, kun taas tavallisen IFN ilman pegylaationa käytetään pistää enintään kolmesta viiteen kertaan viikko. Tämä kerran-viikon injektio pegyloidun IFN yhdessä päivässä suun kautta annostelu nukleosidianalogi ribaviriinin on merkittävästi parantanut nopeus pitkäkestoisen virologisen vasteen kroonista HCV-infektiota ja sai asemansa ensilinjan hoitona [8,9] . Olemme aiemmin raportoitu, että PEG-IFN-α2b, joka sisältää 12 kDa: n polyeteeniglykoli (PEG) on vahvempi antituumorivaikutukset

in vivo

kuin pegyloimatonta IFN ja tämä tulos voidaan osoittaa, että jatkuva IFN altistuminen syöpäsoluja kehon on tehokkaampaa kuin jatkuva injektio [10]. Pohjalta edellä kuvatun tausta, tutkimme kasvua estäviä vaikutuksia PEG-IFN-a2a, joka sisältää kaksi ketjua 20 kDa: n PEG: n ja on pisin puoliintumisaika seerumissa joukossa kliinisesti saatavilla IFN maksan syöpäsolulinjoissa

vuonna vitro

ja

in vivo

.

Methods

solulinjat ja Cell Culture

Tässä tutkimuksessa käytettiin 11 HCC solulinjoja (KIM-1, KYN-1, KYN-2, KYN-3, HAK-1A, HAK-1B, HAK-2, HAK-3, HAK-4, HAK-5, ja HAK-6) ja 2 ihmisen yhdistetty hepatosellulaaristen ja kolangiokarsinooma (CHC ) solulinjoja (KMCH-1 ja KMCH-2). Nämä HCC ja CHC solulinjat perustettiin alun perin laboratoriossamme, ja kukin solulinja säilyttää morfologiset ja toiminnalliset ominaisuudet alkuperäisen kasvaimen kuten kuvattu muualla [11-20]. Koska kasvainten muodostumiseen on suurempi HAK-1B ja KIM-1-soluissa kuin myös muissa 11 solulinjoilla, että meillä on, käytimme näitä kahta solulinjaa varten

in vivo

tutkimuksessa.

soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (Nissui Seiyaku, Co., Japani), jota oli täydennetty 2,5% lämmöllä inaktivoitua (56 ° C, 30 min) naudan sikiön seerumia (FBS, Bioserum, Victoria, Australia ), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (GIBCO BRL /Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) ja 12 mmol /l natriumbikarbonaattia, kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 ilmassa 37 ° C: ssa.

IFN ja reagenssit

PEG-IFN-a2a (PEGASYS

®, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japani) ja spesifinen aktiivisuus 1,4 x 10

7 IU /mg proteiinia ja ei-pegyloidun IFN-a2a (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Saksa) kanssa, 2,0 x 10

8 IU /mg proteiinia käytettiin tutkimuksessa.

Anti-bromodeoksiuridiini (BrdU) vasta-ainetta ja fluoreskeiini-isotiosyanaatti-konjugoitua vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini (FITC-GAM) hankittiin Becton Dickinson Immunocytometry Systems USA (San Jose, CA); ohjata normaalin hiiren IgG

1, mistä DAKO (Glostrup, Tanska); rotan vasta-aine hiiren endoteelisolujen (anti-CD34, klooni MEC14.7), Serotec Co., UK; ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine ihmisen α-sileän lihaksen aktiini (SMA), joka reagoi ristiin hiiren α-SMA (klooni 1A4).

Effects of PEG-IFN-a2a proliferaatioon HCC ja CHC Solulinjat

in vitro

The effects of PEG-IFN-a2a kasvuun viljeltyjä soluja tutkittiin kolorimetrisesti käyttäen 3- (4,5-di- metyylitiatsol-2-yyli) -2,5- difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) sarjat (Chemicon, Temecula, CA), kuten on kuvattu muualla [18,21]. Lyhyesti, solut (1,5 ~ 8 x 10

3 solua per kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille (Nunc, Inc., Roskilde, Tanska), viljeltiin 24 tuntia, ja viljelyväliaine vaihdettiin uuteen keskipitkän kanssa tai ilman PEG-IFN-a2a (0,016, 0,064, 0,256, 1,024, 4,096, 16,4, 65,5, 262, 1048, tai 4194 ng /ml). Kun on viljelty 24, 48, 72 tai 96 tunnin ajan, elävien solujen lukumäärä mitattiin ImmunoMini NJ-2300 (Nalge Nunc International, Tokio, Japani) asettamalla koe aallonpituudella 570 nm, ja viittaus aallonpituudella 630 nm. Pitää optisen tiheyden lineaarisella alueella, kaikki kokeet suoritettiin samalla solut olivat logaritmisessa kasvuvaiheessa.

kvantitatiivinen analyysi apoptoottisten solujen aiheuttama PEG-IFN-a2a

HAK-1B tai KIM-1-soluja viljeltiin pelkästään väliainetta (kontrolli), pegyloimaton IFN-a2a (10 ng /ml = 2,000 IU /ml) tai PEG-IFN-a2a (144 ng /ml = 2000 IU /ml) 72 tunnin värjättiin anneksiini V-EGFP (tehostettu vihreä fl loistelamppu proteiini) Apoptosis Detection Kit (Medical Biological Laboratories Co., Ltd.) mukaan valmistajan ohjeiden. Värjäyksen jälkeen solut analysoitiin käyttäen FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), ja anneksiini V-EGFP-positiivisia apoptoottisten solujen määrä määritettiin.

Morfologiset Observation

morfologinen havainnointi valomikroskoopilla, viljellyt solut ympättiin Lab-Tek kudosviljelmässä kammion dioja (Nunc, Inc.), viljeltiin kanssa tai ilman PEG-IFN-a2a (262, 1048 tai 4194 ng /ml) 72 tunnin ajan, kiinnitettiin 10 min Carnoy liuos ja värjättiin hematoksyliinillä-siinilla (HE).

Effects of PEG-IFN-a2a on HCC Cell Proliferation nude-hiirissä

Kaikki eläinkokeet hyväksyi institutionaalisten komitea eläinkokeiden Kurume University School of Medicine (Luvan numero: 1334) ja jota harjoitetaan mukaan opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institute of Health ja asetusten for Animal kokeilu Kurume University School of Medicine. Hiiret tapettiin murtamalla niska dietyylieetterissä anestesiassa, ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Viljeltiin HAK-1B tai KIM-1 (10

7 solua /hiiri) oli ihonalaisesti (sc) injektoitiin selkään 5-viikkoisen naaras-BALB /c-kateenkorvattomissa nude-hiirissä (Clea Japan, Inc., Osaka, Japani ). Viidestä seitsemään päivää myöhemmin, kun suurin halkaisija kasvaimen, joka mitattiin käyttäen paksuus, saavutettiin noin 5 ~ 10 mm (päivä 0), kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin yhtälön ”suurin halkaisija X (pienin halkaisija)

2 x 0,5 ”, ja sitten hiiret jaettiin 5 ryhmiin (n = 8 kullekin). Kasvaimen tilavuus mitattiin päivänä 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, ja 14. Hiiren kehon paino mitattiin päivänä 0, 8, ja 14. Sen jälkeen, 2 viikon hoidon jälkeen hiiret lopetettiin päivänä 15 ja varsinainen kasvaimen paino mitattiin myös. Kokeessa 1, 5 ryhmää 8 hiiret saivat joko fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) (Control) tai PBS: ää kanssa erilaisia ​​annoksia PEG-IFN-a2a (0,06-60 ug) kerran viikossa 2 peräkkäisen viikon ajan (päivä 1 ja päivä 8). Kliiniseen PEG-IFN-a2a kroonisessa hepatiitti C: hoito on noin 3 ug /kg ja vastaa pienimmän annoksen (0,06 ug /hiiri = 840 IU /hiiri) tässä kokeessa. Tappamisen jälkeen, resektoitiin kasvaimet käytettiin morfologisia tutkimuksia (esim., HE värjäystä ja immunohistokemia) ja entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) analyysi. Jokainen hiiri sai intraperitoneaalisesti 1 mg BrdU 30 minuuttia ennen tappamista. Kokeessa 2, tutkia eroa pegyloimattoman ja pegyloidun IFN, 5 ryhmää 8 hiiret saivat joko PBS: ää (kontrolli), PBS 0,0042 tai 0,042 ug IFN-a2a (840 tai 8400 IU, vastaavasti), tai PBS 0,06 tai 0,6 ug PEG-IFN-a2a (840 tai 8400 IU, vastaavasti). Tässä kokeessa kasvain painot 15. päivänä ja apoptoottisten lukumäärissä verrattiin ryhmien kesken.

morfologinen tutkiminen ihonalainen kasvaimet Nude hiiret

solujen lukumäärä osoittaa ominaisuuksia apoptoosin (esim sytoplasman kutistuminen, kromatiinin kondensaatio ja ydinvoiman pirstoutuminen) laskettiin vähintään kolmessa 0,25 mm

2-alueiden sisällä HE-värjättyä yksilö, ja keskimääräinen pinta-alaa kohti saatiin. TUNEL tekniikka (ApopTag

® Peroksidaasisysteemit

In situ

apoptoosin Detection Kit, Chemicon International, Inc., CA) käytettiin havaitsemaan apoptoottisia soluja, ja keskimäärin TUNEL-positiivisten solujen pinta-alaa kohti on saatu, kuten edellä on kuvattu. Näytteet myös immunovärjättiin sisällytetty BrdU käyttämällä BrdU Värjäys Kits (Oncogene Research Products, Boston, MA), ja keskimääräinen positiivisten solujen pinta-alaa kohti oli saatu edellä kuvatulla tavalla. Lisäksi double-immunovärjäys suoritettiin anti-hiiri endoteelisolujen vasta-aineella, ihmisen α-SMA-vasta, Histofine yksinkertainen tahra hiiren MAX-PO (Rat) sarjat (Nichirei, Tokio, Japani), ja HistoMouse ™ plus-sarjat havaita valtimo kaltainen verisuonten kuten kuvattu edellisessä raportissa [21,22]. Määrä kaksinkertainen immunovärjäyksen-positiivisten verisuonten kasvain laskettiin kunkin näytteen. Granulaatiokudoksen sisällä kasvaimen jätettiin laskentaa verisuonia. Koko lasketaan alue mitattiin ääriviivojen näyttää tietokoneen näytön Mac TARKOITUS (Mitani Corp., Chiba, Japani). Saadusta alusten määrä pinta-alayksikköä kohti (mm

2), ryhmä keskiarvo saatiin vertailuihin.

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

Osia resektoitua ksenograftikasvaimissa homogenoitiin 500 pl: aan jääkylmää Ca

2+ ja mg

2 + vapaata PBS: ää, joka sisälsi 100 mg /ml phenymethylsulfonyl fl uoride käyttäen pelletin survimella. Seosta sentrifugoitiin 10 min (12000 g, 4 ° C), ja supernatantti varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Määrittämisen jälkeen määrä kudosta proteiinin supernatantista käyttäen BCA-proteiinimääritysreagenssilla (Pierce, Rockford, IL), määrä emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) ja IL-8 mitattiin käyttäen kaupallisesti saatavilla ELISA-kittejä ( R 0,0001 ~ 0,05) valikoimia 0,016 ~ 4194 ng /ml PEG-IFN-a2a in HAK-6, 0,256 ~ 4194 ng /ml KYN-3 ja HAK-1A, 4,096 ~ 4194 ng /ml KIM-1, KYN-1, HAK-1B, HAK-2 ja KMCH-2, 16,4 ~ 4194 ng /ml KYN-2, HAK-5 ja KMCH-1, 262 ~ 4194 ng /ml HAK-4, ja 4194 ng /ml HAK-3 (Student

t

-testi). Kahdeksan näytettä käytettiin kussakin kokeessa (n = 8). Koe toistettiin vähintään 3 kertaa kunkin solulinjan. Luvut osoittavat keskimääräistä ± SE kokeista.

suhteellinen elävien solujen määrä tukahdutettiin 11 solulinjoissa (kaikki solulinjat, paitsi HAK-1A ja KMCH-2) annoksesta riippuvalla tavalla, kun 96 tunnin inkuboinnin PEG-IFN- a2a (kuvio 1 B). 7-solulinjat (HAK-1B, KMCH-1, KIM-1, KYN-1, HAK-6, KYN-3, ja KYN-2), määrä oli tukahdutettu 50% tai vähemmän 4194 ng /ml PEG-IFN-a2a, ja 50% inhiboiva konsentraatio (IC50) oli 253 ng /ml HAK-1B, 670 ng /ml KMCH-1, 1105 ng /ml KIM-1, 1128 ng /ml KYN- 1, 1302 ng /ml HAK-6, 1524 ng /ml KYN-3, ja 4431 ng /ml KYN-2. Ei suhde havaittu välillä histologinen erilaistumisen tason alkuperäisestä kasvaimesta ja herkkyys anti-proliferatiivista vaikutusta PEG-IFN-a2a.

Seitsemänkymmentä kaksi tuntia lisäyksen jälkeen 4194 ng /ml PEG-IFN-a2a , 8 solulinjoja (kaikki solulinjat, paitsi KYN-3, HAK-1A, HAK-2, HAK-3, ja KMCH-2) osoitti ominaisuudet apoptoosin, esimerkiksi sytoplasman kutistuminen, kromatiinin kondensaatio ja ydinvoiman pirstoutuminen, eriasteista ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2). Ulkonäkö apoptoosin vahvistettiin lisäksi HAK-1B ja KIM-1-soluja viljeltiin yhdessä 10 ng /ml (= 2000 IU /ml) IFN-a2a tai 144 ng /ml (= 2000 IU /ml) PEG-IFN- a2a apoptoosin havaitsemiseen määrityksellä (taulukko 1). Pegyloimaton IFN-a2a aiheuttama paljon apoptoosin kuin PEG-IFN-a2a.

(A) Ilman PEG-IFN-a2a viljelyväliaineessa. (B) kanssa 4194 ng /ml PEG-IFN-a2a viljelyalustassa. Apoptoottisia soluja (lyhyt nuolet) ominaista sytoplasman kutistuminen, kromaattinen tiivistyminen ja ydin- pirstoutuminen havaittiin (HE värjäystä, X 200).

anneksiini V-EGFP apoptoottisia soluja (%) B Cell linja

Ohjaus

IFN-a2a

PEG-IFN-a2a

HAK- 1B4.1 ± 0,5

b18.5 ± 0.310.9 ± 0.5KIM-19.4 ± 0.447.0 ± 0.229.8 ± 2.1Table 1. kvantitatiivinen analyysi apoptoosin HAK-1B tai KIM-1.

Soluja viljeltiin pelkässä alustassa (Control), IFN-a2a (10 ng /ml = 2000 IU /ml) tai PEG-IFN-a2a (144 ng /ml = 2000 IU /ml).

b Mean ± SE. CSV Lataa CSV

Effects of PEG-IFN-a2a on HCC Cell Proliferation nude-hiirissä

Kronologinen muutosten arvioidaan kasvaimen tilavuuden jälkeen ihonalaisen viljeltyjen HAK-1B tai KIM-1cells ja nude-hiiriin on yhteenveto Kuva 3. Annos-riippuvainen tukahduttaminen kasvaimen havaittiin hiirillä annoksella PEG-IFN-a2a. Kokeessa on HAK-1B kasvaimia, merkittävä ero muutoksia kasvaimen tilavuus ja tuumorin paino välillä havaittiin Kontrollihiiret ja hiirillä, jotka saivat 0,06, 0,6, 6 tai 60 ug PEG-IFN-a2a (

P

0,0001 kahden tekijän factorial ANOVA, ja

P

0,001 ~ 0,02 jonka U-testi, kuvio 3A ja taulukko 2). Kokeessa KIM-1 kasvaimia, merkittävä väheneminen kasvaimen havaittiin myös käyttämällä PEG-IFN-a2a (

P

0,001 kahden tekijän kertoma ANOVA, kuvio 3B). Siellä oli merkittäviä eroja todellisten kasvaimen painon välillä kontrolliryhmän ja PEG-IFN-a2a ryhmät, lukuun ottamatta PEG-IFN-a2a (0,06 ug) ryhmä (taulukko 2). Varsinainen kasvaimen painon kokeen lopussa 2 on yhteenveto taulukossa 3. ihonalainen injektio 0,6 ug PEG-IFN-a2a aiheuttama merkittävä vähentäminen kasvaimen painoa verrattuna verrokkiryhmään ja ryhmässä, joka sai saman kansainvälinen yksikkö muiden kuin pegyloidun IFN-a2a (

P

0,005 ja

P

0,03, vastaavasti). Tässä kokeessa ei ollut merkittävää eroa kontrolliryhmän ja PEG-IFN-a2a (0,06 ug) ryhmä (

P

= 0,078).

hiiret saivat ihonalaisen injektion 0,06 (▲), 0,6 (○), 6 (●), tai 60 (Δ) ug PEG-IFN-a2a, tai pelkällä väliaineella (Control) (□) kerran viikossa 2 peräkkäisen viikon ajan. Nuolet osoittavat päiviä injektion. Luvut osoittavat keskimääräistä ± SE. *

P

0,0001, vs. muut ryhmät. †

P

0,01, verrattuna muiden ryhmien.

Kasvaimen paino (g) B Hoitoryhmä

HAK-1B

KIM-1

Control0.303 ± 0,05

b,

c1.050 ± 0,24

ePEG-IFN-a2a (0,06 ug) 0,141 ± 0,03

d0.725 ± 0,17

fPEG-IFN-a2a (0,6 ug) 0,033 ± 0.010.439 ± 0.04PEG- IFN-a2a (6 ug) 0,015 ± 0.010.434 ± 0.04PEG-IFN-a2a (60 ug) 0,0 0,076 ± 0.05Table 2. paino ihonalainen kasvaimista HAK-1B tai KIM-1-soluja nude-hiirillä tappaa ( koe 1).

viljelty HAK-1B tai KIM-1-soluja (1,0 x 10

7) on ihonalaisesti nude-hiiriin. Viisi ryhmää 8 hiiret saivat joko fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) (Control) tai PBS: ää kanssa erilaisia ​​annoksia PEG-IFN-a2a (0,06-60 ug) kerran viikossa. Kaikki hiiret tapettiin ja kasvaimen paino mitattiin 15. päivänä.

b Mean ± SE.

c

P

0,02, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,06 ug) ryhmä;

P

0,001, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä;

P

0,001, verrattuna PEG-IFN-a2a (6 ug) ryhmä.

d.

P

0,02, versus PEG-IFN-a2a (60 ug).

e Ei merkittävä, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,06 ug) ryhmä;

P

0,03, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä;

P

0,05, verrattuna PEG-IFN-a2a (6 ug) ryhmä;

P

0,01, verrattuna PEG-IFN-a2a (60 ug) ryhmä.

f.

P

0,05, verrattuna PEG-IFN-a2a (60 ug) ryhmä. CSV Lataa CSV Hoitoryhmä

interferoni (IU) B Kasvaimen paino (g) B Apoptosis (lukumäärä solua /0,25

2) B Control0 IU0.726 ± 0,09

b, c7.6 ± 0,9

dIFN-a2a (0,0042 ug) 840 IU0.588 ± 0,07

d7.9 ± 0,9

gIFN-a2a (0,042 ug) 8400 IU0.531 ± 0.04

E7.6 ± 0,7

hPEG-IFN-a2a (0,06 ug) 840 IU0.493 ± 0,04

f8.9 ± 0.9PEG-IFN-a2a (0,6 ug) 8400 IU0.355 ± 0,03 9.7 ± 1.0 * Taulukko 3. todellinen paino ja apoptoottisten lukumäärissä ihonalaisen kasvaimia tappaminen (koe 2).

viljelty HAK-1B-solut (1,0 x 10

7) subkutaani- istutetaan nude-hiirissä. Viisi ryhmille 8 hiiret saivat joko PBS: ää (kontrolli), PBS 0,0042 tai 0,042 ug IFN-a2a (840 tai 8400 IU, vastaavasti), tai PBS 0,06 tai 0,6 ug PEG-IFN-a2a (840 tai 8400 IU, vastaavasti). Kaikki hiiret tapettiin ja kasvaimen paino mitattiin 15. päivänä. Lukumäärä apoptoottisten solujen laskettiin vähintään kolme 0,25 mm

2-alueet kussakin jaksossa värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja keskimääräinen pinta-alaa kohti kussakin ryhmässä saatiin.

b Mean ± SE.

c

P

0,005, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä.

d

P

0,02, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä.

e

P

0,03, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä.

f

P

0,02, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä.

g

P

0,05, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä.

h

P

0,001, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,6 ug) ryhmä. CSV Lataa CSV

histologinen tutkiminen HAK-1B kasvain näytteet värjättiin HE paljasti, että numerot apoptoottisten solujen hoidetuilla hiirillä PEG-IFN-a2a (0,06 tai 0,6 ug) oli huomattavasti suurempi kuin Control, ja määrä kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4, A ja B, taulukko 4). Ilmaantuvuus apoptoosin TUNEL-värjätyt leikkeet osoittivat samat suuntaukset kuin ne, jotka saatiin in HE-värjätyt leikkeet (kuvio 4C ja taulukko 4). Immunohistokemiallinen tarkastelu BrdU kertymä HAK-1B kasvaimia paljasti, että ei ollut merkitsevää eroa BrdU merkintöjen indeksin välillä Ohjaus ja PEG-IFN-a2a (0,06 tai 0,6 ug) ryhmät (taulukko 4). Kuten apoptoosin, samankaltaisia ​​löydöksiä havaittiin kokeessa 2, jossa KIM-1 käytettiin. Ryhmässä, jota käsiteltiin 0,6 ug: PEG-IFN-a2a osoittivat lisääntynyttä apoptoottisten solujen määrässä kuin kontrolliryhmä. Ei ollut merkittävää eroa ohjaus ja IFN-a2a ryhmä. Lisäksi ryhmä hoidettiin 0,6 ug PEG-IFN-a2a (8400 IU) osoittivat suuremman määrän apoptoottisia soluja kuin ne, joilla on 0,042 ug IFN-a2a (8400 IU).

(A) Kontrolli hiiren, jotka saivat pelkästään viljelyalustassa. Kasvain on esitetty kompakti järjestely kasvainsolujen ja siniaallon kaltainen rakenne stroomaan. (B) hiiren, jotka saivat s.c. injektio 0,06 ug PEG-IFN-a2a. On joitakin apoptoottisten kasvaimen soluihin ominaista kutistuminen ja eosinofiilinen muutoksen sytoplasmassa, kromatiinin tiivistyminen ja /tai pirstoutuminen ytimet (nuolet, HE värjäystä, X200). (C) Sama kasvain, kuten on esitetty (B). On joitakin TUNEL-positiivisten solujen osoittaa ruskea ytimet (nuolet, värjätään TUNEL tekniikalla, X200).

Apoptosis

b (lukumäärä solua /0,25

2)

BrdU Labeling päävalikko

c (positiivisten solujen määrä /0,25

2) B Hoitoryhmä

HE tahrata

TUNEL menetelmä

ohjaus 8,4 ± 0,8

d, e 9,6 ± 1,1

e32.3 ± 1,6

fPEG-IFN-a2a (0,06 ug) 12,2 ± 1.015.4 ± 1.827.0 ± 2.6PEG-IFN-a2a (0,6 ug) 12,4 ± 0.916.1 ± 1.531.3 ± 6.9Table 4. numerot apoptoottisten solujen ja BrdU-positiivisten solujen ihmisen HCC kasvaimissa ihonalaisesti nude-hiirissä.

viljelty HAK-1B-soluja (1,0 x 10

7) oli ihonalaisesti nude-hiiriin. Viisi ryhmää 8 hiiret saivat joko fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) (Control) tai PBS: ää kanssa erilaisia ​​annoksia PEG-IFN-a2a (0,06-60 ug) kerran viikossa. Kasvaimia hiirillä, jotka saivat 6 tai 60 ug PEG-IFN-a2a ei voitu käyttää, koska kasvaimet olivat liian pieniä arvioida. Kaikki hiiret tapettiin 15. päivänä.

b lukumäärä apoptoottisten solujen laskettiin vähintään kolme 0,25 mm

2-alueet kussakin jaksossa värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja keskimääräinen pinta-alaa kohti kussakin ryhmässä saatiin. Määrä TUNEL-positiivisten solujen lasketaan myös samalla tavalla.

c määrä BrdU-positiivisten solujen laskettiin vähintään kolme 0,25 mm

2-alueet kussakin osassa, ja keskimääräinen pinta-alaa kohti kussakin ryhmässä saatiin merkintöjä indeksi.

d keskiarvo ± SE.

e

P

0,02, verrattuna muihin ryhmiin.

f. Ei merkittävää, verrattuna muiden ryhmien. CSV Lataa CSV

resekoitu kasvain PEG-IFN-a2a ryhmä osoitti granulointikudos keskellä kasvaimen eri astetta (kuva 5). Valtimoita ilmestyi granulaatiokudoksen jätettiin verisuonten määrä sisällä kasvain. Ei ollut merkittävää eroa verisuonten lukumäärä pinta-alayksikköä kohti sisällä HAK-1B kasvain ja ilmaus bFGF ja IL-8 kasvaimissa välillä PEG-IFN-a2a-ryhmän ja kontrolliryhmän (kuvio 5, taulukko 5 ).

(A) Kasvainsolut korvataan suuri granulointikudos on keskellä resekoidun tuumorin. (Arrowheads, HE värjäystä, X20). (B) Valtimo-kaltainen verisuonten kasvain (nuoli, HE värjäystä, X200). (C) Valtimo-kaltainen verisuoni kasvain (nuoli, CD34 /α-SMA kaksinkertainen immunostain, X200).

Valtimo kaltainen verisuonen

b (Alusten määrä /mm2 ) B tasot kasvaimen lysaatin

c (s /40 ug solun) B Hoitoryhmä

sisällä kasvaimen

bFGF

IL-8

Control0 0,104 ± 0,02

d, e14.0 ± 1,8

e2.8 ± 1,0

ePEG-IFN-a2a (0,06 ug) 0,194 ± 0.0519.8 ± 2.14.9 ± 1.3Table 5. numerot valtimo-kuin verisuonia, ja entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) angiogeneesitekijöiden ihmisen HCC kasvaimissa ihonalaisesti nude-hiirissä.

viljelty HAK-1B-solut (1,0 x 10

7) olivat ihonalaisesti nude-hiiriin. Viisi ryhmää 8 hiiret saivat joko fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) (Control) tai PBS: ää kanssa erilaisia ​​annoksia PEG-IFN-a2a (0,06-60 ug) kerran viikossa. Kasvaimia hiirillä, jotka saivat 0,6, 6 tai 60 ug PEG-IFN-a2a ei voitu käyttää, koska kasvaimet olivat liian pieniä arvioida. Kaikki hiiret tapettiin 15. päivänä.

b määrä valtimo kaltaisten verisuonten kasvain laskettiin kunkin osan, ja keskimääräinen pinta-alaa kohti kussakin ryhmässä saatiin.

c ekspressiotasot emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) ja IL-8 resektoitua kasvaimia mitattiin ELISA: lla.

d keskiarvo ± SE.

e. Ei merkittävää, verrattuna PEG-IFN-a2a (0,06 ug) ryhmä. CSV Lataa CSV

Keskustelu

in vitro

tutkimuksessa osoitimme, että PEG-IFN-a2a estää kasvun 8 ja 11 ulos 13 solulinjojen aika- ja annoksesta riippuvalla tavalla, kuitenkin PEG-IFN-a2a oli ilmeisesti vähemmän aktiivisia IC50 perusteella, verrattuna joko PEG-IFN-α2b tai IFN-α2b tai konsensus-IFN-α tai BALL-1 lymfoblastoidi IFN-α, joka on testattu sama kokeellinen ehto meidän aiemmissa raporteissa [10,18,21]. Esimerkiksi, IC50 HAK-1B-solut oli noin 253 ng /ml PEG-IFN-a2a, 13,1 ng /ml PEG-IFN-α2b, 2,4 ng /ml IFN-α2b, 0,7 ng /ml konsensus IFN- a ja 1,1 ng /ml pallo-1 lymfoblastoidi IFN-α. Toisaalta,

in vivo

tutkimuksessa, s.c. injektion PEG-IFN-a2a kerran viikossa osoitti parempaa tuumorin vastaista vaikutusta kasvaimen tilavuuden tai painon perusteella, verrattuna ei-pegyloidun IFN-a2a. Nämä tulokset saattavat tukevat hypoteesia, että jatkuvassa kosketuksessa IFN indusoi vahvat

in vivo

antituumorivaikutuksia, ja eivät ole yllättäviä, koska todettiin, että PEG-IFN-a2a osoittivat vähemmän aktiivisia in vitro antiviraalista vaikutusta ja mutta oli paljon enemmän

in vivo

antituumorivaikutus kuin pegyloimaton IFN-a2a [23]. Osoitimme myös, että PEG-IFN-a2a voi estää leviämisen CHC solulinjojen sekä HCC. MTT-määritys, kasvua KMCH-1 on hyvin tukahdutettiin vaikka toinen CHC solulinja, KMCH-2 ei ole. Yksi mahdollinen selitys eri herkkyys välillä KMCH-1 ja KMCH-2 on, että alkuperä KMCH-1 on CHC, klassista ja että KMCH-2 on CHC kanssa kantasolujen ominaisuuksia, väli-solun alatyyppiä mukaan uusin WHO: n luokituksen [24]. Tällainen kantasolujen ominaisuuksia kasvaimen voisi olla syy IFN vastus. Toinen mielenkiintoinen havainto on

in vitro

tutkimus on ristiriita tulosten MTT-analyysi ja apoptoosin detektiomäärityksen. Kun HAK-1B tai KIM-1 viljeltiin PEG-IFN-a2a, IC50 HAK-1B oli paljon alhaisempi kuin KIM-1, vaikka HAK-1B osoitti alhaisempaa apoptoottisten solujen kuin KIM-1. Nämä havainnot viittaavat siihen, että saattaa olla joitakin muita menetelmiä kuin apoptoosin, jotka vaikuttavat herkkyyttä antituumorivaikutukset PEG-IFN-a2a. Olemme aiemmin raportoitu, että sekä pegyloitua ja pegyloimatonta IFN-α inhiboivat viljeltyjen HCC-soluissa indusoimalla solusyklin pidätys [10,18]. Ilmentyminen interferonireseptori kasvainsoluihin voi olla mahdollista tekijä liittyvä antituumorivaikutus. Esimerkiksi, Nagano et ai raportoitu, että ilmaisu tämän tyypin I IFN-reseptorin HCC kudokseen, voi olla hyödyllinen ennustaja löytää mahdollisia responder INF-α /5-fluorourasiilin yhdistelmähoito [25]. Immuunimodulaatio by IFN on myös hyvin tutkittu tekijänä liittyvä antituumorivaikutus. Tässä tutkimuksessa käytimme kateenkorvattomissa hiirissä, joilta puuttuu kypsät T-solujen ja ihmisen IFN. Koska IFN lajikohtaisia ​​[26], me päätellä, että se immunomodulaarisia vaikutus rajoittuu tutkimuksessamme, mutta tämä olisi vahvistettava tulevaisuudessa käyttäen hiiren IFN.

morfologinen havainnointi ihonalainen kasvainten nude-hiirten paljasti, että s.c. injektion PEG-IFN-a2a aiheuttaa merkittävän kasvun apoptoottisten solujen verrattuna kontrolliryhmään.