Krooninen sairaus

tiivistelmä

LIV-1, sinkki kuljettaja, on effektorimolekyylin alavirtaan liukeneva kasvutekijöitä. Tämä proteiini on osoitettu edistävän epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ihmisen haiman, rinnan ja eturauhasen syöpäsoluja. Huolimatta seuraus LIV-1 syövän kasvua ja etäpesäkkeiden, ei ole tutkimuksen määrittää roolin LIV-1 eturauhassyövässä etenemiseen. Lisäksi ei ollut rajattu selvästi molekyylimekanismin taustalla LIV-1 toiminto syöpäsoluissa. Esillä olevassa tiedonannossa, löysimme lisääntynyt LIV-1 ilmentymisen hyvänlaatuinen, PIN, ensisijainen ja luu metastaattinen ihmisen eturauhassyöpää. Olemme tunnettu mekanismi, jonka LIV-1 ajaa ihmisen eturauhassyövän EMT androgeenista tulenkestävä syöpäsolujen (ARCaP) eturauhassyövän luumetastaasi malli. LIV-1, kun yli-ilmentynyt ARCaP

E (johdannainen solujen ARCaP epiteelin fenotyyppiin) soluja, edistetty EMT peruuttamattomasti. LIV-1 yli-ilmentyy ARCaP

E solut olivat kohonneita HB-EGF ja matriisin metalloproteinaasi (MMP) 2 ja MMP 9 proteolyyttisen toiminnan, vaikuttamatta solunsisäisen sinkkipitoisuus. Aktivointi MMP johti irtoaminen hepariinin sitoutumisen-epidermaalinen kasvutekijä (HB-EGF) päässä ARCaP

E-solut, jotka herättivät konstitutiivista kasvutekijän reseptorin (EGFR) fosforylaation ja sen loppupään ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi (ERK) signalointia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LIV-1 on osallisena eturauhassyövän etenemisen sillä solunsisäinen kohteena kasvutekijän reseptorin signalointia, joka edistää EMT ja syövän etäpesäkkeiden. LIV-1 voisi olla houkutteleva terapeuttinen kohde hävittämiseksi ennestään ihmisen eturauhassyövän ja luun ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä.

Citation: Lue HW, Yang X, Wang R, Qian W, Xu RZH, Lyles R, et ai. (2011) LIV-1 Edistää Eturauhassyöpä epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon ja metastaasin kautta HB-EGF Irtoaminen ja EGFR-välitteisen ERK Signaling. PLoS ONE 6 (11): e27720. doi: 10,1371 /journal.pone.0027720

Toimittaja: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 23 lokakuu 2011; Julkaistu: 16 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Lue et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee tutkimusapurahoja 2PO1CA098912 ja 5RO1CA122602 (LWKC) National Institutes of Health /National Cancer Institute (https://www.nih.gov) ja W81XWH-07-0172 (LWKC) Department of Defense Yhdysvalloissa (https://cdmrp.army.mil/pcrp). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

LIV-1, solun pinnan proteiinin, ja ehdokas välittäjänä kasvutekijää esiin signalointimolekyyli, on liittynyt useita tärkeitä biologisia prosesseja, toimimalla kuljettaja sinkin ja muiden ionien [1], [ ,,,0],2], [3], [4], [5]. Koska prototyyppi LIV-1 alaryhmä ZIP metallin kuljettajat [5], [6], LIV-1 osakkeiden sekundaarinen rakenne ZIP kuljettajat ja voi olla kyky kuljettaa metalli-ioneja. LIV-1 osoitettiin olevan välittäjänä alavirtaan signaali- anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) ja Snail, yhteistyössä Snail tukahduttamisessa epiteelin merkki E-kadheriinin (E-cad) geenin transkriptio [7]. LIV-1 osoitettiin myös olevan vuorovaikutuksessa kumppani estrogeenireseptorin (ER) in hormoniherkän kudoksissa [3], [8]. ER-positiivisen ZR-75-1 rintasyövän solulinjan, LIV-1 transkription indusoi estrogeenit [9]. Rinta- kasvaimia, LIV-1 ilmentyminen liittyy ER status [10], [11], ja korreloi positiivisesti syövän leviämisen kautta paikallisiin imusolmukkeisiin [12]. Kohdunkaulan syövän, ilmentyminen LIV-1: n osoitettiin olevan korkeampi kasvaimen kuin normaaleissa kudoksissa; RNAi-välitteinen tukahduttaminen LIV-1 inhiboi merkittävästi solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumista, ja vähensi muuttavien ja invasiivisia kyky HeLa-solujen [13]. LIV-1 on myös raportoitu olevan koholla kliinisissä haimakarsinooma ja indusoitiin EMT haiman syöpäsoluissa [14]. Vuonna seeprakala, LIV-1 on välttämätön ydinvoiman lokalisoinnin Snail, Master transkriptiotekijä edistää epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), joka aiheuttaa migraatio gastrula järjestäminen solujen [15]. LIV-1 näin on pakollinen kofaktori säätelevä EMT liittyvien geenien [14], [15], [16].

potentiaali ja ennustavia arvo LIV-1 ihmisen eturauhasen syöpä ei ole tutkittu. Koska sinkki on merkittäviä rooleja ylläpidossa eturauhasen epiteelisolujen homeostaasin [17], ja Snail on keskeinen transkriptiotekijä ohjaamalla eturauhassyöpäsolulinjojen EMT [18], [19], [20], LIV-1 voi olla aktiivisesti mukana edistäminen EMT aikana eturauhassyövän etenemisen ja luun etäpesäke. Tässä tutkimuksessa määritimme taso LIV-1 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja kliininen kudosnäytteiden määritellä suhdetta LIV-1 ja eturauhassyövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. ARCaP ihmisen eturauhassyövän etenemisen solujen mallia käytettiin arvioimaan rooli LIV-1. Meidän tutkimuksessa todettiin, että LIV-1 yli-ilmentymisen edistää eturauhasen syöpäsolun EMT ja helpottaa sen etäpesäke luuhun ja pehmytkudoksiin. Edelleen mekanistinen tutkimus osoitti, että LIV-1 yliekspressio voi upregulate HB-EGF ja MMP2 ja MMP-9 ilmaisun. Jälkimmäinen voi entsymaattisesti katkaisevat kalvoon sitoutuneen HB-EGF, liukoisen HB-EGF, että konstitutiivisesti aktivoitu EGFR kautta lisääntynyt EGFR fosforylaatiota ja sen loppupään ERK signalointi. Tulokset tästä tutkimuksesta osoittavat, että poikkeuksellisen tehostettu LIV-1 ilme on markkeri eturauhassyövän etenemisen, ja aktivoitu LIV-1 on vastuussa konstitutiivisen aktivaation EGFR joka ajaa EMT. LIV-1 voisi olla houkutteleva uusi terapeuttinen tavoite esto eturauhassyövän EMT ja luun ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläin työ suoritettiin noudattaen niitä kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita, ja hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) on Emory University School of Medicine (luvan numero 254-2008).

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen eturauhassyöpä ARCaP

E ja ARCaP

M-solut (johdannainen solujen ARCaP epiteelin ja mesenkymaalisten fenotyyppi, vastaavasti) perustettiin vuonna laboratoriossamme [21]. Soluja viljeltiin T-väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia (FBS, Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Ihmisen alkion munuaisen HEK293-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. RPMI-1640 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Kaikki elatusaineet täydennettiin penisilliinillä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). Soluviljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa atmosfäärissä, johon on lisätty 5% CO

2.

Vasta-aineet ja reagenssit

Polyklonaalisia kaniinin vasta-ainetta vastaan, LIV-1 on tuotettu laboratoriossamme. Kanit immunisoitiin tavanomaisilla immunisointiprotokolla kanssa peptidikonjugaattimäärän KLH-CPDHDSDSSGKDPRNS, joka vastaa tähteitä 146-161 ja LIV-1-proteiinin (GenBank NM_012319). Verta otettiin 2 viikon kuluttua neljännen vauhtia ja IgG puhdistettiin ja testattiin tiettyjen immuuni reaktiivisuus. Polyklonaalinen vasta-aine E-kadheriinin (E-cad), monoklonaalinen vasta-aine vimentiinista ja fosfo-EGFR-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Monoklonaalinen vasta-aine N-kadheriinin (N-cad) ja EGFR olivat BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). Vasta-aineita P44 /42 MAP-kinaasin ja fosforyloidun isoformit olivat Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Monoklonaalinen vasta-aine p-aktiini oli Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1 (IGF-1) ja transformoiva kasvutekijä-β1 (TGF-β1) hankittiin alkaen Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX). Epidermaalinen kasvutekijä (EGF) oli R 5′-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3 ’ja 5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′ E-cad; ; 5’-CCATCACTCGGCTTAATGGT-3 ’ja 5′-GATGATGATGCAGAGCAGGA-3′ N-cad; 5’-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3 ’ja 5′-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3′ varten Snail; 5’-TGCCCGGCGGAATCTCCTGA-3 ’ja 5′-GATGCAGGAGGGAGCCCGGA-3’ HB-EGF; 5’GCTGTCTGCGTGGTGGTGCT -3 ’ja 5’TGGTGTGGTGGGTCCAGGGC -3′ EGR; ja 5’-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 ’ja 5′-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3’ GAPDH. Reaktiot aloitettiin 4 minuutin inkubaatio 94 ° C: ssa, mitä seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C 1 minuutin ajan. Reaktio oli mennyt loppuun, jossa on 7 minuutin pidennys 70 ° C: ssa 7 minuutin ajan. PCR-tuotteet visualisoitiin elektroforeesin jälkeen kautta 1,2% agaroosigeelillä ja värjättiin etidiumbromidilla (0,5 ug /ml).

Western blotting

Solut 80% konfluenssiin hajotettiin kokosolu- lyysipuskuria, kuten aiemmin on raportoitu [22]. Lysaatit inkuboitiin jäissä 30 minuuttia ja sentrifugoitiin 10000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Kustakin näytteestä, 35 ug proteiinia supernatantissa eroteltiin SDS-PAGE: lla ja blotattiin nitroselluloosakalvolle (BioRad, Hercules, CA), joka oli estetty 5% rasvatonta maitoa PBST (137 mM NaCl, 12 mM fosfaatti, 2,7 mM KCI ja 0,1% Tween 20: tä) huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 4 ° C: ssa yön yli. Kalvot pestiin sitten kolme kertaa PBST: ssä ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Viiden pesut PBST erityisiä signaaleja havaittiin inkuboimalla kalvo ECL-reagenssilla (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

mittaaminen solunsisäisen sinkkipitoisuus

Kahta menetelmää käytettiin määrittämään solunsisäinen sinkkipitoisuus. Näytteiden valmistelemiseksi määrityksiin solunsisäisten kokonais-sinkki induktiivisesti kytketty plasma massaspektrometria (ICP-MS), viljeltiin soluja 80% konfluenssiin käsiteltiin trypsiinillä ja pestiin PBS: ssä ja inkuboitiin sitten 300 ul: aan 70% typpihappoa 37 ° C: ssa 2 tuntia. Sitten solut laitettiin 2% typpihappoa ja altistettiin ICP-MS Varian väline. Standardikäyrä muodostettiin sarjalaimennoksissa sinkin instrumentin standardeja. Valmistella näytettä analysoimiseksi solunsisäisen labiilin sinkille fluorometrisesti soluja ympättiin 3x 10

5 solua kuoppa 6 kuoppalevyillä toissapäivänä mittausta. Solut ladattiin 2 uM FluoZIN-3 AM: n (Invitrogen) 1 tunti Opti-MEM, joka sisälsi 0,02% Pluronic F127 (Invitrogen). Pesun jälkeen PBS: ssä, ladattu soluja inkuboitiin ilmaisin-free Opti-MEM: ssa 30 minuuttia. Fluoresenssi FluoZin-3 mitattiin käyttämällä PE Victor

3 V -levylukijalla.

Scratch haavan paranemista määritys

ARCaP

M transfektoitu lyhytaikaisesti kanssa LIV-1 siRNA tai universal siRNA ohjaus käytettiin määrittämään vaeltavien käyttäytymistä. Solut hitaasti ja varovasti raaputettiin 10 ui pipetin kärjen poikki keskellä hyvin 48 tuntia transfektion jälkeen. Jälkeen raapiminen, hyvin kevyesti pestiin kahdesti väliaineen poistamiseksi irrotettuja soluja. Hyvin täydennettiin tuoreella kasvualustalla. Kuvat otettiin 48 tunnin jälkeen naarmuuntumista. Useita näkymiä Kunkin kuopan dokumentoitiin, ja kolmen erillisen kokeen tehtiin.

Trans-hyvin muuttoliikettä ja invaasiota määritykset

Jos haluat tehdä laajuisen hyvin migraatiokokeessa, 2,5 x 10

4 solujen ylä- kammion 24 kuopan transwell levyt 8 mm: n huokoskoon (BD Biosciences) inkuboitiin 16 tuntia täydellisessä alustassa, joka lisättiin alaosaan. Sitten solut kiinnitettiin formaliinilla ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Ei-siirretyn solujen sisälle kammion poistettiin swabbing. Kristallivioletilla vaeltavat solut oli liuottaa Sorensonin puskuria (0,1 M natriumsitraatti ja 50% etanolia, pH 4,2) ja mitattiin absorbanssi OD

590. Invaasio Määritys tehtiin BD BioCoat matrigeelin invaasiota kammiot (BD Biosciences, 8 um huokoskoko). Samoja edellä kuvattuja menetelmiä käytettiin, paitsi että suodattimet oli esipäällystetty 100 ul: n kanssa Matrigeliä klo 1:04 laimennus RPMI-1640.

arviointi tuumorigeenisiä ja metastaattisen potentiaalin

toiminnallinen roolit LIV-1 eturauhasessa kasvainmuodostusta ja etäpesäkkeiden arvioitiin raportoitu aiemmin [23]. Arvioida paikallisen kasvaimen kasvua, 4 viikon ikäisiä kateenkorvattomia uroshiiriä (NCR-nu /nu, National Cancer Institute, Frederick, MD) inokuloitiin subkutaanisesti ARCaP

E-solut (1 x 10

6 50 ui PBS) vakaasti transdusoidaan LIV-1. Kasvaimen mitta mitattiin paksuus päivinä 23, 32, 43, ja 50 injektion jälkeen, ja kasvaimen tilavuus laskettiin pituus x leveys x korkeus x 0,5236 [24]. Arvioida syövän etäpesäkkeitä, joilta puuttuu kateenkorva miespuolinen hiiriin istutettiin intracardiacally kanssa ARCaP

E-solut (2 x 10

6 100 ui PBS: ssä) vakaasti transdusoidaan LIV-1 vasemmalle kammiot. Eläimiä tarkkailtiin 4 kuukautta kehittämiseksi etäpesäkeleesioita. Luumetastaaseja kirjattiin röntgenkuvien radiografian ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä varmistettiin histopatologisesti.

immunohistokemia (IHC) kudoksen microarray (TMA) B

normaaleissa ja sairaissa eturauhaskudoksiin analysoidaan olivat: 1) Yhden mittatilaustyönä TMA normaali eturauhasen kudoksia 4 tervettä miestä; Hyväksytty syöpä, hyvänlaatuinen, ja PIN kudoksia 12 eturauhassyöpätapauksia; Hyväksytty hyvänlaatuinen ja syöpä kudoksia 11 tapausta; Hyväksytty PIN ja syövän välillä 1 tapaus; eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) 2 tapausta; ja eturauhassyöpä luinen etäpesäke 3 eturauhassyöpätapauksia. 2) Yksi mittatilaustyönä TMA koostui 47 luumetastaasin kudoksia 11 eturauhassyöpäpotilaalla. 3) Neljä TMA kukin sisältää 66 tapausta eturauhassyövän ja hyvänlaatuisen eturauhasen sairaudet (US Biomax-. Rockville, MD).

IHC protokolla arvioimiseksi geenin ilmentyminen on raportoitu [22]. Lyhyesti, yksilöitä poistettiin parafiini, vedettömät ja alistettiin antigeenin haku. Sen jälkeen endogeeninen peroksidaasi esto, näytteet inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön, jota seuraa 30 minuutin inkubaatio DakoCytomation EnVision + HRP reagenssia. Signaalit havaittiin lisäämällä diaminobentsidiiniä kromogeenista tai counterstaining hematoksyliinillä. Pre-immunisaatio kanin seerumi toimi negatiivisena kontrollina. IHC värjäys teki kaksi tutkijaa toisistaan ​​riippumatta, joka perustuu neljään värjäytymisvoimakkuuksia 0 +++, kuten aiemmin on raportoitu [22].

gelatiinitsymografialla

Kaikki gelatiinitsymografialla reagenssit hankittiin Invitrogen. Soluja viljeltiin seerumittomassa RPMI1640 väliaineessa 24 tuntia ja väliaine kerättiin. Proteiini keskipitkällä väkevöitiin kanssa AmiconUltracel 30 KDa suodatin (Millipore, Billerica, MA). Yhtä suuret määrät proteiinia (10 ug /näyte) sekoitettiin 2 x Novex Tris-glysiini SDS-näytepuskuria, ja fraktioitiin 10% gelatiinia geelissä ei-pelkistävissä olosuhteissa. Geeli inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa renaturoimalla puskurissa 30 minuutin ajan ja kehitetään puskurissa 30 minuutin ajan. Lopuksi geeli värjättiin SimplyBlue SafeStain, ja bändejä edustavat gelatinaasiaktiivisuutta on MMP2 ja MMP-9: n määrät.

Entsyymi-immunologinen määritys (

ELISA

) HB-EGF

Soluja viljeltiin seerumivapaassa RPMI1640 väliaineessa 24 tunnin ajan. Elatusaine kerättiin ja analysoitiin HB-EGF konsentraatio ihmisen HB-EGF Duoset ELISA Kit (R ja 2) luun etäpesäke vs. hyvänlaatuinen, PIN, ja ensisijainen paikallinen syöpä. Tämä testi vastaa muuttujan t-testiä käytetään, kun on olemassa vain kaksi ryhmää verrataan. Logistinen regressio mallintamiseen käytettiin suhdetta binary Gleason tulokset, jotka jaettiin binary muuttujia hyvin eriytetty (GI≤6) vs. kohtalaista tai huonosti eriytetty (GI≥7) eturauhassyöpä. SAS ja Minitab käytettiin tässä analyysissä.

Tulokset

Ihmisen eturauhassyöpä ARCaP solujen perustettu laboratoriossamme [21] voidaan helposti edistää tehdään EMT vastauksena liukoisen tekijät ja matriksiproteiineja läsnä kasvaimen mikroympäristössä [20], [25], [26], [27]. Selvittämiseksi molekyylimekanismin säätelevä EMT, epiteelin ARCaP

E analysoitiin ero geenien ilmentyminen vasteena liukenevia tekijät, verrattuna sen ARCaP

M vastine joka muotoutuneet mesenkymaaliset fenotyypin. LIV-1 oli yksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistettu [27]. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme rooli LIV-1 säätelyssä EMT ARCaP soluissa arvioimiseksi mahdollinen mekanismi LIV-1 toiminnan edistämisessä eturauhassyövän luuhun ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä.

LIV-1 oli mukana edistämässä EMT että ARCaP solumallissa

aiemmin raportoitu, että ARCaP

E solut koki EMT hoidetuilla liukoisen tekijöistä, kuten IGF-1, EGF, TGF-β1 ja β-2 Mikrogiobuliinin (β -2M) [20], [25], [26], [27]. Esillä olevassa tutkimuksessa, kun ARCaP

E soluja käsiteltiin joko TGF-β1 tai IGF-1, induktio LIV-1 ekspressiota havaittiin sekä RT-PCR: llä ja Western blotting analyysit (kuvio 1A). Kun eri IGF-1 lisättiin induktion väliaineen, reagointikykyä LIV-1-ekspressiota havaittiin olevan annoksesta riippuvaista (kuvio 1A). IGF-1-indusoidun LIV-1 ilmentymisen ARCaP

E solut tapahtui samanaikaisesti kytkimen solun morfologia ja geenin ilmentyminen kohti mesenkymaalisten fenotyyppi,

eli

menetys tiukasti liiman polarisoitunut epiteelisolujen morfologia tulla löyhästi hajallaan fibroblastisoluja lisääntynyt ilmentyminen N-cad ja vimentiinista mutta laski ilmentyminen E-cad, tunnusmerkki säilytettävä polarisoitunut epiteelisolujen (kuvio 1 B). Aktivoitu LIV-1 ilmentymisen näytti tapahtua samanaikaisesti siirtymistä ARCaP

E ARCaP

M, joka on ARCaP mesenkymaaliset variantti [21].

rooli LIV-1 arvioitiin sen muuttunut ilmaisun aikana EMT. A, ARCaP

E soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan kasvutekijöiden indusoimaan EMT. RT-PCR: llä ja Western blotting käytettiin osoittamaan kasvoi LIV-1 ilmentymisen (vasen paneeli), ja annos reagointikykyä lausekkeen (oikea paneeli). B, Western blotting käytettiin varmistamaan EMT kaltaisia ​​ilmaisukeinojen muutoksia käsitellyssä ARCaP

E soluja. C, mesenkymaalisten solujen, kuten ARCaP

M solut altistettiin siRNA pudotus ja LIV-1 ilmentymisen 48 tunnin ajan. RT-PCR ja Western blotting käytettiin tunnistamaan ilmaisullisella muutokset heijastavat kääntyminen EMT käsitellyssä soluissa. D, Scratch haavan paranemista ja siirtokuoppaan invaasio määrityksiä käytettiin määrittämään muuttavien ja invasiivisen käyttäytymisen siRNA käsitelty ARCaP

M-soluissa. * Merkitsee tilastollista merkitystä verrattuna CON1 ohjaus klooni (P 0,05). E, ARCaP

E solut transfektoitiin LIV-1-ekspressiokonstruktin. RT-PCR ja western blotting tehtiin 48 tuntia transfektion jälkeen havaita ilmaisullisella muutokset heijastavat EMT kaltaisia ​​tapahtumia. GAPDH toimi sisäisenä kontrollina RT-PCR-reaktioissa, ja β-aktiini käytettiin lastaus valvonta Western blottauksella.

määrittää roolin LIV-1 välittämisessä EMT, me ohimenevästi alennettu LIV-1 tason mesenkymaaliset kaltainen ARCaP

M-soluissa siRNA knockdown. ARCaP

M soluja käsiteltiin erityisiä LIV-1 siRNA osoitti lyhensi LIV-1-transkriptien (kuvio 1 C). Tärkeää on, että käsitellyt solut osoittivat vähentynyttä ilmentymistä mesenkymaalisten merkkiaineiden N-cad ja Snail, mutta lisääntyneen ekspression E-cad-geenin sekä RT-PCR: llä ja Western blotting analyysit (kuvio 1C). Lisäksi ARCaP

M soluja käsiteltiin erityisiä LIV-1 siRNA osoittivat paljon pienempi vaeltavia ja invasiivisia kyky scratch haavan paranemista ja transwell invaasio määrityksissä (kuvio 1 D). Nämä tulokset viittaavat siihen, LIV-1 ilmentyminen liittyy EMT ja laski LIV-1 ilmentymisen johtaa mesenkymaalisten epiteeli- siirtyminen (MET), käänteinen EMT. Läsnäolo LIV-1 näytti vaaditaan ylläpitämistä mesenkymaalisten fenotyypin.

seuraava tutki kohonnut LIV-1 on epiteelin kaltainen ARCaP

E solut riittäisi aloittaa EMT, arvioituna molekyyli- analyysejä. Lapäisen transfektion jälkeen, jossa LIV-1 ekspressiokonstrukti, ARCaP

E-solut tutkittiin sekä RT-PCR: llä ja western-blottauksella määritykset ilmentymistä EMT-liittyvän markkereita. Transfektoidut ARCaP

E soluilla huomattavasti suurentunut LIV-1 ilmentymisen (kuvio 1 E), mukana lisääntynyt N-cad ja Snail mutta väheni E-cad ilme. Nämä ilmaisulliset muutokset olivat yhtäpitäviä nähdään kasvutekijä herättänyt EMT (kuvio 1 B). Tulokset LIV-1 siRNA Knockdown ja LIV-1 yli-ilmentymisen tutkimukset ARCaP

M ja ARCaP

E soluja ehdotti, että LIV-1 tarjoaa keskeinen säätelijä EMT ihmisen eturauhasen syöpäsoluja.

Tuotanto ja karakterisointi polyklonaalisia vasta-aineita ihmisen LIV-1

arvioida, LIV-1: n ilmentyminen liittyy kliiniseen etenemiseen ihmisen eturauhassyövän, me esiin polyklonaalisia vasta-aineita immunisoimalla kaneja, joilla on KLH-konjugoitua LIV-1-peptidin. Spesifisyys LIV-1-vasta-aineiden vahvistettiin Western-blottauksella koko-solu-uutteiden solujen yli-ilmentävät eksogeenisiä LIV-1. Vuodesta HEK293-solut transfektoitiin väliaikaisesti LIV-1, havaitsimme yhden immuuni-reaktiivisen LIV-1-proteiinin, 110 kDa: n (kuvio 2A). Koska laskettu molekyylipaino LIV-1-proteiini on 90 kDa: n [5], ero 20 kDa: n välillä havaitaan ja ennustetun kokoisia oli todennäköisesti johtuu N-kytketyn glykosylaation LIV-1-proteiinin, kuten aiemmin on raportoitu [5]. Tärkeää on, että havaitseman signaalin LIV-1-vasta-aineita poistettiin, kun vasta-aineet imeytettiin etukäteen kanssa LIV-1-peptidin käytetty immunisointiin. Lisäksi lisääntynyt signaalin voimakkuuden havaittiin ARCaP

E-solut transfektoitiin väliaikaisesti LIV-1 ekspressiokonstrukti, kun taas väheneminen signaali nähtiin ARCaP

M-soluja käsiteltiin ohimenevää LIV-1 pudotus vektori sekä Western blotting ja IHC määrityksissä (kuvio 2B ja 2C). Nämä tulokset osoittivat, että LIV-1 tuottamat vasta-aineet voivat tunnistaa spesifisesti LIV-1-proteiinin, joka on modifioitu testatuissa solulinjoissa.

tuotettu vasta-aineita LIV-1 alistettiin validointi spesifisyyden. A, HEK293-solut transfektoitiin väliaikaisesti LIV-1 ekspressiokonstruktin alistettiin Western blotting -analyysi vasta-aineiden kanssa ja LIV-1 (ylempi paneeli). Vasta-aineen spesifisyyden määritettiin ennalta imevää vasta immunisoivalla peptidi (keskimmäinen paneeli). B, ARCaP

E-soluja transfektoitiin ohimenevästi LIV-1 ekspressiokonstruktin yli-ilmentää LIV-1 ja ARCaP

M-solujen kanssa erityisiä siRNA tukahduttaa LIV-1 ilmentymisen. Ylemmässä 2 paneelit, Western blottaus suoritettiin 48 tuntia myöhemmin vasta-aineita LIV-1. Alemmassa 2 paneelit, nämä solut tutkittiin RT-PCR: llä vahvistaa LIV-1 ilmentymisen. β-aktiini käytettiin kontrollina Western-blottauksella ja GAPDH: ta käytettiin kontrollina RT-PCR-analyysi. C, IHC tehtiin edelleen vahvistaa LIV-1 Ab erityisyyttä ARCaP

E-soluihin väliaikaisesti transfektoitu LIV-1 ilmentymiskonstrukti ja ARCaP

M-solut transfektoitiin väliaikaisesti erityisen siRNA (200 x).

Stable LIV-1 yli-ilmentymisen aiheuttamaa EMT in ARCaP

E solut

jälkeen ohimenevää knockdovvn LIV-1 in ARCaP

M-solut, odotettu käänteinen mesenkymaalisten fibroblastisen solun muoto epiteelin morfologia havaittiin. Nämä morfologiset kytkimet oli helposti havaittavissa geenin ilmentyminen muuttuu (kuvio 1 C). Sen sijaan lyhytaikaisesti yli-ilmentävät LIV-1 ARCaP

E solut eivät indusoi mesenkymaalisten morfologisia siirtyminen, vaikka yhdenmukaistetut ilmaisullisia muutoksia, jotka viittaavat EMT (kuvio 1 E). Olemme epäillään, että puute morfologisia muutoksia voi johtua luonteesta lyhytaikaisella transfektiolla. Niinpä vakaa ARCaP

E-kloonit perustettiin arvioimaan, LIV-1 on kriittinen säädin liittyy morfologisia sekä ilmaisukeinojen ja käyttäytymisen siirtymistä epiteelin on mesenkymaaliset fenotyypin.

eristetty 4 ARCaP

E-kloonit (LIV # 8, 12, 14 ja 17), jotka ekspressoivat stabiilisti suuria määriä LIV-1-proteiinin, kuten havaittiin Western-blottauksella (kuvio 3A). Kaksi ohjaus kloonia (CON1 ja CON2) eristettiin myös transfektio kontrollivektorilla. Ne yli-ilmentävät LIV-1 osoitti tyypillisen EMT kaltaisia ​​ilmaisullisella muutoksia, joissa vähentynyt E-cad ilmentymisen mutta lisäsi N-cad ja Snail ilmauksia (kuvio 3A). Merkittävää on, kaikki kloonit osoittivat merkittävästi muuttunut solumorfologialtaan: sijaan pienen solun koon kanssa mukulakivi kaltainen muoto, jossa tiukasti järjestetty solujen välisen kontakti tyypillistä epiteelisolujen kaltainen ARCaP

E, kaikki neljä kloonit sopeutunut hämmästyttävän muuttunut morfologia näyttämällä menetyksen solujen välisen kontaktin ja tyypillisiä kara-muotoinen mesenkymaalisten solujen morfologia (kuvio 3B). Morfologiset siirtyminen oli pysyvä ja peruuttamaton, jatkuvat kun yli 30 kohtia jatkuvassa viljelyssä, kun taas kaksi vektori-transfektoidut kloonit pysyi epiteelisolujen kaltainen. Näyttää siltä, ​​että vakaita LIV-1 yli-ilmentymisen voisi tuoda esiin sekä morfologisia ja biokemiallisia EMT siirtyminen. LIV-1 on siis voimakas edistäjä EMT vuonna ARCaP

E soluja.

ARCaP

E kloonien yli-ilmentävät LIV-1 näkyy EMT kaltaisia ​​muutoksia geenien ilmentyminen, solun morfologiassa ja käyttäytymistä. A, kaikki neljä LIV-1 yliekspressoivia ARCaP

E-kloonit osoittivat EMT kaltaisia ​​ilmaisullisella muutokset havaitaan Western blottauksella, kun taas kaksi vektorisäätö kloonia (1 ja 2) säilytti epiteelisolujen-ilmaisun profiilin. B, solun morfologia LIV-1 yliekspressoivia solut osoittivat selvästi muutoksia ohjaus klooneista (200 x). C, LIV-1 yliekspressoivia soluja (LIV # 8 ja LIV # 14 verrattiin vektorisäätö klooneja 1 ja 2 sekä vanhempien ARCaP

E ja ARCaP

M solujen muuttunutta vaeltavia valmiudet siirtokuoppaan määrityksissä. Jokainen tulos on keskiarvo ± keskihajonta kolminkertaisessa määrityksessä. D LIV-1 yliekspressoivassa # 8 ja # 14 klooneja verrattiin vektorisäätö klooneja 1 ja 2 sekä vanhempien ARCaP

E ja ARCaP

M solujen muuttunutta invasiivisuus. * ilmaisee tilastollista merkittävyyttä verrattuna CON1 ohjaus klooni (

P

0,05).

The effects of LIV-1 käyttäytymismuutoksia arvioitiin sen edistämiseksi solumigraation ja invaasiota in Boyden kammiossa määrityksissä. Vaikka ohjaus neo transfektoidut ARCaP

E-kloonit osoittivat samanlaisia ​​maahanmuutto- ja invaasion valmiudet muistuttaa läheisesti kuin vanhempien ARCaP

E soluja, toistuvat määritykset paljastivat, että LIV-1 yli-ilmentymisen siirrettävä huomattavasti vaeltavia ominaisuus (kuva 3C) ja invasiivisia pystyvät pääsemään matriiseina (kuvio 3D). Yhdessä nämä tiedot tukevat käsitystä, että lisääntynyt LIV-1 tasot edistää liikkuvuutta ja invasiivisen käyttäytymisen eturauhassyöpäsolujen.

LIV-1 yli-ilmentymisen edistänyt eturauhasen kasvaimen muodostumisen ja etäispesäkkeitä

in vivo

tutkinut roolin LIV-1 ekspressoida pysyvästi ARCAP

E soluja moduloiva myöhemmin tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen käyttäytymistä hiirillä. Vertasimme paikallista ja kaukainen metastaattisen kasvun ARCaP

E kasvaimet ihon alle ja sydämensisäistä tuumorisoluinokulaatiosta protokollia kuten aiemmin on kuvattu [21], [23].

Nahanalaisen istutusta, LIV-1 yli-ilmentävät kloonit indusoi samanlainen esiintyvyys kasvainten muodostumista vektori transfektoitiin valvontaa, jokainen ryhmä, jossa on 6 kasvaimia yhteensä 8 rokotukset.