Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Detection keuhkosyöpään varhaisessa vaiheessa herkkien seulontatestejä voisi olla tärkeä strategia parantaa ennustetta. Tavoitteena oli tunnistaa paneelin kiertävän MikroRNA plasmassa, jotka edistävät varhaista havaitsemista keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmanäytteet 100 alkuvaiheen (I IIIA) ei- pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilasta ja 100 ei-syöpä valvonta seulottiin 754 verenkierrossa MikroRNA kautta qRT-PCR käyttäen TaqMan MicroRNA Arrays. Logistinen regressio kanssa suopunki rangaistus käytettiin valita paneelin MikroRNA syrjiviä tapausten ja kontrollien välillä. Sisäinen validointi mallin syrjinnän tehtiin laskemalla bootstrap optimismi korjattu AUC valitun mallin.

Tulokset

tunnistettu paneeli 24 MikroRNA optimaalinen luokituksen suorituskykyä. Näiden 24 MikroRNA yksinään voisi syrjiä keuhkosyöpää ulkopuolisista syövän säätimet AUC 0,92 (95% CI: ,87-0,95). Tämä luokitus parani AUC 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) lisäyksen jälkeen sukupuolen, iän ja tupakoinnista malliin. Sisäinen validointi malli viittaa siihen, että erottelukyky Paneelin on korkea, kun sitä sovelletaan riippumattomia näytteitä korjattu AUC 0,78 varten 24-miRNA paneeli yksin.

Johtopäätös

24 -microRNA ennustaja parantaa keuhkosyöpää ennustaminen pidemmälle kuin tunnettuja riskitekijöitä.

Citation: Wozniak MB, Scelo G, Muller DC, Mukeria A, Zaridze D, Brennan P (2015) Circulating MikroRNA kuin ei-invasiivisia biomarkkereita Early Detection of Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 10 (5): e0125026. doi: 10,1371 /journal.pone.0125026

Academic Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, SAKSA

vastaanotettu 16. lokakuuta 2014; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2015; Julkaistu: toukokuu 12, 2015

Copyright: © 2015 Wozniak et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Taqman Human MicroRNA Array kokeilut ovat MIAME yhteensopiva ja on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) alle liittymisen GSE64591.

Rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Vuonna 2012, 1,82 miljoonaa uutta tapausta, ja 1.590.000 kuolemista johtuu keuhkosyöpään kirjattiin, eli 13% kaikista syöpätapauksista ja 19% kaikista syöpäkuolemista vastaavasti [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 80-85% kaikista keuhkosyöpää ja koostuu pääasiassa kaksi histologista tyyppiä: adenokarsinooma (AC) ja okasolusyöpä (SCC). Huolimatta edistysaskeleet hoidon yleisen 5 vuoden eloonjäämisaste vain 16% [2] on lähinnä myöhään diagnoosi. Havaitseminen keuhkosyövän varhaisessa vaiheessa herkkien seulontatestejä voisi olla tärkeä strategia parantaa keuhkosyöpää ennustetta.

Kansallinen Lung Screening Trial (NLST) käyttäen pieniannoksista kierteisen tietokonetomografia (LDCT) korkeaviskoosisessa riskihenkilöiltä osoittaa, että 20% vähennys keuhkosyövän aiheuttaman kuolleisuuden ja 6,7% vähennys tahansa syystä johtuvan kuolleisuuden [3] voidaan saavuttaa. Kuitenkin korkea vääriä positiivisia hinnat NLST [4], kustannukset ja mahdolliset haitat säteilyltä altistumisesta korostavat tarvetta yksinkertaistaa ja ei-invasiivisia ja helpommin menetelmiä varhaiselle syövän havaitsemiseen täydentävinä biomarkkereita.

MikroRNA (miRNA) ovat ryhmä pieniä (~ 22-nukleotidin pituinen) ei-koodaus, yksijuosteinen RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä transkription jälkeen. Poikkeamat miRNA ilmentymisen tasojen on todettu suhteessa onkogeneesiin ja tuumorietäpesäke [5], mukaan lukien NSCLC. Yli 2500 ihmisen miRNA sekvenssit ovat tällä hetkellä tiedossa [6]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumin ja plasman miRNA (kutsutaan kiertävä miRNA) läsnä suuria lupauksia uusina ei-invasiivisia biomarkkereita varhaiseen toteamiseen eri syöpien johtuu niiden helppous, ja pitkän aikavälin vakauden [7,8]. Vuonna keuhkosyöpä, useat miRNA ekspressioprofiileja on havaittu huomattavan suuri ennustearvojen lukien 34-miRNA diagnostinen allekirjoitus, jonka AUC 0,89 [9], 10 miRNA paneelin AUC 0,97 seerumissa sekä 16-miRNA suhdelukuja allekirjoituksen riskin (AUC: 0,85) ja diagnoosi (AUC: 0,88) [10,11] plasmassa näytteitä NSCLC potilaiden.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet huomattavia epäjohdonmukaisuuksia vaikka nämä perustuivat rajallinen otoskokojen tai käyttää ehdokas miRNA lähestyy. Lisäksi taso kiistaa esiintyy että miRNA havaittu veressä vain ilmoittaa muutoksista verisolujen toissijainen yleinen huono terveydentila ja eivät koske erityisesti syövän läsnäolon kohde-elin. Vaikka mittaus miRNA ilmaisun plasmassa tai seerumissa on oletettu on lupaava lähestymistapa diagnosoinnissa keuhkosyöpä, käsite vaatii lisätutkimuksia osoittamaan sen potentiaalia käytettäväksi kliinisissä sovelluksissa. Ei ole vahvaa näyttöä siitä, seerumi tai plasma on ylivoimainen miRNA arvioinnissa kuitenkin viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että plasman voidaan edullinen näytteen valinta koska RNA vapautuu koagulaatioprosessin voivat muuttaa koostumusta kiertävän miRNA seeruminäytteessä [12 ].

Täällä esittelemme genominlaajuisten miRNA ilmaus näytön plasmanäytteissä 100 NSCLC tapauksissa ja 100 ohjaa jossa me määritteli miRNA allekirjoitusta, joilla on korkea diagnostinen arvo, joka tunnistettiin tiukat tilastollisia lähestymistapoja.

tulokset

Tutkimuskanta

ominaisuudet 200 tutkimukseen osallistuneista, mukaan lukien 65 potilasta, joilla keuhkojen SCC, 35 potilaalla on keuhko AC ja 100 valvontaa on esitetty taulukossa 1. oli ero sukupuoli (enemmän miehiä tapauksista), ikä haastattelu (tapaukset olivat keskimäärin 1,5 vuotta vanhempia kuin kontrollit), tupakointi asema (15% enemmän virtaa tupakoivien tapausta) ja alkoholin juominen tila (tapauksissa mukana 12% enemmän entinen alkoholia kuluttajat). Keuhkosyöpä potilasta oli varhainen IA-IIIA vaiheessa. Keskimääräinen seuranta-aika oli 2,48 vuotta. Tänä seuranta-aika, 64 100 tapausta kuoli ja 36 olivat vielä elossa sensuroinnin.

Micro-RNA profiilit plasman

Sen arvioimiseksi, onko tietty miRNA allekirjoitukset ovat havaittavissa plasmassa näytteitä potilaista, joilla alkuvaiheessa NSCLC, teimme suurikapasiteettisten näytön 754 miRNA käyttäen TaqMan Human MicroRNA Arrays. Keskimäärin 235 ja 115 miRNA oli havaittu Card ja Kortin B vastaavasti (läsnä vähintään 80 ulos 200 näytettä joko tapauksissa tai valvonta) (kuvio 1). Mirna ekspressioprofiileja plasmassa oli quantile normalisoituneet ja poikkeavalla tavalla ilmaisun analyysien välillä NSCLC ja kontrollit. 350 havaittu miRNA plasmassa, 61 miRNA todettiin merkittävästi ilmentyvät eri välillä keuhkosyöpää ja valvonta (35 Card, 26 Card B) sisältäen 33 voimistunut ja 28 vaimentua miRNA (p-arvo 0,05). Nämä koostuvat 21 miRNA ilmentyvät eri merkittäviä oikaistu p-arvo korjataan useiden testaus (taulukko 2). Huolimatta merkittävistä ero ilmaisua, valvottu hierarkkinen klusterointi analyysi osoitti, että tämä joukko 61 miRNA voinut selkeästi erottaa toisistaan ​​keuhkosyöpää ja tarkastukset (S1 Kuva).

Prediction mallit

valitse paneeli miRNA erotteleva tapausten ja kontrollien välillä, logistiikkaregressiomallin kanssa suopunki rangaistus oli asennettu. Tämä analyysi tunnistettu paneeli 24 plasma miRNA kanssa optimaalisen luokituksen suorituskyky (S2 ja S3 kuviot). Taulukko 3 esittää täydellisen luettelon valituista miRNA paneelissa. Useita regressioanalyysimme osoitti, että yhdistelmä 24 miRNA yksinään voisi syrjiä keuhkosyöpää tarkastuksissa erittäin korkea AUC 0,92 (95% CI: ,87-,95). Logistisessa mallissa mukaan lukien 24-miRNA paneeli ja oikaistu tärkein keuhkosyövän riskitekijöihin eli sukupuoli, ikä haastattelu ja tupakointi, luokittelu parani AUC 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) (kuvio 2) . Parannus suuruus syrjintä johtuu 24-miRNA paneeli on merkittävä verrataan tärkeimpien keuhkosyövän riskitekijät yksin. AUC: t koko logistisen mallien kanssa ja ilman 24-miRNA paneeli oli 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) ja 0,72 (95% CI: ,65-+0,78), tässä järjestyksessä (kuvio 3). Ennustearvo oli samaa suuruusluokkaa (AUC: 0,95; 95% CI: 0,91-0,98) vaihdettaessa kategorisen tupakointi tilamuuttujan jatkuva pack-vuoden muuttuja. Erityisesti vaikka johdettu molempien histologisia tyyppejä, 24 miRNA paneeli suoritetaan yhtä hyvin sekä ACS (AUC: 0,94) ja SCC (AUC: 0,96). Samoin ennustaja tehonnut hyvin syövät kaikissa vaiheissa (IA-IIIA), AUC oli 0,96 I vaiheessa (IA ja IB; n = 49) potilasta, 0,98 II vaiheessa (vaihe II A ja II B; n = 21) potilaiden ja 0,97 vaiheessa IIIA (n = 30) potilaista (dataa ei esitetty).

Sisäinen validointi valitun 24-miRNA paneeli mallia (eli validointi osuus vaihtelu johtuen parametrien estimointi) käyttäen bootstrap optimismi korjattu AUC ehdottaa, että erottelukyky paneelin on korkea, kun sitä sovelletaan riippumattomia näytteitä (korjattu AUC 0,86 varten 24-miRNA paneeli yksin, 0,87 mallin kuten sukupuoli, ikä ja tupakointi tila ja 0,89 mallin pack-vuotiaat muuttuja). Bootstrap optimismi korjattu AUC jossa otettiin huomioon koko miRNA luokittimen valintaprosessin (rangaistaan ​​Lasso logistinen regressio) oli 0,78.

Keskustelu

Huolimatta laajasta kehitysten kuvantamisen ja yhdistetyn hoitomuotoja, 5- vuoden pysyvyys keuhkosyöpään on parantunut vain vähän viime vuosikymmeninä [2]. Ei-invasiivisen, biomarkkereiden perustuva kerrostuminen alkuvaiheen keuhkosyöpään voitaisiin siis täydentää LDCT seulonta ja parantaa hoidon hallintaa. Olemme kehittäneet paneeli 24 plasma miRNA pystyy erotteleva alkuvaiheen NSCLC tapausten valvonta on korkea AUC 0,92 seulonnan jälkeen 754 miRNA 100 pienisoluista keuhkosyöpää ja 100 ei-syöpä yksilöitä. Tämä joukko miRNA tunnistettiin erittäin tiukat tilastollisia menetelmiä. Tietääksemme tämä on myös yksi suurimmista kartoitustutkimusten of miRNA plasmassa. Testit kuten nämä osoittavat useita etuja kliinisessä lukien ei vaadita invasiivisia näytekokoelmatodistuksen ( ”nestemäinen koepala”), edullisia verrattuna kuvantamismenetelmiä, suoraviivainen laboratoriomenettelyt ja sisällyttäminen paneelin biomarkkerit sijasta yhden miRNA.

Toistaiseksi useat tutkimukset ovat miRNA profiilit plasmassa ja seerumissa kehitetty diagnosoimiseksi NSCLCs [9-11,13-16]. Huolimatta hyvin lupaavia tuloksia nämä tutkimukset ovat osoittaneet melko pieni päällekkäisyyttä tunnistettu miRNA allekirjoitusten, ja perustuivat rajoitettu otoskoot /altaat näytteitä, jotka eivät mahdollistaneet arvioida, mikä vaikutus yhden potilaan geneettisen allas, tai käyttää ehdokas miRNA lähestymistapa löytö miRNA paneelin. Vaihtelu preanalyyttiset tekijät, kuten näytteidenvalmistusmenettelyitä, ja eri normalisointi strategioita tekee vertailun tutkimusten vaikeaa. Myös erot miRNA profiilien välillä seerumin ja plasman [14] voi selittää osan puuttuminen korrelaatio miRNA ekspressiotasoja välillä aiemmissa tutkimuksissa. Lopuksi kuvataan allekirjoitukset voivat poiketa niiden sisältämän lukuisia miRNA tavoitteet ja niiden mahdolliset irtisanomisia. Koska meidän tutkimuksessa arvioitiin eniten miRNA profiileja, pystyimme arvioimaan ennustearvo aiemmin raportoitu miRNA allekirjoitusten tietomme. Mielenkiintoista, vaikka pieni päällekkäisyys miRNA välillä ennustavia, eri potilasryhmässä, näytteen käsittelyyn, louhinta protokollia ja normalisointi menettelyt verrattuna aikaisempiin tutkimuksiin [9,10,13], suhteellisen korkea ennustearvo (AUC: +0,68-+0,78) of näiden miRNA paneelit havaittiin tutkimuksessamme (S1-S4 taulukot, S4 kuvassa), mikä korostaa mahdollisia kiertävän miRNA biomarkkereina keuhkosyövän havaitsemiseen. Meidän data, paras syrjiä NSCLC tapausten ja kontrollien todettiin, että 34-miRNA allekirjoituksen raportoineet Bianchi ja työtovereiden [9] osoittaa AUC 0,78 (95% CI: 0,72-0,84). Alempi ennustearvo havaittiin käytettäessä allekirjoitus riskin (kehitetty valmiiksi diagnostisia näytteitä) ja diagnoosi (kehitetty tapauskontrollitutkimuksessa) kuvanneet Boeri ja työtovereiden [10] ja äskettäin vahvistanut saman ryhmän [11] osoittaa AUC 0,71 (95% CI: 0,65-0,78) ja AUC 0,70 (95% CI: 0,63-0,76), vastaavasti. Lopuksi 10-miRNA paneeli määritelty Chen ja kollegat tuottivat AUC 0,68 (95% CI: 0,61-0,74), kun asennettu käyttämällä data [13].

Aiemmat raportit esiin kysymyksen siitä miRNA löydetty liikkeeseen peräisin kasvaimia. Teoriassa miRNA plasmassa tai seerumissa voivat olla peräisin kasvaimeen tai tulehduksellinen isännän vasteita. Koska miRNA tietojen kasvainkudoksen meidän näytesarja vertasimme paneeli 24 miRNA meidän ennustaja on ilmennetty eri miRNA AC ja SCC keuhkojen kautta saatuja analyysi Cancer Genome Atlas (TCGA) miRNA sekvenointitulosten ( https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Kaksitoista miRNA mukana meidän ennustaja myös muutettu TCGA tiedot joko histologia. Kuitenkin suunta yhdistyksen vastasi vain let-7c ja miR-218. Tämä viittaa siihen, että ennakoiva rooli plasman miRNA on riippumaton kudoksesta linjassa aiempien havaintojen Boeri ja työtovereiden [10].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös ehdottaneet, että merkittäviä eroja runsaasti mikroRNA biomarkkereiden raportoitu kirjallisuudessa voisi olla seurausta sisällyttämisen haemolyzed näytteiden [17-19]. Minimoida hemolyysin, käytettyjen näytteiden meidän tutkimuksessa seurattiin standardoituja protokollia ja käsiteltiin 2 tunnin kuluessa siitä hetkestä, verinäytteen. Lisäksi QC vaihe toteutettiin arvioida mahdollisia hemolyysi arvioimalla ekspressiotasot 10 aiemmin raportoitu hemolyysiä liittyvät miRNA, mukaan lukien miR-451, miRNA miR-16, miR-15b, miR-486-3p, miR-532- 3p, miR-886-5p, miR-636, miR-1255B, RNU48 ja miR-92a [17,19] kaikkien miRNA havaittu tutkimuksessamme. Emme havainneet merkittäviä eroja hemolyysiä liittyvien miRNA välillä keuhkosyöpää ja valvontaa meidän sarjassa paitsi miR-15b (p-arvo = 0,024) (S5 taulukko). Kuitenkin korjauksilla miR-15b on aiemmin raportoitu tuumorikudoksissa [20,21] ja miR-15b on ehdotettu seerumin biomarkkeri havaitsemiseksi NSCLC [22]. Lisäksi yksikään hemolyysiä liittyvien miRNA olivat läsnä meidän 24-miRNA ennustaja.

Tutkimuksemme on useita huomionarvoista vahvuuksia, kuten: huolellinen valinta potilaille, joilla on kaikki kliiniset tiedot, standardoidut ja yhtenäisen käsittelyn verinäytteiden 2 tunnin veren keruusta, ultrasentrifugointi jälkeistä jäätymisenesto- poistamiseksi kryopresipitaatti ja solu roskat, suuri otoskoko, suuri määrä miRNA analysoitu ja erittäin tiukan tilastollisen arvioinnin miRNA ennustaja. Tunnetut ennustavat keuhkosyövän joutuivat malleja tutkimuksessa riippumatta tilastollista merkitystä todella testata lisätään Lisäysarvo meidän 24-miRNA paneeli (kuvio 3).

rajoitus on, että johtuen oikeuskäytännön valvonta suunnittelu Tutkimuksemme, verinäytteitä kerättiin diagnoosia tehtäessä. Osittaiseksi korjaamiseksi rajoitteen teimme rajoittaa analyysimme alkuvaiheen NSCLC. Myös meidän tutkimus puuttuu ulkoinen validointi sarjassa. Puuttua tähän huoleen suoritimme sisäinen validointi käyttäen bootstrapping menetelmää, joka osoitti, että ennustearvo paneeli pysyy korkealla, kun niitä sovelletaan itsenäisen näytesarjan.

pienuus kypsä miRNA ja niiden sekvenssihomologia edeltäjä miRNA vaatii herkkä kvantitatiivisista analyysimenetelmistä. Käytimme nykyinen ”kultainen standardi” menetelmä mittaamiseen verenkierrossa miRNA. TaqMan miRNA Kortit käyttävät kohdespesifinen, varsi-silmukka käänteistranskriptioaluketta vastaamaan haasteeseen lyhyt pituus [23]. Vaikka korkea tarkkuus ja spesifisyys qRT-PCR-tekniikkaa, kukin miRNA ekspressiotaso mitataan voidaan vaikuttaa sekä systemaattinen kokeellinen harhaa ja tekninen vaihtelut mukaan lukien eroista näytteestä hankinta, vakauttaminen, RNA, ja näyte eroja. Tämän seurauksena datan normalisointi on kriittinen minimoida ”kohina”, ja saada biologisesti merkityksellistä tietoa ja kehittää miRNA-pohjainen biomarkkerit. Koska pysyvästi ilmensivät endogeenisen kiertävän miRNA toimimaan normalisoinnin valvonta, sekä tarkistaa herkkyyden tuloksemme useita normalisoinnin strategioita testattiin Tutkimuksessamme lukien kvantiili normalisointi, sijoitus normalisointi, geometrinen keskiarvo normalisointi, normalisointi endogeenisiin U6snRNA valvontaa ja ATH-miR-159a piikki-in eksogeenisen ohjaus. Perustuen alustavat data-analyysi tontteja, epävakaus endogeenisen ohjaus, ero runsaasti piikki-in vs näytteessä miRNA, päätimme quantile normalisoinnin valittiin analyysiin. Lisäksi vähentämiseksi sekoittavat teknisistä vaihtelu, kuten levy-to-levyyn vaihtelua ja vaihtelun vuoksi puhdistusta, jaoimme näytteitä niin, että diagnostiset muuttujat olivat tasapainossa suhteen päivään analyysin tai rekisterinumero ja satunnaistettiin kussakin päivä ja levy.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoittaa, että 24-miRNA paneeli on merkittävästi ja itsenäisesti liittyvät keuhkosyöpä seuraava analyysi nesteen koepala ja lisää keuhkosyövän ennuste pidemmälle myötävaikuttanut perustettu riskitekijöitä. Tutkimuksemme tulisi siten nähdä parhaillaan tutkimusta tarjoaa vahvan ja prediktiivisille miRNA paneeli tunnistaa läpi tiukan tilastollisen lähestymistavat lisävalidointia hyvin suunniteltu suurten mahdollisten ikäluokat ja seulonta kokeet. Jos nykyiset havainnot validoitu, sen odotetaan myötävaikuttaa merkittävästi kliinisen ja kansanterveyskäytännön ja voi johtaa tehokkaampaan keuhkosyöpää seulonta parantamalla ilmoittautuminen määrittelyperusteita jotka hyötyisivät lisäseulonta.

Potilaat ja menetelmät

Tutkimuskanta

Keuhkosyöpä potilaiden ja verrokkien rekrytoitiin IARC tapauskontrollitutkimuksessa koordinoitu Moskovassa vuodesta 2006 vuoteen 2012. Tapauksia tapaus syöpäpotilaille kerätty Venäjän NNBlokhin Cancer Research Centre ja Moskovan Clinical Oncology Dispensary palvelevat Moskovassa ja lähialueilla. Kontrollit rekrytoitiin yksilöiden vierailevat kaksi Moskova yleistä sairaaloissa sairauksien liity keuhkosyöpään ja siihen liittyvistä riskitekijöistä. Kaikki TET kunhan kirjallinen lupa ja haastateltiin.

Oheislaitteet veri kerättiin EDTA-putkiin aikaan haastattelun ja käsitellään mahdollisimman nopeasti (yleensä 2 tunnin kuluessa). Tapauksissa, veri piirtää suoritettiin ennen leikkausta ja mitään adjuvanttia hoitoa. Plasma näytteet eristettiin sentrifugoimalla kokoveri 2000xg 10 minuuttia huoneenlämmössä. Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa. Kaikki näytteet saatiin noudattaen Helsingin julistuksen ohjeita ja hyväksyi paikallinen Institutional Review Board ja IARC eettinen komitea. Yhteensä 100 keuhkosyöpää ja 100 kontrollia sisällytettiin (taulukko 1).

RNA: n eristämistä

Sulatuksen jälkeen plasmanäytteet sentrifugoitiin 16000 x g: ssä 5 minuuttia poistamiseksi kryopresipitaatti ja solujätteen . Kokonais-RNA eristettiin 300 ui plasmaa käyttämällä NucleoSpin miRNA Plasma kit (Macherey- Nagel, Düren, Saksa) mukaan valmistajan protokollan kanssa proteinaasi K Digest, lisäys 2 ug glykogeenin operaattorin ja DNAasilla sulattaa vaiheita. Kaikki näytteet piikki-in 10 pmol

Arabidopsis thaliana

synteettinen miR-159 a (syntetisoitu Eurofinsille MWG Operon, Ebersberg, Saksa) ohjaamaan vaihteluita RNA valmistusvaiheessa. Puhdistettu RNA pidettiin -80 ° C: ssa ennen kuin niitä käytettiin käänteistranskriptioon.

profilointi, jonka TaqMan Human MicroRNA Arrays

Expression tasot 754 miRNA (Sanger miRBase V14) kvantitoitiin käyttäen TaqMan Human MicroRNA Array A + B Card Set v3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) kohti valmistajan ohjeiden (mukaan lukien pre-vahvistus) (S1 Methods). Quantitative miRNA ekspressiotietojen hankittiin ABI 7900HT SDS ohjelmisto v2.4. Cycle kynnys (Ct, aikana, joka on ensimmäinen havaittavissa huomattava kasvu fluoresenssin) arvot asettaa käyttämällä ExpressionSuite ohjelmistoa (Applied Biosystems) ensimmäisessä 60 näytettä (automaattinen lähtötilanteessa ja kynnys) ja nämä kynnysarvot Ct käytettiin jäljellä sarja . Taqman Human MicroRNA Array kokeilut ovat MIAME yhteensopiva ja on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) alle liittymisen GSE64591.

tilastollinen analyysi

Tarkempi vertailuja tutkimuksen muuttujien tapausten ja kontrollien välillä käyttivät Chi-Square-testin kategorisen datan, ja Studentin t-testiä varten jatkuvan datan. Aineisto analysoitiin HTqPCR paketti [24] käyttäen R Bioconductor [25]. miRNA kanssa määrittelemätön Ct-arvoja yli 120 näytteet suodatetaan pois. Aineisto quantile normalisoida. Sen jälkeen normalisointi Ct-arvoja, joiden kvartiiliväli (IQR) on alle 1,5 ja endogeenisen valvonta poistettiin myöhempää analyysia, ja Limma analyysi suoritettiin tunnistamiseksi säädellään eri tavalla miRNA tapausten ja kontrollien välillä. Jossa Limma, yhden kertoma lineaarinen malli on varustettu kullekin miRNA sekä keskivirhe (SE) valvotaan käyttäen empiirinen Bayes malli johtaa moderoitu

t

-tilasto kunkin miRNA [26]. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Raportoimme myös oikaistu p-arvot korjattiin useita testejä käyttäen Benjamini-Holm menetelmä kontrolloida väärien positiivisten virhemäärä. Logistinen regressio kanssa suopunki rangaistus (jossa rangaistus parametri tuning suoritti 20-kertaisesti ristivalidointi) käytettiin valita paneeli miRNA erotteleva tapausten ja kontrollien välillä. Logistinen regressio malleja käytettiin arvioimaan, onko 24-miRNA paneeli liittyi keuhkosyöpä oikaistu tunnettu riskitekijä keuhkosyövän (ikä, sukupuoli ja tupakointi tila). Viljelyala vastaanotin toimii ominaiskäyrä (AUC) laskettiin arvioida erottelukykyä mallin. Sisäinen validointi valittuun malliin tehtiin laskemalla bootstrap optimismi-korjattu AUC. Tämä korjaus osuus overfitting mallin parametrit valittuun malliin. Lisäksi optimismia-oikea AUC laskettiin bootstrap koko mallin valintaprosessin. Tämä selittää overfitting sekä mallin valinta ja parametrien arviointi. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen STATA v11 (STATA, College Station, TX) ja R [25]. Kaikki esitetään p-arvot ovat kaksipuolisia.

tukeminen Information

S1 Kuva. Arvojärjestyksen 61 merkittävää ilmentyvät eri MikroRNA (p-arvo 0,05) keuhkosyöpäpotilaita verrattuna kontrolleihin.

NSCLC tapaukset on korostettu punaisella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s001

(TIF)

S2 Kuva. Optimaalinen lambda-arvo ja rajat validoitu virhe tontilta Lasso regressioanalyysimme.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s002

(TIF)

S3 Fig. Rasiakuvaajien 24 plasma miRNA sisältyvät paneelin keuhkosyöpäpotilaita ja valvontaa IARC tapauskontrollitutkimuksessa (2006-2012).

Mediaani pistemäärä on viiva keskellä laatikko ja 25

th ja 75

persentiili ovat alemman ja ylemmän osan ruutuun. Viikset ulottuvat äärimmäisissä piste enintään 1,5 kertaa kvartiiliväli pois laatikosta. Vieraat havainnot annetaan pisteinä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s003

(TIF)

S4 Fig. Arvio ennustearvo aiemmin kuvattu usean miRNA allekirjoituksia varhaisen havaitsemisen NSCLC potilaiden IARC tapauskontrollitutkimuksessa aineisto (2006-2012).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s004

(TIF)

S1 Methods. Täydentävillä menetelmillä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s005

(DOCX) B S1 Taulukko. Logistinen regressio ennustemallista kanssa microRNA paneelin ilmoittamat Bianchi F

et al

(2011) [9] arvioitiin IARC tapauskontrollitutkimuksessa (2006-2012).

Doi: 10,1371 /journal.pone .0125026.s006

(DOCX)

S2 Taulukko. Logistinen regressio ennustemallista kanssa microRNA paneelin ilmoittamat Chen X

et al

(2012) [13] arvioitiin IARC tapauskontrollitutkimuksessa (2006-2012).

Doi: 10,1371 /journal.pone .0125026.s007

(DOCX)

S3 Taulukko. Logistinen regressio ennustemallista kanssa 16-microRNA suhde allekirjoitus riskin ilmoittamien Boeri M

et al

(2011) [10] arvioitiin IARC tapauskontrollitutkimuksessa (2006-2012).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s008

(DOCX)

S4 Taulukko. Logistinen regressio ennustemallista kanssa 16-microRNA suhde allekirjoitus diagnoosin ilmoittamien Boeri M

et al

(2011) [10] arvioitiin IARC tapauskontrollitutkimuksessa (2006-2012).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s009

(DOCX)

S5 Taulukko. Arviointi hemolyysiä liittyvien miRNA keuhkosyöpäpotilaiden verrattuna valvontaa IARC tapauskontrollitutkimuksessa (2006-2012).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s010

(DOCX)

Kiitokset

Haluamme kiittää IARC Genetic Services Platform tarjota laboratoriolaitteet. Olemme kiitollisuudenvelassa jäsen Priscilia Chopard teknistä apua, tohtori Patrick van Uden hyödyllisiä kommentteja käsikirjoituksen ja haluaisimme kiittää kaikkia potilaita niiden osallistumista. Olemme myös kiitollisia henkilöstöä sairaaloiden, haastattelijat, data johtajat, patologian osastot, ja ensiapuasemien että tukenut tätä tutkimusta. Abstraktin esiteltiin 2014 vuosikokouksessa American Association for Cancer Research.