Krooninen sairaus

tiivistelmä

ERG-geenin uudelleenjärjestäytymistä löytyy noin puolet kaikista eturauhasen syöpiä. Toiminnalliset analyysit eivät täysin selitä selektiivinen paine aiheuttaa ERG uudelleenjärjestely kehittämisen aikana eturauhassyöpää. Tunnistaa transkription muutokset eturauhassyövän, mukaan lukien kasvaimia ERG-geenin uudelleenjärjestelyjä, suoritimme meta-analyysi julkaistiin geenien ilmentyminen tietojen seurasi vahvistukset mRNA ja proteiini tasoilla sekä ensimmäinen toimiva tutkimuksia. Kahdeksan ilme tutkimuksissa (n = 561) ihmisen eturauhasen kudoksia otettiin mukaan meta-analyysi. Transkription välisiä muutoksia eturauhasen syöpä ja ei-syöpä eturauhasen, sekä ERG toisiintuminen-positiivisia (ERG +) ja ERG toisiintuminen-negatiivinen (ERG-) eturauhassyöpä, analysoitiin. Yksityiskohtaiset tulokset pääsee läpi online-tietokanta. Me validoitu meidän meta-analyysi käyttäen tietoja omasta itsenäinen mikrosiru tutkimuksessa (n = 57). 84% ja 49% (fold-muutos 2 ja 1,5, tässä järjestyksessä) kaikista transkription muutosten välillä ERG + ja ERG- eturauhassyövän määritetty meta-analyysi tarkastettiin Validointitutkimuksessa. Valitut tavoitteet vahvistettiin immunohistokemiallisesti: NPY ja PLA2G7 (säädellään ylöspäin ERG + syövät), ja AZGP1 ja TFF3 (säädellä vähentävästi ERG + syövät). Ensimmäinen toiminnallisia tutkimuksia varten yksi merkittävimmistä ERG uudelleenjärjestely liittyvien geenien – neuropeptidi Y (NPY) – paljasti lisääntynyt glukoosin oton

in vitro

osoittaa mahdollista roolia NPY säätelyssä solujen aineenvaihduntaan. Yhteenvetona, löysimme vankka väestö riippumaton transkription muutoksia eturauhassyövän ja ensimmäiset merkit ERG uudelleenjärjestelyjä asiakkuutta aineenvaihdunnan muutoksia syöpäsolujen aktivoimalla suuren metabolisen molekyylejä kuten NPY. Tutkimuksemme osoittaa, että aineenvaihdunnan muutoksia mahdollisesti edistää selektiivisen paineen suositaan ERG uudelleenjärjestelyjä eturauhasen syöpä.

Citation: Massoner P, Kugler KG, Unterberger K, Kuner R, Mueller LAJ, Fälth M, et al. (2013) karakterisointi Transkription muutokset ERG Rearrangement-Positive Eturauhassyöpä Tunnistaa asetukseen Metabolinen Sensors Kuten neuropeptidi Y. PLoS ONE 8 (2): e55207. doi: 10,1371 /journal.pone.0055207

Editor: Hari Koul, University of Colorado, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 elokuu 2012; Hyväksytty: 27 joulukuu 2012; Julkaistu 4 helmikuuta 2013

Copyright: © 2013 Massoner et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa taloudellisen tuen Comet Centerin Oncotyrol (Project 3.1), autonomisen provinssin Bolzanon, Etelä-Tirolissa, (Grant 37 /40,3), Itävallan Science Fund FWF (Grant J3201), ja Tirolin Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: kun keskustelee Oncotyrol , Center for Henkilökohtainen Cancer Medicine GmbH, kirjoittajat haluavat paljastaa seuraavaa: PM, KU ja HK toteutetaan tätä työtä työntekijät /osakkuusyritysten Oncotyrol GmbH. Työ tämän hankkeen rahoittavat yhdessä Oncotyrol GmbH yhteydessä Itävallan COMET rahoitusohjelmaan. Oncotyrol GmbH ei aio jättää patentin tai kaupallisesti harjoittaa tulokset sisältyvät tähän käsikirjoitus. Näin ollen ei kilpailevia kiinnostusta voitaisiin tunnistaa yhteydessä kuvatun työn. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Noin puolet kaikista eturauhasen syöpiä satama geenin uudelleenjärjestely [1]. Viimeksi mainittu on muodostettu fuusioimalla 5 ”säätelyelementit androgeenin-säädellään geenin koodaavan alueen jäsen E kaksikymmentäkuusi (ETS) geeniperheen transkriptiotekijöiden.

ETS

uudelleenjärjestelyjä aiheuttaa androgeenista ajettava-ilmentyminen ETS transkriptiotekijöiden [1]. Yleisin ETS uudelleenjärjestely on translokaatiota androgeenisäädellyn transmembraaninen proteaasi seriini 2 (

TMPRSS2

) geeni, jossa v-ets erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin geeniin (

ERG

) transkriptiotekijä osuus on noin 85% kaikista ETS uudelleenjärjestely-positiivisten eturauhasen syöpiä [2] – [4]. ERG uudelleenjärjestely on varhainen tapahtuma Genesis eturauhassyöpää. Se on jo läsnä paikalliseen heikompilaatuisen eturauhassyöpä [5], [6] ja jatkuu metastaattisen ja kastraatio kestävä tyypit (CRPC) [1], [4], [7]. Varhainen ulkonäkö ja tiheä ERG uudelleenjärjestelyjä osoittavat valikoiva etu uudelleenjärjestely-positiivisten solujen eturauhassyövässä.

Toiminnalliset analyysit tähän mennessä ole säädetty tyhjentävä selitys selektiivisen paineen pakottaa ERG uudelleenjärjestelyn alkuvaiheessa eturauhasen syöpä. ERG uudelleenjärjestely tulokset ERG yliekspressio [1]. Jälkimmäinen raportoitu edistää syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota sekä solujen erilaistamattomuuden ja transformaatio [8] – [11]. Rooli ETS uudelleenjärjestelystä etenemistä eturauhassyövän ei myöskään ole selvitetty. Vaikka jotkut tutkimukset osoittavat yhdistyksen välillä uudelleenjärjestely-positiivisten syöpien, aggressiivisempia kasvaimia ja huono ennuste (eli [12] – [14]), toiset käyvät tällaista yhdistys (eli [15] – [17]); jotkut jopa ilmoittaa myönteisen ennusteen (eli [18], [19]). Meidän täytyy tietenkin lisätietoja ETS uudelleenjärjestely-positiivisia eturauhasen syöpiä, jotta voidaan ymmärtää biologiaan eturauhassyövän.

runsaasti geenien ilmentymisen tietojen on julkaistu vuodesta menettely ilmaisun analyysi käyttäen mikrosiruja perustettiin yli vuosikymmen sitten [20]. Nämä tutkimukset ovat raportoineet erilaisia ​​muutoksia geenien ilmentyminen liittyy erilaisiin sairauksiin, kuten eturauhasen syöpä. Validointi suuri määrä tietoja saatujen geenien ilmentyminen kokeiluja on haastavaa. Vain pieni määrä tunnistettujen ehdokkaat on toiminnallisesti validoitu. Nämä tiedot ovat suinkaan täydellinen ja silti sisältää paljon tietoa odottavat hyväksikäyttöä. Meta-analyysit sallivat yhteenlaskettu analyysin yksittäisistä tutkimuksista, jotka vaikuttavat vähemmän paikallisten havaintojen ja mahdollistaa datan vähennys saavuttaa kestäviä tuloksia.

Esitämme meta-analyysi julkaistiin geeniekspression tietoja tunnistamiseksi transkription muutokset eturauhassyövän. Lähestymistapamme mukana vertailun eturauhassyövän versus hyvänlaatuinen eturauhasen kudosta, ja ERG uudelleenjärjestely-positiivinen (ERG +) ja ERG uudelleenjärjestely-negatiivinen (ERG-) eturauhasen syöpiä. Me validoitu tulokset meidän meta-analyysin avulla tietojen riippumattoman mikrosirujen tutkimuksen ja vahvisti valitut kohteet immunohistokemiallisesti. Olemme myös suorittaa alustava toiminnallisia tutkimuksia varten yksi merkittävimmistä säännelty geenejä, nimittäin neuropeptidi Y (NPY). Tuloksemme osoittavat, että ERG-uudelleenjärjestelyjä mahdollisesti indusoida metabolisia muutoksia syöpäsolujen aktivoimalla suuren metabolisen molekyylejä kuten NPY.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet Kohorteissa

kudosnäytteitä käytetyt meta-analyysi on kuvattu toisaalla (tutkimukset ja viittaukset taulukko 1). Kudosnäytteitä validoimiseksi ilmaisun tutkimusta ja immunohistokemiallista tutkimusta valittu Innsbruck eturauhassyövän biopankissa. Tämä biopankki perustettiin aikana Tirolin varhaisen havaitsemisen ohjelma eturauhassyövän laitoksella urologian, Innsbruck Medical University [21]. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja dokumentoitu tietokannassa yliopistollisen sairaalan Innsbruckin kanssa lakisääteisten määräysten ja vaatimusten eettisen komitean Innsbruckin Medical University. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea on Innsbruckin Medical University (tutkimus ei. AM 3174, tarkistus 2). Kohorteissa analysoitu tässä olivat seuraavat: a) Expression analyysin validointitutkimuksessa; 57 eturauhassyöpäkudoksille; GSC 5 n = 1, GSC 6 n = 5, GSC 7 n = 36, GSC 8 n = 3, GSC 9 n = 11, GSC 10 n = 1; potilaiden ikä, keskiarvo ± keskihajonta (SD), 61,7 ± 6,9 vuotta; potilaiden seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) taso, 7,4 ± 5,0 ng /ml. b) immunohistokemiallinen tutkimus; 93 eturauhassyöpäkudoksille, GSC 5 n = 19, GSC 6 n = 22, GSC 7 n = 32, GSC 8 n = 10, GSC 9 n = 10; potilaiden ikä, keskiarvo ± keskihajonta (SD), 60,6 ± 6,4 vuotta; PSA taso, 6,6 ± 5,4 ng /ml.

Meta-analyysi

Valitsimme kahdeksan ilmaisun tutkimukset, jotka käsittävät 561 ihmisen eturauhasen kudosten, että meta-analyysi (taulukko 1, kuva S1). Ne on luetteloitu tietokantoihin Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [22], Array Express (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress) [23] ja Oncomine (https://www.oncomine.org) [24]. Kaikki tutkimukset suoritettiin käyttäen Affymetrix sirutekniikkaa.

integroiva analyysi microarray tietojen raakadataa, kuten tallennettu CEL tiedostoja, normalisoitiin käyttäen gcRMA algoritmia [25], [26]. Yksityiskohtaisia ​​tietoja tutkimus-erityisiä tietoja esikäsittelyä, katso täydentävillä menetelmillä. Jos haluat tehdä tutkimustenväliseen vertailu geeniekspressiotasot, platform-geenistä koetin-set tunnisteet kartoitettiin yhteiseen nimiavaruuden, kuten aiemmin on kuvattu [27], [28]. Tässä alustakohtaisia ​​tunnisteet kartoitettu Entrez geeni tunnisteiden avulla nykyistä probeset /Entrez kuvaukset alkaen BioMart kautta biomaRt paketti [29]. Aina kun enemmän kuin yksi anturi-sarja oli kartoitetaan Entrez geeni tunnisteen, koetin-asetettu korkein varianssi käytettiin analyysiin. Tunnistaa eri tavalla säännelty geenejä käytimme kaksivaiheista lähestymistapaa. Ensin johdetaan yhdistettynä p-arvot kaikissa tutkimuksissa käyttäen Fisherin käänteinen khiin neliö menetelmä [30]. Sitten lasketaan yhdistetty (painotettu) kertamuutoksia. Aiemmassa tutkimuksessa, kirjoittajat käytetään permutaatio testi arvioida merkitystä [27]. Me, toisaalta, johdettu informaatiota chi-neliön jakauman ehdotetulla tavalla [31]. Katso täydentäviä menetelmiä lisätietoja p-arvoista ja kertamuutosta laskelmat. Toiminnallinen merkintä klusterointi tulosten meta-analyysi suoritettiin käyttäen DAVID tietokantaa (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [32].

Validation Expression Analysis

Itsenäinen microarray data set (GSE32571) aiemmin tuottaman coauthors käytettiin validointi ERG liittyvän geenin allekirjoitus. Esillä analyysit, eturauhassyöpäkudoksille (n = 57) jaettiin ryhmiin ERG + ja ERG- käyttäen break-toisistaan ​​fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH) määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Kudosnäytteet eristettiin macrodissection 10 um kryoleikkeet. Kokonais-RNA eristettiin kanssa EZ1 RNA Mini Kit (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden, laatu tarkastetaan käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), ja määrällisesti. Kokonais-RNA valmistettiin hybridisaatio Illumina Human Sentrix-12 BeadChip paneelit (Illumina) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Illumina microarray data prosessoitiin käyttäen avoimen lähdekoodin putki ”Lumi” [34]. Sen jälkeen kvantiiliesti- normalisointi, ero geenien ilmentymistä määritettiin käyttämällä R paketti ”Limma” [35]. Yksityiskohtaiset menetelmät ja kliiniset tiedot ilmaisun validointitutkimuksen kuvataan muualla [36].

immunohistokemia

Tissue diat (n = 10) ja kudossiruina (TMA; n = 92; halkaisija 0,6 mm ), jossa syöpä (n = 3) ja hyvänlaatuisten (n = 1) ydintä eturauhasen kudoksen eturauhassyöpäpotilaalla käytettiin immunohistokemiallista analyysia varten. Kaikki kudosnäytteitä värjättiin ERG. Yhdeksän näytteet ulkopuolelle, koska niiden pienen määrän kasvainkudoksen. 24 kudosten osoitti hyvin heikkoa tai heterogeeninen ERG värjäys, kun taas 69 kudoksiin väli voimakkaille tai negatiivinen ERG värjäystä jaettiin ryhmiin ERG + ja ERG-, vastaavasti. 61 kudosnäytteitä käytettiin immunohistokemiallinen vertailun ERG + ja ERG-. Antigeeni haku ja immunohistokemia suoritettiin käyttäen Discovery XT automatisoitu slide-värjäys järjestelmä (Ventana Medical Systems). Kaikki kohde vasta testattiin testi kudos microarray sisältää eri ihmisen kudosnäytteitä. Immunohistokemiallinen värjäys arvioitiin kokenut uropathologist (G. S.). Optimaalinen antigeeni haku olosuhteita määritettiin kaikkien kohde vasta-aineita. Target vasta, toimittajat, artikkeleiden numeroita, ja pitoisuudet olivat seuraavat: anti-AZGP1, Sigma, HPA-012582, 01:50; anti-ERG, Epitomics, EPR3864, 1:100; anti-GPR116, IMGENEX, IMG-71635, 1:100; anti-neuropeptidi Y, Abcam, ab30914, 1:200; anti-PLA2g7, Sigma, HPA-0035915, 1:400; anti-HPGD, Atlas, HPA004919, 1:75; anti-TFF3, Strategic Diagnostics, 29940002, 1:5000. Antigeenin haku kaikkien vasta-aineiden suoritettiin kuumentamalla esikäsittely 98 ° C: ssa 1 tunnin ajan CC1, tris-pohjainen puskuri, jossa pH on lievästi emäksinen. Target vasta inkuboitiin 1 tunti 37 ° C: ssa, jonka jälkeen iView DAB havaitseminen (diaminobentsidiini visualisointi, Ventana Medical Systems) ja hematoksyliinillä counterstaining. Kuvat otettiin käyttäen Axio Imager M1 (Zeiss) ja TissueFAXS ohjelmistot (TissueGnostics). Kvantitatiivinen immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin käyttäen HistoQuest immunohistokemia analyysin ohjelmisto (TissueGnostics), joka on solu-pohjainen värjäytymisen intensiteetti analyysin työkalu, joka käyttää ydin- solun tunnistusmarkkerin (tässä tapauksessa hematoksyliinillä), jota seurasi kvantitatiivinen analyysi tietyn merkki leimattu eri väriä (tässä tapauksessa sytoplasmaattinen värjäystä diaminobentsidiinillä, DAB, ruskea).

soluviljelmäkokeita

DU145, DUCaP, LNCaP, PC3 ja VCAP ovat johdannaisia ​​eturauhassyöpäetäpesäkkeet. Nämä hankittiin ATCC ja viljeltiin mukaisesti ATCC suosituksia. EP156T ja RWPE-1 tehdään kuolemattomiksi hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen, kun taas CAF ja PM151T ovat eturauhasen stromasoluja [37] – [39]. Hyvänlaatuinen ja strooman soluja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [37] – [39]. Identiteetin syöpäsolulinjojen vahvistettiin oikeuslääketieteelliset DNA-sormenjälkien menetelmiä käyttämällä AmpFlSTR® SGM Plus® PCR-monistamisen Kit (Applied Biosystems).

Solut ympättiin 24-kuoppalevyille, seerumia, ja käsiteltiin 25 nM rekombinanttia NPY /24 h (Sigma) yhteensä 48 tuntia. Yhteensä solumäärät määritettiin käyttäen CASY solulaskijassa ja analysaattorin järjestelmän (Scharfe System). Glukoosi tasot mitattiin soluviljelysupernatantit käyttäen Gluc Cell glukoosiseurantajärjestelmä (Thermo Fisher Scientific). qPCR ja immunoblottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [40].

Tilastot

Tilastolliset laskelmat meta-analyysi ja validointi ilmaisun analyysi suoritettiin käyttäen R (http: //www.r-project .org), pakettien Bioconductor avoimen lähdekoodin bioinformatiikan tietokanta [41] ja toiminnot MADAM [42].

Tilastolliset laskelmat immunohistokemiaan ja soluviljelmäkokeita suoritettiin käyttäen SPSS 18 for Windows. Kolmogorov-Smirnov-testiä käytettiin tutkimaan normaalijakaumaa tietokokonaisuuksien. Non-normaalijakaumaa dataa ja tietoja Gaussin (normaali) jakauma analysoitiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testi ja Studentin t-testi, vastaavasti, jotta voidaan laskea merkitystä ryhmien välisiä eroja. P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä. Virhe palkit histogrammit esittävät keskihajonnan (SD) vähintään kolmen erillisen kokeen.

Tulokset

Meta-analyysi Julkaistu Gene Expression Tiedot eturauhassyövän

tutkia muutoksia geenien ilmentyminen ihmisen eturauhassyövän, suoritimme meta-analyysi julkaistiin geenien ilmentyminen tietoja. Kahdeksan itsenäistä microarray tutkimuksia otettiin mukaan meta-analyysi, joka koostui 561 eturauhasen kudosnäytteistä (taulukko 1). Seuraavat kaksi numeroa tutkittiin: a) vertailu geenien ilmentyminen eturauhassyövässä kudoksiin ja eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksia; ja b) vertailu geeniekspression ERG uudelleenjärjestely-positiivinen (ERG +) ja ERG uudelleenjärjestely-negatiivinen (ERG-) eturauhasen syöpiä (opintosuunnitelma kuvassa 1).

Meta-analyysi tehtiin kahdeksan itsenäistä geenien ilmentymisen tutkimukset keskittyvät ihmisen eturauhasen kudoksia. Kahdenlaisia ​​vertailevia analyysejä käytettiin. Geenit osoittaa säädellään eri tavalla ERG + ja ERG- eturauhassyöpäkudoksille validoitiin käyttäen riippumaton geenien ilmentymisen analyysi (ensimmäinen validointi) ja immunohistokemiallisella värjäyksellä (toinen validointi; vain valitut geenit).

tulokset meidän meta -analyysi on esitetty kuvioissa 2A-B, ja jotka on lueteltu taulukossa S1A-B. Tulokset meta-analyysi ja yksittäiset tutkimukset voivat myös olla nähtävissä verkossa osoitteessa https://prostatedb.eigenlab.net/. Sen lisäksi, että vähemmän konservatiivinen Chi-squared menetelmä, jota sovellettiin johtamiseksi yhteenvedon p-arvo [31], tietokannan luetellaan myös enemmän konservatiivinen yhteenveto p-arvo on johdettu jonka permutational lähestymistapa [27].

geenit säädellään eri tavalla eturauhassyövässä ja eturauhasen hyvänlaatuisesta kudoksen (A, C), ja ERG + ja ERG- eturauhassyöpäkudoksen (B, D). A-B) tulivuori tontteja. Differentiaalisesti säännelty geenejä korostettuna kun vähintään 2-kertainen alaspäin (vihreä) tai säädelty (punainen), ja oli oikaistu p-arvo on pienempi kuin 0,1. C-D) Graafinen kaavio kahdeksan kärkipään toiminnalliset klusterit määritetään toiminnallisen annotation klustereiden käyttäen DAVID tietokantaa. Koko klustereiden korreloi tunnistettujen proteiinien liittyy toiminnallinen merkintä (kertamuutosta 1,5). Kun proteiinit ovat läsnä useammassa kuin yhdessä klusterin, klustereiden on yhdistetty viivoilla. Paksuus yhdyslinjat kuvaa niiden proteiinien läsnä on kytketty sekä klustereita. Koskevat tiedot 561 kudosnäytteitä käytettiin meta-analyysissä.

ensimmäinen verrattuna eturauhassyöpäkudoksille kanssa eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksiin. Mitä geenit, jotka olivat vähintään 1,5-kertainen säännellyn ja paljasti säädetyn p-arvo 0,1, huomasimme, että 280 geenejä säädellään ylöspäin (46 heistä yli 2-kertainen), kun taas 275-geenit olivat alassäädetty (36 enemmän kuin 2-kertaisesti) eturauhassyöpäkudoksille verrattuna eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksissa (kuvio 2A, taulukko S1A). Toiminnallinen merkintä paljasti, että eri tavalla geenien (fold-muutos 1,5) koodi molekyylejä (transmembraaninen ja ekstrasellulaarinen viestintäproteiinit), rakenteellisia proteiineja (solun tukirangan ja soluadheesiota proteiinit) ja osallistuvien proteiinien proteolyysin ja haavan paranemista (kuvio 2C) . Proteiinien, joiden tiedetään olevan yhteydessä eturauhasen syöpään (esim AMACR [43], AGR2 [44], CRISP3 [45], HPN [46], HOXC6 [47], OR51E2 [48]), samoin kuin proteiinit, jotka eivät liity eturauhasen syöpään näin mennessä (esimerkit PPM1H, SLC4A4, CaMKK2) havaittiin meta-analyysissä.

sitten verrataan ERG + ja ERG- eturauhassyöpäkudoksille. Tietoa ei ollut saatavilla koskevat ERG uudelleenjärjestely tilan eturauhassyöpänäytteissä tutkimuksissa käytetty meta-analyysi. ERG uudelleenjärjestely aiheuttaa ERG yli-ilmentyminen ja havaitaan noin 50% kaikista eturauhassyöpäkudoksille [1], [3]. Jaoimme kaikki eturauhassyöpänäytteissä tutkimuksista mukana meta-analyysissä kolmeen ryhmään, jotka perustuvat niiden ERG ilmentymisen taso: ERG yli-ilmentymisen-positiivista näytettä, ERG väli näytteitä, ja ERG yli-ilmentyminen-negatiiviset näytteet (kuva S2). Jokainen ryhmä koostui kolmannes kaikista näytteistä yksi tutkimus. ERG yli-ilmentyminen-positiivista näytettä oletettiin olevan ERG uudelleenjärjestelyn-positiivisia ja merkitään ERG + luokka, kun taas ERG yliekspressio-negatiivisten näytteiden oletettiin olevan ERG uudelleenjärjestelyn-negatiivinen ja osoitetaan ERG- luokkaan. Näytteet määritetty ERG mäinen ryhmä jätettiin analyysin varmistaa tarkan vertailun ERG + ja ERG- eturauhassyöpänäytteissä. Käyttö ERG ilmaisun korvikkeena geeni uudelleenjärjestely-asema on kuvattu aiemmin [49] ja varmistettiin omissa microarray tutkimuksen alla kuvatulla tavalla. Vertaileva meta-analyysi paljasti 109 säädelty ja 58 alas geenien (fold-muutos 1,5; oikaistu p-arvo 0,1; 36 geenit olivat yli 2-kertainen säännelty) in ERG + verrattuna ERG- eturauhasen syöpä (kuvio 2B, taulukko S1B). Differentiaalisesti säännelty geenejä, jotka liittyvät toiminnallisten klustereiden signalointi (solunulkoinen signalointi peptidejä ja hormoni signalointi), tarttuvuus (soluadheesiota ja soluväliaineen proteiinien), ja puolustus vastaus (haavan paranemista ja tulehdusreaktio, kuvio 2D).

meta-analyysi paljasti muutoksia geenien ilmentyminen eri alaryhmissä kehityksen aikana eturauhassyöpää. Useat tutkimukset käsittävät riippumattomia potilasaineistoihin otettiin mukaan analyysiin. Siksi tunnistetut muutokset geenien ilmentyminen tarkoittavat väestössä-riippumattomia vaikutuksia liittyvät eturauhasen syöpään.

Meta-analyysi Validation Independent Expression Analysis

sitten validoitu tulokset meidän meta-analyysi. Keskityimme vertailuun ERG + ja ERG- eturauhasen syöpiä koska nämä alatyypit on kuvattu viime aikoina ja ei ole laajasti tutkittu toistaiseksi. Sillä validointi meta-analyysissä käytimme tietojen riippumattoman ilmaisun tutkimus suoritetaan vaihtoehtoinen lauseke platform (Illumina). Validointitutkimuksessa eroaa meta-analyysi tutkimukset seuraavat seikat: a) riippumaton potilaan kohortin (n = 57) valitaan Innsbruck eturauhassyövän biopankissa; b) vaihtoehtoinen geenien ilmentyminen tekniikka (validointitutkimuksella Illumina BeadChip matriisia; meta-analyysin tutkimuksista, Affymetrix GeneChip mikrosiruja); ja c) ERG + ja ERG- ryhmätehtävä (kuvio 3A). Meta-analyysissä, ERG + ja ERG- kudokset jaettiin mukaan ERG ekspressiotasoja. Validointitutkimuksessa ERG uudelleenjärjestely-asema määritettiin fluoresenssi in situ -hybridisaatiolla käyttäen break erilleen määritys kuten aiemmin on kuvattu [33] (kuva S3A).

84% kaikista geeneistä havaittiin differentiaalisesti säänneltävä ERG + ja ERG- kudoksissa (fold-muutos 2) on vahvistaa riippumaton lauseke tutkimus. A) Study ominaisuudet. B) ERG ekspressiotasot ERG uudelleenjärjestely-positiivinen ja -negatiivinen kudoksen validointitutkimuksessa. ERG uudelleenjärjestelyjä määritettiin fluoresoivalla in situ -hybridisaatiolla. C) geenit säädellään eri tavalla vuonna ERG + ja ERG- kudoksiin. D) Validoitu geenien meta-analyysi ja validointitutkimuksessa. P-arvo korjataan BH; Fisherin yhteenlaskettu p-arvo, Benjamini-Hochberg korjattu.

ensimmäinen vahvisti, että ERG uudelleenjärjestely johti ERG yli-ilmentyminen (kuvio 3B, kuvio S3A-C), mikä osoittaa, että ERG + ja ERG- ryhmät oikein osoitettu meta-analyysissä sekä validointitutkimuksessa. Sitten analysoimme ilmaus 155 geenien (12 geenit jätettiin puuttuvien tai tarpeeton koetin sarjat) tunnistaa näiden differentiaalisesti säädellä ERG + ja ERG- kudosten meta-analyysissä (FC 1,5; p 0,1). 49% (76/155) kaikista geenien havaittiin differentiaalisesti säänneltävä ERG + ja ERG- eturauhassyöpä meta-analyysi tarkastettiin Validointitutkimuksessa. Kun validointi analyysi rajoittui geenejä, jotka ovat säänneltyjä vähintään 2-kertainen meta-analyysissä, nämä oli 84% (27/32) (Kuva 3C-D, taulukko S2). Kun olemme analysoineet validointi ilmaus tutkimuksessa riippumaton tutkimus ja tutki kaikki geenit paneelit, nämä oli edelleen 20% ja 41% FC 1,5 ja FC 2, vastaavasti (taulukko S2). Välistä yhdenmukaisuutta meta-analyysi ja itsenäinen validointi tutkimus osoitti, että meidän meta-analyysi syntyy luotettavia tuloksia, jotka olivat riippumattomia näytteen kohortin näyte tehtävän, ja sen palveluksessa geeniekspressiota teknologia.

Protein Analysis käyttäminen Immunohistokemia

Tutkimuksemme oli keskittynyt mRNA ekspressiotasot asti tällä kertaa. Sitten tutkittiin, koodaamien proteiinien säädellään eri tavalla geenit sijaitsevat eri määriä ERG + ja ERG- eturauhassyöpäkudoksille. Valitsimme itsenäisen kudoksia (ei käytetä ilmaisua analyysi) päässä Innsbruck eturauhassyövän biopankki jotta edelleen varmistaa, että tutkimus paljastaisi yleinen ERG + eturauhasen syöpään liittyvien muutosten sijaan potilas-erot.

Jos haluat liittää kudosten ryhmät ERG + ja ERG-, päätimme ERG proteiinin tasot immunohistokemiallisesti käyttämällä vasta-ainetta aiemmin määritetty hakemuksen [50]. ERG immunohistokemia sallittu selvä ero ERG + ja ERG- kudoksiin. Suostumuksella julkaistaan ​​koskevat tiedot ERG + kudoksissa, värjäytymisintensiteettiä ERG vaihteli vahva heikko (kuva S4A) [50]. Jotkut kudokset näyttivät heterogeeninen ERG. Sekä ERG-positiivisia ja ERG-negatiivisten syöpäsolujen oli läsnä näissä kudoksissa (kuvio S4b). Värjäystä tarkastukset suoritettiin a) hyvänlaatuinen eturauhasen soluja, jotka ovat negatiivisia ERG (kuvio S4C, vasen kuva); b) endoteelisolujen ja lymfosyyttien, jotka tahra positiivinen ERG [50] ja muodostavat sisäisen värjäytymistä ohjaus (esimerkki kuvassa S4C, oikea kuva); ja c) solulinjat, jotka edustavat ERG + (VCAP) tai ERG- (DU145) eturauhassyöpä (kuvio S4d). Aiempien raporttien, noin puolet (tässä 60%) kaikista tutkittiin eturauhaskudoksiin ilmestyi ERG-positiivisia (tiivistelmä 93 eturauhassyöpätapauksia kuvassa S4E) [1], [3]. Heijastaa meta-analyysissä, kudoksista korkealla tai keskitason ERG värjäystä verrattiin kudoksiin negatiiviset ERG värjäys; kudoksiin heterogeeninen ja alhainen ERG värjäys suljettiin.

kuusi kohdegeenien alistettiin proteiiniin validointi:

GPR116

,

NPY

ja

PLA2G7

, kolme geenit yliekspressoitu ERG + kudoksissa, ja

AZGP1, HPGD

ja

TFF3

, kolme geeniä säädellä vähentävästi ERG + eturauhassyöpäkudoksille. Neljässä testattujen geenien, proteiinien tasot heijastuvat sääntelyä mRNA: iden: NPY ja PLA2G7 olivat säädellään ylöspäin ERG + kudoksissa kun AZGP1 ja TFF3 näytti alassäädetty (kuva 4). TFF3 on raportoitu differentiaalisesti säänneltävä ERG + kudoksissa [51]; Näin ollen vain 11 näytettä käytettiin vertailussa. Mukaisesti tietomme, PLA2G7 äskettäin raportoitu liittyvän ERG + kasvaimiin [52]. Proteiini tasoilla kohdegeenien

GPR116

ja

HPGD

ei muuttunut vertaamiseen ERG + ja ERG- eturauhassyövän (tuloksia ei ole esitetty). On edelleen epäselvää, välisten erojen mRNA ja proteiini tasoilla näiden kahden geenin heijastavat biologinen (eri sääntelyn mRNA ja proteiini taso) tai tekninen (vasta suorituskyky) vaihtelut.

) Jatkuva dioja eturauhasen kudosten kaksi edustavasta potilaasta. B) kvantifiointi kudosnäytteiden saatu 61 eri eturauhassyöpäpotilaille käyttäen Immunohistokemian kvantifiointitietokoneohjelmaa HistoQuest. HistoQuest ei erotella epiteelin ja strooman soluja. Erot värjäytymisen intensiteetti epiteelisoluissa ylittää erot näkyvät ruudussa-blotteja. Bar, 100 uM. Tilastot, Mann Whitneyn U-testi; *, P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

ERG-liittyvä ilmaiseminen NPY aiheuttaa Lisääntynyt glukoosin imeytymisen eturauhassyöpäsoluissa

saataisiin uutta tietoa roolista ERG-uudelleenjärjestelyjä eturauhassyövässä olemme tutkineet toimintoja säädellään eri tavalla geenien ERG + eturauhasen syöpäsoluja. NPY valittiin toiminnallista analyysiä. NPY on pieni neuropeptidi, jossa kuvattiin keskeisenä säätelijänä energiatasapainon ihmiskehossa (tarkistetaan [53]). Mittasimme glukoosin oton

in vitro

onko NPY aiheuttaa metabolisia muutoksia eturauhasen syöpäsoluja.

vahvistaneet NPY yli-ilmentymisen ERG + eturauhassyövän solulinjoissa käyttämällä qPCR ja immunoblottauksella. qPCR ekspressiotasot NPY paljasti korkeimman ekspression NPY mRNA: n ERG + solulinjoja DUCaP ja Vcap verrattuna muihin eturauhasen solulinjojen (kuvio 5A). NPY-proteiini ei ollut havaittavissa immunoblot ainoastaan ​​DUCaP ja Vcap (kuvio 5B). Kun käsitelty eturauhassyövän solut, jotka eivät ekspressoi endogeenistä NPY (DU145, LNCaP ja PC3) ja rekombinantti NPY (48 h, 25 nM), havaitsimme suuremman glukoosin sisäänottoa NPY-käsitellyissä soluissa kuin käsittelemättömissä soluissa (kuvio 5C). Tätä vaikutusta ei havaittu soluissa, jotka ilmentävät endogeenistä NPY (VCAP, kuvio 5C). Sen tutkimiseksi, ihmisen eturauhasen kudokset ovat potentiaalisesti NPY reagoivat vihdoin verrattuna ilmaus NPY ja NPY-reagoiva reseptorit NPY1R, NPY5R ja NPY2R (NPY affiniteetti sijalla, [54]) eturauhasen kanssa kuin muilla ihmisen elinten, käyttäen Oncomine tietokanta (https://www.oncomine.org) [24]. Huomasimme, NPY olla runsaampia hyvänlaatuisia ja syöpä- eturauhasen kudosta verrattuna hyvänlaatuisia ja syöpä- kudoksia, jotka ovat peräisin muista elimistä, kun NPYRs ilmaistiin samassa määrin eturauhasen ja muiden kudosten (edustaja tutkimukset on esitetty kuviossa S5). Niinpä useissa kudoksissa saattaa olla NPY reagoiva. Eturauhanen tuottaa kuitenkin merkittäviä määriä endogeenisia NPY. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että ERG-uudelleenjärjestelyjä eturauhassyövän liittyy erilaisia ​​transkription muutosten syöpäsoluissa, mukaan lukien ekspressio metabolisen antureita, kuten NPY.

NPY mitattiin qPCR (A) ja immunoblottaus (B ) eturauhasen solulinjoissa. NPY ilme oli eniten ERG + DuCAP ja VCAP syöpäsolujen. C) NPY stimulaatio (48 h, 25 nM) kasvoi glukoosin sisäänottoa eturauhassyövän solut, jotka eivät ilmennä endogeenista NPY (DU145, LNCaP, PC3). PC, eturauhassyövän solulinjoissa; BP, hyvänlaatuinen eturauhasen solulinjojen; PS, eturauhasen strooman solulinjat.

Keskustelu

Tämä tutkimus suoritettiin sen määrittämiseksi muutoksia geenien ilmentyminen eturauhassyövässä, jotka johtuvat yleisestä muutoksiin liittyvät eturauhasen ja riippumaton potilaan ikäluokat, tekninen vaihtelut, ja käytetyt menetelmät. Keskityimme transkription muutosten ERG uudelleenjärjestely-positiivinen (ERG +) eturauhassyöpä, koska nämä kasvaimet muodosti vähemmän tunnettu alaryhmä eturauhasen syöpiä. Odotimme tutkimuksen tulokset saatiin julkinen tietokanta geenien ilmentymisen muutoksia eturauhassyövän ja tarjota uusia oivalluksia biologia ERG + eturauhasen syöpiä. Havaitsimme, ensimmäistä kertaa, että ERG uudelleenjärjestelyt ovat mahdollisesti liittynyt metabolisia muutoksia eturauhasen syöpäsoluja.

meta-analyysi käsitti 561 kudosten peräisin kahdeksan itsenäistä tutkimuksista.