Krooninen sairaus

tiivistelmä

eturauhasen epiteelisolujen sekä normaalista ja syöpä kudoksia, viljellään kolmiulotteisia (3D) kulttuurin palloset, edustaa lupaavaa

in vitro

malleja tutkimuksen normaali ja syöpä -relevant kuviot epiteelisolujen erilaistumisen. Olemme kehittäneet laajimman paneelin pienoiskoossa eturauhasen soluviljelymalleissa 3D mennessä (n = 29), mukaan lukien monet ei-transformoituja ja useimmat nykyisin käytettävissä klassinen eturauhassyöpä (PRCA) solulinjat. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli analysoida morfogeneettisen ominaisuuksien PRCA malleja 3D, vertailla fenotyypit, geenien ilmentyminen ja aineenvaihdunnan 2D- ja 3D-kulttuureissa, ja arvioida niiden merkitystä prekliinisen lääkekehityksen, tauti mallinnus ja perustutkimusta. Ensisijainen ja ei-transformoitujen eturauhasen epiteelisolujen, mutta myös useita PRCA linjat, muodostuu hyvin erilaistunut kierroksen pallosia. Nämä osoittivat vahvaa solu-solu kontakteja, epiteelin polarisaatio, ontelo ja kattoi täydellinen tyvikalvon (BL). Useimmat PRCA linjat kuitenkin muodostunut suuri, huonosti eriytetty pallosia tai aggressiivisesti tunkeutuvat rakenteita. PC-3 ja PC-3M soluja, hyvin erilaistunut palloset muodostunut, joka sitten spontaanisti muuttuu erittäin invasiivisia soluihin. Nämä solulinjat voivat aiemmin tehty epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on tilapäisesti rajoitettu hyväksi epiteelin kypsymisen signaaleja soluväliaineen (ECM). Induktio rasva ja steroidien aineenvaihduntaan, epigeneettiset uudelleenohjelmointi, ja ECM remodeling edustaa yleistä mukauttamista 3D kulttuuriin, riippumatta muutoksen ja fenotyypin. Sen sijaan, PI3-Kinase, AKT, STAT /interferoni ja integriini signalointireitteihin olivat erityisen aktivoituna invasiivisia soluissa. Erityiset pienmolekyylisalpaajien kohdistettu PI3-Kinase estetty invasiivisia solujen kasvua tehokkaammin 3D kuin 2D yksikerrosviljelmässä tai kasvua normaalien solujen. Meidän paneelissa solumalleja, ulottuen laaja kirjo fenotyyppisten plastisuus, tukee tutkimus eri liikennemuotojen solumigraation ja kasvain morfologioita, ja on hyödyllistä ennakoivaa testaus syövän ja antimetastaattisia yhdisteitä.

Citation: Härmä V, Virtanen J, Mäkelä R, Happonen A, Mpindi JP, Knuuttila M, et al. (2010) Kattava paneeli kolmiulotteisia malleja Studies Eturauhassyöpä Kasvu, Invasion and Drug Responses. PLoS ONE 5 (5): e10431. doi: 10,1371 /journal.pone.0010431

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 tammikuu 2010; Hyväksytty: 31 maaliskuu 2010; Julkaistu: 03 toukokuu 2010

Copyright: © 2010 Härmä ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat myöntäminen Suomen Akatemian MN (nro 111597). Lisärahoitusta OK ja JV toimittivat FP6 ja FP7 Integroidut hankkeet PRIMA ja EPITRON Euroopan komissio. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kaksiulotteinen (2D) yksikerroksinen soluviljelmissä edustavat erittäin reductionist malleja epiteelisolujen ja epiteelin syövät, tappioiden fysiologisten soluväliaineen (ECM) keinotekoiset muovipinnoille, ja korkeat pitoisuudet seerumissa. Niinpä solut menettävät asiaankuuluvat ominaisuudet, kuten erilaistumista, polarisaatio, solu-solu viestintä ja soluväliaineen kontakteja, vaikka haavan paranemista, tulehduksellinen prosesseja, ja hyper-leviämisen keinotekoisesti edistetään. Yksikerrosviljelmässä eturauhassyövän (PRCA) linjat, homeostaasin erilaistumattoman kasvaimen kantasolujen avulla pohjapinta, kauttakulku-vahvistin- ja lopullisesti erilaistuneita, hormoni-herkkä onteloerityssolut riippuu soluviljelmässä olosuhteissa kalsiumin ja seerumin [1], [2] , ja vain huonosti edustaa tuumorisolun biologiassa in vivo. Puuttuminen asiaan tyvikalvon (BL), vialliset ECM laskeuma, ja puuttuvat strooman tai myoepithelial komponentteja [3] lisäksi keinotekoiseen luonteeseen. Tämän seurauksena tehokkain pienmolekyylisalpaajien yksikerrosviljelmissä ovat kemoterapeuttiset lääkkeet, jotka kohdistuvat leviämisen ja mitoosin. Tämä epätasapaino vaikuttaa köyhien ennustearvo yhdistettä efficacies välillä

in vitro

ja

in vivo

kokeita. Drug toimintaa, joka liittyy solu-solu-vuorovaikutus, kypsymistä epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja syövän kantasolut (CSC) on todennäköisesti jäädä havaitsematta. Sekä 3D arkkitehtuuri ja ECM aiheuttavat voimakasta vaikutuksia lääkeaineiden tehoon [4]. Rauhas epiteelisyöpäsolujen nopeasti sopeutua erilaisiin mikroympäristöihin ja voi dynaamisesti vaihtaa vaihtoehtoisia väyliä, jotka säätelevät lisääntymistä, erilaistumista ja selviytymistä.

lääkeresistenssin kehittymisen tai epäonnistuminen vastata kemoterapeuttisten edellyttää myös asianmukaisia ​​soluviljelymalleissa. Lääkeresistenssi usein johtuvan syövän kantasolujen (CSC) hypoteesi: antimitoottisena syöpälääkkeiden säästää hidas lisääntyvän, kasvaimeen uudistava Stern- tai progenitorisolujen [5] – [7], joka lopulta uudelleen muodostavat kasvain massa. Tämä voi olla samanaikainen EMT [7] – [10] ja lisääntynyt metastaattinen potentiaali [8]. Etsintä syöpälääkkeet on siis tullut uuteen vaiheeseen, jossa tutkijat yhä käyttää organotypic mallijärjestelmiin suoremmin tutkittavaa lääkettä tavoitteet monisoluisten organoids, usein rikastaa kantasoluja [11]. Asianmukaiset

in vitro

kokeellisissa malleissa soveltuvat analysointiin CSC homeostaasin, EMT, invaasio ja metastaasi, ovat yhä merkityksellisiä syöpälääkkeen löytö. Näitä on myös kustannustehokas ja riittävä läpimeno korkea pitoisuus seulontaan.

kulttuuri rauhastilavuus epiteelin (syöpä) solut puhdistetussa ECM, kuten kollageeni, hydrogeelit tai Matrigel, perustettiin yli kaksi vuosikymmentä sitten [12 ]. Matrigel edustaa rekonstruoitu, laminiini-rikas tyvikalvon, joka tukee prosesseja, kuten solun polariteetti, solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutus, ja uudelleen ilmentyminen erilaistumisen merkkiaineiden jopa transformoitujen linjat [13]. Rintarauhasen ja eturauhasen epiteelisolut pallosten muodostamiseksi, kutsutaan mammospheres [14], tai prostaspheres [15], vastaavasti. Normaalin eturauhasen epiteelisolujen erilaistumisen hyvin polarisoitunut ontto pallosia, tunnusmerkki toimiva, rauhas epiteelisolujen. Sama microenvironment tukee myös solujen vaeltamiseen, haarautuminen ja muodostumista ominainen acini [16], [17]. Sitä vastoin tuumorisolut yleensä näytä viallisen erilaistumista ohjelman, ja muodostavat epätyypillinen sferoidit sekavaa arkkitehtuuri, kuten on osoitettu merkittävimmin ja rintasyöpiä [18] – [20]. Geeniekspressiomalleja sferoidi- osoitettiin korreloivan ominaisuuden fenotyyppejä muodostettu 3D kulttuureissa [19], [20] ja yleistä erilaistumista ja aggressiivinen mahdollisuudet syöpien [21], [22]. Samanlaisia ​​normaaliin epiteelisolujen PRCA solut voivat myös aktiivisesti hyökätä ympäröivä matrigeelin, vaikka niiden tila muuttoliikkeen eroaa normaalista, kollektiivinen levy tai putki muuttokäyttäytymisen havaittu aluevaltaus normaalien solujen. Fenotyyppi syövän invaasio riippuu koostumuksesta ja tiheydestä ECM, ja voivat vaihdella amoeboid kupliminen, mesenkymaalisten fibroblastien kaltainen liikkuvuutta ja monisoluisten streaming tai ketjun muuttoliike [23], [24]. Luonnollisesti invasiivisia potentiaali riippuu myös geneettisestä taustasta PRCA solujen ja niiden (yleensä vaarantuu) kyky harjoittaa tiukat epiteelin solu-solu kontakteja. Rintarauhasen ja muut epiteelisyöpäsolujen muodostavat lieriön, kara kaltaisia ​​soluja, joilla on mahdollisuuksia tehdä sopimuksia ja venyttää, jolla tuetaan siirtymistä kautta ympäröivään ECM mesh. Paljon vähemmän tiedetään PRCA. Invasion avustaa proteolyyttisen prosesseja ja proteaasit, kuten katepsiini [25], matriksin metalloproteinaasien (MMP: t [24]), liukoinen erittämät tekijät fibroblastien tai läsnä fibroblastien itsensä [26], [27], ja muut tekijät, kuten fibronektiiniä ja lysyl oksidaaseja [26]. Tässä suhteessa, 3D-malleja tuumorisolun invaasiota [28] edustavat solujen dynamiikka ja arkkitehtuuri kasvainten paljon parempi kuin 2D yksikerrosviljelmiä, jossa solut leviävät ja liitää muovipintaan. Mahdollinen läpikäymään EMT ja hankkia mesenkymaalisten maahanmuutto tilat on toinen parametri oletetaan lisäävän rintojen ja punasoluaplasiassa hyökkäyksen ja liikkuvuutta [29].

Lisäksi on epäselvää, PRCA palloset, varsinkin kun kasvatetaan lrECM , osoittavat rikastaminen CSC väestön (joka liittyy usein EMT), tai kehittää vastustuskyky kemoterapeuttisia aineita ja ionisoivaa säteilyä [30], [31]. Ainakin osallistumista CSC: n tai EMT voisi odottaa näyttämään aivan eri erottamaan 3D kulttuureissa LrECM verrattuna kelluvan prostaspheres ja 2D yksikerroksista olosuhteissa [32]. Viimeksi ei vähäisimpänä, soluviljelymalleissa kasvainsolujen invaasio hetkellä vain muutamaan laajalti käytetty, mahdollisesti keinotekoinen määritykset (siirtokuoppaan invaasio määritykset, scratch-haavan muuttoliike määritykset). Koska hyökkäys on täysin erilainen alle 3D olosuhteissa tahansa edustavassa 3D hyökkäyksen mallit edustavat todellinen uutuus [26, 28, ja 33].

Tässä raportoidaan kehittämistä ja morfologiset luonnehdinta pienoiskoossa 3D soluviljelymalli järjestelmiä hyödyntäen paneeli 29 eturauhasen solulinjoissa. Valikoima edustavimmat linjat sitten lisäksi tunnusomaista genominlaajuisten transcriptome analyysejä ja systeemibiologian tunnistaa keskeiset polkuja, molekyylejä, geeni verkkoja, ja otaksuttu lääkekohteiden kriittinen kasvun ja invaasion pahanlaatuisten PRCA soluja. Lisäksi bioinformatiikan kuva analyysityökaluja määrällisesti dynaamisia fenotyyppisen ominaisuuksia, kuten invasiivisia rakenteita, pallojakaantuminen muoto tai huumeiden vasteita on kehitetty.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja yksikerrosviljelyissä

Solulinjat hankittiin ATCC tai pyydetty alulle laboratorioista (Taulukko S1). Normaali epiteelisolujen ja johdannaiset (PrEC, EP156T, RWPE-1, RWPE-2, RWPE-2 /W99, WPE1-NB14, PWR-1E, PZ-HPV-7: n ja CA-HPV-10) viljeltiin Keratinosyyttien Serum- free Medium (KSFM, Gibco), jota oli täydennetty 12,5 mg /l naudan aivolisäkeuutteella ja 1,25 ug /l EGF. 3D-viljelmät, 2% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco) lisättiin. Useimmat punasoluaplasia linjat viljeltiin RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. MDA-PCa-2b: n ja NCI-H660-soluja viljeltiin Hamin F12-alustassa (Gibco), 20% FBS: ää, 25 ng /ml choleratoxin, 10 ng /ml EGF: ää, 5 uM fosfoetanoliamiini, 0,1 ng /ml hydrokortisonia, 45 nM seleenihappo- ja 5 ug /ml insuliinia (kaikki Sigmalta). Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa standardeissa soluviljelyolosuhteissa (5% CO2, 95% kosteus). Identity solulinjojen varmistettiin arrayCGH (vertaileva genominen hybridisaatio) on Agilent 244 k ihmisen genomia paneelit, kun 10-15 kohdat sisälsivät soluja lopetettiin.

miniatyrisoituja 3D kulttuureissa.

Solut upotettu välillä kaksi kerrosta Matrigel päällystämättömän Angiogeneesi μ-kalvot (Ibidi Gmbh, Saksa): pohja kuopat täytettiin 10 ui Matrigel /elatusaineeseen (01:01; 50%) ja polymeroitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Soluja ympättiin sitten 20,000 solua /ml (tiheys ~1000 solua /kuoppa). Sen jälkeen kun kiinnitys (1-2 tuntia 37 ° C: ssa), solut peitetään toisella kerroksella Matrigel /elatusaineeseen (01:04, 25%), sen annettiin polymeroitua yön yli 37 ° C: ssa. Solujen viljelyväliaine vaihdettiin joka toinen päivä.

3D bulk kulttuureissa RNA.

Prostaspheres viljeltiin Millicell roikkuu soluviljelmässä lisätään 1,0 mikrometriä PET läpinäkyvä kalvoja (Millipore) 6-kuoppaisille (Costar). Kalvoja esi-päällystettiin matrigeeliin /väliainetta (01:01), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan, jotta kiinnitys kalvoon. Solususpensio sekoitettiin 01:04 kanssa matrigeeliä, siirretään päällystetty hyvin, ja polymeroitiin yön yli 37 ° C: ssa. Soluja syötettiin joka toinen päivä tuoreella alustalla alta.

Solun kiinnitys, immunofluoresenssilla merkintöjä ja kuvantaminen.

miniaturized 3D viljelmät kiinnitettiin sisällä mikrokuoppia käyttäen 4% paraformaldehydi, täydennettynä 0,8% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 5 mM EGTA: ta ja 1 mM MgCl

2 15-20 minuutin ajan RT: ssä. Kiinteä viljelmät pestiin 3 kertaa PBS: llä ja blokattiin 1 tunnin ajan 20% hevosen seerumia. Viljelmiä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden (lueteltu taulukossa S2), pestiin PBS: llä ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 4 h sekundaarisia vasta-aineita ja Hoechst tumaväriä (1:5000).

3D rakenteet värjättiin Calcein AM elävien solujen väriaine (Invitrogen). Konfokaaliset kolmiulotteisia kuvia otettiin käyttäen Zeiss Axiovert 200 M pyörivät levyn konfokaali yksikkö Yokogawa CSU22 ja Zeiss Plan-Neofluar 5 x tavoite. Z-pinot hankittiin askel koko 19 pm. Intensiteetti ennusteet luotiin SlideBook 4.2.0.7 ja NIH ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/), lisäksi analysoitiin VTT Acca ohjelmisto (herkkyys 10, kynnys 5, rakenteita alle 500 pikseliä alueella /koko suodatettua out). Rasiakuvaajien visualisoitiin R. 20x faasikontrasti- Viivästys kuvat hankittiin Incucyte (Essen välineitä), esikäsitellyt kanssa ImageJ ja analysoitiin VTT Acca (herkkyys 30, kynnys 5, rakenteita alle 1000 pikseliä alueella suodatetaan pois) .

RNA ja microarray.

3D bulk viljelmät pestiin jääkylmällä PBS: llä, kalvoja leikattiin veitsellä ja pallosia siirrettiin 6-kuoppaisille levyille. Geelit sekoitettiin voimakkaasti 9 ml: lla 5 mM EDTA PBS: ssä, siirretään 15 ml: n Falcon-putkiin, ja niitä inkuboitiin pöydälle keinuvivun 45 min irtoamisen Matrigel. Prostaspheres sedimentoitiin sentrifugoimalla ja lyysattiin RLT-puskuria (Qiagen). Solut kasvatettiin yksikerroksisessa lyysattiin 90% konfluenssiin, suoraan 10 cm soluviljelymaljoille käyttämällä RLT-puskuria. Kokonais-RNA (biologisista toistoa) uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen), mukaan valmistajan protokollaa. 300 ng RNA monistettiin Ambion n Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit. IVT reaktio suoritettiin yön yli (-16 h), jotta saadaan riittävä biotinyloidun cRNA. RNA ja cRNA pitoisuudet mitattiin nanodrop ND-1000, yleinen laatu seurattiin BioRad Experion elektroforeesi asemalle. 750 ng cRNA hybridisoitiin on Illumina n Sentrix HumanRef-8 v3 BeadChips, 58 ° C: ssa yön yli. Hybridisoituun cRNA havaittiin 1 mg /ml Cyanine3-streptavidiini (GE Healthcare Biosciences), ja taulukot skannattiin Illumina BeadArray Reader. Aineisto laatu tarkastetaan ja purkaa käyttäen Illumina GenomeStudio ohjelmistoa, ilman normalisointi tai tausta vähennyslasku.

Microarray data-analyysi.

Raaka microarray tiedot olivat kvantiiliesti–normalisoitu käyttämällä Bioconductor R paketti ”beadarray”. Normalisoitu tietoja jatkokäsitellään käyttämällä varianssi ja intensiteetti suodatin. Tilastollinen analyysi ero geenin ilmentyminen suoritettiin käyttämällä Limma ja lumi R /Bioconductor paketteja. Kynnys ero ilmentyminen oli q 0,05 jälkeen Benjamini-Hochberg useita testaus korjauksen. Normalisoitu Illumina geenien ilmentyminen tietojen koko paneelin kokeiluja on toimitettu GEO (Geenien ilmentyminen Omnibus) kuin tutkimuksessa GSE19426.

Data käytettiin sitten kahdessa eri tilassa: arvioimaan suhteelliset muutokset geenien ilmentymisen 2D- ja 3D kokeissa tai eri ajankohtina 3D kulttuuri, tarkoittaa normalisoidut arvot 3D vähennettiin keskiarvoista toistojen 2D yksikerrosviljelmässä ja lasketut. Log (2) muunnettava 2D /3D-suhteet käytettiin sitten klusterointi ja heatmap sukupolven (Cluster 2.11 ja TreeView 1,60, Stanfordin yliopisto), ja geeni ontologian analyysi (GO, DAVID, https://david.abcc.ncifcrf.gov/) . K-means klusterointi käytettiin vetää edustava lämpökarttoja perustuu 2D /3D-suhde tiedot, tuottaa 12 solmua (100 toistojen). Gene Set Analysis (GSA) paketin R käytettiin määrittämään merkittävästi rikastettu geenin luokkia, tässä ”Maxmean” tilastoja käytettiin laskemiseen rikastamiseen tulokset, ja permutaatio perustuu p-arvot olivat peräisin 1000 bootstrap jäljittelee. Väärä löytö määrä (FDR) korjausta sovelletaan myös mittana merkitystä. Gene sarjaa käytetään analyysiin saatiin Molecular allekirjoitukset Database (MSigDB, Broad Institute), kuten sijoitteluun, kuratoinut, koekspressoimalla naapurustossa, GO, ja evolutiivisesti konservoituneita transkriptio-tekijä tavoitteita.

Toiseksi normalisoitu mutta muuten un-käsitellyt geenien ilmentyminen tietoja käytettiin määrittämään geenin allekirjoituksia, jotka korreloivat ilmiasun (pyöreä /normaali, massa, stellate fenotyyppi). Pääkomponenttianalyysi (PCA) ja piirtämisen informatiivinen geenien korreloi sferoidiviljelmiä morfologit tehtiin perustuu erikoistunut R skriptejä. Geenit edustaa suurinta prosenttiosuutta varianssin valittiin perustuvat ANOVA.

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ja yhdisteen valinnan.

Differentially ilmaistaan ​​geeniryppäät (2D /3D-suhteet) oli ladattu IPA suorittaa geeni verkkoanalyysejä ja tunnistamiseen mahdollisesti informatiivinen keskeinen ”hub” geenejä. Erityiset pienmolekyylisalpaajien tiettyjä navat tai keskitin geenejä ja polkuja hankittiin TOCRIS ja SIGMA-Aldrich (katso alla). Muita ja riippumattomista lähteistä huumeiden /kohdetiedot myös hyödyntää samaan tarkoitukseen (drugbank, https://www.drugbank.ca, Matador https://matador.embl.de).

RT-PCR validointi.

2 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio Invitrogen Superscript II käänteistranskriptaasilla 50 ui. cDNA: t laimennettiin 1/10. QRT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena kanssa 7900HT Fast Sequence Detection System (Applied Biosystems) 96-kuoppaisilla tai 384-kuoppalevyformaatissa, 8 ul /kaivo. PCR-alukkeet ja koettimet on suunniteltu perustuen Roche Universal Probe Library, oligonukleotidit tilattiin Sigma-Aldrich. Alukkeita käytettiin 300 nM, koettimet 100 nM pitoisuus; 2x TaqMan® Universal PCR Master Mix. PCR-ajojen analysoitiin käyttäen Applied Biosystems SDS-ohjelmisto.

Protein lysaattia mikrosiruja (LMA).

Prostaspheres kerättiin päivinä 3, 6, 8, 10 ja 14; mukaan seuraavalla tavalla: mikrokuoppia pestiin PBS: llä, Matrigel sekoitetaan jääkylmällä 5 mM EDTA PBS: ssä, siirretään V-pohjaisille 96-kuoppalevylle (Greiner), ja inkuboitiin jäällä pöydälle-ravistimessa 30 minuuttia. Pallosia sentrifugoidaan ja lyysattiin LMA-puskuria (0,2% SDS, 100 mM Tris, 10 mM DTT). Yksikerrossoluissa kerättiin LMA-puskurissa 90% konfluenssiin 10 cm: n maljoilla. Kunakin ajankohtana, kaksi biologista rinnakkaisnäytteiden painettiin yhteen array. Tulostus, värjäys, skannaus, tausta vähennyslasku, normalisointi suhteessa p-aktiini-signaalin, ja tietojen analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [34].

Western-blottauksella.

Proteiininäytteet viljelmän kuopat kerätään kuvattua microwell levyt, ja lyysattiin WB-puskurissa (25 mM Hepes pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,3, 0,5% Triton X-100, 20 mM β-glyserofosfaatti, 100 uM vanadaatti, 0,5 mM PMSF ja 1 mM DTT). Proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin menetelmällä, ja proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla esivalettuja Hakulaite geelejä (Lonza), siirretään Protran nitroselluloosa- siirto kalvo (Whatman), ja blotattiin ensisijaisen vasta taulukossa S3. Multiplex inkubointi kolmen vasta käytettiin sijoittaa pienten kokonaismäärä proteiinien uutettu miniatyrisoituja kulttuureista. Vasta-aineet havaittiin Alexa infrapunaväri konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (Invitrogen), ja kalvot skannattiin Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).

lääkehoitojen 3D.

yhdisteitä tilattiin SIGMAsta tai Tocris Inc., ja liuotetaan sopiva ajoneuvo (DMSO, etanoli, 1x PBS) mukaan valmistajan ohjeiden. Rekombinantti ihmisen kemokiinit, sytokiinit, ja toiminta-estävien vasta-aineiden tilattiin R muodostuminen asiaan monisoluisten rakenteita tuetaan. Sferoidiviljelmiä muodostuminen Matrigel oli tyypillisesti aloittanut yksittäisiä soluja. Pallojen muodostunut Matrigel yleensä putosi neljään morfologiset luokkiin, muokattu [19], [35] (Kuva 1, Kuva S2).

Useimmat rakenteet joutui luokkiin pyöreä, massa, stellate tai grape- pitää. Jotkin solulinjat eivät muodostamaan rakeita Matrigel mutta jatkui yksittäisinä elävien solujen jopa kaksi viikkoa (single fenotyyppi). Useimmat sferoidit oli kuvattu päivinä 9-10 inokulaation jälkeen. PC-3 pallosia, on esitetty pyöreinä fenotyyppi päivänä 9, läpikäyvät muodonmuutoksen invasiivisia /stellate fenotyyppi päivänä 13. Sama tapahtuu PC-3M on sitä ennen (päivä 5-8).

Haaroitus /Round fenotyypin.

Normaali ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen (PrECs) ja ei-transformoituja linjat kuten RWPE-1 ja EP156T solut muodostivat kierroksen pallosia jälkeen 6-10 päivää viljelmässä (kuvio 1). Normaali PrECs ja in vitro kuolemattomia solulinjoja, kuten RWPE-1 ja PWR-1E-solut samanaikaisesti muodostuu haaroittumista acinar ja pyöreä pallomainen rakenteita, aktiivisesti siirtyä ympäröivään ECM muodossa suuria soluaggregaatteja (kuvio 2a-d). EP156T solut osoittivat vähän tai ei lainkaan haaroittumista rakenteita. Pyöreä rakenteet yleensä kehitetty vankka tyvikalvon (BL), kapselointi sekä sferoidit ja basaalisoluissa rakenteet (kuvio 2, kuvio S2, Kuvio 3g-m). Yllättäen tuumorilinjoja DU145, PC-3 ja PC-3M solut muodostivat myös pyöreä ja hyvin eriytetty, polarisoitunut pallosia (kuvio 2e), jota ympäröi täydellinen BL, ja usein sisältää ontelon (PC-3, kuvio 3e + r) . Lisäksi PC-3 pallosia monesti sisäisen solu- massa muistuttaa rakenteiden nähdään PIN (eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasioihin). Immuuni värjäys tiukka risteyksen proteiinien, kuten ZO-1 (ei kuvassa) ja F-aktiini (kuva 3a-c) osoittivat yleisesti erittäin vahva solu-solu kontaktien ja solujen polarisaatio kierroksella pallosia muodostama sekä normaaleissa että kasvainsoluissa.

A) Faasikontrasti- kuva haarautuvia rakenteita muodostetaan RWPE-1-soluissa, B) acinar muodostama rakenne RWPE-1 värjättiin vasta-aine B1-laminiinin. C) Haaroitus tai klusterin kaltaisia ​​rakenteita muodostuu ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen (PrEC). D). Mixed haarautuminen ja massan fenotyypin rakenteet muodostama PWR-1E soluissa. E) Round muodostuneet PC-3-solut päivänä 9, elävien solujen värjäytyminen calcein. F) Morfologiset muutosta kierroksen pallosia osaksi invasiivisia rakenteisiin päivänä 13. G) Phase-kontrasti kuva invasiivisen PC-3 rakenteiden ympärillä päivä 13. H). Värjäys PC-3 filopodia vasta-aineen kanssa, joka on spesifinen aktiivinen muoto integriinin beeta 1 (ITGB1), joka kuvaa tiheä koriste tappimaisen solun rakenteita.

Alexa488-leimattua phalloidin havaitsemiseen käytettiin F aktiini ja Hoechst tahra merkitä ytimet (sininen). RWPE1, DU145 ja PC3-solut osoittavat ilmentymistä EMT liittyvien mesenkymaalisten markkereita, riippumatta fenotyypin (PC-3-solut; kierros päivä 9, stellate päivänä 14).

Mass fenotyyppi.

suurin osa PRCA (LNCaP, 22rV1, MDA-punasoluaplasian 1, UM-SCP1, CWR-r1, LAPC-4) ja kaksi

in vitro

muuttaneet linjat (PWR-1E, RWPE-2) syntyy suuria, epäsäännöllisiä sferoidit usein puutteellisia tai puuttuvat BL, myös puuttuu ontelo (kuvio 3d + k). PWR-1E oli ainoa massa-fenotyypin solulinja kykenee haarautuvia /asinussolujen morphogenesis (kuvio 2d). Luminaaliselle keratiineista KRT8 ja KRT18 olivat aina vahvasti esille (taulukko S3). Solu-solu kontakteja, kypsymiseen ja polarisaatio olivat yleensä vähäisempiä verrattuna pyöreä sferoideja, heijastuu usein munuaisen muotoinen epäsäännöllinen pallosia (kuvio 1). Mass fenotyypin rakenteet ei yleensä näy invaasio lrECM; kuitenkin, muodostuminen filopodia tai valejalka johdonmukaisesti havaittu 22rV1 ja toisinaan LNCaP ja RWPE-2 solulinjoissa. LNCaP sferoidit solut havaitaan usein jättämään pallomainen rakenteiden sivustoja epätäydellisen BL kattavuus (kuva S2).

Grape-kaltainen fenotyyppi.

Vain yksi solulinja, 1013L, muodosti jatkuvasti löysä klustereita solujen erityisen huono solu-yhteydet, joilla ei ole mitään BL. LAPC-4-solut muodostivat sekä massan ja rypäleen kaltaisia ​​rakenteita. Ei invasiivisia ominaisuudet havaittu näissä solulinjoissa.

säteittäisen ”invasiivinen” fenotyyppi.

in vitro transformoitujen solulinjojen RWPE-2 /W99, WPE-1 /NB14, ja tuumorilinjoja ALVA-31 ja ALVA-41 muodostetun säteittäisen tai invasiivisia rakenteita, tunnettu siitä, että kara-, kuten filopodia (kuvio 2g) ja nopea migraatio soluketjuja läpi ympäröivän ECM. Invasiivinen muodostamat rakenteet olivat lähes yksinomaan monisoluisten ja osoitti ketjumaisen invaasio tilassa. Fibroblastien kaltainen mesenkymaaliset hyökkäys yksittäisten solujen havaittiin vain satunnaisesti.

in vitro

transformoituja linjoja RWPE-2, RWPE-2 /W99 ja WPE1 /NB14 samanaikaisesti muodostuu stellate rakenteita ja pyöreä pallosia, mikä osoittaa, heterogeeninen koostumus näistä solulinjoista. Näiden, RWPE-2 /W99 edusti solulinja parhaiten yhteen stellate fenotyyppi, ja valittiin lisäkokeita. Kuolemattomiksi eturauhasen stroomasolut (WPMY-1) ja tuumorista peräisin, ensisijainen stroomasolut (ei esitetty) on myös muodostettu stellate kaltaisia ​​rakenteita, kuitenkin puuttuvat nopea motiliteettia ja invasiivisia ominaisuuksia.

Invasiivinen kytkin.

Pyöreä ja hyvin eriytetty, polarisoitunut sferoidit muodostettiin PC-3 ja PC-3M soluja, mutta koki spontaani suuntautumista invasiivisia morfologia noin 10-13 6-8 päivää 3D, vastaavasti (kuvio 2e + f, lisänä invaasio elokuva S1). Puhkeamista morfologisen muuttumisen stellate, invasiivisia fenotyyppi oli riippuvainen solutiheyteen. Transformation voitaisiin tilapäisesti viivästyä ja jopa osittain palautuivat kun ruokinta tuoretta alustaa, mutta lopulta edistyi kunnes kaikki rakenteet perusteellisesti muuttaneet ja vain tähtisolut rakenteet pysyivät (kuvio 2g). Invasiivinen rakenteet ja filopodia muodostunut jo ennen hyökkäystä voimakkaasti ilmaisi aktiivinen muoto laminiinien-reseptorin integriinin beeta 1, mikä osoittaa vahvaa kontakteja soluväliaineen edellytyksenä invasiivisia prosesseja (kuva 2h). Samalla BL transformoitujen rakenteiden yhä sumea ja ne hajosivat (kuvio 3m). Voimakas ilmentyminen mesenkymaalisten merkkiaineiden vimentiinista VIM ja fibronektiinin FN1 (Kuva 3o-y), havaittiin ei-invasiivisia RWPE-1 (heterogeeninen) ja DU145, mutta myös PC-3-solut, ei korreloinut stellate fenotyyppi. Lisäksi ilmaus VIM ja FN1 ei kasvanut muun invasiivisen muutosta PC-3 ja PC-3M soluissa (kuvio 3s + y) B

”Single” fenotyyppi.

Jotkut syöpälinjojen ( VCAP, DuCaP, NCI-H660 ja MDA-PCa 2b) ei pallosten muodostamiseksi, mutta jatkui yksittäisinä soluja ( ”single” tai ”yksikössä fenotyyppi”) ja jopa 2 viikkoa. Mielenkiintoista, kaikki nämä solulinjat olivat positiivisia ETS-transkriptiotekijän fuusio tapahtumia tai uudelleenjärjestelyjä (TMPRSS2-ERG in H660, VCAP ja DuCaP, tasapainoinen ETV1 uudelleenjärjestelystä MDA-PCa 2b). Geenien ilmentyminen analyysit VCAP solujen Matrigel osoitti, että solut voidaan tehdä terminaali erilaistumisen tai vanhenemista kun upotettu Matrigel (tuloksia ei ole esitetty). Ilmentäminen TMPRSS2-ERG fuusio geenin ja leviämisen kannalta olennaisia ​​geenejä pienennettiin Matrigel. Kuitenkin kasvu VCAP ja DuCaP ollut rajoitettu kollageenin tyyppi I geelit; ja geeniekspressiomalleja Col I oli rajoitettu (ei esitetty).

Dynaaminen muutoksia geenien ilmentyminen vasteena Matrigel korreloivan normaali, muunnetaan ja invasiivisia ominaisuudet

LrECM ja muodostumista sferoidien indusoivat perustavanlaatuisia muutoksia solubiologian, proteiini ja mRNA geenin ilmentymistä PRCA soluja. Noin 3400 mRNA: t ilmentyvät eri 2D- ja 3D-olosuhteissa, mutta eivät johdonmukaisesti kaikissa solulinjoissa ja kaikkina ajankohtina. Kolme yleistynyt malleja muuttuneen geeniekspression havaittiin poikki paneelista solulinjojen (kuva 4a + b). Altered ilmentymistä valittujen geenien validoitiin qRT-PCR (kuvio 4c). Tekijöitä differentiaalikaavojen, mikä vahvistetaan qRT-PCR, olivat yleensä suuremmat verrattuna array data. GO analyysit ja GSEA paljasti erittäin merkittävä rikastetun funktionaalista geeniä luokat useimpien klusterien (taulukot S4, S5 ja S6).

A) Heatmap, joka havainnollistaa 12 klusterit tuottamat K-means algoritmi. Ryhmät 1 + 2 edustavat geenejä yksinomaan vaikuttavat normaaleissa soluissa (PrEC, EP156T). Klusterit 6-8 edustavat geenejä samoin indusoi tai tukahdutettu kaikissa solulinjoissa vastauksena 3D soluviljelmässä Matrigel 3D riippumatta fenotyypin tai transformaatio. Klusterit 9-12 geenejä sisältävät ominaista stellate /invasiivisia tyyppiä solulinjoja (ALVA31, PC3, PC3M, RWPE2 /W99), tai jotka syntyvät spontaanin konversion kierroksen stellate rakenteiden (esim PC3, päivä 13 ja 15).