Krooninen sairaus

tiivistelmä

On yhä enemmän todisteita siitä, että Embelin, aktiivinen komponentti

Embelia Ribes

, indusoi apoptoosia ihmisen syöpäsoluja, mutta yksityiskohtaiset mekanismit ovat vielä epäselviä. Tässä olemme tutkineet vaikutusta Embelin kasvuun ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Embelin esti voimakkaasti solujen kasvua erityisesti ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, mukaan lukien PC3, DU145, LNCaP-LN3 ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen, RWPE-1 verrattuna rintasyövän (MDA-MB-231, MCF-7, ja T47D), hepatooma (HepG2, Hep3B ja Huh-7), tai istukkasyöpä (JEG-3). Havaitsimme, että Embelin indusoiman apoptoosin PC3-solujen ajasta riippuvalla tavalla korreloi vähentynyt ilmentyminen Bcl-2, Bcl-x L, ja Mcl-1, lisäsi translokaation Bax osaksi mitokondrioita, ja pienentää mitokondrion kalvon potentiaalia. Lisäksi Embelin aiheuttama jännite riippuva anioni kanava (VDAC) 1 ilme ja oligomerisaatioaste jotka voivat edistää sytokromin

c

ja AIF vapautumista. Koska Embelin kykeni inhiboimaan Akt aktivointi ja syklo-oksigenaasi-2: n ilmentymisen, vaikutukset Wnt /β-kateniinin signalointi määritettiin. Embelin aktivoitu glykogeenisyntaasikinaasi (GSK) -3β estämällä fosforylaation ja tukahdutti β-kateniinin ilme. Vaimennus β-kateniinin-välitteisen TCF transkriptionaalisen aktiivisuuden ja geenin transkription, kuten sykliini D1, c-myc, ja matriisin metalloproteinaasi (MMP) -7, jotka on esitetty Embelin-käsitellyissä soluissa. Muutokset β-kateniinin tasoja vasteena Embelin blokattiin litiumkloridin, GSK-3-estäjällä, joka osoittaa, että Embelin voivat pienentää β-kateniinin ilmentymistä kautta GSK-3β aktivointi. Lisäksi altistuminen PC3 solujen Embelin johti vähentynyt merkittävästi solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Johtopäätöksenä nämä havainnot viittaavat siihen, että esto Akt signalointi ja aktivointi GSK-3β osittain myötävaikuttaa proapoptoottiseen vaikutus Embelin eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: Park N, Baek HS, Chun YJ (2015 ) Embelin aiheuttama apoptoosi ihmisen eturauhassyöpäsolujen välittyy modulaatio Akt ja β-kateniinin Signaling. PLoS ONE 10 (8): e0134760. doi: 10,1371 /journal.pone.0134760

Editor: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Korean tasavalta

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2015 Hyväksytty: 13 heinäkuu 2015; Julkaistu: 07 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Research Foundation of Korea (NRF) se rahoitettiin Korean hallitus (MSIP) (nro 2015R1A5A1008958). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Embelin (2, 5-dihydroksi-3-undekyyli-1, 4-bentsokinoni), eristettiin vaikuttava ainesosa hedelmä

embelia ribes

Burm (myrsikkikasvit), on ollut käytetään hoitoon kuume ja osoitettu olevan tulehdusta, anti-karsinogeeninen [1], antioksidantti [2], kouristuksia [3], ja antibakteerinen toiminta [4,5]. Embelin tiedetään olevan voimakas pienmolekyylisalpaaja- X-linked apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (XIAP), joka kumoaa sitoutuminen XIAP ja prokaspaasi-9 [1]. Embelin toimii voimakas inhibiittori NF

κ

B [6,7] ja osoittaa sytotoksisia vaikutuksia erilaisissa syöpäsolulinjoissa [8]. Vaikka Embelin tiedetään tukahduttaa soluproliferaatiota, ja indusoida apoptoosia monissa ihmisen syöpäsoluissa, molekyylitason mekanismeja näiden vaikutusten edelleen epäselviä. Apoptoosi on tärkeä rooli valvoa solujen eheyden ja on tiukasti säänneltyä. Kaksi keskeistä erillistä apoptoottisia reittejä on kehitetty, ulkoisen ja sisäisen polkuja. Aloittaminen signaalit sisäisen reaktiotien syntyvät kehitys- vihjeet tai soluvauriot joka aiheuttaa mitokondrion kalvon potentiaalin ja vapauttamaan proapoptoottisten proteiineja [9, 10]. Kuitenkin mekanismit, joilla apoptogenic initiaattorit ulkorajan yli mitokondrion kalvon (OMM) ei ole vielä täysin ratkaistu. Jännitteestä riippuva anioni kanava (VDAC) 1 sijaitsee OMM on ehdotettu tärkeä osa läpäisevyyden siirtymisen huokosten (PTP), joka johtaa sytokromin c vapautumiseen ja apoptoosin indusoivan tekijän (AIF) [11,12]. Oligomeroimalla VDAC1 muodostaa suuri huokosrakenne vastauksena useisiin pro-apoptoottiset signaalit voidaan tarvita sytokromi c: n vapautumisen [13]. Lisäksi vuorovaikutus VDAC1 Bax, joka on proapoptoottiset Bcl-2-perheen proteiini voi muodostaa suurempia monimutkaisempi kuin VDAC1 yksinään tai Bax yksin ja edistää avaaminen PTP [14]. Kuitenkin, anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit, kuten Bcl-2, Bcl-x L, tai Mcl-1 estää PTP aukon ja niihin liittyy hoitoa kestävyys ja etenemisen monia syöpätyyppejä, mukaan lukien eturauhassyöpä [15]. Aikaisempien tutkimusten, Mcl-1 on tärkeä säätelijä apoptoosin ja erilaistumisen ja yli-ilmentyy useimmissa eturauhassyöpäsolujen [16]. Chen et ai. raportoitiin uusi reitti, joka koostuu Akt, syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), ja Mcl-1, hankittu resistenssi apoptoosiin syöpäsoluissa [17]. Akt säätelee solun signalointi verkot, jotka ovat mukana prosesseihin liittyy solujen proliferaatiota, erilaistumista, ja aineenvaihduntaa ja aktivoi COX-2-välitteisen apoptoosin vastaisen polku, joka käsittää Mcl-1 [18,19]. Fosforylaatiota Akt klo Ser 9 tähteen GSK-3β johtaa sen inaktivaatioon [20, 21], jolloin vakauttamisen β-kateniinin, joka korreloi lisääntynyt transkriptio alavirtaan kohdegeenien [22]. Lisäksi GSK-3β fosforylaation selvästi estää β-kateniinin ilmentymistä ja kestävyys apoptoosin. Tämä tutkimus osoittaa, että Embelin indusoi mitokondrio-riippuvaista apoptoosia ja tukahduttaminen β-kateniinin ilmaisun kautta Akt eston ja GSK-3β aktivoitumista ihmisen eturauhasen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3, DU145, ja LNCaP-LN3, ihmisen eturauhasen epiteeli- solulinjan RWPE-1, ihmisen maksan hepatosellulaarista karsinoomaa HepG2, Hep3B ja HuH-7: n tai ihmisen rintasyöpäsolulinja MDA- MB-231, MCF-7, ja T47D-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Ihmisen choriocarcinoma solulinja JEG-3 hankittiin Korean Cell Line Bank ja viljeltiin DMEM-väliaineessa, jossa oli 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Reagenssit

Embelin ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 100 mM liuosta, jossa oli Embelin valmistettiin dimetyylisulfoksidiin, varastoidaan pieninä erinä -20 ° C: ssa ja sitten laimennettiin tarpeen soluviljelyelatusainetta. 8m Liuos, jossa oli litiumkloridia saatiin Sigma-Aldrich ja laimennettiin tarpeen soluviljelyelatusainetta. FBS ja RPMI 1640 -elatusaineessa ostettiin HyClone (Logan, UT). Neon Transfektiosysteemi, JC-1 iinianalyysikitissä ja COX-4-vasta-aine oli yhtiöltä Life Technologies (Carlsbad, CA). Bikinkoniini- happo (BCA) proteiini iinianalyysikitissä ja ECL kit olivat Thermo Scientific (Rockford, IL). Vasta-aineet fosfo-Akt (Ser 473), GSK-3β, fosfo-GSK-3β, tai Bcl-2 olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineita yhteensä-Akt, VDAC1, Bcl-x L, Bax, β-kateniinin, sykliini D1, GAPDH tai vuohen anti-kaniini IgG-Texas Red ja Ultra Cruz kiinnitysväliaine oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), Mcl-1, sytokromi

c

, AIF, β-kateniinin, c-myc tai histoni H1 vasta-aineet olivat peräisin Millipore Co. (Bedford, MA). Kaikki muut kemikaalit olivat korkeinta puhtautta tai molekyylibiologian laatu ja saatiin kaupallisista lähteistä.

solunelinkykyisyysmääritys

Solut (1 x 10

4 solua /kuoppa) lisättiin 96-kuoppaisella pyöreäpohjaiseen mikrolevyllä ja inkuboitiin nimetty aikaa 37 ° C: ssa. Hoidon jälkeen määritettyyn aikaan, soluja käsiteltiin 10 ui EZ-CyTox (Daeil Lab Service, Korea) lisättiin kuhunkin kuoppaan. 2 h kuluttua inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen GENIOS Pro mikrolevylukijalla (TECAN, Sveitsi).

anneksiini V /PI-apoptoosimäärityksessä

Solut pelletoitiin 1200 rpm: ssä ja pestiin kerran 1 ml: lla jääkylmää fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Saatu pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan 1 x sitomispuskurissa. Saatua seosta pidettiin jäissä 60 minuutin ajan, minkä jälkeen solut tehtiin läpäiseviksi 50 ug /ml anneksiini V-FITC: tä ja 50 ug /ml propidiumjodidia 1 x sitoutumispuskuria. Näytteitä pidettiin 37 ° C: ssa 60 min ja analysoitiin välittömästi käyttäen BD FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA).

mittaus mitokondrion kalvon potentiaali (Δ

ψ

m) B

Soluja kasvatettiin poly-d-lysiinillä päällystettyihin peitelasit käsiteltiin 24 h Embelin kasvualustaan, pestiin nopeasti PBS: llä, ja sitten leimattiin 2 pM JC-1 30 min ajan 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa. Kun oli pesty useita kertoja PBS: llä, peitelasit asetettiin lasilevyille käyttäen Ultra Cruz kiinnitysväliaine. Fluoresenssisignaalien analysoitiin LSM 510 META konfokaali laserskannaus (Zeiss, Jena, Saksa).

Ohimenevä transfektio

lyhytaikaista transfektiota, solut transfektoitiin pece myr-Akt tai ihmisen COX -2 promoottori lusiferaasi konstruktioita ja PRL-Renillaa (Promega) vektorien käyttäen Neon Transfektiosysteemi kuin valmistajan suosittelemia. Lyhyesti, yksi päivä ennen transfektiota, noin 5 x 10

5 solua per 60 mm levy ympättiin RPMI 1640 elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin sitten uudelleen Opti-MEM seerumia. Transfektio suoritettiin 2 ug: lla plasmidi-DNA: ta 5 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Transfektion jälkeen soluja pidettiin RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää 48 tuntia.

Solunosafraktiointi

Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja pestiin jääkylmällä PBS: llä. Subsellulaariset suoritettiin käyttäen Mitochondria eristäminen pakki viljeltyjen solujen ja NE-PER Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction Kit Thermo Scientific. Western-blottaus tehtiin käyttämällä vasta-aineita seuraavia ohjaus markkeriproteiinien: GAPDH varten sytosolifraktion, COX-4 mitokondriofraktiosta tai histoni-H1for tumafraktios-.

Western blot-analyysi

solut solubilisoitiin jääkylmää lyysipuskuria (pH 7,4), joka sisälsi 25 mM HEPES, 1% triton X-100, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF: ää, ja 1 ug /ml leupeptiiniä. Uutettu proteiinit (30 ug) erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) 10% polyakryyliamidigeeleillä, ja siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-kalvoja. Membraanit blokattiin 5% (w /v) rasvatonta kuivattua maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa 2 h 4 ° C: ssa ja sitten inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla 1: 1000 laimennos 5% (w /v) Tris- puskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 0,1% Tween-20. Inkubaation jälkeen sekundaarisen vasta-aineen 2 h, proteiinit visualisoitiin ECL ja bändi intensiteetti analysoitiin käyttämällä ChemiDoc XRS tiheysmittari ja kvantifioidaan Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad, Richmond, CA). Proteiinikonsentraatiot arvioitiin käyttäen BCA-menetelmällä mukaan toimittajan suositusten käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.

Immunofluoresenssi

Soluja kasvatettiin poly-D-lysiinillä päällystettyihin peitelasit käsiteltiin 24 h Embelin kasvualustaan, pestiin nopeasti PBS: llä, ja sitten käsiteltiin kasvualustaan, mukaan lukien 100 nM MitoTracker koettimia (Invitrogen). 1 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin 3,7% (w /v) paraformaldehydillä PBS: ssä, pH 7,4, 30 min huoneenlämmössä. PBS-pesun jälkeen soluja blokattiin 15 minuutin ajan PBS: ssä, joka sisälsi 5% vuohen seerumia ja 0,2% Triton X-100, sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineella (1: 1000) 1 tunnin ajan, pestiin perusteellisesti, ja värjättiin 1 tunnin ajan vuohen anti-kani-IgG-Texas Red (1: 500). Sen jälkeen kun vielä pesun jälkeen peitinlasit kiinnitettiin objektilaseille käyttäen Ultra Cruz kiinnitysväliaine. Fluoresenssisignaalien analysoitiin käyttämällä LSM 510 META konfokaali laserskannaus Microscope (Carl Zeiss, Saksa).

Cross-linkittäminen VDAC

hoidon jälkeen Embelin, sulfo-EGS DMSO: ssa loppukonsentraatioon 250 uM. Sen jälkeen, kun 25-min inkuboinnin jälkeen 30 ° C: ssa, silloittaja pysäytettiin lisäämällä 1 M Tris-HCl (pH 7,5) lopulliseen konsentraatioon 20 mM. Näytteet liuotetaan sitten 1% NP-40 ja ultraäänellä 7 s viisi kertaa 30% pulssin käyttäen Vibra-Cell sonicator (Sonics and Materials, Newtown, CT).

DNA: n fragmentoituminen määritys

DNA-fragmentit uutetaan Exgene Cell SV genomisen DNA: n puhdistus järjestelmä (GeneAll, Korea) mukaan valmistajan protokollaa. DNA-fragmentit erotettiin käyttämällä geelielektroforeesia 1% agaroosigeelillä. Ladattu DNA visualisoitiin ChemiDoc XRS (Bio Rad).

Dual lusiferaasireportterigeenin määritys

Solut (1 x 10

6 solua /kuoppa) kotransfektoitiin 2 ug ihmisen COX 2-promoottorin lusiferaasi-rakenteet ja PRL-renilla (Promega) vektoreita tai 2 ug TOPFlash lusiferaasin vektorien kanssa villityypin TCF sitoutumiskohdat ja FOPFlash sivektorissa mutantti TCF sitoutumiskohtien mukaan valmistajan protokollan avulla Neon transfektion järjestelmää. 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 30 uM Embelin varten ilmoitettu ajat, ja hajotettiin passiivinen hajotuspuskuria, ja lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin peräkkäin käyttäen Dual Luciferase Assay System (Promega), jossa on FilterMaxia F3 mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, CA) .

Haavan paranemista määrityksessä

solut (1 x 10

6 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille soluviljelylevyille. Solujen annettiin kasvaa konfluenssiin RPMI1640-alustalla, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 25 ug /ml mitomysiini C: ssa 30 minuuttia. A1-mm leveä naarmu tehtiin poikki solukerrokselle käyttäen steriiliä pipetin kärkeä. Levyt valokuvattiin jälkeen ilmoitetun ajan.

invaasiomääritys

Solun hyökkäystä mitattiin käyttämällä kennon invaasiomääritys Kit (Chemicon, Temecula, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut siirrostettiin invaasio kammion insertti, joka sisältää 8 um: n huokoskoon polykarbonaattikalvon päällystetty ohuella kerroksella polymeroidun kollageenia. Tunkeutuvat solut pohjassa insertin kalvo värjättiin ja valokuvattiin.

gelatiinitsymografialla

väliaine analysoitiin gelatinaasien gelatiinitsymografialla. Sillä gelatinaasit, näytteet erotettiin ei-pelkistävissä olosuhteissa on 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, joissa on 0,1% gelatiinia. SDS-PAGE-geeli inkuboitiin rena- 15 minuuttia kolme kertaa. Sitten geelit korvattu kehittämiseen puskurissa 37 ° C: ssa yön yli. Geelit pestiin ja valokuvattiin värjäyksen jälkeen 0,5%: lla Coomassie Blue liuosta 30 min.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä, jota seurasi Dunnettin pareittain useita vertailu t-testi GraphPad Prism-ohjelmiston (GraphPad Software Inc., CA) tarvittaessa. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä *

p

0,05.

Tulokset

Embelin estää proliferaatiota ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

Erilaisia ​​ihmisen syöpäsolulinjoja, mukaan lukien eturauhasen syöpäsolujen (PC3, DU145 ja LNCaP-LN3), ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (RWPE-1), rintasyövän soluja (MDA-MB-231, MCF-7, ja T47D), hepatoomasoluja (HepG2, Hep3B ja Huh-7), ja koriokarsinoomasolut (JEG-3) käsiteltiin eri pitoisuuksilla Embelin määrittää vaikutukset Embelin on soluproliferaatiota (kuvio 1). Embelin estivät merkittävästi kasvua ihmisen eturauhasen syöpäsolujen verrattuna sen vaikutuksia muihin syöpäsoluihin. Solujen elinkelpoisuus väheni Embelin ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja eturauhasen epiteelisolujen, kuten PC3, DU145, LNCaP-LN3 ja RWPE-1 IC

50-arvot 23,6 uM, 11,0 uM, 32,0 uM, ja yli 200 uM kun soluja viljeltiin 24 h (kuvio 1 E). Eturauhassyöpäsolulinjoissa selvästi inhiboi Embelin, mutta normaalissa eturauhasessa solu ei vaikuta Embelin pitoisuus on alhainen 24 tuntia. Lisätutkimuksia, 30 uM pitoisuus Embelin valittiin hoitoon PC3-soluja.

Soluja käsiteltiin Embelin eri konsentraatiot ilmoitettu kertaa. Solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK. Formatsaanisakka muodostuminen kvantitoitiin spektrofotometrillä 450 nm: ssä. Solujen prosenttiosuus elossa kussakin ryhmässä suhteessa kontrolliin laskettiin. (A) PC3 solu. (B) DU145 solu. (C) LNCaP-LN3 solu. (D) RWPE-1-solu. (E) IC

50-arvot Embelin erilaisissa ihmisen syöpäsolujen linjat. IC

50-arvot analysoitiin käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen riippumattoman määrityksen. *, Poikkeaa merkittävästi käsittelemätön kontrolli solut (

p

0,05).

induktio apoptoosin Embelin

Valaistaan ​​onko Embelin indusoi apoptoosin PC3 solut, virtaussytometria-analyysi suoritettiin anneksiini V- ja propidiumjodidi (PI) -stained soluja. Hoito 30pM Embelin jopa 48 tuntia aiheutti voimakkaan kasvun nopeus apoptoosin. Solut, jotka käsitelty 30 uM Embelin: ssa 12 h ja 24 h oli 15,6-kertainen ja 17,2-kertainen apoptoosin käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 2A). 48 tunnin kuluttua inkuboinnin merkittävä kasvu nekroosia havaittiin Embelin-käsitellyissä soluissa. Hoito Embelin indusoi myös kromosomi-DNA pirstoutuminen on ajasta riippuva tavalla (kuvio 2B). Koska mitokondrioiden läpäisevyys siirtyminen voi johtaa apoptoosin, me määritti Embelin mitokondrion kalvon potentiaali (Δ

ψ

m). Kuvio 2C osoitti Embelin voimakkaasti vähentynyt Δ

ψ

m, merkitään punainen /vihreä fluoresenssi suhde ajasta riippuva tavalla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Embelin pystyy aiheuttamaan apoptoosin muuttamalla mitokondrion kalvon läpäisevyyden.

(A) Soluja inkuboitiin osoitetun ajanjaksoilta Embelin (30 uM), ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI . Apoptoosi mitattiin virtaussytometrillä. Solu populaatiot syrjitty kussakin neljänneksessä kuin eläviä soluja vasemmassa alakulmassa (anneksiini V negatiivinen /PI negatiivinen), varhainen apoptoottisten solujen vasemmassa yläkulmassa (anneksiini V positiivinen /PI negatiivinen), myöhäinen apoptoottisten solujen oikeassa yläkulmassa (anneksiini V positiivinen /PI positiivinen), ja nekroottinen solut alemmassa oikeassa neljänneksessä (anneksiini V negatiivinen /PI positiivinen). (B) induktio DNA: n fragmentoituminen PC3-soluissa Embelin. Soluja inkuboitiin osoitetun ajanjaksoilta Embelin. Kromosomi-DNA eristettiin ja DNA: n fragmentoituminen määritettiin. M, DNA markkeri; P, paklitakseli (1 uM). (C) Kun PC3-soluja inkuboitiin Embelin ajanjaksojen, solut leimattiin 2 M JC-1 30 minuutin ajan ja Δ

ψ

m määritettiin konfokaalimikroskopialla. Suhde JC-1 aggregaatti (punainen) monomeeri (vihreä) voimakkuus laskettiin Image J ohjelmisto. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen riippumattoman määrityksen. *, Poikkeaa merkittävästi käsittelemätön kontrolli solut (

p

0,05).

Sen määrittämiseksi, onko Embelin vaikuttaa tasot apoptoosiin liittyvien proteiinien mitokondrioita, mittasimme määrä Bax: (pro-apoptoottisen), Bcl-2, Bcl-x L, ja Mcl-1 (anti-apoptoottisen). Kuten on esitetty kuviossa 3A ja 3B, olemme havainneet, että Embelin (30 uM) indusoitua voimakkaasti translokaatio Bax välillä sytosolista mitokondrioissa. Ilmentymisen tasot anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit, kuten Bcl-2, Bcl-x L, ja Mcl-1 oli vähentynyt merkittävästi Embelin. 24 h jälkeen Embelin hoidon, tasot Bcl-2, Bcl-x L, ja Mcl-1 oli 15%, 58%, ja 28%: n valvonnan tasolla, vastaavasti. Release sytokromi

c myynnissä maassa mitokondrioita sytosoliin myös parannettu läsnä ollessa Embelin (kuvio 3C). 24 tunnin kuluttua Embelin hoidon, sytokromi

c

taso laski 45% mitokondrioissa, mutta sytosoliin sytokromi

c

oli kasvanut 1,8-kertaiseksi ohjausyksikön tasolla. Konfokaaliset mikroskooppinen analyysi osoitti myös, että Embelin parantaa Bax translokaation mitokondrioita ja sytokromi

c

päästämistä sytosoliin (kuvio 3B ja 3D). Olemme myös havainneet, että Embelin indusoi translokaatio apoptoosia indusoivan tekijän (AIF) päässä mitokondrioita, läpi sytosoliin, ja lopuksi tumaan (kuvio 3E). Konfokaaliset mikroskooppinen analyysi osoitti, että hoito Embelin parantaa AIF translokaatio tumaan (kuvio 3F). Sen määrittämiseksi, ovatko Embelin indusoi oligomerointi VDAC edistää muutoksia Δ

ψ

m, ja vapauttamaan sytokromi

c

ja AIF, soluja käsiteltiin sulfo-EGS tuottaa rajat yhdistävällä VDAC, ja oligomerointi VDAC määritettiin Western-blottauksella käyttäen anti-VDAC1 vasta-aine. Kun soluja käsiteltiin Embelin (30 uM) enintään 24 h, Embelin selvästi indusoima ja dimerointi VDAC1 ajassa riippuvalla tavalla (kuvio 3G). Nämä tulokset viittaavat siihen, että VDAC1 voi olla välittäjänä Embelin indusoiman apoptoosin ja että VDAC oligomerointi aiheuttama Embelin saattaa määrätä sen gating kyky ulosvirtausta mitokondrion proteiinit, kuten sytokromi

c

ja AIF.

(A), (C), (E) translokaatio pro-apoptoottisen proteiinin (Bax), sytokromi

c

, AIF, ja taso anti-apoptoottisten proteiinien (Bcl-2, Bcl-xL , Mcl-1) analysoitiin western-blottauksella. Soluja käsiteltiin Embelin varten osoitetun ajanjaksoja. Inkuboinnin jälkeen solut kerättiin ja sytosolin ja mitokondrioiden fraktiot eristettiin. Uutetaan proteiinit erotettiin SDS-PAGE (10%) ja Western blot-analyysi suoritettiin. GAPDH taso määritettiin lastaus säätimet sytosoliin ja koko lysaatit. COX-4 taso määritettiin latauskontrollina varten mitokondrioita. Histoni H1 taso määritettiin latauskontrollina ydinvoiman murto. C, sytosolifraktion, M, mitokondriofraktiosta, N, tumafraktios-. Numerot väliset blotit ovat suhteet intensiteetin bändejä jälkeen normalisoitu ohjaus. (B), (D), (F) translokaatio Bax (B), sytokromi

c

(D), ja AIF (F). Soluja viljeltiin on mikroskooppisen dioja ja käsiteltiin Embelin 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja sen jälkeen värjättiin käyttäen spesifistä vasta-ainetta. Sitten solut värjättiin Texas-Red-leimattua sekundaarista vasta-ainetta. Fluoresenssi määritettiin käyttäen konfokaalimikroskopia. G, Expression of VDAC1 ja oligomeroinnissa VDAC1. Embelin-käsitellyt solut otettiin talteen ja inkuboitiin sitten sulfo-EGS (250 uM) 25 minuutin ajan 30 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla (8%), VDAC1 proteiinit mitattiin käyttäen Western blot-analyysi. 33-kDa edustaa VDAC1 monomeerit kun bändi 65 kDa edustaa VDAC1 dimeerin. Mitokondriofraktiosta eristettiin ja erotettiin SDS-PAGE (12%) ja Western blot-analyysi suoritettiin. COX-4 taso määritettiin latauskontrollina varten mitokondrioita.

esto Embelin Akt aktivointi ja β-kateniinin reitin

Aiemmin Chen et al. raportoitiin uusi reitti, joka koostuu Akt, ja COX-2: hankitun apoptoosin resistenssin syöpäsoluissa [17]. Koska huomasimme, että Embelin estää Akt-fosforylaation ja COX-2: n ilmentymisen määritettiin. Soluja käsiteltiin 30 uM Embelin 6, 12 tai 24 h ja tasot fosfo-Akt (Ser 473), yhteensä Akt, ja COX-2 mitattiin Western blot-analyysi. Kuten on esitetty kuviossa 4A, fosforylaatio Akt on Ser 473 ja ilmentyminen COX-2: ta väheni merkittävästi Embelin, vaikka koko Akt eivät muuttuneet merkittävästi. 24 tunnin kuluttua Embelin hoidon, fosfo-Akt ja COX-2 tasot laskivat 99% ja 52%, vastaavasti, valvonnan taso soluja. Samanaikaisesti arvioimme esto Akt aktivaation PC3-soluissa, fosforylaatiota Akt ja solujen elinkykyisyys laski Akt estäjä IV (0,3 uM) (kuvio 4B). Kun solut transfektoitiin PECE-Myr-Akt-plasmidi ilmentymistä konstitutiivisesti aktiivisen Akt, Embelin-välitteinen väheneminen Akt fosforylaatio Ser 473 (kuvio 4C). Lisäksi olemme havainneet, että Embelin-välitteinen väheneminen solujen elinkelpoisuuden esti Myristoylated Akt ilmaisua. Embelin inhiboi myös COX-2-promoottorin aktiivisuuden määritettynä lusiferaasireportterigeenin määritys, joka osoittaa, että Embelin voi estää Mcl-1-ilmentymisen estämiseksi, Akt-COX-Mcl-1-reitin.

(A) Soluja käsiteltiin 30 uM Embelin varten osoitetun ajanjaksoja, ja kokosolulysaateille valmistettiin, ja uutettiin proteiinit erotettiin SDS-PAGE (10%) ja Western blot-analyysillä käyttämällä fosfo-Akt yhteensä Akt, ja COX-2-vasta-aineita tehtiin. Numerot väliset blotit ovat suhteet intensiteetin bändejä jälkeen normalisoitu ohjaus. (B) Soluja transfektoitiin Myr-Akt-plasmidi, ja käsiteltiin sitten 30 uM Embelin 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen riippumattoman määrityksen. *, Poikkeaa merkittävästi käsittelemätön kontrolli solut (

p

0,01) ja **, poikkeaa merkittävästi Embelin ainoastaan ​​käsiteltyjä soluja (

p

0,001). Kokosolulysaateille valmistettiin ja veren kokonaiskolesterolia Akt ja fosfo-Akt määritettiin Western blot -analyysillä. (C) AKT-estäjällä IV käsiteltiin solujen lysaatit valmistettiin ja uutettiin proteiinit erotettiin SDS-PAGE (10%) ja Western blot-analyysillä käyttämällä fosfori-Akt yhteensä Akt, ja GAPDH vasta-aineita tehtiin. Soluja käsiteltiin 0,312 uM AKT-estäjällä IV 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK. Formatsaanisakka muodostuminen kvantitoitiin spektrofotometrillä 450 nm: ssä. Solujen prosenttiosuus elossa kussakin ryhmässä suhteessa kontrolliin laskettiin. (D) transfektoitiin COX-2 sivektorissa ja renilla lusiferaasi vektori 48 tuntia. Solut altistettiin kahden lusiferaasianalyysissä. Suhteellinen tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta, normalisoitu Renilla lusiferaasiaktiivisuus, näytetään. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen itsenäisen määrityksen. *, poikkeaa merkittävästi käsittelemätön kontrolli (

p

0,05).

Edellinen raportti osoittaa, että β-kateniinin on ratkaiseva rooli useissa kasvun signaaleja ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [23]. Sen vaikutuksen määrittämiseksi Embelin on β-kateniinin ilmentymistä, PC3-soluja käsiteltiin Embelin (30 uM) enintään 24 tuntia, ja Western-blottaus suoritettiin. Kuvio 5A osoittaa, että Embelin pystyy vähentämään β-kateniinin tason aika-riippuvaisella tavalla. 24 tunnin kuluttua Embelin hoidon taso β-kateniinin pieneni 40% tasosta hallinnassa soluissa. Määritimme TOP flash lusiferaasiaktiivisuuden mittaamaan tasoa β-kateniinin tumaansiirtymiseen ja TCF transkription aktivaation. Embelin (30 uM) inhiboi merkittävästi TOPflash aktiivisuutta 19% valvonnan 24 tunnin jälkeen (kuvio 5B). Konfokaaliset mikroskooppinen analyysi vahvisti myös, että hoito Embelin selvästi vähentynyt tasolle β-kateniinin PC3-soluissa (kuvio 5C). Transkription kohdegeenien β-kateniinin, kuten sykliini D1, c-myc, ja MMP-7 oli myös merkittävästi tukahdutti Embelin (kuvio 5D). Mielenkiintoista, mRNA transkriptio MMP-7 oli lähes täysin tukossa 12 h hoidon Embelin. Western blot-analyysi osoitti myös, että Embelin väheni voimakkaasti sykliini D1, c-Myc, ja MMP-7-proteiinin tasot (kuvio 5D).

(A) koko solulysaatit valmistettiin ja uutettiin proteiinit erotettiin SDS-PAGE (10%) ja Western blot-analyysillä käyttämällä β-kateniinin, fosfo-β-kateniinin tai GSK-3β-vasta-aineita tehtiin. Numerot väliset blotit ovat suhteet intensiteetin bändejä jälkeen normalisoitu ohjaus. (B) Lusiferaasianalyysi. TOPFlash tai FOPFlash-transfektoituja soluja käsiteltiin Embelin. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin ja suhteellinen tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta, joka on normalisoitu Renilla lusiferaasiaktiivisuus, on esitetty. (C) Solut kannen slip 24 tuntia ja käsiteltiin 30 uM Embelin jopa 24 tuntia. Sitten solut värjättiin β-kateniinin-vasta-ainetta, ja fluoresenssi määritettiin käyttäen konfokaalimikroskopialla. (D) Expression of sykliini D1, c-Myc ja MMP-7 määritettiin käyttämällä kvantitatiivista PCR: llä ja Western blot-analyysi. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen itsenäisen määrityksen. *,

#

§, poikkeaa merkittävästi käsittelemätön kontrolli (

p

0,05). Numerot väliset blotit ovat suhteet intensiteetin bändejä jälkeen normalisoitu ohjaus.

Edellinen raportissa ehdotettiin, että GSK-3β moduloi β-kateniinin tasoja fosforylaatio β-kateniinin on Ser 33/37 ja Thr 41 [24]. Tutkimme, onko Embelin pystyy parantamaan GSK-3β vakautta ja toimintaa. Kuten on esitetty kuviossa 6A, olemme huomanneet, että Embelin voimakkaasti esti fosforylaatio GSK-3β on Ser 9 Akt aktivointi. Embelin indusoituu voimakkaasti fosforylaatiota β-kateniinin on Ser 33/37 /Thr 41 ja voi edistää β-kateniinin hajoamiseen. Oletimme, että Embelin-välitteinen kasvu fosforylaatiota β-kateniinin voi aiheuttaa GSK-3β aktivointi, koska vähentynyt β-kateniinin tasolla Embelin hoito oli lähes täysin talteen käsittelemällä LiCl: (20 mM), GSK-3β estäjä . LiCI: vähensi myös Embelin-välitteisen induktion β-kateniinin fosforylaation. Kuten hoidon LiCl ei toipunut Embelin välittämää väheneminen GSK-3β fosforylaation, LiCl voi estää GSK-3β aktiivisuutta, mutta ei muuta GSK-3β fosforylaatiota. Mielenkiintoista, Mcl-1 oli kasvanut 1,4-kertaisesti LiCI käsittely ja vähentynyt taso Mcl-1kirjoittaja Embelin merkittävästi talteen LiCl (kuvio 6A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Mcl-1 ilmentymisen moduloidaan GSK-3β aktiivisuutta. Maurer et ai. raportoitu, että GSK-3β kautta Akt aktivaation aiheuttama Mcl-1 ilme [25]. Tuloksemme vahvistivat myös, että GSK-3β aktivaation Embelin välittämän Akt esto estää Mcl-1 ilme. Lisäksi, LiCI: n indusoimaa TOPFlash aktiivisuutta 2,5-kertainen ohjaus ja Embelin esti TCF transkription aktivaation aiheuttama LiCl aiheuttama kasvu β-kateniinin (kuvio 6B). Konfokaaliset mikroskooppinen analyysi osoitti, että hoito Embelin estää lähes täysin β-kateniinin ilmaisu (kuvio 6C). Hoito LiCl talteen Embelin välittämää väheneminen β-kateniinin ilme. Chen et ai.