Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimen mikroympäristölle (TME) on aktiivinen toimija syövän synnyn ja muutoksia sen koostumuksessa muuttaa syövän kasvua. Carcinoma liittyy fibroblastien, luuytimestä peräisin multipotentteihin mesenkymaaliset kantasolut (BMMSCs), ja tulehdussolujen voivat kaikki vaikuttaa koostumuksen TME johtaa muutoksiin leviämisen, invaasiota ja etäpesäkkeiden muodostumista karsinoomasoluja. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet vuorovaikutusta BMMSCs ja suun kielen okasolusyöpä (OTSCC) solut analysoimalla invaasio etenemistä ja geeniekspressiomalli. Vuonna 3-ulotteinen myoma organotypic invaasion malli läsnäolo BMMSCs inhiboivat mutta nousi hyökkäyksen OTSCC soluja. Lisäksi signaalit peräisin OTSCC soluista sääteli ilmaus tulehduksellinen kemokiineja BMMSCs, kun taas BMMSC tuotteiden aiheuttama ilmaus tunnetaan hyökkäystä liittyy molekyylejä syöpä soluja. Erityisesti sen jälkeen, kun solu-solu-vuorovaikutuksia, kemokiini CCL5 on runsaasti erittyy BMMSCs ja toiminnan estävää vasta-ainetta vastaan, CCL5 inhiboi BMMSC parantaa syövän invaasio alueella. Kuitenkin CCL5- estävää vasta-ainetta ei estänyt syvyyttä hyökkäystä. Lisäksi altistuksen jälkeen BMMSCs, ilmaus tyypin I kollageenin mRNA: OTSCC soluissa oli merkittävästi sääteli. Kiinnostavaa kyllä, myös korkea ilmentyminen tyypin I kollageenin N-terminaalinen propeptidi (PINP)

in vivo

korreloi syöpäkuolleisuuden of OTSCC potilaista, kun taas ei ollut yhdistyksen välillä syöpä kudoksen CCL5- tasot ja kliiniset parametrit. Lopuksi tulokset viittaavat siihen, että vuorovaikutus BMMSC ja syövän solut indusoivat sytokiinien ja matriisi-molekyylin ilmentyminen, joka korkean tason tyypin I kollageenin tuotanto korreloi ennusteen OTSCC potilailla.

Citation: Salo S, Bitu C, Merkku K, Nyberg P, Bello IO, Vuoristo J, et al. (2013) ihmisen luuytimen mesenkyymikantasoluista Pakotettava kollageenin tuotantoa ja Tongue Cancer Invasion. PLoS ONE 8 (10): e77692. doi: 10,1371 /journal.pone.0077692

Editor: Dimas Tadeu Covas, University of Sao Paulo – USP, Brasilia

vastaanotettu: 14 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 02 syyskuu 2013; Julkaistu: 21 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Salo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus on tukenut Akatemia, Suomen Syöpäyhdistys, Sigrid Juseliuksen säätiö, Suomen Hammaslääkäriseura Apollonian ja Emil Aaltosen säätiö apurahoja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimen mikroympäristölle (TME) käy läpi laajan muuttuu kasvaimen kasvun aikana [1] ja etenemistä kasvain on riippuvainen peruskudoselementeistä [2]. Solujen mikroympäristössä, mukaan lukien syöpä, liittyy fibroblastien (valuuttalisiin), luuytimestä peräisin multipotentteja mesenkymaaliset stroomasolut (BMMSCs), kasvaimeen liittyvät makrofagit (TAM) ja muiden tulehdussolujen sekä verisuonten solujen kaikki osaltaan eriasteisesti tunnusmerkkejä syöpä ja syövän ekosysteemin [3] [4]. Ne tuottavat soluväliaineen, kasvutekijät, sytokiinit, proteaasit ja niiden sääntelyviranomaisten, ja siten tarjoavat mikroympäristön tukeva syövän solujen lisääntymistä ja kuolemattomuus, angiogeneesin, uudelleenohjelmoinnin energia-aineenvaihduntaan, kiertää immuuni tuhoutuminen, ja suosimalla invaasio ja etäpesäkkeiden [5], [1 , 3,6], [4].

kielen syöpä komponentit TME on alkeellinen rooli hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden prosesseja, joilla on suora vaikutus potilaiden kliinisiin tuloksiin [7]. Olemme osoittaneet, että korkea taajuus valuuttalisiin on yhteydessä huonoon ennusteeseen mobiili kielen syöpäpotilailla [8], [9]. Valuuttalisiin on myös osoitettu lokalisoida paikalla metastaattisen imusolmuke samalla sovitettu ensisijainen kieli kasvaimia viittaa helpottaminen etäpesäkkeiden [10]. Meidän Tuoreessa tutkimuksessa profiloitu molekyyli cross-talk välillä suun syöpäsoluja ja TME ja esitti, että tutkittaessa tunnettujen pro-tuumorigeenisen komponentit tulehdussuodoksen, kuten säätelevien T-solujen, tam2 (ts TAM alatyyppi tukemiseen invaasiota ja etäpesäkkeiden) soluja, ja säätelijä-T-solujen indusoimiseksi immuunisolujen, paljasti kielteinen vaikutus potilaille samanlainen valuuttalisiin [11].

BMMSCs on osoitettu sisällyttää vaurioitunut tai tulehtuneeseen kudokseen sekä kotona kasvaimia ja sivuston etäpesäkkeiden, jossa ne integroituvat TEM ja tarjota lähteen soluja, kuten valuuttalisiin [12], [ ,,,0],13] [14], [15] ,, [2]. Sytokiinien ja kasvutekijöiden kasvainsolujen erittämiä yhdessä hormonaalisten tekijöiden tulehduksellisten ympäröivien kudosten kasvainten houkutella BMMSCs kasvaimen peruskudos [16]. BMMSCs on osoitettu invaasiota ja etäpesäkkeiden erilaisissa syövissä, kuten rinta-, paksusuoli- ja imunestejärjestelmän syöpiä [17], [18], [19]. Kuitenkin vaikutus ja rooli BMMSCs vuonna TEM ja mekanismit niiden mahdolliset vaikutukset eri kasvaimiin edelleen kiistanalaisia ​​[20], [21].

Lisäksi eri solutyyppejä, soluväliaineen (ECM) proteiineja TME voi toimia myös ratkaisevia tekijöitä dynaamiseen kattava järjestelmä vaikuttamalla syövän tulos [22]. Runsain proteiini TME on tyypin I kollageeni, joka johtaa kasvaimen kasvun, invaasion ja syövän leviämisestä. Erityisesti vapauttamista aminoterminaalisen propeptidin tyypin I prokollageenin (PINP) osoittaa kasvaimen aiheuttaman fibro-proliferatiivinen vaste [22-24].

Tämän työn tavoitteena oli tutkia vaikutusta BMMSCs ja karsinoomasolut vuorovaikutusta OTSCC geenien ilmentyminen, invaasio ja kliininen tulos OTSCC potilaista. Tässä osoitimme, että BMMSCs indusoi OTSCC karsinoomasolulinjoissa invaasiota

in vitro

osittain läpi kemokiinin CCL5- signaloinnin koska sen estäminen vähensi hyökkäyksen alueella. Vuonna OTSCC soluissa ilmentymisen tyypin I kollageenin mRNA säädeltiin johdettuja signaaleja BMSCC, ja korkea ekspressiotaso immunoreaktiivisia tyypin I prokollageenin korreloi syövän aiheuttamaa kuolleisuutta ja OTSCC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen kielen levyepiteelisyövän soluja HSC-3 (JCRB 0623; Osaka National Institute of Health Sciences, Osaka, Japani), SAS ( JCRB 0260; Osaka National Institute of Health Sciences, Osaka, Japani) ja ihmisen dysplastic suun keratinosyyttien DOK (European Collection of Cell Cultures 94122104, Salisbury, Wilts., UK) viljeltiin 1: 1 DMEM /F-12 (Invitrogen) täydennettynä 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 50 ug /ml askorbiinihappoa, 250 ng /ml fungitsonia, 5 ug /ml insuliinia (naudan haiman), 0,4 ug /ml hydrokortisonia (kaikki Sigma-Aldrich), ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS). Sillä zymografian, naudan sikiön seerumia korvattiin 0,5% laktalbumiini (Sigma-Aldrich). Ihmisen luuytimestä peräisin BMMSCs alun perin saatu potilailta käyttää lonkkamurtuman tai nivelrikko. Eettinen komitea Oulun yliopistollisen sairaalan oli hyväksynyt tutkimussuunnitelman (Lausunnot 4 /2000,58 /2009 ja 21/2011; tutkimus Diary 180/2001 ja 12/2004), ja potilaat olivat antaneet tietoisen kirjallisen suostumuksensa tutkimukseen osallistumisesta . BMMSCs tässä tutkimuksessa käytetyt otettiin talteen ja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [25] [26]. Kaikki kokeet suoritettiin solujen varhainen numerot 3 – 4. Human ikenen fibroblasteja (GF) Tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin koepaloja terveen ikenen kuten aiemmin on kuvattu [27]. Karsinooma liittyvä fibroblasteja (CaDEC12) [11], joka on peräisin näytteestä kielen SCC sekä normaali suun fibroblasteja (NOFS) [28] viljeltiin samassa media GFS [27]. Kaikki solut viljeltiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 37 ° C: ssa. Vuonna BMMSC tai GF yhteistyössä viljelmiä HSC-3, SAS tai DOK soluja BMMSC tai GF elatusaineet käytettiin.

Organotyyppisiä invaasiomääritys

organotypic invaasiomääritys ja kvantifiointia invaasion suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Vuonna monokulttuuria määrityksissä 2,0 x 10

5-4 x 10

5 HSC-3 tai SAS soluja tai 2 x 10

5 DOK soluja viljeltiin päällä myoma levyn toimivaksi 10 – 14 päivää. Yhdessä luviljelymäärityksistä 0,5-1,5 x 10

5 BMMSCs lisättiin yhdessä syöpäsolujen päällä on myoma levyjen (OTSCC: BMMSC suhde vaihteli välillä 2: 1-5: 1). Histologinen osa myoma levyt värjättiin monoklonaalisella pancytokeratin vasta-aineella (DAKO, klooni AE1 /AE3). Keskimääräinen hyökkäyksen alueella tai syvyys HSC-3, SAS, DOK tai mahdollinen muu ohjaus- soluja kasvatettiin yksipuolinen asetettiin 100%. Inhiboimiseksi hyökkäyksen, 50 ug /ml monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen CCL5 (R 55 yrs4035.155-70 yrs3026.3 70 yrs4438.6SexMale5649.1Female5850.9Tumour grade14035.126254.431210.5Tumour stage1-26355.33-45144.7Neck imusolut nodesNegative7969.3Positive3530.7Neck dissectionNo1614.0Yes9886.0Adjuvant therapyNo6859.6Radiotherapy3429.8Radio- ja chemotherapy97.9Missing data32.6Total114Table 1. Potilaan kliinistä tietoa.

CSV Lataa CSV

immunohistokemia

Immunovärjäys suoritettiin kaikki meidän OTSCC näytteitä, jotka oli aiemmin valittu edustavan kasvaimen massan resektoitua yksilöitä. Sen jälkeen korkean lämpötilan antigeeni hakumenetelmä sitraattipuskurilla varten CCL5- (REAL Target Retrieval Solution, pH 6, Dako, Glostrup, Tanska) tai Tris /EDTA PINP (10 mmol /l Tris, 1 mmol /l EDTA, pH 9), kohdat blokattiin inkuboimalla vuohen normaalia seerumia, 30 min. Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa polyklonaalisen vuohen anti-ihmisen CCL5-vasta-ainetta (# AF-278-NA, R imusolmukkeiden vapaa etäpesäkkeitä tutkittiin D. D. ja M.V.). Eri malleja luokitella ilmaisun valittiin. Aluksi näytteet luokiteltiin perustuu yleiseen ero värjäytymisen välillä pinnallinen ja invasiivisia alueilla kasvaimia luokiteltiin (värjäys näkyy voimistunut pinnallinen alueilla kasvaimen tai värjäys näkyy voimistunut invasiivisia alueilla kasvain). Niiden positiivisten solujen strooman ja kasvainsoluja sekä pinnallinen ja invasiivisia alueet kasvaimen pisteytettiin neljän pisteen asteikolla (0 = 0%, 1 = 0-25%, 2 = 25-50% ja 3 = 50%, nimeltään no, matala, kohtalainen ja korkea ilmaisun, vastaavasti). Lisäksi, kun läsnä on PINP värjäyksen veren ja imusuonten arvioitiin. Epiteelinalaisella strooman morfologisesti normaali epiteelin myös värjättiin. Klo dysplastic limakalvon sivustoja sekä epiteelisolujen ja epiteelinalaisella strooman solut analysoitiin.

RNA Häiriöitä

kolme kaupallista CCR5 lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) oligonukleotidit (Thermo Scientific # VGH5518-98903425, # VGH5518-99159618, # VGH5518-99294601) ja ei-hiljentäminen ohjaus (Thermo Scientific # RHS4348) saatiin Thermo Scientific Open Biosystems GIPZ Lentivirusvektorikonstruktit shRNAmir Kirjasto (Thermo Scientific). Transductions HSC-3-solujen virus- ja kontrollivektoreihin suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeita puromysiinin (Sigma-Aldrich) valinta. Tehokkuutta pudotus, jonka CCR5-shRNA määritettiin virtaussytometria-analyysillä käyttäen monoklonaalista anti-CCR5-vasta-ainetta (BD Pharmingen, # 556903) ja isotyyppiä IgG: tä (BD Pharmingen, # 555576) kontrollina. Noin 70% pudotus CCR5 saatiin verrattuna ei-hiljentäminen ohjaus solujen yhden kaupallisen oligonukleotidien (Thermo Scientific # VGH5518-99159618).

Tilastollinen

Kaikki määritykset toistettiin 2-4 kertaa, paitsi 3D invaasiomääritys SAS ja DOK solut, jotka tehtiin vain kerran kolmena myoma levyjä kohti mono- tai co-kulttuuri. Erot solujen lisääntymisen ja haavojen paranemista, invaasio alue ja syvyys arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä. Kaikissa kokeissa,

p

-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastoanalyyseihin potilaan materiaalista käytimme PASW Statistics 18 (IBM corp.) Ohjelmisto. Chi-neliö-testiä käytettiin laskemiseen tilastollisesti merkitseviä eroja prognostisia ja kliinis muuttujia. Survival taulukot laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä, ja verrattiin log-rank-testi. Monimuuttuja selviytymisen ja toistumisen analyysit tehtiin siksi, että Coxin suhteellisten riskien mallia käyttäen seuraavia kovariaatit: sukupuoli (mies tai nainen), ikä diagnoosin aikana ( 55 v, 55-70 v ja 70 v), kasvain vaihe (1-4) ja kasvaimen histologinen (no = 1, kohtalaisen = 2 ja huonosti = 3 eriytetty karsinoomat mukaan Maailman terveysjärjestö WHO pään ja kaulan karsinooma luokittelu (2005) yhdessä PINP ekspressiokuviota muuttujia kuten. Coxin tehtiin käyttäen taaksepäin vaiheittain valikoima muuttujia, ja

p

arvo 0,05 hyväksyttiin rajana sisällyttämistä kovariaattina.

tulokset

BMMSCs aiheuttaa kielen syöpäsoluinvaasiota vuonna 3D in vitro organotyyppisissä mallissa

vaikutus BMMSCs kielessä syöpäsoluinvaasiota tutkittiin myoma organotyyppisissä malli [29], joka on enemmän uskollinen ihmisen TME kuin edellinen eläinkudosta johdettu malleja. ihmisen kielen karsinoomasoluja, HSC-3, SAS tai dysplastisia DOK soluja viljeltiin kuten monokulttuuri tai yhteistyössä kulttuurin BMMSCs päällä myoma levyjä. Sen jälkeen 10-14 päivä hyökkäyksen alue ja syvyys kvantitoitiin analysoimalla kuvaa otettu pancytokeratin värjätään histologisia osastoja monokulttuurin ja yhteistyön kulttuuri levyjä. Kuten kuviossa 1 on esitetty, BMMSCs indusoi kasvua hyökkäyksen alueella, ja jopa selvempi vaikutus nähtiin invaasion syvyyteen HSC-3-BMMSCs co-viljelmissä (kuvio 1A-1B). Lievää hyökkäys alueella nähtiin myös SAS solujen läsnä ollessa BMMSCs, vaikkakaan ei tilastollisesti merkitsevä. Kuitenkin näyttänyt olevan mitään vaikutusta invaasio syvyys (kuvio 1 C-1D). Mielenkiintoista on, BMMSCs esti hyökkäyksen dysplastic DOK soluja (kuvio 1 D-1E), mikä viittaa erilaisen vaikutuksen BMMSCs on karsinoomasoluja verrattuna ei-pahanlaatuisia soluja.

Luuydinperäiset BMMSCs parantaa hyökkäyksen HSC-3-solut (A, B), mutta ei dysplastisia soluja (E, F) 3D myoma organotyyppisissä malli [29]. Minor kasvu, vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, nähtiin hyökkäys alueella SAS (C, D). Histologinen osat saatu myoma levyt värjättiin monoklonaalisella pancytokeratin vasta-aineella (DAKO, klooni AE1 /AE3) ja valokuvattiin 100 x suurennuksilla kanssa DMRB valokuva mikroskoopin kytketty DFC 480 kameraan QWin V3 ohjelmisto (Leica). Mittakaava 100 pm.

Tutkia jos lisääntynyt hyökkäyksen HSC-3-soluissa oli lisääntyneen solujen lisääntymistä, HSC-3 ja SAS soluja viljeltiin päälle myoma levylle monokulttuuria tai co -Kulttuuri kanssa BMMSCs tai gfs. Histologinen osat on saatu näiden levyjen immunovärjättiin leviämisen merkki Ki67 ja positiiviset solut laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solujen lisääntyminen tasot olivat huomattavasti alhaisempia HSC-3 ja SAS co-viljelmiä BMMSCs verrattuna yhteistyössä viljelmien GFS (kuva 2A-2B). Vahvistaa, että vaikutus nähdään histologinen kohdissa tuli alennetussa syöpäsolujen lisääntymistä, HSC-3-soluja viljeltiin, kuten mono- tai co-kulttuurin soluviljelykammion liukuu BMMSCs leimattu fluoresoivalla värillä. Sen jälkeen kun yhdessä viljelemisen yön yli, solut värjättiin Ki67. Kuten kuviossa 2C on esitetty, BMMSCs esti HSC-3-solujen lisääntymisen merkittävästi myös solujen yhteisviljelmässä määrityksessä. Elinkelpoisuuden HSC-solujen pysyi edelleen korkea ja mitään merkkejä apoptoosin havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

histologiset kohdat saatu myoma levyt värjättiin polyklonaalisella anti-Ki67 vasta-aine. BMMSCs estävät leviämisen HSC-3 ja SAS solujen organotyyppisissä invaasiota malli (A, B) sekä soluviljelymäärityksillä (C), ja vaihda HSC-3, mutta ei dysplastisia DOK soluja kohti muuttavien fenotyyppiä vähemmän solu-solu yhteystiedot (D, nuolenpäitä). Normaali ikenen fibroblastit, GFS, edistää haavan sulkeminen yli BMMSCs mahdollisesti osittain johtui kasvusta soluproliferaatioon syöpäsolujen (E). Mittakaava 50 pm.

Koska lisääntymistä ei korotettu, voidaan arvioida, lisääntynyt hyökkäys oli seurausta korkeamman syöpäsolun muuttoliike naarmu määritys suoritettiin HSC-3 ja DOK soluja ympätään yksinään tai yhdessä BMMSCs tai GFS 24-kuoppaisille levyille. BMMSCs siirtynyt HSC-3-soluissa, mutta ei dysplastic DOK soluja, kohti muuttavien ilmiasuun lamellipodioihin rakenteet ja vähemmän solu-solu kontaktit (kuvio 2D). Kuitenkin GFS edistänyt nopeampi haavan sulkemiseen kuin BMMSCs, mikä saattaa osittain johtua vaikutuksista seerumin leviämisen kapasiteetti syöpäsolujen (kuvio 2D-2E) B

ilmentyminen kemokiinin CCL5- on säädellään ylöspäin BMMSCs jälkeen vuorovaikutus syöpäsolut

BMMSCs viljeltiin sitten käsitellyllä median saatu HSC-3. Vaikka useita geenejä säädellään ylöspäin, Suurinta kasvu geeniekspression BMMSCs nähtiin kemokiinin geenejä (taulukko 2). Kun kemokiinin ilmentyminen tutkittiin proteiinin tason ilmentymistä CCL5 havaittiin olevan pääasiassa seurausta vuorovaikutuksesta HSC-3 ja BMMSC soluja pikemminkin kuin yhteistyössä viljelmistä HSC-3-soluissa ja GFS (kuvio 3A). Samanlaisia ​​havaintoja saatiin co-viljelmistä SAS ja BMMSCs, mutta ei DOK soluista vuorovaikutuksessa BMMSCs (kuvio 3A). Tällä proteiini tasolla ylössäätöä useimpien kemokiinien listattu taulukossa 2 havaittiin olevan peräisin OTSCC solulinjoista vuorovaikutusta sekä BMMSCs ja gfs. Jotkut kemokiinit, kuten CCL2, CCL20 ja CXCL8, myös säädelty seurauksena vuorovaikutukset BMMSCs ja DOK soluja, kuten tutkittu immunomäärityksissä (tuloksia ei ole esitetty).

Gene

Symbol

kertamuutos

kemokiini (CC motiivi) ligandin 2CCL2830.66chemokine (CC motiivi) ligandin 5CCL5194.90chemokine (CC motiivi) ligandin 20CCL20182.23chemokine (CXC-motiivin) ligandin 1CXCL1134.91chemokine (CXC-motiivin) ligandin 2CXCL280.98chemokine (CXC-motiivin) ligandin 3CXCL380 .14chemokine (CXC-motiivin) ligandin 5CXCL573.90chemokine (CXC-motiivin) ligandin 8 (interleukiini 8) CXCL8 (IL8) 18.06chemokine (CC motiivi) ligandin 13CXCL1316.86Table 2. Up-kemokiini geenien BMMSCs jälkeen altistaa loppukäsitellyksi HSC-3 soluviljelyalustoja (fold muutos 2).

CSV Lataa CSV

Co-viljelmä OTSCC solujen BMMSCs tuloksia korkean ilmentymisen kemokiinin CCL5- HSC-3 ja SAS soluja, mutta ei dysplastic DOK soluissa (A). Toiminto-esto monoklonaalinen vasta CCL5- (Mab CCL5-) hieman estää BMMSC parannettu hyökkäystä alueella, mutta sillä ei ole vaikutusta invaasio syvyyttä, kun taas vasta-aine CXCL1 ei lisää estävä vaikutus OTSCC invaasiota (B, C).

Function-estävää vasta-ainetta vastaan ​​CCL5- estää BMMSC lisääntynyt invaasio alue

vieressä tutkitaan tärkeyden CCL5- leviämisen kielen syövän, koska CCL5- on osoitettu edistää liikkuvuutta suun syöpäsolujen [32]. CCL5 osoitettiin myös olevan tärkeitä syövän etenemisen useiden syöpien, kuten rinta- ja kolorektaalisyövän [17,33]. Siksi testasimme vaikutus CCL5- toiminta-estävää vasta-ainetta on OTSCC ja BMMSC yhteistyössä kulttuureissa 3D hyökkäyksen mallia. Testasimme myös mahdollista vaikutusta aineen estävällä funktiolla vastaan ​​CXCL1 päällä hyökkäystä, koska CXCL1 myös siitä peräisin BMMSC-HSC-3 vuorovaikutus ja se on aiemmin osoitettu olevan läsnä syöpiä, kuten rinta-, keuhko-, peräsuolen ja eturauhasen syöpiä tukenut eikä tukahduttaa syövän etenemistä [34-36]. Suun syöpä CXCL1 on ehdotettu olevan rooli syövän etenemisen sillä potilaan näytteitä ilmentymisen CXCL1 on osoitettu liittyvän leukosyyttien infiltraatiota, imusolmuke etäpesäke ja angiogeneesiä [37]. Kuten on esitetty kuviossa 3, CCL5 toiminto-esto monoklonaalinen vasta-aine kykeni huomattavasti heikentämään BMMSC-edistää HSC-3 soluinvaasion alueella, mutta sillä ei ollut vaikutusta invaasion syvyyteen (kuvio 3B-3C). CXCL1 ei ollut vaikutusta hyökkäystä, koska se ei lisännyt estävä vaikutus CCL5- 3D invaasion malli (kuva 3B-3C).

potilasnäytteistä CCL5- ilmaistaan ​​pääasiassa tulehdussolujen ja joitakin syöpäsoluja, mutta vain harva valuuttalisiin ovat CCL5- positiivisia

Seuraavaksi arvioida tärkeyttä CCL5- ilmentymisen potilaan Tuumorinäytteissä diagnostiikka kielen syöpä, histologisia osat edustavat eri vaiheissa dysplastisia vaurioiden ja kielen karsinoomat ihmisen potilasta värjättiin anti-CCL5- vasta-aine. Ilmentyminen CCL5 oli enimmäkseen havaittu tulehdussolujen ja joissakin syöpäsoluissa (kuvio 4A-4B), mutta vain harva valuuttalisiin olivat CCL5 positiivisia, arvioituna immunohistokemiallisella kolokalisaation CCL5 ja CAF markkeri αSMA (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin ilmaus CCL5 ei liittynyt kliinisen tuloksen OTSCC potilailla (ei esitetty). Ilmentyminen CCL5- edelleen normaalipainoisille ensisijainen suun fibroblasteja (NOF, [28]) ja CaDEC12 soluihin [11]. Immunomääritys havaitsemiseksi erittyy CCL5- in soluviljelyalustoissa oli hyvin vähäinen tai olematon CCL5- ilmentymistä normaaleissa fibroblasteissa, mutta huomattavasti korkeampi ilmentyminen CaDEC12 soluissa (kuvio 4C).

CCL5 ilmentyy pääasiassa tulehdussolujen TME ja joidenkin syöpäsolujen potilaan näytteissä, kuten on esitetty immunovärjäämällä Pab CCL5, mutta vain harva valuuttalisiin ovat positiivisia CCL5 (A, B). CaDEC12 solujen primaariviljelmiä valuuttalisiin saatu kielen syöpäpotilailla, näihin suhteellinen määrä CCL5 verrattuna NOFS, normaali suun fibroblasteja (C). Mittakaava 100 pm.

rooli CCL5- /CCR5-akseli ei ole kriittinen BMMSC lisääntynyt kielen syövän invaasio

CCL5- signalointi syöpäsoluissa on ehdotettu välittyvän lähinnä, mutta ei välttämätön ainoastaan, kautta CCR5-reseptorin [38]. Sekä HSC-3: n ja SAS-soluja osoitettiin ilmentävän tämän reseptorin (kuvio 5A). Yhteistyössä kulttuurin suunnilleen kaikki syöpäsolut ilmaistuna CCR5 kuitenkin monokulttuurien vain noin 25% syövän solut olivat positiivisia CCR5 viittaa siihen, että kontaktin stroomasolut tai CCL5 induktio tarvitaan suurempi CCR5 ilmentymisen (virtaussytometria-analyysi; tuloksia ei ole esitetty ). Yhdistyksen CCL5- ja CCR5 ilme on ehdottanut äskettäin myös muut [39,40]. Kuten CCL5-CCR5-akselilla on osoitettu edistävän motiliteettia ihmisen suun syöpäsolujen

in vitro

[32], ja indusoida MMP-9 [32], tutkimme myös vaikutusta rCCL5 on MMP-9 ilmaisun tasoilla HSC-3 ja SAS sekä dysplastic DOK soluissa. Aikaisempien tarkkailu Chung ja työtoverit [32] rCCL5 selvästi lisääntynyt ilmentyminen MMP-9 HSC-3-soluissa ja SAS soluja, mutta ei dysplastic DOK soluissa (kuvio 5B). Kuitenkin, rCCL5 ei aiheuttanut epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), kuten analysoitiin Western-blottauksella anti-vimentiinin vasta-ainetta, tai syöpäsolujen lisääntymistä (tuloksia ei ole esitetty).

CCL5- CCR5 ilmaistaan ​​HSC-3 ja SAS soluja, mutta ei BMMSCs (A). rCCL5 voi indusoida MMP-9 HSC-3: n ja SAS, mutta ei DOK soluissa (B). Vaiennettaisi ilmentymisen CCR5-reseptorin HSC-3-solujen downregulates geenin ilmentyminen noin 70% kontrolliin verrattuna soluihin ja estää signaloinnin lisäämällä ilmentymistä MMP-9 syöpäsoluissa (C, D). CCR5 pudotus on vähäinen tai ei lainkaan vaikutusta BMMSC tehostettu hyökkäys HSC-3 solujen 3D organotyyppisissä malli (E, F).

Tutkiakseen tärkeyden CCL5- /CCR5 akselin leviämisen kielen syövän, teimme 3D hyökkäyksen tutkimuksen SAS ja HSC-3 OTSCC solujen pienentää CCR5 ilme ja toiminta-estävää vasta-ainetta vastaan CCL5-. Ensin esti ilmentymistä CCR5 transdusoimalla HSC-3-solujen kanssa CCR5-shRNA ja tuotettu stabiili solulinja, jossa on ~ 70%: n inhibitio CCR5 ilmaisun ja vähentää vaste rCCL5 induktion (kuvio 5C, 5D). 3D Yhdessä viljelemisen invaasiomääritys CCR5 pudotus solut tunkeutuneet yhtä tai kuin villityypin tai ohjata HSC-3-solujen transdusoitu kuin hiljentäminen shRNA (kuvio 5E, 5F). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös, jossa monoklonaalinen vasta-aine CCR5 (tuloksia ei ole esitetty).

Expression kollageenin ja epiteelin plastisuus komponentit indusoituvat syöpäsoluissa jälkeen BMMSC vuorovaikutus

Mahdolliset mekanismit hyökkäyksen edistävää vaikutusta BMMSCs syöpäsoluihin tutkittiin edelleen microarray analyysi. HSC-3-soluja käytettiin kokeissa, koska ne vastasivat selvemmin BMMSCs kuin SAS-solujen, erityisesti 3D-invaasion malli. HSC-3-soluja viljeltiin niin Monokulttuuri tai rinnakkaisviljelemällä BMMSC solua 6-kuoppalevyillä 24 tuntia, minkä jälkeen HSC-3-solut lajitellaan pois yhteisviljelmissä FACS (ei esitetty) ja RNA uutettiin mikrosiruanalyysillä .