Krooninen sairaus

tiivistelmä

äskettäin löydetty gammaretrovirus, kutsutaan XMRV, äskettäin raportoitu olevan läsnä eturauhassyöpäsolulinja CWR22Rv1. Käyttämällä molempia immuunihistokemiallisesti laaja-reaktiivinen hiiren leukemiaviruksen (MLV) ja anti-seerumia, ja PCR: ää määritetään, onko lisää eturauhassyövän tai muut solulinjat sisältävät XMRV tai MLV-liittyvät virukset. Tutkimuksemme oli mukana yhteensä 72 solulinjojen, johon sisältyi 58 60 ihmisen syövän solulinjoja käytetään syövän huumeiden näytöt ja ylläpidettiin NCI-Frederick (NCI-60). Olemme tunnistaneet gammaretroviruses kahdessa muussa eturauhassyövän solulinjoissa: LAPC4 ja Vcap, ja osoittavat, että nämä virukset ovat replikaatiokykyisiin. Viral Genomikartoituksen tunnistettu virusta LAPC4 ja VCAP kuin lähes identtinen toisen tunnetun ksenotrooppisen MLV,

BXV

-1. Olemme myös tunnistaneet gammaretrovirus on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjassa EKVX. Eturauhassyöpäsolulinjoissa näyttää olevan taipumus tartunnan hiiren gammaretroviruses, ja ehdotamme, että tämä saattaa olla osittain johtuu solulinjaan toimipaikkaan ksenograftin passage immuunipuutteisilla hiirillä. On epäselvää, jos infektio näitä viruksia on tarpeen solulinjan perustaminen, tai mitä sekoittavia rooli niillä saattaa olla kokeissa suoritettiin näiden yleisesti käytettyjen linjat. Tärkeää on, tulokset viittaavat siihen tarvitaan säännöllistä syöpäsolulinjois- retroviruksen ”saastuminen”, aivan kuten rutiininomainen mycoplasma testaus.

Citation: Sfanos KS, Aloia AL, Hicks JL, Esopi DM, Steranka JP, Shao W, et ai. (2011) tunnistaminen replikaatiokykyistä Hiiren Gammaretroviruses yleisesti käytetyissä eturauhassyöpäsolulinjoissa. PLoS ONE 6 (6): e20874. doi: 10,1371 /journal.pone.0020874

Editor: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Ranska

vastaanotettu: 24 helmikuu 2011; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2011; Julkaistu: 17 kesäkuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: K.S.S. tukivat tutkijatohtorin palkinnon Estä Syöpäsäätiön. Tämä tutkimus tuettiin osittain Intramural tutkimusohjelma NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. IHC tutkimukset tukivat NCI-SPORE eturauhassyövässä P50CA58236. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ksenotrooppiset Hiiren leukemiavirus liittyvistä virus (XMRV) raportoitiin ensimmäisen kerran vuonna 2006 uutena gammaretrovirus löytyy eturauhaskudoksiin eturauhassyöpään potilaista [1]. Myöhemmät tutkimukset eivät päässeet yksimielisyyteen esiintyvyys viruksen eturauhassyövän, joissa ilmoitettuihin vaihteli 0%: sta noin 27% (tarkistetaan [2], [3]). Vuonna 2009 raportoitiin, että yleisesti käytetty eturauhassyöpäsolulinja CWR22Rv1 sisältää replikaatiokompetentin XMRV, ja tuottaa viruksen korkeilla tasoilla kulttuuri [4].

Sitä ei toistaiseksi tiedetä tarkasti, miten CWR22Rv1 solulinja tautitartuntaa kanssa XMRV. Yksi selitys on, että virus oli eturauhassyövän, josta solulinja perustettiin. Jos todistettu, tämä löytö tukee näkemystä, että XMRV on läsnä ihmisessä ja voivat perustaa tartunnan ihmisen eturauhasen. Toinen selitys voisi olla, että solulinja infektoitiin jälkeen solut poistettiin potilaasta, esimerkiksi aikana ksenotransplantaatioon immuunipuutteisilla hiirillä (yleisesti käytetty ja usein välttämätöntä käytäntöä perustamiseen eturauhassyöpäsolulinjoissa). Itse asiassa viimeaikaiset tiedot esittämä Pathak

et. al.

klo 17

th konferenssi retrovirukset ja opportunistiset infektiot (Croi) tarjoavat vahvoja perusteita joka XMRV todennäköisesti alkunsa rekombinaation kahden erillisen ja puutteellinen endogeenisen MLV että tartutti CWR22 ihmisen syöpäsoluja jossain vaiheessa prosessi sarjareittien soluista ksenograftissa (katso [5] tarkistettavaksi). Tämä -ksenografti käytettiin myöhemmin tuottaa solulinja, CWR22Rv1, joita viljellään useissa laboratorioissa ympäri maailmaa, joissa tutkitaan eturauhasen syöpä. Raportit infektion ihmisen solulinjojen eläinten retroviruksia ovat melko yleisiä kirjallisuudessa [6], [7], [8], (tarkistetaan [9]), ja se on hyvin dokumentoitu esiintyvän seuraavia Ksenotransplantaation solujen ja kudosten immuunipuutteisilla hiiret (tarkistetaan [10]). Myös raportoitu retrovirusinfektiolla solulinjoja, jotka selvästi tapahtunut kulun kulttuurin, koska linjat koskaan siirrostettiin hiirillä [9], [11]. Muita potentiaalisia solulinjan infektion retrovirusten kuuluvat laboratorio- saastuminen ja käyttöä retrovirusvektorien tutkimukseen [9]. Mikä tärkeintä, on vain harvoja esimerkkejä, joissa retrovirus- läsnäolo viljellyissä ihmisen soluissa voitiin jäljittää todellisen infektion potilaaseen. Yksi vakiintunut esimerkki tästä on löytö ihmisen T-lymfotrooppinen virus 1 (HTLV-1), viljellyissä soluissa sairastavien potilaiden T-solulymfooma [12].

löytö XMRV on CWR22Rv1 solulinja sai meidät kyselemään muita eturauhassyöpäsolulinjoissa läsnäolo XMRV tai muiden hiiren gammaretroviruses. Jos lähde retrovirusinfektiolla ei eturauhasen syöpä potilas, mutta käyttöön viemällä eläimiä tai laboratoriossa saastuminen, sitten läsnäolo replikaatiokompetentin retrovirusten yleisesti käytetty eturauhassyövän solulinjoissa tutkimuksen saattaisi olla vaikuttavat sekoittavat kokeelliseen tuloksiin.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

Lähde solulinjojen ja kuvaus solulinjan kudosten microarray (TMA) rakentaminen on järjestetty Text S1. Kaikki käytetyt solulinjat olivat todennettu kautta lyhyitä tandem-toisto (STR) profilointi 9 genomista lokusten kanssa Powerplex 1,2 (Promega) ennen sisällyttämistä TMA.

XMRV /MLV immunohistokemia (IHC) B

diat sisältävät osat formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kontrollisoluja tai TMA poistettiin parafiini ja höyrytettiin 25 min. sitraatti- pohjainen paljastumista ratkaisu antigeenin hakuun (Vector Laboratories). IHC (myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit) joko anti-p30 (MLV30) tai anti-gp70 (MLV70) antiseerumit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [3].

XMRV ja MLV PCR

Perimän DNA: ta (gDNA), uutettiin viljelty solu pelletit kustakin solulinjoja käytetään TMA käyttäen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). DNA amplifioitiin ensin genomi-GAPDH PCR-alukkeita (GAPgen-F 5′-GGGCTCTCCAGAACATCATCC-3 ’ja GAPgen-R 5′-GTCCACCACTGACACGTTGG-3′), laadun varmistamiseksi, että DNA-templaatin. MLV-spesifinen aluke (In-For) sekä XMRV-spesifisten reverse-alukkeen (poistetaan-Rev) olivat, kuten aiemmin on kuvattu [13], jossa on odotettu tuote koko 104 bp. Degeneroitunut Pan-MLV alukesekvenssit olivat seuraavat: Pan-MLV-F 5’-GCARCCCWGGGAGACGTC-3 ’ja Pan-MLV-R 5′-AGACRCGCRGCGCGGYT-3’, jossa on odotettu tuote kooltaan noin 206 bp (181 bp XMRV ). PCR suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 ui (joka sisälsi 1 x PCR-puskuria, 1,5 mM MgCl

2, 200 uM dNTP: itä, 400 nM F ja R-aluketta, 1 U AmpliTaq Gold, Applied Biosystems) käyttäen noin 100 ng gDNA varten malli ja seuraavat sykliparametrit: 95 ° C 2 min .; 40 sykliä 95 ° C 30 s., 54 ° C 1 min. (Pan-MLV-alukkeet) tai 64 ° C: ssa 30 sekuntia. (XMRV alukkeita), 72 ° C 30 sekuntia .; lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. Sarjalaimennokselle testit CWR22Rv1 gDNA osoitti, että degeneroitunut Pan-MLV PCR-määritystä herkkyys oli havaita viruksen alas 0,1 ng CWR22Rv1 gDNA (vastaa ~100-200 virus- genomien tai ~10-20 tartunnan saaneiden solujen [3], [ ,,,0],4]) ja XMRV PCR-määritys kykeni havaitsemaan alas 1-2 virusgenomien (kuva S1). Ero herkkyyttä voidaan todennäköisesti selittää osittain käyttämällä degeneraattialukkeiden Pan-MLV PCR.

Pitkän kantaman PCR ja sekvensointi virusgenomien

Täyspitkä tai lähellä täysi pituus virusgenomit monistettiin genomisesta DNA: sta valmisteet LAPC4, Vcap ja EKVX solulinjoja ja sekvensoitiin, kuten on kuvattu teksti S1 ja Taulukko S2.

fylogeneettinen analyysi

Täyspitkä genomien tunnetuista endogeenisia MLV sekvenssit [14] ja virus genomit eristetty LAPC4, VCAP ja EKVX rinnastettiin käyttäen ClustalW. Perustuen linjaus, naapuri-liittymällä puu synnytettiin käyttäen oletusasetuksia MEGA version 5 (MEGA 5) [15].

infektiivisyysmääritys

Solun viiva supernatantit kerättiin 24 tunnin kuluttua . kulttuuriin ja suodatetaan 0,45 um: n suodattimen. Tarttuvuuden määrityksessä käytetään iGLuc-Derse soluja, 293 MCAT pohjainen solulinja, joka tuottaa

Gaussia

Luciferase (Gluc) entsyymi vasta infektio, johon replikaatiokompetentin MLV. iGLuc-Derse soluja ympättiin 3,5 x 10∧4 solua /kuoppa 12-kuoppalevyllä. Soluja käsiteltiin 20 ug /ml DEAE-dekstraania 30 min. DEAE-dekstraani poistettiin sitten ja solut huuhdeltiin media. Seuraavaksi 500 ui kutakin supernatanttia lisättiin iGLuc-Derse solujen kolmena kappaleena. Soluja inkuboitiin 3 tunnin ajan. ja 400 ui muuta mediaa lisättiin. Kaksi ja kolme päivää infektion jälkeen 10 ui median kustakin kuopasta määritettiin lusiferaasiaktiivisuus. 3 päivää infektion jälkeen, solut siirrostettiin. Kaksi päivää sen jälkeen, kun solun kulkua, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin uudelleen. Soluja siirrostettiin yhteensä 13 päivää. Lisätietoja solulinjan annetaan tulevassa julkaisussa.

Vectorette PCR

Vectorette PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, 2 ug genomista DNA: ta pilkottiin yön yli sopivassa lämpötilassa seuraavilla restriktioentsyymeillä:

Ase

I,

BspH

I,

BstY

I,

Hind

III

Nco

I, ja

Pst

I. Vectorette oligot lämpökäsiteltiin sitten yön yli 4 ° C: ssa konsentraatiossa 1 uM käyttäen T4-DNA-ligaasia (New England Biolabs). Vectorette PCR suoritettiin käyttäen virus-specific forward-aluketta (joko Virus-VEC-F1 5′-GACTGAGTCGCCCGGGTACC-3 ’, tai virus-VEC-F2 5′-CGCTTCTCGCTTCTGTAACCGCG-3’, sekä 3 ’LTR in nukleotidiasemasta 8525 ja 8437 ja Xmv43, vastaavasti) ja Vectorette-spesifinen reverse-aluketta (5’-CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA-3 ’). PCR-tuotteet puhdistettiin geelillä ja kloonattiin pCR®2.1-TOPO-vektoriin (Invitrogen). Transformoidut bakteeri- pesäkkeet valittiin sattumanvaraisesti sekvensointiin.

Tulokset

LAPC4, VCAP ja EKVX syövän solulinjat ovat saaneet hiiren leukemia virus, joka ei ole XMRV

Koska aloitusnäyttöruudulle hiiren gammaretroviruses ihmisen solulinjoissa, käytimme kudos microarray (TMA), joka sisälsi yhteensä 72 solulinjojen, joka sisälsi 58 60 ihmisen syöpäsolulinjoja käytettiin antisyöpälääkeaine näytöt ja ylläpidetään NCI-Frederick (NCI -60) (taulukko S1). Kuten kuviossa 1A, IHC kanssa laajasti reaktiivisen antiseerumeja Moloneyn (Mo-MLV) p30

CA (MLV30) tai gp70

SU (MLV70) [3] tunnistettiin kolme eturauhassyövän solulinjoissa (CWR22Rv1, LAPC4 [17], VCAP [18]) positiivisina virus. Vaikka CWR22Rv1 oli aiemmin raportoitu saaneen replikaatiokompetentin XMRV [4], LAPC4 ja VCAP ei tiedetä sisältävän retroviruksia. Mielenkiintoista on, aikaisemmassa tutkimuksessa, soluviljelyalustoja alkaen VCAP oli anecdotally raportoitu näyttämään virusvaikutusta [4]. Olemme myös tunnistaneet ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjassa, EKVX, olevan positiivinen virus.

(A) Esimerkkejä MLV-negatiivinen (DU145) ja positiivisia (CWR22Rv1, LAPC4, VCAP ja EKVX) syöpäsolun linjat värjättiin MLV30 ja MLV70 antiseerumeita. (B) Positiivinen värjäytyminen LAPC4, VCAP ja EKVX ei edusta XMRV. Kaistat 1-7, PCR MLV-spesifisiä alukkeita (1 = CWR22Rv1, 2 = LAPC4, 3 = VCAP, 4 = DU145, 5 = LNCaP, 6 = PC3, 7 = EKVX), kaistat 8-11, PCR XMRV- spesifisiä alukkeita (8 = CWR22Rv1, 9 = LAPC4, 10 = Vcap, 11 = EKVX). Ero tuote kooltaan CWR22Rv1 (kaista 1) ja LAPC4, VCAP tai EKVX (kaistat 2,3,7) johtuu XMRV-erityinen 24-nt poistamista [13]. L = molekyylipaino tikkaat.

seuraavaksi käytetään PCR-määrityksessä onko LAPC4, VCAP ja EKVX sairastaa XMRV. Kuten kuviossa 1B, PCR degeneroitunut yleiseurooppalainen MLV alukkeita (suunniteltu pitkälti monistamaan MLV lajit) tunnistettiin positiivinen tuotteen odotettavissa CWR22Rv1, LAPC4, VCAP ja EKVX. Myös odotetusti perustuva IHC tuloksiin, PCR degeneroitunut MLV alukkeiden oli negatiivinen eturauhassyövän solulinjoissa DU145, LNCaP ja PC3. PCR: llä alukkeilla, jotka kattavat 24 nukleotidin deleetio, jotka sisältyvät genomiin XMRV, mutta ei millään muulla tunnetulla MLV [13] oli vain positiivinen CWR22Rv1 (kuvio 1 B), mikä osoittaa, että virus (es) läsnä jäljellä solulinjoja, jotka olivat positiiviset IHC eivät XMRV. Täydelliset tulokset IHC ja PCR: ää 72 solulinjoissa on esitetty taulukossa S1. Kontrolloida sitä mahdollisuutta, että positiivinen PCR tulokset voivat johtua hiiren DNA saastuminen, testasimme kaikki positiiviset solulinjat kanssa PCR-määritystä hiiren intrakisternaalisen Hiukkanen (IAP) kuten aiemmin on kuvattu [19]. Kuten kuviossa S2, yksikään solulinjojen havaittiin olevan positiivinen kontaminoivaa hiiren DNA: han. IAP määritys on aiemmin osoitettu olevan erittäin herkkä hiiren DNA, ja out-suorittaa PCR-perustaiset määritykset hiirelle mitokondriaalisen DNA (mtDNA) [19].

Viral Genomikartoituksen, fylogeneettinen analyysi ja integrointi sivuston kartoitus

sen määrittämiseksi identiteettiä virusten läsnä LAPC4, VCAP ja EKVX, suoritimme pitkän kantaman PCR ja sekvensointi kuvatulla tavalla Text S1. 8046 nukleotidisekvenssi (GenBank Accession # JF908817) saatu EKVX ryhmittyneet kanssa ksenotrooppinen MLV ryhmä fylogeneettinen analyysi, mutta ei ollut identtinen minkään MLV, joista täyspitkä genominen sekvenssi tunnetaan (kuvio 2, tukeminen kuva S3). Tämä sekvenssi määritettiin myös NCBI BLAST Tietokantahauissa olevan 98% samanlainen kuin retrovirus aiemmin eristettiin DG-75 B-lymfoblastoidisolulinja [20], ja identtinen osittainen

pol

ja

env

sekvenssit eristettiin EKVX toisessa tuoreessa tutkimuksessa [8].

fylogeneettisen puun edustaa tunnettua ksenotrooppiset MLV sekvenssit. Tämä puu on vain ksenotrooppinen MLV, joissa varsinaista provirus- sekvenssi tunnetaan, mikä on todennäköisesti vain pieni osa kaikista endogeenisen ksenotrooppinen MLV läsnä hiirillä.

LAPC4 ja Vcap, Vectorette PCR suoritettiin määrittää viruksen integraation sivustoja ja 5 ’ja 3’ päissä virusgenomien. Lähes identtisiä (99% samankaltaisia) virusgenomeja 8657 nukleotidiä (GenBank Accession # JF908815, JF908816) sekvensoitiin päässä LAPC4 ja Vcap solulinjat. NCBI BLAST ja Ensembl tietokantahakuihin paljasti lähes täydellisesti (99%) sisältämän sekvenssin kromosomissa 1 C57BL /6J hiiri genomin (nukleotidipaikasta 172871652-172880308). Tämä sijainti kartat tunnettuun hiiren ksenotrooppiset gammaretroviral provirussekvenssejä kutsutaan

BXV

-1 (tai XMV43) [21]. Fylogeneettinen analyysi paljasti myös, että LAPC4 ja VCAP virukset ovat fylogeneettisesti samanlaisia ​​kuin

BXV

-1 (kuvio 2, tukeminen kuva S3).

BXV

-1 on ehjä ja tarttuva provirus ja vaikka yleisesti käytetty eturauhassyövän solulinjoissa ei tiedetä esiintyvän tämän viruksen,

BXV

-1 tiedetään kykenevän tartuttamaan tuumorisoluja kuljetettiin läpi heikentyneisiin hiirissä [22]. Testasimme VCAP solulinja suoraan ATCC ja vahvisti, että hajautettu VCAP on positiivinen virus. Vahvistamaan, että infektio LAPC4 solujen edustaa infektio, joka oli läsnä alussa passage LAPC4 (vastakohtana saastuminen meidän laboratorio), saimme LAPC4 solut jäädytettiin vuonna 1998 sekä soluja nykyisin viljellään laboratoriossa (eli vuodesta 2010 ) päässä CL Sawyersilta laboratorioon Memorial Sloan Kettering Cancer Center [17]. Kuten kuviosta S4, kaikki LAPC4 solut testattiin päässä Sawyersilta lab olivat positiivisia viruksen.

varmistamiseksi edelleen, että LAPC4 ja VCAP solulinjat ovat sairastuneet integroidulla

BXV

-1 provirukseksi, kartoitimme useita viruksen integraation sivustoja kummankin riviä käyttäen Vectorette PCR [16]. Mielenkiintoista, virus integraatio sivustot tunnistettiin introni alueilla useiden geenien sekä LAPC4 ja VCAP (taulukko 1). Ei yhteistä integrointi sivustoja tunnistettiin kahden solulinjoista; odotamme kuitenkin, että listan integraation sivustojen taulukossa 1 ei ole tyhjentävä. Valitse integraatio sivustot olivat edelleen todennetaan LAPC4 ja VCAP käyttämällä pitkän kantaman PCR ja alukkeita, joka kesti integraatio sivustoja (taulukko 1).

Infected syövän solulinjat tuottavat replikaatiokompetentin virus

Voit varmistaa, että yleisesti käytetty eturauhassyövän solulinjoissa LAPC4 ja VCAP sisältävät integroidun ja replikaatiokompetentin virus, teimme virusinfektiivi- määritystä. Indikaattori solulinja, iGLuc-Derse solut, vain erittävät

Gaussia

lusiferaasientsyymi seuraava infektio, johon replikaatiokompetentin MLV.

Gaussia

havaittu lusiferaasiaktiivisuutta 48 tuntia infektion jälkeen iGLuc-Derse solujen supernatantti CWR22Rv1, LAPC4 ja Vcap solulinjoissa (kuvio 3). On kiinnostavaa, että kolmena kappaleena infektio iGLuc-Derse solujen supernatantti EKVX solulinja ei osoittanut

Gaussia

lusiferaasiaktiivisuus, kunnes 13 päivää (ja 3 kohtia) infektion jälkeen (kuvio 3). Edelleen, vain 2 3 infektioiden osoittivat lusiferaasiaktiivisuutta taustan yläpuolella. Siten viruksen EKVX soluista on ilmeisesti hyvin alhainen tarttuvuus, ainakin iGLuc-Derse solulinjassa. Ei

Gaussia

havaittu lusiferaasiaktiivisuutta soluista (siirrostettiin yhteensä 13 päivää) altistetaan supernatantti DU145, MycCaP (hiiren eturauhassyövän solulinja on saatu CL Sawyersilta lab) tai PC3 solulinjoja ( kuvio 3). CWR22Rv1 on aiemmin raportoitu aiheuttavan replikaatiokompetentteja XMRV [4], mutta se ei ole raportoitu, että LAPC4, Vcap ja EKVX tuottaa replikaatioon kykenevän viruksen.

10 ui elatusainetta määritettiin 2 päivää altistuksen jälkeen 24 tunnin ajan. soluviljelmän supernatantti CWR22Rv1, LAPC4 ja Vcap, ja 13 päivää (ja 3 kohtia) altistumisen jälkeen supernatantti EKVX, DU145, MycCaP (hiiren eturauhassyövän solulinja) ja PC3. Punainen viiva ilmaisee tausta lusiferaasiekspressiota joka määritetään mock-tartunnan ohjaus. Virhepylväät edustavat standardin keskivirhe 3 kokeita.

Ei huolta, että eturauhassyövän tuottavien solulinjojen replikaatiokompetentin virukset voivat cross-saastuttaa muita solulinjoja laboratoriossamme, jotka ovat negatiivisia MLV, me testattu nykyinen kulttuureissa laboratoriossamme läsnäolo MLV. Olimme hämmästyneitä kaksi kohtaa, joissa MLV-negatiivisia solulinjoja ylläpitää laboratoriossa (DU145, LNCaP) ovat saastuneet oltuaan MLV (kuva S5). Esimerkiksi kun nämä solulinjat saatiin suoraan ATCC (LNCaP) tai NCI (DU145) ne olivat negatiivisia viruksen, joka osoittaa, että linjat saastunut jossain vaiheessa kulttuurin laboratoriossa. PCR-analyysi, jossa XMRV-spesifisiä alukkeita osoitti, että kontaminoivat virus oli todennäköisesti XMRV, mahdollisesti viljelmän ohella CWR22Rv1 (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että jos CWR22Rv1 soluja viljellään rutiininomaisesti tyypillisessä biolääketieteellisen tutkimuksen laboratoriossa (esim tavallisilla luokan II Bioturvallisuuskaapit ja menettelyt soluviljelmässä, jossa kahden eri solu- linjat ovat koskaan läsnä konepellin alle samaan aikaan), että XMRV voi tartuttaa ja saastuttaa muut solulinjat.

keskustelu

Tutkimuksemme osoittaa, että eturauhassyövän solulinjoissa näyttäisi olevan taipumusta infektion hiiren gammaretroviruses. Ehdotamme, että tämä suuntaus saattaa johtua siitä, että suurin osa vakiintunut eturauhassyöpäsolulinjoissa luotiin viemällä heikentynyt immuunivaste hiirillä. Itse asiassa,

BXV

-1 on läsnä SCID ja

nude

hiirillä ja kasvainsoluja siirrostettiin läpi nämä eläimet voivat saada tartunnan kanssa ksenotrooppiset MLV [22]. Vaikka infektio ihmisen solulinjoissa hiiren gammaretroviruses on kuvattu aikaisemmin kirjallisuudessa, mikä tekee nykyinen tutkimus erityisen tärkeää on se, että ennen tätä tutkimusta ei ollut tiedossa, että useat yleisesti käytetyt eturauhassyövän solulinjaa saastuttamia MLV. Itse asiassa huomasimme aikana Tutkimuksemme että muut solulinjat ylläpitää laboratoriossa (DU145, LNCaP) ovat ilmeisesti saada tartunnan kanssa XMRV laboratoriossa.

yhdenmukaiset annettujen tietojen nykyisessä tutkimuksessa , tuoreessa tutkimuksessa Hue

et. al.

, joka seulottu 411 ihmisen kasvainsolulinjoja päässä Catalogue somaattisten mutaatioiden Cancer (COSMIC) kerääminen, EKVX todettiin olevan jonkin ksenotrooppiset MLV liittyvät viruksen suoralla sekvensoinnilla virus

gag

,

pol

ja

env

geenit [8]. Lisäksi Hue

et. al.

tutkimuksessa testattu kaikki, mutta 14 solulinjat tutkittiin olevassa tutkimuksessa (lukuun ottamatta LAPC4, LNCaP, PrEC, Vcap, CWR22Rv1, RWPE, abi, kyseistä luottoa, C4-2B, 957 E /h, PacMet UT1, MDA-PAC2b, DLD-1 ja Hep3B) samoin todennut niiden olevan negatiivisia MLV. Vaikka Tutkimuksen tekijät eivät yritä saada täysipitkän sekvenssin viruksen kontaminoivat EKVX tai osoittaa, että virus on replikaatioon kykeneviä, osittainen

pol

ja

env

sekvenssit Hue

et. al.

tutkimus (GenBank # FR670589 ja FR670597, vastaavasti) ottelu 100% samankaltaisuus lähes täyspitkän virussekvenssiin saatu tässä tutkimuksessa (GenBank # JF908817). Olemme nyt osoittaneet, että virus sisältyvät EKVX solulinja on replikaatiokompetentteja (kuvio 3), klusterien fylogeneettinen analyysi, joiden tiedetään ksenotrooppisia MLV (kuvio 2, tukeminen kuvio S3), ja se on 99% samanlainen kuin retrovirus aiemmin eristetty PO -75 B-lymfoblastoidisolulinja. Kuten kaikki eturauhassyövän solulinjoissa havaittiin sisältävän MLV esillä olevassa tutkimuksessa EKVX solulinja perustettiin ksenograftin liikkuminen on

nude

hiirillä [23].

On useita raportoitu esimerkkejä ja retrovirusinfektion muuttamalla biologiset ominaisuudet ihmisen solulinjoissa. Esimerkiksi

in vivo

immunogeenisuutta solulinjojen on osoitettu olevan voimakkaasti muuttunut annettaessa retrovirusinfektiolla kerta liikkuminen on

nude

hiirillä [24]. Samoin ksenotrooppiset MLV hankittu käytetyt solulinjat HIV tutkimuksen jälkeen

in vivo

passage immuunipuutteisilla hiiriä osoitettu muuttavan biologisia ominaisuuksia HIV-1 [25]. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että MLV usein yhdentää lähellä transkription aloituspaikkoja (5 kb ylävirtaan tai alavirtaan) aktiivisesti puhtaaksi geenien [26]. Kiinnostavaa kyllä, kaksi seitsemästä viruksen integraation sivustoja tunnistettu VCAP ovat 5 kb transkription aloituskohdasta (taulukko 1). Integraatio sivusto sijaitsee kromosomissa 1 sijaitsee noin 2 kb alavirtaan transkription aloituskohdasta ja EFCAB2 (EF-käden kalsiumia sitova alue 2) geenistä. Samoin integrointi päällä tunnistettu kromosomissa 7 sijaitsee noin 1,4 kb ylävirtaan LFNG (O-fucosylpeptide 3-beeta-N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi), liittyvän geenin Notch signalointia. Ei tiedetä, mitä sekoittavat vaikutukset infektion yleisesti käytetty eturauhassyövän solulinjoissa replikaatiokompetentteja hiiren gammaretroviruses voi olla kokeellinen tuloksia. Mielenkiintoista on, että on raportoitu, että XMRV proteiinit ovat runsaampia soluviljelyalustoissa on CWR22Rv1 soluja kuin mikä tahansa ihmisen proteiini [4]. Syistä, kuten tämä, ehdotamme, että syöpäsolujen linjojen tulisi käydä seulontakäytäntö saastuttaa MVL: itä, aivan kuten nykyinen käytäntö rutiini testaus viljeltyjen solujen mycoplasma.

tukeminen Information

teksti S1.

tukeminen menetelmiä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s001

(DOC) B Kuva S1.

määrittäminen herkkyyttä Pan-MLV ja XMRV-spesifinen PCR-määrityksissä. Sarjalaimennoksia CWR22Rv1 genomisen DNA: ta, joka oli lisätty 100 ng LNCaP (MLV-negatiivinen) genomista DNA: ta ja sitä käytettiin templaattina PCR: ssä. (A) Pan-MLV-alukkeet (B) XMRV alukkeita. Näytteet testattiin kahtena kappaleena: 1 ng CWR22Rv1 (kaista 1-2), 0,1 ng CWR22Rv1 (kaista 3-4), 0,01 ng CWR22Rv1 (kaista 5-6), 0,001 ng CWR22Rv1 (kaista 7-8), negatiivinen kontrolli (kaista 9-10). L = molekyylipaino tikkaat.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s002

(TIF) B Kuva S2.

Testing MLV-positiivisia solulinjoja läsnäolon kontaminoivien hiiren DNA: sta PCR-määritys IAP. Kaista 1 = C57BL /6J hiiren genomista DNA: ta (positiivinen kontrolli), kaista 2 = CWR22Rv1, kaista 3 = LAPC4, kaista 4 = VCAP, kaista 5 = EKVX, kaista 6 = negatiivinen kontrolli. Kaikki testatut solulinjat olivat negatiivisia kontaminoivan hiiren DNA. L = molekyylipaino tikkaat.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s003

(TIF) B Kuva S3.

Fylogeneettinen analyysi viruksen genomeja peräisin LAPC4, VCAP ja EKVX solulinjoissa. Fylogeneettiseen puu edustaa tunnettujen endogeenisten MLV sekvenssit, mukaan lukien polytrooppinen (PMV), modifioitu polytrooppi (Mpmv) ja ksenotrooppisia (Xm) viruksia. Tämä puu on vain endogeenisia MLV: t, joiden koko provirus- sekvenssi tunnetaan, mikä on todennäköisesti vain pieni osa kaikista endogeenisen MLV läsnä hiirillä. Eksogeeninen MLV (CAS-BR-E, AKV, MLMCG ja Friend) sisältyvät myös vertailun vuoksi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s004

(TIF) B Kuva S4.

Testing aikaisin kulku LAPC4 läsnäolon viruksen. Yleiseurooppalainen MLV alukkeita kuvattu kuviossa 1 käytettiin testaamaan LAPC4 soluja meidän laboratorio (kaista 1), varhainen kulku LAPC4 jäädytettiin vuonna 1998 C. Sawyersilta lab (kaista 2), LAPC4 solut jäädytettiin vuonna 2010 C . Sawyersilta lab (kaista 3), ja pilkata DNA uutto negatiivinen kontrolli (kaista 4). Kaikki LAPC4 solut analysoitiin olivat positiivisia viruksen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s005

(TIF) B Kuva S5.

Esimerkkejä MLV-negatiivisten eturauhassyövän solulinjoissa, jotka ovat saastuneet oltuaan MLV aikana serial passage soluviljelyllä laboratoriossa. Eturauhassyöpä solulinjat saadaan suoraan NCI (DU145) tai ATCC (LNCaP) ovat negatiivisia, kun värjättiin MLV30 ja MLV70 antiseerumeita. Nämä rivit yllättäen havaittu olevan positiivinen virus jälkeen sarjareittien laboratoriossa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s006

(TIF) B Taulukko S1.

Täydellinen tulokset IHC ja PCR 72 ihmisen solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s007

(DOC) B Taulukko S2.

Käytetyt alukkeet sekvensoida virusgenomeja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s008

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori John Isaacs ( Johns Hopkins) tarjoamiseksi useita solulinjoja solulinjan mikrosirulla. Haluamme myös antaa tunnustusta ja kiittää tohtori Charles Sawyersilta (MSKCC) ilmoitetaan nopeasti kulun LAPC4 näytteitä ja Dr. John M. Coffin (Tufts University) ja tarjoamalla asiantuntemusta ja apua fylogeneettiseen analyysit.