Krooninen sairaus

tiivistelmä

E-vitamiini saanti on ollut mukana vähentämiseen virtsarakon syövän riskiä. Kuitenkin mekanismit ovat edelleen vaikeasti. Tässä raportoimme, että δ-tokotrienolia (δ-T3), joka on yksi E-vitamiini-isomeerien, hallussaan kaikkein voimakas sytotoksinen kapasiteetti ihmisen virtsarakon syövän soluissa, verrattuna muihin E-vitamiini isomeerejä. δ-T3 inhiboi syöpäsolujen lisääntymistä ja colonogenicity kautta induktion G1 vaiheen pysähtymisen ja apoptoosin. Western blotting-määritys paljasti, että δ-T3 lisäsi ekspressiotasot solusyklin estäjät (p21, p27), pro-apoptoottinen proteiini (Bax) ja tukahdutti ekspressiotasot solusyklin proteiinin (sykliini D1), anti-apoptoottiset proteiinit (Bcl-2: Bcl-x

L ja Mcl-1), jolloin kaspaasi-3 aktivointi ja pilkkominen PARP. Lisäksi δ-T3 hoito esti ETK fosforylaation tasolla ja indusoi SHP-1 ilmentymisen, joka korreloi downregulation STAT3 aktivointia. Tämän mukaisesti, δ-T3 vähensi STST3 proteiinin taso tumafraktios-, sekä sen transkription aktiivisuutta. Knockdovvn SHP-1 osa poistuu δ-T3 aiheuttama solujen kasvua pidätys. Tärkeää on, pieni annos δ-T3 herkistyneet Gemsitabiinilla aiheuttama sytotoksisia vaikutuksia ihmisen virtsarakon syöpäsoluja. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot osoittivat, ensimmäistä kertaa, sytotoksisille vaikutuksille δ-T3 virtsarakon syövän solujen ja viittaavat siihen, että δ-T3 saattaisi olla lupaava Chemosensiti- reagenssi Gemsitabiini virtsarakon syövän hoidossa.

Citation: Ye C, Zhao W, Li M, Zhuang J, Yan X, Lu Q, et al. (2015) δ-tokotrienoliin indusoi ihmisen virtsarakon syövän Cell Growth pidättäminen, Apoptosis ja Chemosensiti- estämällä STAT3 Pathway. PLoS ONE 10 (4): e0122712. doi: 10,1371 /journal.pone.0122712

Academic Editor: Andrea Morrione, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 02 joulukuu 2014; Hyväksytty: 13 helmikuu 2015; Julkaistu 7 huhtikuuta 2015

Copyright: © 2015 Ye et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat tiede- ja teknologiaministeriön kansantasavallan Kiinan (2011CB944104), National Natural Science Foundation of China (81172009, 81372168) , Doctoral Fund opetusministeriön Kiina (20110091120028) Dr. J. Yan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on merkittävä kliininen ongelma maailmanlaajuisesti. Se on toiseksi yleisin virtsateiden syöpä kehittyneissä maissa, joissa arviointiin 74690 uutta tapausta ja 15580 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuonna 2014 [1]. Valitettavasti virtsarakon syöpä on myös yksi toistuva ja kallis pahanlaatuisia kasvaimia, jossa neljä miljardia dollaria vuotuiset kustannukset virtsarakon syöpäpotilailla Yhdysvalloissa vuonna 2010 [2-4]. Kirurginen resektio, säteily ja kemoterapia ovat yleisiä terapeuttisia lähestymistapoja virtsarakon syöpään. Kuitenkin eri sivuvaikutukset liittyvät kunkin hoidon ja jotkut syöpäsolujen lopulta lääkkeille vastustuskykyiset. Siksi on välttämätöntä kehittää uusia strategioita torjumiseksi virtsarakon syövän, kuten täydentäviä hoitoja, joita voidaan käyttää yhdessä nykyiset hoidot.

E-vitamiini saanti on kääntäen verrannollinen virtsarakon syöpäriski vanhemmille henkilöille tai runsaasti tupakoivat useista epidemiologisissa tutkimuksissa [5,6]. Molemmat tokoferolit (TP) ja tocotrienols (T3) kuuluvat E-vitamiinia perhe, ja jokainen subfamily koostuu neljästä isomeeristä: α-, β-, δ- ja γ. Suurin ero TP ja T3 on rakenteesta niiden sivuketjujen, farnesyyli- T3 ja tyydyttyneiden fytyyli TP [7-9]. Verrattuna TP, joita esiintyy yleisesti lehdet ja siemenet useimpien kasvien, T3S ovat vähemmän yleisiä ja pääasiassa löytyy palmuöljyn ja riisi leseet. Kaksi kliinistä tutkimusta, Women Health Study (WHS) tutkimus ja seleeni E-vitamiinia ja eturauhassyöpä kemopreventioon Trial (SELECT), tehtiin tutkimiseksi syövän ehkäisy omaisuutta α-TP [10,11]. Kumpikaan tutkimus osoitti merkittävää vaikutusta α-TP vastaan ​​keuhko-, rinta- ja paksusuolen syövän naisten ja miesten eturauhassyövän. Siksi eri T3 isomeerit ovat herätti enemmän tutkimusta huomiota viime aikoina, mikä johtuu niiden mahdollinen sovellus myrkyttömät ruokavalion syöpälääkkeen [12-14]. Niistä δ-T3 osoitti vahvaa tehoa vs. erilaisia ​​syöpiä, kuten haiman, peräsuolen ja rintasyöpä [15-17]. Kuitenkin myös δ-T3 hallussaan syövän vastaista aktiivisuutta vastaan ​​virtsarakon syöpä ei ole vielä tutkittu.

aktivoituminen Signal muuntimet ja Activator of Transcription 3 (STST3) on usein havaittu eri syöpätyyppejä, kuten virtsarakon syöpä [18 ]. Fosforylaatio 705 tyrosiini- tähteen STAT3 proteiinia, joka on ratkaiseva tapahtuma sen aktivoitumisen, johtaa muodostaa STST3 homodimeerejä ja translokaation tumiin. Nuclear lokalisoitu STAT3 dimeeri sitoutuu promoottorien eri kohdegeenien ja säätelee niiden transkriptiot, jotka ovat mukana syöpäsolujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja hyökkäys [19]. Lisäksi on raportoitu, että ultravioletti indusoi apoptoosin voidaan tukahduttaa vastaavasti STAT3 aktivointi; kun taas STAT3 esto indusoi kaspaasi riippuvaista apoptoosia ja estää solujen vaeltamiseen ja angiogeneesin syöpäsoluissa [20,21]. Tuore tutkimus kertoo vielä, että konstitutiivisesti aktivoitu STST3 in urothelial soluissa nopeuttaa etenemistä lihakseen-invasiivisia virtsarakon syöpä, mikä osoittaa, että STST3 on ratkaiseva rooli virtsarakon syövän kehityksen [22].

Tässä tutkimuksessa havaitsimme vahvempi sytotoksisuutta δ-T3 ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa kuin hyvänlaatuisen ikuisti urothelial soluja. Mekanistisesti osoitimme, että δ-T3 esti ETK aktivointi ja säädelty SHP-1 ilmentymisen, joka korreloi tukahduttaminen STAT3 signalointireitin. Olemme myös osoittaneet pieniä annoksia δ-T3 parannettu herkkyys virtsarakon syövän solujen kemoterapia-agentti – gemsitabiini.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja solulinjoissa

Kaikki kemikaalit ja reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ellei toisin mainita. α-, γ-, δ-T3 ja α-tokoferoli (α-TP) oli ystävällisesti toimittanut Davos Life Science Ltd (Synapse, Singapore). Gemsitabiini on Eli Lilly Company (Indianapolis, IN). Bcl-2, Bcl-x

L, Mcl1, PARP, pro-kaspaasi-3, pSTAT3 (Y705), pETK (Y40), STAT3 ja SHP-1-vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers , MA). ETK, p21 ja p27-aineet olivat peräisin BD Biosciences (San Jose, CA). p-Actin vasta-aine hankittiin AbMax Biotechnology Company (Peking, Kiina). Bax-vasta ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ei-pahanlaatuisen kuolemattomaksi urothelial solulinja SV-HUC-1, virtsarakon syöpä solulinjoja T24, 5637, J82 ja UMUC-3 saatiin Cell Bank, Type Culture Collection, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja viljellään 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 95% ilmaa ja 5% CO

2. Kuten siRNA häiritseviä määritystä, SHP-1 kohdistaminen siRNA: 5′-GAGAACGCUAAGACCUACAtt-3 ’ja ohjaus siRNA: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3’ transfektoitiin syöpäsolujen käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), tässä järjestyksessä.

solunelinkykyisyysmääritys

solujen elinkelpoisuuden tutkimuksessa, 1,5 x 10

3 virtsarakon syövän solut maljattiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle. Solut käsiteltiin sitten eri pitoisuus (50, 100, 150, 200 uM) ja E-vitamiini-isomeerien 24, 48 ja 72. Hoidon jälkeen, 10 ui 5 mg /ml MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 h. Formatsaanikitei- jälkeen kiteet suspendoitiin uudelleen 100 ui: aan DMSO: ssa ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin. Kukin koe toistettiin kolme kertaa ja kasvukäyrät osoitti keskiarvo ja keskihajonta.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

jälkeen 14 päivän inkubointi 100 uM α-TP, α-T3, γ- T3 ja δ-T3, pesäkkeet kiinnitettiin 100% metanolia, ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Vain pesäkkeitä, joiden 50 solut laskettiin. Kukin käsittely toistettiin kolmena kappaleena.

Virtaussytometrianalyysi

Soluja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla δ-T3 48 tuntia, ennen kuin näytteet fiksoitiin 70% etanolia. Soluja inkuboitiin 10 mg /ml RNaasi A: ta, joka sisälsi PBS: ssä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen lisättiin 1 mg /ml propidium- jodia (Sigma). Jälkeenpäin solut analysoitiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) Calibur virtaussytometrillä (BD FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA).

Apoptosis analyysi

anneksiini V /propidium- jodidi (PI) värjäys suoritettiin käyttämällä Alexa Fluor 488 anneksiini V /Dead solukuoleman Kit (Invitrogen, Cat # V13245, Inc., Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1×10

6 solut trypsinoitiin, jonka jälkeen suspendoimalla uudelleen 100 ul: aan sitoutumispuskuria ja inkuboitiin 1,0 ui PI: n ja 5,0 ul: aan anneksiini V-fluoreseiini isotiosynaatti- 15 minuuttia pimeässä huoneen lämpötilassa. Jälkeenpäin solut havaittiin käyttämällä FACS Calibur Instrument (Becton Dickinson) ja analysoitiin käyttäen Flowjo 7,6 ohjelmistoa.

Reaaliaikainen käänteistranskriptiotuotteiden polymeraasiketjureaktio analyysi

Kokonais-RNA uutettiin Trizol (Invitrogen ). Ilmentymistasojen

Bcl2

,

bclxl ja mcl1

geenien havaittiin kvantitatiivisella käänteis- transkriptio polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR). Alukkeet luetellaan seuraavasti:

Bcl2

: eteenpäin, 5′-CGTACAGTTCCACAAAGGCA-3 ’ja reverse, 5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’;

bclxl

: eteenpäin, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3 ’ja reverse, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3’;

mcl1

: eteenpäin, 5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3 ’ja reverse, 5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3’;

β-aktiini

käytettiin sisäisenä kontrollina. Alukkeet

β-aktiini

olivat 5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3 ’ja 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’. qPCR suoritettiin käyttäen SYBR Green (TaKaRa Biotechnology Co Ltd, Dalian, Kiina) väriaineen tunnistusmenetelmä ABI StepOne Sequence Detection System alla oletus olosuhteissa: 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 55 ° C: ssa 31 S. Comparative CT menetelmää käytettiin kvantifiointiin selostukset.

Western blotting-määritys

Solut lyysattiin RIPA puskuriin, joka sisälsi proteaasiestäjäseostabletit tabletti (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail I (Sigma). Solulysaateista (20 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Jälkeen blotting 5% rasvatonta kuivamaitoa fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20 (PBST), kalvoja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 1: 500 1000 laimennoksia PBST tai 5% BSA: ta yli yön 4 ° C: ssa mukaan valmistajan ohjeiden. Blotit pestiin ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 1 tunnin ajan, ja lopuksi havaitaan ECL-reagenssilla (Thermo Scientific).

Lusiferaasiaktiivisuus määritys

vaikutus δT3 on STAT3 reagoiva elementti, joka sisältää promoottorin (STAT3-Luc) aktiivisuus analysoitiin käyttäen lusiferaasianalyysissä. T24-soluja (2,5 x 10

5 per kuoppa) siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille. Yön yli viljelyn jälkeen solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ja 0,5 ug: STAT3-Luc ja 1 ng TK-Renilla lusiferaasiplasmidin. 24 tunnin transfektion jälkeen solut inkuboitiin δT3 24 tuntia ja kerättiin. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Assay (Promega) ja havaittiin käyttäen Victor mikrolevylukijaa (Perkin-Elmer).

Nuclear uutteet valmisteen

T24-solut maljattiin 10 cm: n maljalla, jota seuraa käsittely 150 uM δ-T3: ssa 24 tuntia. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Solupelletti suspensoitiin varovasti uudelleen 4X tilavuuteen jääkylmässä hypotonisessa lyysipuskuria (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl

2, 10 mM KCI, 0,3% NP-40, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA: ta, 0,5 mM DTT), proteaasi-inhibiittorit (Roche), ja pidettiin jäissä 30 min. Soluja säilytetään puskurissa kunnes ne ovat turvonneet. Solulysaatit sentrifugoidaan 10 min ajan 10000 x g. Supernatantit olivat soluliman uutteet. Suspendoi sakka (tumafraktios-) 4X volyymien vahvan proteiinin lyysipuskuria (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl

2, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 25% glyseroli, 0,5 mM DTT) proteaasi- inhibiittori 15 min. Supernatantti kerättiin, kuten ydin- proteiinin sentrifugoimalla 12000 rpm 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) B

ChIP määritys suoritettiin käyttämällä ChIP iinianalyysikitissä (Cat. 17- 295, Millipore), mukaan valmistajan ohjeiden. Sen jälkeen, kun ydin- uutteet eristettiin kuten edellä on esitetty, vasta-ainetta vastaan, STAT3 (CAT # 9139, Cell Signaling Technology) käytettiin immunosaostamaan kromatiinin ydin- jakeet, kun taas epäspesifinen IgG-vasta-ainetta käytettiin teknistä negatiivisena kontrollina. Mittaukset tehtiin kolmena kappaleena ja tehdä Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (AppliedBiosystems, Carlsbad, CA, USA). Sekvenssit alukkeiden käytetään ChIP-qPCR analyysi

bclxl geenin

promoottori ovat seuraavat: Bcl-x L-aluketta 2F 5′-CTGGGTTCCCTTTCCTTCCA-3 ’, Bcl-x L-aluke 2R 5’-TCCCAAGCAGCCTGAATCC -3 ’[23]; Bcl-x L-aluke 1F 5’-CCCTTGCAGCTAGTTTTCTA-3 ’, Bcl-x L-aluketta 1 R 5′-TGAATTCTGAGGCCAAGGGAA-3’; Bcl-x L-aluke NCF 5’TGCCAGGCCTTCGCTCAA-3 ’, Bcl-x L-aluke NCR 5-CAGATAAACTCTGTCCACAGA-3’. Primer asettaa 1 954 emäsparia alavirtaan transkription aloituskohdasta, kun taas alukesarjaa 2 on 1277 emäsparia alavirtaan TSS, joka kattaa säilynyt STST3 sitova motiivi ennusti verkkosivuilla (www.dcode.org). Primer NC on paikallistaa 1880 bp alavirtaan viimeisen eksonin, joka toimii negatiivisena kontrollina.

Tilastollinen analyysi

Kaikki numeeriset arvot esitetään keskiarvona ± SD. Opiskelijan paritonta t-testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin. Merkitys asetettiin

P

0.05.

Tulokset

solumyrkkyvaikutuksessa E-vitamiinin isomeerien virtsarakon syöpäsolujen

Jotta voidaan tutkia mikä E-vitamiinia isomeerit olla sytotoksisia vaikutuksia ihmisen virtsarakon syövän solujen

in vitro

, käsittelimme neljä yleisesti käytetty ihmisen virtsarakon syövän solulinjat, T24, 5637, J82 ja UMUC-3. Nämä neljä solulinjat sisältävät eriasteista geneettisten monimutkaisuus, joka kattaa yhteisen geneettisiä mutaatioita löydetty ihmisen virtsarakon syöpä näytteitä. Näitä ovat inaktivoinnin TP53 ja RB1, aktivointi K-Ras ja H-Ras tai tappio PTEN (www.atcc.org). Tulokset osoittivat, että sekä γ- ja δ-T3 näkyy syöpälääkkeen vaikutuksia pitoisuudesta riippuvalla tavalla, kun taas α-T3 sekä α-TP ei havaittu sytotoksisia vaikutuksia alueella annoksia, jotka testasimme (kuvio 1A ). Testataan sytotoksisia vaikutuksia E-vitamiinin isomeerin normaali rakon soluissa, olemme myös käsitelty SV-HUC-1, kuolemattomaksi hyvänlaatuisen urothelial solun kanssa E-vitamiinia isomeerit. Huomattavaa on, että γ- ja δ-T3 kohdistuu vähemmän myrkyllisyyttä ei-pahanlaatuisia virtsarakon epiteelisolujen (kuvio 1A). Lisäksi, hoito δ-T3: n ja γ-T3 myös merkittävästi vähentynyt pesäkemäärät, verrattuna a-T3: n ja α-TP (kuvio 1B). Käyttäen MTT-määritystä ja pesäkemuodostusta, osoitimme, että järjestys estävä vaikutus E-vitamiini-isomeerien on δ-T3 γ-T3 α-T3 ja α-TP kaikissa neljässä ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa; Näin ollen, δ-T3 valittiin lisätutkimuksia varten.

(A) Ihmisen virtsarakon syövän solujen T24, 5637, J82 ja UMUC-3, sekä ei-pahanlaatuisia ihmisen urothelial SV-HUC-1-soluja käsiteltiin kukin E-vitamiini-isomeerien (α-TP, α-T3, γ-T3 ja δ-T3) vaihtelee 0-200 uM 72 tuntia, ja solujen elinkyky havaittiin MTT-määrityksellä. (B) Pesäkkeenmuodostusta määritys T24 5637, J82 ja UMUC-3-solujen kanssa 100 uM α-TP, α-T3, γ-T3 ja δ-T3 14 päivää. Pystypalkit osoittavat keskiarvo solumäärä ± SD kummassakin hoitoryhmässä. *,

P

0,05; ***,

P

0,001, verrattuna ajoneuvon hoitoryhmässä.

δ-T3 aiheuttaa G1 pysähtymiseen ja apoptoosiin

osoittavat lisäksi syövän vaikutuksia δ-T3, analysoimme solusyklin jakautuminen virtaussytometria (kuvio 2A-2D). T24 ja 5637-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla δ-T3 (0, 50, 100 ja 150 uM) 48 tuntia. Virtaussytometria analyysi osoitti, että δ-T3 hoito (≥ 100 uM) aiheuttama G1 vaiheen pysähtymisen ja vähentäminen solupopulaation S-vaiheessa. Lisäksi apoptoottiset solupopulaatio (sub-G1) nousi pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A-2D). Edelleen karakterisoimiseksi apoptoosin induktion, teimme anneksiini V /PI-värjäyksen määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa 3, δ-T3 indusoi apoptoottisen indeksi sekä T24 (kuvio 3A) ja 5637 (kuvio 3B), solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla.

Soluja käsiteltiin δ-T3 vaihtelee 0-150 uM 48 tuntia. Solusyklin jakelu ja Sub-G1-suhteet arvioitiin virtaussytometrialla. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001.

anneksiini V /PI-analyysi osoitti, että δT3 indusoi apoptoosia T24 (A) ja 5637 (B) virtsarakon syövän solujen, verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrollisoluihin.

δ-T3 indusoi solukierron estäjiä ja alas-säätelee pro-selviytymisreittiin

Western blotting-analyysi tehtiin tutkia edelleen ekspressiotasot proteiinien mukana solusyklin ja apoptoosin. 24 tunnin kuluttua hoidon δ-T3 eri pitoisuuksina T24 ja 5637 soluja, havaitsimme lisääntynyt ekspressiotasot solusyklin estäjät, p21

Waf1 /CIP1 ja p27

Kip1, ja laski ekspressiotasot sykliini D1 ( kuvio 4A). Lisäksi, δ-T3 hoidon aktivoituu myös pro-kaspaasi-3, ja johti PARP pilkkominen (kuvio 4B). Koska kaspaasi-3 voi olla kautta mitokondrioiden polku, testasimme apoptoosiin liittyvien proteiinien mitokondrioissa. Kuten on esitetty kuviossa 4C, ilmentymisen taso pro-apoptoottisen proteiinin, Bax on parannettu; Toisaalta, anti-apoptoottiset proteiinit, Bcl-2, Bcl-x

L ja Mcl-1 oli tukahdutettu kun δ-T3 hoitoon. Kuten on esitetty S1 kuviossa, lohkaisu apoptoottisten markkereita (kaspaasi-3 ja PARP), induktion pro-apoptoottisen Bax-proteiinia, samoin kuin väheneminen anti-apoptoottisia proteiineja on vahvistettu toisessa kaksi virtsarakon syöpäsolulinjoista (J82 ja UMUC-3).

Western blotting-analyysi solusyklin (A), apoptoosin (B) ja muiden apoptoosiin liittyvien (C) proteiinin tasot T24 ja 5637-solut, kun δ-T3 hoito 24 h. β-Actin käytettiin latauskontrollina.

δ-T3 defosforyloitiin ETK ja voimistuvan SHP-1 tukahduttaa STST3 signalointi

edelleen leikellä vaikutuksia δ-T3 loppupään signalointi, olemme analysoineet STAT3-signalointireitin, joka on yksi tärkeimmistä anti-apoptoottisia reittejä, joka antaa säilyä ja chemo-vastus virtsarakon syövän solujen vastaan ​​eri kemoterapeuttisten aineiden [18-21]. Huomasimme, että δ-T3 tukahdutti fosforylaation taso STAT3 (Y705) pitoisuudesta riippuvaisella tavalla molemmilla T24 ja 5637 virtsarakon syövän solulinjoissa (kuvio 5A). Aktivointi STAT3 säätelevät ylävirran kinaasien ja fosfataasien. Virtsarakon syöpä, epiteeli- ja endoteelisolujen tyrosiinikinaasi (ETK) on usein yli-ilmentynyt [24]. Ei-reseptori-tyrosiinikinaasin, ETK aktivointi /ilmentymistä tarvitaan STAT3 aktivaation syöpäsoluja. Tämän mukaisesti, havaitsimme, että aktiivinen muoto ETK (fosforylaatio Y40) pelkistettiin δ-T3 hoito, alkaen pitoisuudesta 50 uM sekä T24 ja 5637 solua. Lisäksi δ-T3 silmiinpistävän indusoidun ilmentymisen taso proteiinityrosiinifosfataasi SHP-1, joka toimii negatiivisena säätelijänä ja STAT3 aktivointia (kuvio 5B). Tumaansiirtymiseen of STAT3 on tärkeää sen toiminnan transkriptiotekijänä. Ydin- ja sytosolin jakeet proteiinia lysaatin peräisin δ-T3 käsitellyt solut erotettiin. Kun δ-T3 hoito, STST3 proteiinin taso ytimet aleni T24-soluissa (kuvio 5C). Edelleen vahvistaa vähentämistä ydinvoiman STAT3 käyttöaste sen kohdegeenien, suoritimme ChlP määrityksen käyttämällä vasta-ainetta STST3. Kuten kuvassa 5D, δ-T3 vähensi rekrytointi STAT3 päälle sen sitoutumiskohdista

bclxl

lokukseen 5,55 taitoksia (alukesetin 1) ja 5,93 taittuu (alukesetin 2), kun taas negatiivinen kontrolli alukesarjan (NC) eivät osoittaneet mitään eroa. Konsertti tähän tulokseen, transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3-reagoiva promoottori merkittävästi tukahdutettu δ-T3 hoidon lusiferaasireport- määritys (kuvio 5E). Lisäksi qRT-PCR Tulokset paljastivat, että kolme STST3 suora kohdegeenien (

Bcl2

,

bclxl

ja

mcl1

) on vaimentua mRNA tasoilla molemmissa kaksi virtsarakon syövän solulinjoista (kuvio 5F), mikä osoittaa, että vähennys johtuu pääasiassa kopioinnin säätely. Sen tutkimiseksi, SHP-1 on välttämätön STAT3 aktivaation aiheuttama solujen eloonjäämistä, me pudotti endogeenisen SHP-1 RNA-interferenssi (kuvio 5G) ja totesi, että sen ehtyminen osittain kumottu δ-T3 aiheuttama myrkyllisyys T24-soluissa (kuvio 5H). Tämä vahvisti myös, että δ-T3 aiheuttama virtsarakon syöpä solujen lisääntymisen estäminen osittainen kautta SHP-1 induktio. Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että δ-T3 käsittely laski fosforylaation taso yhdessä tumaansiirtymiseen ja STAT3-proteiinin, jolloin transkription alentaminen loppupään kohdegeenien ihmisen virtsarakon syövän soluissa.

Western blotting-analyysi STAT3 /ETK signalointireitille liittyvien (A) ja SHP-1 (B) proteiini tasoilla T24 ja 5637 kuuluvat solut δ-T3 hoito 24 tuntia. Western kvantitoitiin Image J ohjelmisto ja numerot alla ylähavas suhteellinen STAT3 ekspressiotasot normalisoidaan lastaus valvontaa. (C) vähentäminen ydin- STAT3 proteiinin tason päälle hoidossa 150 uM δ-T3 T24-soluissa. LaminB1 käytettiin ydin- lastaus ohjaus. Tubuliinia käytettiin sytoplasmisen lastaus ohjaus. (D) genominen rakenne

bclxl

geenin osoitettiin, jossa etiketit kolmen alukesarjoista siru määritystä. Primer asettaa 1 ja 2 sisältävät STAT3 sitova elementti; kun taas alukesarja 3 (NC) toimii negatiivisena kontrollina. STAT3 käyttöaste

bclxl

promoottori virtsarakon syövän solulinja T24 hoidettiin 150 uM δ-T3 tai ajoneuvon 18 tunnin analysoitiin Chip määrityksessä. Input DNA ja immunosaostettiin DNA analysoitiin qPCR analyysejä käyttämällä alukesarjoja kuvattu edellä ja normalisoitu IgG ohjaus. Virhe palkki osoittaa keinot ± SD. ***,

P

0,001. (E) δ-T3 hoito vähensi STAT3 alavirran kohdegeeneissä (

Bcl2

,

bclxl

ja

MCL-1

) ilmentymistä mRNA tasolla. (F) Lusiferaasiaktiivisuus analyysi STAT3-Luc, kun hoito 150 uM δ-T3 T24-soluissa 24 tuntia. TK-Renilla lusiferaasia plasmidia käytettiin sisäisenä kontrollina. (G) Knockdown tehokkuus SHP-1 in T24-soluissa Western-blottauksella määrityksessä. p-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina. sinc, negatiivinen kontrolli siRNA. siSHP-1, siRNA kohdistamista SHP-1. (H) T24-soluja käsiteltiin siRNA ja SHP-1 tai sinc, mitä seuraa käsittely δ-T3 tai ajoneuvon. Solujen elinkelpoisuus testattiin MTT-määrityksellä. **,

P

0,01; ***,

P

0,001.

Alin pitoisuus δ-T3 voimisti apoptoottinen vaikutus gemsitabiinin on T24 virtsarakon syöpäsolujen

Gemsitabiini on ensilinjan kemoterapiaa virtsarakon syöpien [25,26]. Siksi tutkimme onko alhainen pitoisuus δ-T3 voi lisätä herkkyyttä virtsarakon syövän solujen gemsitabiini. MTT-analyysi osoitti, että käsittely 25 uM δ-T3 parantaa sytotoksista vaikutusta Gemsitabiini on T24, 5637, J82 ja UMUC-3-solulinjojen (kuvio 6A ja S2 kuviossa). Virtaussytometria tietoja anneksiini V /PI costaining paljasti, että yhdistelmähoito lisääntynyt apoptoottisen vaikutuksen, verrattuna gemsitabiini hoito yksinään. Apoptoottiset nousi 34,6% ja 19,28% vuonna Gemsitabiini käsiteltyjä soluja 53,3% ja 28,4% yhdistetyssä käsitelty T24 ja 5637-soluissa, vastaavasti (kuvio 6B). Pesäkemuodostusta osoittivat myös, että hoito Gemsitabiini plus δ-T3 merkittävästi tukahdutti pesäkkeiden muodostumisen kapasiteetti T24 syöpäsolujen (kuvio 6C). Kuten kuviossa 6D, co-hoidon pieninä pitoisuuksina δ-T3 ja Gemsitabiini silmiinpistävän aiheuttama Bax ja tukahdutettu Bcl-x L ja Bcl-2, mukana läsnäolo PARP pilkkominen. Johdonmukaisesti, Huomasimme myös, että co-hoito vähensi fosforylaation taso ETK, aiheuttama SHP-1 ilmentymisen ja esti niiden loppupään STAT3 aktivointi (kuvio 6E).

(A) T24 ja 5637 soluja inkuboitiin 48 tuntia läsnäolo 25 uM δ-T3 ja /tai 0,08 uM GEM. Sitten prosenttiosuus solujen elinkykyisyys määritettiin MTT-määrityksellä. (B) T24, ja 5637-soluja viljeltiin 48 h poissa tai läsnä ollessa 25 uM δ-T3 ja /tai 0,08 uM GEM, vastaavasti. Apoptootosinopeudet analysoitiin anneksiini V /PI värjäystä määrityksessä. (C) Yhdistetty hoito GEM (0,08 uM) ja δ-T3 (25 uM) 14 vuorokauden täysin poistanut pesäkkeenmuodostusta kapasiteettia T24 soluja. (D) Western blot analyysi apoptoosin liittyvät ja STAT3 signaloinnin liittyvän proteiinin tasot T24-soluissa, käsiteltiin δ-T3 ja /tai GEM: ssa 48 tuntia. (E) Western blotting analyysi STAT3 signalointi-liittyvä proteiini tasot T24-soluissa, käsiteltiin δ-T3 ja /tai GEM 24 tuntia. **,

P

0,01; ***,

P

0,001.

Keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti sytotoksista vaikutusta δ-T3 ihmisen virtsarakon syöpäsoluja. Verrattuna muihin E-vitamiini-isomeerit, tuloksemme osoittivat, että sekä δ- ja γ-T3 ovat voimakkaita estäjiä virtsarakon syövän solujen proliferaatiota. Sen sijaan, α-T3: n ja α-TP ei ole syövän vaikutuksia vastaan ​​virtsarakon syövän solujen samoissa kokeellisissa asetuksia. Vaikka sekä δ- ja γ-T3 on merkittäviä sytotoksisuuden virtsarakon syövän soluissa, δ-T3 näyttää olevan tehokkaampi kuin y-T3, mikä viittaa siihen, että se on bioaktiivinen. Tämä on sopusoinnussa havaintojen kanssa, kun δ-T3 käytetään hoidoissa muiden syöpien, mukaan lukien keuhko- ja haimasyövän [13,15,27]. Lisäksi verrattuna y-T3, se on vähemmän tiedetään syöpälääkkeen vaikutuksia δ-T3. Siksi olisi mielenkiintoista tutkia, onko δ-T3 voitaisiin mahdollisesti käyttää yhtenä johtavista vitamiineja kemopreventioon ja hoitoon virtsarakon syöpään.

Tässä raportissa osoitti lisäksi, että δ-T3 esti STAT3 signalointi polku, joka on keskeisessä asemassa syövän solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. On todettu, että STST3 usein aktivoituvat eri syöpätyyppejä, kuten virtsarakon syöpä. Käyttämällä fosforylaation taso STAT3 at Y705 korvikemarkkerina, Lin ja työtovereiden totesi, että STST3 on overactivated 19% ihmisen virtsarakon syöpä kudoksiin (

n

= 100) [28]. Weissmann ja työtovereiden totesi, että pSTAT3 on kohonnut syövän kantasolujen väestön UBC yksilöitä, mikä viittaa siihen, että aktivointi STAT3 on merkitystä ylläpitoon syöpäsolun stemness [29]. Näiden tavoitteiden mukaisesti, siirtogeenisiä ilmentyminen STST3 tyvisoluissa hiiren virtsarakkoepiteeliin kiihtyi etenemistä kohdunkaulan

in situ

invasiivisen virtsarakon syövän alle karsinogeeni nitrosamiinia hoitoa, verrattuna villin tyypin hiirten saman kohtelun [22 ]. Huomattavaa on, että keskeytys STAT3 signalointireitin joko Knockdown STST3 tai yliekspressio hallitseva negatiivinen muoto STAT3 indusoi solujen kasvun pysähtymisen ja apoptoosin [30], mikä osoittaa, että kohdistaminen STST3 signalointi on lupaava terapeuttinen lähestymistapa virtsarakon syöpäpotilailla.

aktivointi STAT3 säätelevät ylävirran kinaasien ja phosphotases. ETK, joka tunnetaan myös nimellä BMX, on jäsen Tec-perheen ei-reseptori-tyrosiinikinaasin. Se sisältää useita kriittisiä verkkotunnuksia kuten Plekstrin homologia (PH), Tec homologia (TH), Src homologia SH3, SH2 ja SH1 kinaasialue. Kohonnut ekspressio ETK on havaittu ihon liikakasvun ja eturauhassyövän [31,32]. Äskettäin ETK ehdotettiin voidaan käyttää biomarkkerina ennustaa eloonjäämisaste potilailla, joilla on cystectomy virtsarakon syöpä [24]. Sen onkogeeniset toiminta on sidoksissa sen vuorovaikutusta ja aktivointi STAT3 [24,33]. Kuten yliekspressoitiin glioblastooma kantasoluja (GSCs), ETK aktivoi STST3 säilyttää itseuudistumiseen ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa GSCs [34]. Lisäksi knockdovvn ETK estää aktivoitumisen STAT3 kahdessa virtsarakon syövän solulinjoista T24 ja UM-UC-3 [24], mikä osoittaa, että ETK toiminnot ylävirtaan STST3 virtsarakon syövän soluissa.

Lisäksi SHP- 1 on ei-transmembraaninen PTP, joka toimii negatiivisena säätelijänä STAT3 reitin [35]. Tuumorisuppressorina, promoottori SHP-1 on usein hypermetyloitunut leukemia ja lymfooma-soluja [36]. Ensin raportoitiin, että δ-T3 indusoi SHP-1 annoksesta riippuvalla tavalla virtsarakon syövän soluissa. Koska γ-T3 myös aiheuttaa SHP-1 ilmentymisen estämiseksi STST3 signalointia myeloomassa ja maksasyövän solut [36,37], sekä γ- ja δ-T3 voi toimia samalla tavoin estämään STST3 signalointi indusoimalla SHP-1 ilme. Yhdenmukainen tukahduttaminen STAT3 reitin, jotka ovat erittäin merkityksellisiä virtsarakon syövän synnyn [22], tukahduttaminen STAT3 vahvistettiin edelleen vähentämään sen loppupään tavoitteita, kuten Bcl-2, Bcl-x

L ja Mcl- 1, sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Cellular fraktioinnin Western blotting ja lusiferaasianalyysissä käyttäen STST3-Luc plasmidi vahvisti, että δ-T3 vaikuttaa STAT3 aktivointi estämällä sen ydin- translocalization aiheuttaa sen kohdegeenien. Nämä tiedot edelleen perusteltuja inhibition STAT3 signalointireittiä δ-T3.

Gemsitabiini on yleisesti käytetty kemoterapeuttisten lääkeaine virtsarakon syöpään. Huomasimme, että pieniä annoksia δ-T3 parannettu Gemsitabiini indusoiman apoptoosin. Verrattuna gemsitabiini hoito yksinään, co-hoitoon käytetään δ-T3 ja Gemsitabiini silmiinpistävän tukahdutti aktivointi ETK, STAT3 ja induktio SHP-1. Tämä tukee käsitystä, että ö-T3 voimistaa Gemsitabiini välittämää apoptoosia indusoiva soluista SubG1 väestö seuraa pilkkominen PARP. Johdonmukaisesti, Kanai

et al

havaittu, että E-vitamiini sukkinaatti aiheuttama virtsarakon syövän solujen apoptoosin ja parannettu chemosenstivity paklitakselille [38]. Ottaen huomioon, että virtsarakon syöpä kasvaa ulospäin virtsarakon onteloon, tiputtamisen terapeuttiset aineet voidaan helposti rakossa, joka saattaa lisätä tehoa huumeita. **,

P

0,01;