Krooninen sairaus

tiivistelmä

Piilevä transformoivan kasvutekijä β-sitovan proteiinin 4 (LTBP4) on soluväliaineen molekyyli, joka on jäsenenä tärkeitä sidekudoksen verkkojen ja tarvitaan oikea taitto ja eritystä TGF-β1. LTBP4 on vaimentua syövissä eri kudoksissa. Tässä osoitamme, että LTBP4 myös vaimentua vuonna adenokarsinooman ja okasolusyöpää ruokatorven

in vitro

ja

in vivo

. Re-ilmentyminen LTBP4 ruokatorven syövän solulinjoissa vähensi solujen vaeltaminen kyky, kun taas solujen elinkelpoisuutta ja solujen lisääntymistä pysyi ennallaan. Hypermetylaatiota promoottorialueet kahden tärkeimmän ihmisen LTBP4 transkription muotoja, LTBP4L ja LTBP4S, havaittiin olevan osallisena LTBP4 hiljentäminen. Yksityiskohtaisia ​​tutkimuksia metylaatiovyöhykkeiden promoottorin alueiden LTBP4L ja LTBP4S tunnistettu GATA1, SP1, E2F4 ja Smad3 mahdollisina transkriptiotekijät liittyvät LTBP4 ilme. Vuonna

in vitro

transkriptiotekijän aktiivisuuden tutkimukset huomasimme E2F4 uusina tehokas säädin LTBP4S ilme.

Citation: Bultmann I, Conradi A, Kretschmer C, Sterner-Kock A (2013) Latentti Transforming Growth Factor β-sitovan proteiinin 4 Onko vaimentua sisään ruokatorven syöpä kautta Promoottori metylointi. PLoS ONE 8 (5): e65614. doi: 10,1371 /journal.pone.0065614

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 19 helmikuu 2013; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 31, 2013

Copyright: © 2013 Bultmann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Maria Pesch-Foundation (National Science rahoitus Organisation). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vuonna 2008 ruokatorven syöpä oli arvioidun 482000 uutta tapausta kahdeksas yleisin maligniteetti maailmassa ja 407000 kuolemantapausta kuudenneksi yleisin kuolinsyy [1]. Kun Yhdysvalloissa mediaani-ikä diagnoosin ruokatorven syöpä on 68 vuotta ja noin 80% kaikista uusista tapauksista diagnosoidaan miehillä. 5 vuoden kokonaiselinaikaa nousi 5% vuonna 1975 19% vuonna 2001 [2]. Euroopassa keskimääräinen ikä diagnoosin 70 vuotta, ja 67% vasta diagnosoitu tapaukset ovat miehillä. 5 vuoden yleinen eloonjäämisaste on 9,8% huomattavasti pienempi kuin Yhdysvalloissa [3].

Kaksi hallitseva histologisia tyyppejä ruokatorven syöpä ovat adenokarsinoomat (EAC) ja okasolusyöpää (ESCC) . Molemmat ilmeisesti eroavat malleja esiintyvyyden ja on oma erillinen etiologia [4]. Euroopassa 1 vuoden suhteellinen eloonjääminen sairastavien potilaiden ESCC on 33,9% ja 37,9% EAC-potilaille, mutta 5 vuoden suhteellinen eloonjääminen on 10,1% ja 10,6%, tässä järjestyksessä, lähes identtinen [3]. Yksi riskitekijän EAC ja ESSC on tupakointi, kun alkoholinkulutuksen oletetaan riskitekijä vain ESCC [4]. Katsovat, lihavuus, refluksitauti ja Barretts ruokatorvi vain riskitekijöitä EAC [4]. Päivittäinen saanti tuoreita hedelmiä ja vihanneksia liittyy pienentynyt riski sekä histologisia tyyppejä ruokatorven syöpä [4].

Muutokset soluväliaineen tärkeä rooli syövän synnyn ruokatorven syöpään. Hajoamista ja vähentää ilmentymistä soluväliaineen proteiinien liittyvät kasvaimen etenemiseen, mukaan lukien invaasio ja muuttavat mahdollisia, sekä etäpesäkkeiden, solujen lisääntymisen ja angiogeneesin [5].

soluväliaineen proteiini piilevä transformoivan kasvutekijä β-sitovan proteiini 4 (LTBP4) on yksi neljästä isoformien LTBPs (LTBP1-4) ja alue fibrillin /LTBP glykoproteiineja. LTBP1, LTBP3 ja LTBP4 sitoutuvat kovalenttisesti transformoiva kasvutekijä p: t (TGF-p: t), ja niitä tarvitaan oikean laskostumisen ja erittymisen TGF-p: aa, [6], [7]. LTBP4 vain sitoo TGF-β1, kun taas LTBP1 ja 3 sitovat kaikkia kolmea TGF-β-isoformien [7].

TGF-β1 on pluripotenttien ja läsnäoleva sytokiinien kuuluvat superperheen rakenteellisesti läheisten kasvutekijöiden kanssa hyvin dokumentoitu roolit solujen proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosia, tarttuvuus, ja solunulkoisen matriksin [8], [9].

sen lisäksi, että ratkaisevan tärkeää chaperoning ja kuljettamiseksi TGF-β solun ulkopuolella, LTBPs on osoitettu olevan ulkojäsenet sidekudoksen verkostojen, kuten mikrofibrilliaggregaattien /elastinen kuituverkon ja fibronektiiniä verkon [10]. Sisällyttäminen LTBPs osaksi ECM on ratkaisevan tärkeää sääntelyn piilevän TGF-β varastointi ja aktivointi [11].

Various transkription muotoja LTBP4 olemassa ihmisillä ja tärkeimmät lomakkeet ovat pitkiä (LTBP4L, NM_001042544) ja lyhyt (LTBP4S; NM_001042545) muodossa. Käyttämällä kahta riippumatonta promoottorit sekä transkription muodot ilmaistaan ​​eri ekspressiomalleja kudosspesifisellä tavalla [12].

On osoitettu, että väärin säädeltyyn ilmentyminen LTBP isoformien liittyy puhkeamista epiteelin kasvainten [13] , [14], [15], [16], [17], [18]. LTBP1 on vaimentua eri ihmisen epiteelisolujen kasvaimet maksa, munasarjat ja neuroendokriinisten kasvainten ruoansulatuskanavan [14], [16], [18]. LTBP2 on vaimentua vuonna ESCC ja nenänielun karsinoomat [13], [15]. LTBP4 on vaimentua ihmisen ja hiiren duktaalikarsinooma

in situ

ja rintarauhasen adenokarsinooman [17].

mekanismeja, jotka johtavat downregulation LTBPs eri epiteelin kasvaimet ovat suurelta osin tuntemattomia. Kuitenkin LTBP2 tiedetään, että hypermetylaatiota promoottori on vastuussa downregulation in ESCC ja nenänielun karsinoomat [13], [15].

Esillä oleva tutkimus tutkii proteiinin ilmentymisen soluväliaineen proteiinin LTBP4 vuonna eri vaiheissa ruokatorven syövän etenemisessä, samoin kuin eri adenokarsinoomat ruoansulatuskanavassa. Lisäksi olemme tutkineet mahdollisia sääntelymekanismiin vastuussa LTBP4 inaktivaatio ruokatorven syöpään.

Tulokset

LTBP4 on vaimentua eri vaiheissa ruokatorven syövän etenemisessä

Tässä tutkimuksessa tutki proteiinin ilmentymistä LTBP4 ruuansulatuskanavan karsinoomia ja erityisesti neoplasioista ja preneoplasias ruokatorven. Näin ollen, ensin arvioidaan ekspressio LTBP4 tasoilla eri syövän kudossiruina immunohistokemiallisella värjäyksellä.

analyysi potilaan kudosten eri adenokarsinoomat ruoansulatuskanavan paljasti merkittävän downregulation LTBP4 verrattuna normaaleihin kudoksiin saman elimen . Yksityiskohtaisesti, adenokarsinoomat ruokatorven osoitti 37%, mahan 17%, haima 9%, ohutsuolen 4% ja paksusuolen 22% LTBP4 ilmentymistä (kuvio 1A).

A) LTBP4 proteiinin ekspressiotasot olivat arvioidaan immunohistokemia kudossiruina potilaan adenokarsinoomat (AC) ja ruokatorven, mahan, haiman, ohutsuolen ja paksusuolen verrattuna normaaliin kudokseen saman elimen. B) LTBP4 proteiinin ekspressiotasot arvioitiin immunohistokemiallisesti potilaan kudoksissa ruokatorven syöpään etenemistä verrattuna normaaliin ruokatorven kudosten kudossiruina. C) immunohistokemiallinen arviointi LTBP4 ilmentymisen normaalissa ruokatorvi, ruokatorven adenokarsinooma (EAC) vaihe II, EAC vaiheen III ja kaukainen imusolmuke etäpesäke. Mustat nuolet osoittavat LTBP4-positiivista värjäytymistä. Tulokset esitetään ± keskihajonta ja * p 0,05, ** p 0,01 verrattuna normaaliin kudokseen. Pylväsdiagrammit: 50 pm.

Lisäksi olemme keskittyneet enemmän juuri LTBP4 ilmaisun neoplasioista ja preneoplasias ruokatorven (kuvio 1 B). Cancer viereiseen normaaliin kudokseen näkyvissä 43%, hyperplasia 22%, karsinooma

in situ

8%, EAC 37%, pienisoluinen erilaistumaton karsinooma 3%, ESCC 4% ja etäpesäkkeiden 4% LTBP4 ilmentyminen verrattuna normaaleihin ruokatorven kudosta. Verrattuna normaaliin ruokatorven kudosta LTBP4 ilmentyminen oli myös merkittävästi vaimentua potilaan kudoksessa refluksiesofagiitin (38%) ja krooninen tulehdus (39%), sekä riskitekijöitä EAC (kuvio 1 B).

Normaali ruokatorven kudos selvästi osoitettu LTBP4 ilmentyminen ruokatorven epiteelisoluissa ja vähemmän näkyvästi asuva lymfosyyttien sisällä lamina propria (kuvio 1 C ja tukeminen Information S1). LTBP4 ei ollut esitetty vaiheen II ja vaiheen III EACS (kuvio 1 C). Kaukaisilla imusolmuke etäpesäke, syöpäsolut ei myöskään esiintynyt LTBP4 ilmaisu, kun taas ympäröivä mesenkymaalisten kudosten osoitti selvästi LTBP4 ilmaisu (kuvio 1 C). Kuitenkin korrelaatioita ole LTBP4 ekspressiotasot ja kliinisten parametrien, kuten patologisia vaiheessa tai metastaattinen tila havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

Re-ilmentymisen LTBP4 ruokatorven sinoomasolulinjoja vähentää solujen vaeltaminen kyky

LTBP4 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua EAC ja ESCC. Tutkia roolia LTBP4 ruokatorven syöpä tarkempia, OE33, solulinja on peräisin EAC, ja KYSE180, solu, joka on peräisin ESCC, analysoitiin.

Molemmat solulinjat osoittivat samanlaisia ​​LTBP4 ilmentymisen transkription ja proteiini taso (tukeminen Information S1). Ohimenevä uudelleen ilmentäminen LTBP4 (transfektion tehokkuus 40-50%) vuonna OE33 ja KYSE180 solut johti neljän ja yhdeksän kertainen säätelyä LTBP4, vastaavasti (tukeminen Information S1). Pienempi nauhat jälkeen ohimenevän uudelleen ilmentymisen LTBP4 saattaisivat puuttuu translaation jälkeiset modifikaatiot, vaikutusta aiemmin kuvattu [19]. Osittainen proteolyysi voidaan sulkea pois, koska LTBP4 ja c-myc voitiin havaita fuusioproteiinina. Ohimenevä uudelleen ilmentymisen LTBP4 muokattu kyky OE33 ja KYSE180 soluja siirtää. 24 h kuluttua migraation etäisyys OE33 solujen väheni 5% (p = ei riittävä) ja KYSE180 solujen 30% (p 0,05) verrattuna ohjaamaan vektoriin transfektoiduissa soluissa (kuvio 2A). Immunofluoresenssivärjäyksen paljasti, että LTBP4 ja c-myc-positiivisia soluja on määritelty rajojen solun vapaassa välissä. Ainoa ei-transfektoidut solut muuttivat solun vapaassa välissä (kuvio 2B). Solujen elinkykyä ja soluproliferaatiota ei muutu, kun uudelleen ilmentymisen LTBP4 on OE33 ja KYSE180 soluja (tietoja ei esitetty).

A) Migration etäisyys OE33 ja KYSE180 soluissa sen jälkeen, kun ohimenevän transfektion joko pcDNA6 kontrollina tai pcDNA6-LTBP4 24 tunnin sisällä. Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa. Symbolit edustavat tulokset kunkin yksittäisen kokeen ja kuvaajat dokumentoida kunkin keskiarvoja. Merkitykset annetaan:

#P = ei riittävä ja * p 0,05. B) edustaja immunofluoresenssivärjäyksen of migraatiokokeessa suoritettiin KYSE180 solujen uudelleen ilmentävien LTBP4. LTBP4 (vihreä) ja c-myc (punainen) positiiviset solut (keltainen), joka määritellään rajojen solun vapaassa välissä. Vain ei-transfektoidut solut muuttivat soluun vapaa aukko. Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). Nuoli osoittaa siirtymisen suuntaan. Pylväsdiagrammi: 50 pm.

Demetylaatio hoito 5-atsa-2′-deoksisytidiini indusoi LTBP4 ilmaisu, kun taas TGF-β1 ilmentyminen ei muutu

Epigeneettiset muutoksia, kuten metylointi sytosiinin jäämien CpG-sekvenssit, niin sanotut CpG-saarekkeiden, joita tiedetään säätelevän inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeeneille syöpäsoluissa [20]. Jälkeen demetylaatio hoito 5-atsa-2′-deoksisytidiinin LTBP4 ilmentyminen indusoitiin OE33 ja KYSE180 solujen yli 150% ja 60%, vastaavasti (kuvio 3A), kun taas demetylaatio hoito 5-atsa-2′-deoksisytidiini ei muuttaa merkittävästi TGF-β1 ilmentyminen sekä ruokatorven syöpä solulinjoissa (kuvio 3B).

A) qPCR analyysi osoitti induktio LTBP4 ilmentymisen OE33 ja KYSE180 soluissa, sen jälkeen demetylaatio hoidon 5-atsa-2′-deoksisytidiini. B) qPCR analyysi ei osoittanut mitään merkittäviä muutoksia TGF-β1 ilmentyminen OE33 ja KYSE180 solujen jälkeen demetylaatio hoidon 5-atsa-2′-deoksisytidiini. Käsittelemättömät solut toimivat kontrollina. Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa, ja keskiarvo laskettiin. Tulokset esitetään ± keskihajonta ja * p 0,05 verrokkiin nähden.

LTBP4 promoottori alueita hypermetyloitunut ruokatorven sinoomasolulinjoja

Analysoimme ennustettu riippumaton promoottorialueet LTBP4L ja LTBP4S N-terminaalisen alueen genomisen

LTBP4

DNA-sekvenssi [12]. Tällä alueella kahdeksan CpG-saarekkeiden (I-VIII) on todettu, mukaan lukien kaksi CpG-saarekkeiden (I ja II) sisällä ennustettu LTBP4L promoottori ja kolme CpG-saarekkeiden (IV-VI) sijaitsevat ennustettu LTBP4S promoottori. CpG-saarekkeiden III, VII ja VIII lepäävät välittömässä läheisyydessä promoottorin rakenteiden (kuvio 4).

metylaatiostatuksen oletetussa LTBP4 promoottorin alueet analysoitiin klonaalinen bisulfiitti sekvensointi OE33 ja KYSE180 soluja. Kahdeksan CpG-saarekkeiden tunnistettiin ja ainakin kymmenen sekvensoitiin kullekin solulinjan. Prosenttiosuus metylaation kussakin CpG-saarekkeen visualisoidaan kuin ympyräkaavio. Eksonit on havainnollistettu mustat laatikot ja LTBP4 promoottorit punaiset viivat. Käännöksen alku alueet ilmoitetaan (ATG). Katkoviivat edustavat vaihtoehtoisten silmukoinnin LTBP4.

Yksityiskohtainen analyysi metylaatiostatuksen CpG saarten OE33 ja KYSE180 paljasti, että CpG-saarekkeiden (III, VII, VIII) etäiseksi promoottorialueille metylaatio oli harvoin ( 3%) havaittiin (kuvio 4).

CpG-saarekkeiden sijaitsevat LTBP4L promoottorin hypermetyloitunut (kuvio 4). In OE33 ja KYSE180 solujen CpG-saarekkeen näytin keskimäärin metylaatio noin 50% ja 80% ja CpG-saarekkeen II 45% ja 60%, vastaavasti (kuva 4).

CpG-saarekkeiden sijaitsevat LTBP4S promoottorin näytetään eri metylaation. CpG-saarekkeen V ja VI osoitti alle 2% metylaatio, kun taas CpG-saarekkeen IV osoitti OE33 ja KYSE180 solujen keskimäärin metylaatio oli noin 40% ja 30%, vastaavasti (kuva 4).

Mahdollisten transkriptiotekijöiden for LTBP4L ja LTBP4S

Lisätietoja

in silico

analyysin internet-pohjainen hakuvälineet Matlnspector [21], TFSEARCH [22] ja Promoottori 2.0 [23] tehtiin tutkia, genomisen sekvenssin CpG-saarekkeiden I, II ja IV sisällä LTBP4L ja LTBP4S promoottori alueet sisältävät säätelyelementtejä. Mikään yhteisen promoottorin elementtejä, kuten TATA- tai CCAAT-box-havaittiin, mikä on yhdenmukaista aikaisempien havaintojen [12]. On osoitettu, että promoottorialueet LTBP4L ja LTBP4S sisältää useita XCPE sivustoja sekä sitoutumiskohdat eri transkriptiotekijöiden [12]. CpG-saarekkeiden I, II, ja IV ei sisällä XCPE sivustoja, mutta otaksuttu sitoutumiskohtia transkriptiotekijöille GATA1, Smad3, E2F4, SP1, ja MZF-1 havaittiin (tukeminen Information S1).

yksityiskohtainen tarkastelu n metylaation CpG island I paljasti kaksi hyvin metyloitu CpG-dinukleotidien molemmissa solulinjoissa osana oletetun GATA1 sitoutumiskohdan (kuvio 5).

in silico

analyysi LTBP4 promoottorikohtien tunnistettu erittäin metyloitu sitoutumiskohdan GATA1 että LTBP4L edistäjä OE33 ja KYSE180 soluja. Erittäin metyloitua sitoutumiskohtia SP1 ja E2F4 löytyy LTBP4S promoottori molemmissa solulinjoissa. Sitoutumiskohdan Smad3 tunnistettiin lähellä. Metylaatiostatuksen analysoitiin kloonivalinnalla bisulfiitti sekvensointi ja vähintään kymmenen sekvensoitiin kullekin solulinjan. Prosenttiosuus Metylointi visualisoida ympyräkaavio. Eksonit on havainnollistettu mustat laatikot ja LTBP4S ja LTBP4L promoottorit punaiset viivat. Käännöksen alku alueet ilmoitetaan (ATG). Katkoviivat edustavat vaihtoehtoisten silmukoinnin LTBP4.

CpG-saarekkeen IV kaksi erittäin metyloitua CpG-dinukleotidien havaittiin molemmissa solulinjoissa (kuvio 5). Nämä CpG-dinukleotidit havaittiin osana oletetun sitoutumiskohta joko transkriptiotekijän SP1 tai E2F4. Lisäksi 13 nukleotidia ylävirtaan erittäin metyloitua CpG dinukleotideissä sitoutumiskohdan Smad3 tunnistettiin (kuvio 5).

Käytimme

in vitro

transkriptiotekijän aktiivisuuden tutkimukset sen arvioimiseksi, transkriptiofaktoreiden GATA1 , SP1, Smad3 ja E2F4, tunnistettiin otaksuttu säätelyelementtejä CpG saarilla I ja IV, pystyivät muuttamaan toiminnan LTBP4L tai LTBP4S promoottorit. Ilmaus transkriptiotekijöiden varmistettiin SDS-PAGE ja immunoblottaus (tukeminen Information S1).

Kuten kuviossa 6 on esitetty, havaitsimme, että GATA1 hieman lisääntynyt LTBP4L promoottorin aktiivisuutta, mutta ei muuttanut LTBP4S promoottorin aktiivisuutta ( Kuvio 6A).

HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi pGL4.10-LTBP4L tai pGL4.10-LTBP4S ja

Renilla

lusiferaasin ekspressiovektori normalisoimiseksi. Soluja myös ko-transfektoitiin eri pitoisuuksilla A) GATA1 ekspressiovektori, B) SP1 ekspressiovektori, C) Smad3 ekspressiovektori tai D) E2F4 ekspressiovektoriin. 24 tunnin kuluttua solut hajotettiin, ja lusiferaasin aktiivisuudet määritettiin. Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa, ja keskiarvo laskettiin. Tulokset esitetään ± keskihajonta.

Havaitsimme pitoisuudesta riippuva kasvu joko LTBP4L tai LTBP4S promoottorin aktiivisuuden SP1 ja Smad3, mutta LTBP4S promoottori toimintaa nousu oli paljon merkittävämpi kuin LTBP4L promoottorin aktiivisuus lisätä (Kuva 6B ja kuvio 6C). LTBP4L promoottorin aktiivisuus ei muuttunut E2F4, mutta E2F4 hieman lisääntynyt LTBP4S promoottorin aktiivisuutta (kuvio 6D).

tutkia mahdollisen tehostajana funktio GATA1, SP1, Smad3 ja E2F4, myös määritetty aktiivisuus LTBP4L ja LTBP4S promoottorit liittyy minimaalinen promoottori.

ei ollut ilmeisiä muutoksia GATA1, SP1, Smad3 (tuloksia ei ole esitetty) tai E2F4 (kuvio 7) LTBP4L promoottorin toimintaa ja GATA1, SP1 tai Smad3 on LTBP4S promoottorin aktiivisuus, kun LTBP4 promoottorit liittyy minimaalinen promoottori (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin E2F4 johti 14-kertainen LTBP4S promoottorin aktiivisuuden, kun se liittyy minimaalinen promoottori (kuvio 7).

HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi pGL4.23-LTBP4L tai pGL4.23-LTBP4S ja

Renilla

lusiferaasin ekspressiovektori normalisointia. Solut myös kotransfektoitiin eri pitoisuuksina olevan E2F4 ekspressiovektoriin. 24 tunnin kuluttua solut hajotettiin, ja lusiferaasin aktiivisuudet määritettiin. Kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa, ja keskiarvo laskettiin. Tulokset esitetään ± keskihajonta.

Keskustelu

soluväliaineen proteiini piilevä TGF-β sitovan proteiinin 4 (LTBP4) on vaimentua ihmisen ja hiiren ductal karsinoomat

in situ

, invasiivisia nisäkarsinoomia [17], [24], sekä koiran nisäkarsinoomia [25], viittaa mahdolliseen fylogeneettiseen säilyneitä säätely LTBP4 ilmaisua. Iässä 6-8 kuukautta Ltbp4S hiirten kehittää peräsuolen adenokarsinooman [26]. Nämä tulokset osoittavat, että ilman LTBP4 voi olla rooli kehitettäessä epiteelin kasvaimet.

Nyt olemme huomanneet, että LTBP4 on vaimentua eri ihmisen adenokarsinoomia maha-suolikanavan, sekä neoplasioista ja preneoplasias ruokatorven .

Toistaiseksi ei molekyylitason biomarkkereita diagnosointiin tai riskien kerrostuminen ja arviointi ruokatorven syöpä käytetään kliinisessä käytännössä [27]. Tuloksemme viittaavat siihen, LTBP4 ehdokkaana geenin biomarkkeri paneelin kasvaimiin, ja etenkin preneoplasias ruokatorven kudosta.

LTBP4 ei ole ainoa LTBP joka liittyy muodostumista eri syöpätyyppien [13], [14 ], [15], [16], [18], [28]. Kasvainten maksan, munasarjat ja neuroendokriinisten kasvainten ruoansulatuskanavan ilmentymistä LTBP1 vähenee [14], [16], [18]. Ltbp3 on vaimentua kasvaimia erityisiä aktivoitua hiiren T-solujen populaatioita verrattuna naiivien T-solujen [28]. Nenänielun karsinoomat ja ESCC LTBP2 ilmentyminen vähenee ja uudelleen ilmentymisen LTBP2 in ESCC kasvainsoluissa estää neoplastisen kapasiteetti

in vitro

ja

in vivo

[13], [15]. Tuloksemme osoittavat samanlaista vaikutusta varten LTBP4

in vitro

. Re-ilmentyminen LTBP4 EAC ja ESCC solujen vähentää solujen vaeltamiseen kyky, kun taas solujen elinkelpoisuutta ja solujen lisääntymistä säilyvät ennallaan. Nämä tiedot viittaavat siihen, että LTBP4 oma roolinsa edistettäessä EAC ja ESCC solun liikkuvuus. Kuitenkin löytää taustalla molekyylitason mekanismit mikä vähentää solun liikkuvuus lisätutkimukset ovat tarpeen.

Hyvin tutkittu transkription sääntelymekanismina, joka on usein muuttunut aikana pahanlaatuisiksi, on metylaatio CpG saarista promoottorit [29 ]. Aiemmin on osoitettu, että promoottori metylaatio on vastuussa vähentää ilmentymistä LTBP2 nenänielun karsinooma ja ESCC [13], [15]. Tuloksemme osoittavat, että demetylaatio hoito johtaa säätelyä LTBP4 EAC ja ESCC solulinjoissa ja korkeamman LTBP4 ilmaisun vähentää syövän solujen vaeltamiseen. Demetylaatio hoito palauttaa LTBP2 ilmentyminen ESCC solulinjoissa ja korkea LTBP2 ilmentyminen korreloi paremmin selviytymisen ESCC potilaista [13]. Siten epigeneettiset hoito ruokatorven syöpään kanssa hypomethylating aineilla voisi olla yksi uusi terapeuttinen lähestymistapa, koska epigeneettiset hoitojen atsasitidiinin osoittaa ensimmäisen lupaavia tuloksia potilailla, joilla on myelodysplastista oireyhtymää, parantaa elämänlaatua ja selviytymistä [30]. Tietenkin tämä uusi lupaava terapeuttinen lähestymistapa on ruokatorven syöpä on lisätutkimuksiin.

LTBP4L ja LTBP4S ennustetaan voidaan transkriboitu ohjaus kahden riippumattoman promoottorit [12]. Tarkemmat analyysit metylaatiovyöhykkeiden molempien promoottorien johdetut solulinjat EAC ja ESCC paljastaa erittäin metyloitua otaksuttu sitoutumiskohtia erilaisille transkriptiotekijöitä, kuten GATA1, Smad3, E2F4 ja SP1.

erittäin metyloitua otaksuttu sitoutumiskohdan GATA1 on tunnistettu LTBP4L promoottorialueen. Mahdolliset sitoutumiskohtia GATA1 löytyy myös ylävirran alueelta LTBP1S [31], mikä viittaa Mahdollista asetusta eri LTBP isoformien GATA1. Kuitenkin meidän

in vitro

transkriptiotekijän aktiivisuuden tutkimukset osoittavat vain vähäistä indusoivaa vaikutusta GATA1 päälle LTBP4L ilmaisun ja mitään vaikutusta LTBP4S ilme.

LTBP4S promoottorialue sisältää erittäin metyloitua otaksuttu sitoutumiskohtia transkriptiotekijät SP1 ja E2F4 ja lisäksi oletetun sitoutumiskohdan Smad3 tunnistetaan 13 nukleotidia ylävirtaan erittäin metyloitua CpG dinukleotideissä. SP1 transkriptiotekijät ovat tärkeitä säätelijöitä eri soluväliaineen proteiinien [32] ja Smad3 sitoutumiskohdat ovat tarpeen induktio ihmisen LTBP3 promoottorin aktiivisuutta TGF-β1 [33]. Meidän

in vitro

transkriptiotekijän aktiivisuuden tutkimukset osoittavat, että SP1 ja Smad3 pikemminkin säädellä LTBP4S kuin LTBP4L. Lisäksi E2F4 näyttää näkyvin vaikutus sääntelyä LTBP4S, mutta E2F4 toimii ainoastaan ​​voimakas säätelijänä LTBP4S ilmaisun yhdessä TATA-box kuten säätelyelementti. Tietääksemme nämä tulokset ovat ensimmäinen paljastaa yhteyden LTBPs ja transkriptiotekijä E2F4. Aiemmat tutkimukset tunnistettu merkittävä rooli E2F4 säätelyssä erilaistumisen ja kehityksen eri soluista, kuten rasvasolut [34], punasolujen [35], [36] ja kallon osteoblastien progenitorisolujen [37]. Puutos E2f4 hiirillä johtaa syntymän jälkeiseen kuoleman takia heikentynyt kehitys hengitysteiden epiteelin [38]. Mielenkiintoista, ihmisillä mutaatiot LTBP4 osoittavat samanlaisen, hieman miedompi keuhko fenotyyppi, kuolevat varhain elämässä takia heikentynyt keuhkojen kehitystä ja näyttää kallon ja kasvojen poikkeavuuksia, kuten microretrognathia, tasainen midface, väistymässä otsa ja laaja fontanelles [39]. Ltbp4S hiirten myös kehittää keuhkojen ilmiasuun heikentynyt keuhkojen kehitykseen, mutta mitään selvää kraniofakiaalisten poikkeamia [26], [40]. Nämä tulokset ovat lupaavia indikaattorit sääntelyn vaikutus E2F4 on LTBP4S ilme, suhteen keuhkojen kehitystä. Tämä mielenkiintoinen uusi näkökohta vaatii lisätutkimuksia.

osoittavat nyt, että LTBP4 on vaimentua EAC ja ESCC kautta promoottori metylaatio, jotka viittaavat siihen, LTBP4 mahdollisena ennustetekijöiden biomarkkereiden jotka voivat rikastuttaa hoitovaihtoehtoja. Lisäksi tunnistimme transkriptiotekijä E2F4 uusina tehokas säädin LTBP4S ilme.

Materiaalit ja menetelmät

kudossiruina immunohistokemiallinen värjäys ja pisteytys

kudossiruina (TMA) varten ruokatorven syövän etenemisessä, useita mahasyöpä, haimasyöpä, ohutsuolen syöpä ja paksusuolen syöpä jokainen sisältää ylimääräistä kudosnäytteistä levyepiteelin normaali limakalvo ja submucosa on esopagus, normaali mahan cardia, normaali haima, normaali ohutsuolen epiteelisoluissa ja limakalvojen ja normaalin paksusuolen olivat ostettu USA Biomax (USA). TMA leikkeet värjättiin primaarisella vasta-aineen vastaan ​​N-terminaalinen fragmentti LTBP4 (tukeminen Information S1). Antigeeni haku tehtiin microwaving sitraattipuskurissa (pH 6,0) 10 minuutin ajan. Ensisijainen vasta-aine laimennettiin 1:100 ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Vasta-aine havaittiin käyttäen SuperVision RED 2 AP-polymeeri mukainen pakkaus valmistajan protokollan (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Saksa). TMA osat vastavär- käyttäen hematoksyliinillä, kuivattu, ja peitettiin. Myönteisiä immunoreaktiivisuus, luokittelu tehtiin semikvantitatiivisesti viiden tason, jossa 0 = alle 10%, 1 = 10-25%, 2 = 25-50%, 3 = 50-75%, 4 = yli 75% positiivista for LTBP4 värjäystä. Ei yritetty grade tuloksiin perustuen värjäyksen värin voimakkuutta, koska luontainen subjektiivisuuden tällaisen mittauksen, ja sen alttius vaihtelut tutkijat. Arviointi suoritettiin itsenäisesti kaksi kokeneita tutkijoita, jotka olivat tietoisia liittyvät kliiniset tiedot ja ristiriitaisia ​​tulokset ratkaistaisiin keskustelun mikroskoopilla.

Solulinjat

OE33, solulinja on peräisin adenokarsinooma ruokatorven, hankittiin European Collection of Cell Cultures (ECACC, UK). KYSE180, solu, joka on peräisin ruokatorven okasolusyöpä, hankittiin German Collection of Microorganism ja Cell Cultures (DSMZ, Saksa). Kaikki ruokatorven solulinjoja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% 10,0000 U /ml penisilliiniä /10,000 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Transfektio ja migraatiokokeessa

Ihmisen cDNA LTBP4L (NM_001042544) ja LTBP4S (NM_001042545) ostettiin Origene (USA) ja kloonattiin (alukkeiden tukeminen Information S1) osaksi pcDNA6 /

myc-

His vektori (Life Technologies, Saksa). OE33 ja KYSE180 soluja ympättiin 1,5 × 10

4 /hyvin ja 2 x 10

4 /kuoppa, vastaavasti, Culture-Lisäykset muuttoliike määritykset (ibidi, Saksa) ja transfektoitiin väliaikaisesti 1: 1 seoksella pcDNA6 /

myc

His ekspressiovektoreita LTBP4L ja LTBP4S 24 tuntia myöhemmin. Kulttuuri-insertit poistettiin 18 tuntia transfektion jälkeen. Siirrettyjä etäisyys solujen mitattiin 0 h, 3 h, 6 h, 12 h ja 24 h kuluttua poistamisen Culture-lisäosien. Transfektiotehokkuus määritettiin immunofluoresenssilla ja proteiinin ilmentymistä SDS-PAGE ja immunoblottaus.

Immunofluoresenssikoe

Solut kiinnitettiin 24 tuntia poiston jälkeen Culture-Lisäykset 15 minuuttia 4% paraformaldehydi ja blokattiin 60 minuutin ajan 5% naudan seerumin albumiinia /0,3% Triton X-100 PBS: ssä. Soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (tukeminen Information S1) yli yön 4 ° C: ssa. Toissijainen vasta-aineet kytkettiin Alexa Fluor 488 tai Cy3 (Life Technologies, Saksa). Tumat vastavärjättiin DAPI (Life Technologies, Saksa).

RNA Expression Analysis

Konfluentteja viljelmiä ruokatorven soluja käytettiin RNA: n kanssa TRIzol reagenssilla (PEQLAB Biotechnologie, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. RNA pitoisuuksia ja puhtaudet määritettiin spektrofotometrisesti. Käänteistranskriptio tehtiin oligo-dT-alukkeita ja SuperScript III-käänteistranskriptaasia (Life Technologies, Saksa), käyttämällä 1 ug kokonais-RNA mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Saatu cDNA näytteitä käytettiin kvantitatiivista tosiaikaista PCR (qPCR) analyysi. qPCR tehtiin käyttäen Platinum® Kvantitatiivinen PCR SuperMix-UDG w /ROX (Life Technologies, Saksa). Kolme rinnakkaista reaktiota perustaa ja qPCR tuotteet varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. LTBP4 ja TGF-β1 kvantifiointi mRNA-tasojen laskettiin käyttämällä standardikäyrää menetelmällä. Standardikäyrät luodaan käyttämällä kymmenkertaista laimennosta ulkoista ohjausta. Käytetyt alukkeet ja koettimet (Eurofinsille MWG Operon, Saksa) on lueteltu tukeminen Information S1.

SDS-PAGE ja immunoblottaus

Konfluentteja viljelmiä ruokatorven solut kerättiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris HCl: lla, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 0,5% Na-deoksikolaattia; 0,1% SDS), jota oli täydennetty proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Switzerland). Proteiinikonsentraatiot määritettiin kolorimetrisesti Bradfordin menetelmällä käyttämällä Protein Assay Kit (Biorad, USA). 100 ug kokonais-solujen proteiinit erotettiin SDS-PAGE (7,5% polyakryyliamidigeeleillä) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Macherey-Nagel, Saksa). Seuraavat estää 5% maitojauhetta tai 5% BSA TBST: ssä, ensisijainen vasta-aineita (tukeminen Information S1) käytettiin yli yön inkubointi nitroselluloosakalvoille. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) toimi loading ohjaus. Antigeenit havaittiin käyttäen peroksidaasi-konjugoitua anti-rabbit- tai anti-hiiri-vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch, USA). Kemiluminesenssin signaali mitattiin käyttäen ImageLab mittausohjelma (Biorad, USA).

metylointi analyysi

Genominen DNA ruokatorven syöpä solulinjoja uutettiin standardimenetelmillä ja modifioitu käyttämällä EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit (QIAGEN, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Kaksi promoottorialueet LTBP4 tunnistettiin aiemmin [12]. Käyttämällä UCSC Genome Browser [41] kahdeksan CpG-saarekkeiden (CG pitoisuus 50%) tunnistettiin sisällä promoottorialueille. Metylaatiospesifisen alukkeet suunniteltiin MethPrimer [42]. Käytetyt alukkeet on lueteltu tukeminen Information S1. Monistettu ui bisulfiittikäsiteltyä CpG-saarekkeiden subkloonattiin sitten PGM-T Easy Vector (Promega, USA).