Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kuihtuminen tai laihtuminen huolimatta riittävä ravinto, merkittävästi heikentää elämänlaatua ja hoitovaste syöpäpotilailla. Syöpäpotilailla, luuston lihasten kuihtumista, laihtuminen ja kuolleisuus ovat kaikki positiivisesti liittyy lisääntynyt seerumin sytokiinien, erityisesti interleukiini-6 (IL-6), ja kun läsnä on akuutin vaiheen vasteen. Akuutin vaiheen proteiineja, kuten fibrinogeeniä ja seerumin amyloidi A (SAA), syntetisoidaan hepatosyyttien vastauksena IL-6 osana synnynnäistä immuunivastetta. Perehtyä välisiä suhteita näiden havaintojen tutkittiin hiirillä, joilla on keskivaikea tai vaikea Colon-26 (C26) -carcinoma kuihtuminen.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kohtalainen ja vaikea C26 kakeksia liittyi korkea seerumin IL-6 ja IL-6-perheen sytokiinien ja hyvin samankaltainen luustolihasten geeniekspression. Top kanoninen reitit säädellään ylöspäin molemmat olivat komplementti /Hyytymisketjun, proteasomin, MAPK signalointi, ja IL-6 ja STAT3 polkuja. Kuihtuminen liittyi lisääntynyt lihas pY705-STAT3 ja lisääntynyt STST3 lokalisointi myonuclei. STAT3 kohdegeenien, kuten SOCS3 mRNA ja akuutin vaiheen vaste proteiinit, olivat erittäin aiheutettiin kakektisissa lihas. IL-6 hoitoa ja STAT3 aktivointi sekä myös aiheuttama fibrinogeenin viljellyissä C2C12 lihasputkia. Kvantitointi lihas vs. maksan fibrinogeenin ja SAA proteiinin tasot osoittavat, että lihas vaikuttaa suuri osa seerumin akuutin vaiheen proteiinien syöpään.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat siihen, että STAT3 transcriptome on merkittävä mekanismi tuhlaa syövän. Kautta IL-6 /STAT3 aktivointi, luurankolihasten indusoituu syntetisoimaan akuutin vaiheen proteiineja, jolloin syntyy molekyylitason yhteydestä havaintojen korkea IL-6, lisääntynyt akuutin vaiheen vasteen proteiineja ja lihasten tuhlaa syövässä. Nämä tulokset viittaavat siihen, mekanismi, jonka STST3 saattavat kausaalisesti vaikuttaa lihasten kuihtumista muuttamalla profiilia geenien ilmaistuna ja kääntää lihasten niin että aminohapot vapautunut lisääntynyt proteolyysin kuihtuminen syntetisoidaan osaksi akuutin vaiheen proteiineja ja viedään vereen.

Citation: Bonetto A, Aydogdu T, Kunzevitzky N, Guttridge DC, Khuri S, Koniaris LG, et ai. (2011) STST3 Aktivointi Luurankolihasvaikutukset Linkit lihassurkastumasta ja akuutin vaiheen vaste syöpäkakeksialle. PLoS ONE 6 (7): e22538. doi: 10,1371 /journal.pone.0022538

Editor: Gianni Parise, McMaster University, Kanada

vastaanotettu: 06 toukokuu 2010; Hyväksytty: 29 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 20 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Bonetto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahoja TAZ National Cancer Institute R01 CA122596 (www.nci.nih.gov), National Institute for General Medical Studies R01 GM092758 (www.nigms.nih.gov), American Cancer Society Research Scholar Grant TBE-111831 (www .acs.org), yksittäiset jako peräisin ACS Institutional Grant yliopiston Miami, jonka Papanicoulau Corps for Cancer Research (www.papcorps.org), jota naisten Cancer Association of University of Miami (www.wcaofum. org), jonka Wendy Will Case Cancer Fund (www.wwccf.org), Department of Defense Breast Cancer Research Program (BCRP) BC045536 (cdmrp.army.mil), ja jonka Amit perhe. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kuihtuminen tai etenevä surkastuminen rasvan ja luustolihasten huolimatta riittävä ravinto, on laajalle levinnyt ja tuhoisa komplikaatio syöpä [1], [2], [3]. Kuihtuminen kärsii yli puolet kaikista syöpäpotilaita ja tulokset heikkous, heikentynyt elämänlaatu, huono hoitovaste, ja alttius sairauteen. Lisäksi kuihtuminen on itse vastuussa 25-30% kaikista syöpään liittyvien kuolemien [1], [2]. Tällä hetkellä ei ole olemassa hyväksyttyä, tehokkaita hoitoja lihassurkastumatilaan syövän.

Kliinisesti syöpäkakeksialle määritellään painon vähintään 5%, kun läsnä on taustalla sairaus liittyy lihasten heikkous, väsymys, anoreksia, alhainen lihasmassaa ja epänormaalia biokemia, mukaan lukien lisääntynyt tulehdus, anemia ja alhainen seerumialbumiini. Laihtuminen on 5%, 10% tai 15% koko kehon painosta kutsutaan lievä, keskivaikea tai vaikea kakeksia, vastaavasti, ja molemmat laihtuminen ja nopeus laihtuminen korreloi positiivisesti kuolleisuus [4]. Etiologia kuihtuminen on monitekijäinen. Vaikka potilasalaryhmässä ilmaantuu varhaisvaiheen kylläisyyden ja anoreksiaa, tutkimukset ovat osoittaneet, että ravinnontarpeestaan ​​kakektisilla potilaita on oltava riittävä pitämään kehon painosta, mutta ne menettävät paino riippumatta [5]. Kuten hyvin, kakektisia potilaat voivat olla hypo-, normo- tai hyper-aineenvaihdunnan suhteen lepää energian kulutusta, mikä viittaa siihen, että korjauksilla aineenvaihduntaa voi yksin olla vastuussa havaitusta painon menetystä [2]. Lisäksi kasvaimen kilpailu metabolisen polttoaineille on epätyydyttävä selitys kuihtuminen, sekä siksi pinpoint kasvaimia voi tuottaa kuihtuminen ja koska ihmisen kasvainten 500 g tai suurempi eivät välttämättä indusoi tuhlaa [6].

systeeminen metabolinen derangements huomattava in syöpäkakeksiassa havaitaan myös muunlaisella systeemisen tulehduksen [7]. Sytokiinit, mukaan lukien tuumorinekroositekijä (TNF) /TNF, interleukiini (IL) -1α, IL-1β, interferoni-γ, ja IL-6 ovat sekaantuneet kuihtuminen sekä kokeellisilla manipuloinnin hiirimalleissa ja assosioituessa seerumipitoisuuksilla potilaille, joilla on kakeksia [6], [7]. IL-6 on monitoiminen sytokiini osallistuu erilaisia ​​isännän puolustusta ja patologisten prosessien [8]. Toiset ja olemme osoittaneet, että IL-6 anto hiirille on riittävä indusoimaan tuhlaaminen lihasten ja rasvan varastoi ja vakavimmissa tapauksissa lopulta kuolemaan [9], [10], [11], [12], [13] , [14]. Kuten hyvin, IL-6: lla on merkittävä rooli asiakkuutta kakeksian hiirillä paksusuolen-26 tasyöpäsolulinja ja kohtusyöpä linja, Yomoto, koska anto IL-6 salpaajien vähentää lihassurkastumatilaan näissä malleissa [15], [ ,,,0],16], [17], [18]. Seerumin IL-6 on herkkä ennustaja laihtuminen, kuten potilailla, joilla on edennyt pienisoluinen keuhkosyöpä [19] ja paksusuolen syöpä [20]. IL-6 ja muut gp130 ligandit kuten LIF ja CNTF uskotaan välittävän kakeksian yhdistämällä anoreksia, lipidien hajoamista, insuliiniresistenssi, ja vaikutukset proteiinisynteesiä ja hajoaminen. Kuitenkin molekyyli reittejä säätelee IL-6 luurankolihaksessa, jotka johtavat lihasten kuihtumista ovat tuntemattomia.

IL-6 vaikuttaa soluihin sitoutumisen IL-6-reseptorin α-ketjun (IL-6Rα), myös tunnettu gp80, joko sen kalvoon sitoutunut vai liukoinen muoto, joka indusoi gp130: n dimerisaation ja aktivointi siihen liittyvät Janus-kinaasien (Jaks), joka tyrosiini fosforyloi gp130 [21]. Nämä tapahtumat johtavat aktivointi kaksi suurta signalointireittien, STAT3 ja mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK /ERK) cascade. STAT3 aktivaatio tyrosiinifosforylaa- johtaa dimeroitumi- ja tumaansiirtymiseen, DNA: ta sitova ja modulaatio geenin ilmentymisen. Yhteistyössä c-Jun ja erilaisia ​​transkriptiotekijä CAAT tehostaja-sitova proteiini (C /EBP), IL-6 signaloinnin kautta STAT3 up-regulation akuutin vaiheen vasteen proteiinin geenin ilmentyminen maksassa. Akuutin vaiheen reaktio on yleistetty vaste luonnollinen immuniteetti, joka koostuu noin 40 geenien säädelty jopa useita tuhatkertaisesti stimuloitaessa [22].

Tisdale ja Fearon työtovereiden ovat sidoksissa syöpä kuihtuminen kanssa pysyviä kohonneet akuutin vaiheen vasteen proteiineja seerumissa [23], [24], [25]. Noin 50% kaikista syöpäpotilaista, osoittavat seerumin akuutin vaiheen vasteen proteiineja aikaan syövän diagnoosi, ja prosenttiosuus syöpäpotilaiden kohonnut seerumin akuutin vaiheen vaste kasvaa sairauksien esiintyvyys ja vaiheessa [24], [26]. Kohonneita fibrinogeeniä havaitaan monissa maligniteetteja, kuten keuhko- ja melanooma, ja lisääntynyt ilmentyminen korreloi synkkä tulos [27], [28]. Nykyiset mallit posit että kasvain ja isäntä peräisin tekijät indusoivat proteolyysin jotta ylläpitää kroonista maksan akuutin vaiheen vasteen. Tuotanto akuutin vaiheen vasteen proteiineja maksassa edellyttää kataboliaa rakenteellisten proteiinien luustolihasten lähteenä aminohappoja. Koska erot aminohappo käyttöasteen lihasproteiineista versus akuutin vaiheen, enintään 2,6 g lihasten proteiinia tai 12 g lihaskudosta voidaan hukkaan syntetisoimiseksi 1 g akuutin vaiheen vasteen proteiinit [29].

pyrittiin määrittämään mahdollisista yhteyksistä kohonnut sytokiineja, akuutin vaiheen vaste ja tuhlaa syövässä. Kirjoittajat raportoivat luonnehdinta seerumin sytokiinien ja lihaksen transcriptome paksusuolessa-26 adenokarsinooman malli syöpäkakeksialle. Tarjoamme näyttöä STAT3 aktivointi, kohdegeenin ilmentyminen ja akuutin vaiheen vaste sekä maksan ja luustolihasten näissä hiirissä, tarjoaa molekyylitason yhteydestä näiden havaittuja ilmiöitä.

Tulokset

Colon26 malli syöpäkakeksiassa

Istuttaminen paksusuoli-26 (C26) adenokarsinoomasolua Balb /c- tai CD2F1 hiirillä on klassinen malli syöpäkakeksialle [30], [31]. Kuten useimmissa syöpäpotilailla, ruokailu ei ole lyhennetty C26 kuihtuminen ja IL-6-tasot kohoavat [30]. Toimenpiteet, jotka vähentävät IL-6 tässä mallissa estävät myös tuhlaa [15], [16], [17], [18]. Meidän käsissämme, CD2F1 naarashiirillä ruiskutettiin C26 solujen kokenut asteittainen lasku koko kehon paino (kuvio 1A-B). Hiiret lopetettiin 10% laihtuminen (19 päivää injektion jälkeen) ja 15% laihtuminen (24 päivää), mikä keskivaikea ja vaikea kakeksia. Lasku koko kehon paino oli mukana suhteellisesti enemmän lihasmassan (kuvio 1 C). Quadriceps painonlasku 23,7% (

p

0,001 vs. PBS-pistetään valvonta) kohtalaisen kakektisissa hiirillä ja 24,4% (

p

0,001) vakavasti kakektisissa hiirillä. Samoin kaksoiskantalihas painot laskivat 25,2% (

p

0,001) kohtuullisissa kuihtuminen ja 30,0% (

p

0,001) vakavia kuihtuminen. Tällainen lasku lihasmassaa tiedetään johtuvan lisääntynyt proteiinien hajoaminen johtuu aktivointi proteolyyttisen koneen [32] samoin kuin menetys tietyn lihaksen proteiinien, kuten myosiinin raskaan ketjun (MyHC) [33]. Sopusoinnussa menetys lihasten proteiinia, liukoinen quadriceps proteiinipitoisuus (joka lasketaan vakio proteiiniuutoksia) pienennettiin molemmissa tautitiloissa (kuvio 1G). Lisäksi MyHC väheni merkittävästi sekä kohtalainen (-69%, p 0,01) ja vaikeaa (-81%, p 0,01) kakeksia (kuva 1 E-F).

A, B, painon muutokset valvonnan hiirille ja hiirille ruiskutettiin C26 syöpäsoluja. Hiiret tapettiin päivänä 19 oli menettänyt -10% kehon painosta, pitää kohtuullisena kuihtuminen. Hiiret tapettiin päivänä 24 oli menettänyt -15% kehon painosta, pidetään vakava kuihtuminen. C, laski merkittävästi quadriceps ja gastrocne- painoja havaittiin C26 kakeksia. Erot olivat pieniä lihaksia kohtalainen vastaan ​​vakava kuihtuminen. D, maksan paino ja kasvaimen paino molemmat lisääntyi vakavuuden /kestoon kuihtuminen. E, edustaja Western blotting varten myosiinin raskaan ketjun (MyHC) in nelipäiseen lihakseen sekä ohjaus ja kasvain hiirille. F, Densitomet- kvantifiointiin Western blotting varten MyHC proteiini havaitaan merkittävä väheneminen sekä kohtalainen (-69% vs. kontrollit) ja vaikea (-81% vs. kontrollit) kuihtuminen. G, Total proteiinipitoisuus nelipäiseen lihakseen kontrollista ja tuumoreita kantavaa hiirtä. Proteiinipitoisuus on merkittävästi vähentynyt molemmissa kohtalainen (-7% vs. kontrollit) ja vaikea (-13% vs. kontrollit). n = 4-5 ryhmää kohti; ** P 0,01, *** P 0,001.

Toisin kuin lihasten kuihtumista, yhteensä maksan paino nousi 17,3% (

p

0,01) kohtuullisissa kuihtuminen ja 36,4% (

p

0,001) vaikea kakeksia (kuvio 1 D). Kasvaimen koko kasvoi myös ajan kanssa ja tuhlaa (kuvio 1 D), samoin kuin pernan koon (tuloksia ei ole esitetty).

Plasma analyytin profilointi sekä kohtalaisen ja vaikeasti kakektisia hiirillä paljasti, että verenkierrossa IL-6 ja kolme muuta gp130 ligandeja, IL-11, leukemiaa estävä tekijä (LIF) ja onkostatiini M lisääntyivät merkitsevästi kasvaimen kantavien hiirten (taulukko 1). Tasot Tuumorinekroositekijä (TNF), IFN-γ: n ja IL-1α, kolme muiden sytokiinien liittyy usein kakeksia, oli merkittävästi kohonnut samoin. Seerumin IL-6 reagoiva akuutin vaiheen fibrinogeenin, haptoglobiini ja Von Willebrand Factor myös merkittävästi indusoitiin vastauksena kasvain. Toisin kuin ihmisillä, C-reaktiivinen proteiini (CRP) ei ole akuutin vaiheen proteiini hiirillä ja ei koholla kuihtuminen. Tämä nousu plasman IL-6 ja akuutin vaiheen vaste proteiinit yhdistettynä kasvu maksassa massa ovat johdonmukaisia ​​tunnettujen vaikutusten IL-6 välittämisessä maksan akuutin vaiheen vasteen [13], [34], [35], [36], [37]. Nämä tulokset hiirillä C26 kasvaimia rinnakkain yhdistys IL-6 ja akuutin vaiheen vaste lihassurkastumatilaan syöpäpotilailla.

transkriptio profiilin C26 mallin syöpäkakeksialle

me pyrittiin määrittämään muutoksia lihaksen geenien ilmentyminen liittyy tuhlaa. Mikrosiruanalyysi ja tietojen normalisointi suoritettiin RNA eristettiin nelipäinen hiirten, joilla on kohtalainen tai vaikea C26 kakeksia ja ei-kasvain laakeri valvontaa. Valvomaton arvojärjestyksen näytteiden selvästi erotettava ohjaus lihas, kohtalaisen hukkaan ja vakavasti hukkaan näytteistä (kuvio 2A).

, Heat kartta nelipäinen geeniekspression C26 kuihtuminen osoittavat selvästi klusterointi geenien koeryhmään. Näytteet on normalisoitu valvontaa. Sininen merkitsee alas geenien, keltainen ylös geenien, ja musta ei muutosta. Vain geenejä

P

0,05 yksisuuntaisella ANOVA näkyvät. B, vertailu geeniekspression kohtalaista tai vaikeaa C26 kakeksia (NextBio).

Tilastollinen analyysi suoritettiin geenien tunnistamiseen esillä merkittäviä muutoksia ilmaisun aikana kuihtuminen. Niistä 45281 selostukset, 1607 geenejä havaittiin ilmentyä erilailla kohtalainen kuihtuminen ja 1328 vakavia kuihtuminen (-2≤ kertainen muutos ≥2,

p

0,05) (kuvio 2B). Kaiken kaikkiaan 700 geenit ilmaistaan ​​yleinen kohtalaista tai vaikeaa kuihtuminen, joista kaikki paitsi 5 säädeltiin samaan suuntaan molemmissa ryhmissä (taulukko S2). Top 30 geenien kertamuutosta säädellään kussakin keskivaikean ja vaikean kakeksia on esitetty taulukoissa 2 ja 3. Lopuista 907 olivat ainutlaatuisia kohtalaiseen kakeksian (taulukko S3) ja 628 vakavaan kakeksian (taulukko S4). Samankaltaisuus geenin ilmentymisen näiden kahden ryhmän välillä oli erittäin merkitsevä (

p

= 1,0 e-323). Huolimatta monista merkittävästi muuttunut geenejä, useimmat geenit katsotaan yleisesti olevan ”kodinhoitoa” geenejä ja käytetään normalisointia strategiat eivät olleet erilaisia ​​ryhmien välillä. Erityisesti gylceraldehyde-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), beeta-aktiini (ACTB), b-aktiinin (ACTB), 18S RNA: n (RN18S), aldolaasi (ALDOA, ALDOB, ALDOC) ja useimmat tubuliinit (TUBA2, TUBB1, TUBB2a, TUBB2c, TUBB3, TUBB4, TUBG1, TUBG) pysyivät ennallaan.

Tunnetut lihasten kasvua säätelygeenit

lihasten surkastuminen lähes kaikki etiologies liittyy lisääntynyt ilmentyminen luustolihasten ubikitiini E3 ligaasit, Trim63 /Murf-1 ja Fbxo32 /Atrogin-1 [38], [39], [40]. Molemmat olivat selvästi lisääntynyt meidän mikrosiruanalyysi, jolla on suurempi nousu Trim63 /Murf-1 versus Fbxo32 /Atrogin-1 ja korkeamman ilmentymisen kohtalainen vastaan ​​vakava kuihtumista (kuva 3). Nämä suuntaukset varmistettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä. Lihasatrofia liittyy myös alentunut ilmentyminen koodaavan RNA: n rakenteellisia proteiineja. Todellakin, microarray ja qRT-PCR, sydämen alfa aktiini ja myosiinin raskaan ketjun 8 oli säädeltiin, enemmän vakavia verrattuna kohtalainen kuihtumista. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​raportteja muiden C26 kuihtuminen [33].

, Expression of ubikitiinipromoottori ligaaseina Fbxo32 /Atrogin-1 ja Trim63 /MuRF1 aiheuta microarray ja qPCR analyysi. Ilmentymistä geeneillä, jotka koodaavat lihaksen rakenteellisia proteiineja, mukaan lukien ACTA1 ja MHY8 vähenevät. B, geeniekspressiomalleja in C26 kuihtuminen kartoitettu päälle kaavamainen lihasten kasvua säätelyreaktioissa. Geenit kanssa osoittivat kasvua edistävää aktiivisuutta in lihasten näkyvät vihreinä, kasvua estävä geenien punaisena. Numero vasemmalla edustaa kertamuutosta kohtuullisissa kuihtuminen ja aivan vakava kuihtuminen, että nuoli osoittaa suunnan muutoksen. Geenit ilman arvoja ei joko muuttaa tai eivät läsnä aineisto.

Pathway analyysi

Jotta voitaisiin tunnistaa molekyylien polkuja säädellään vastauksena C26 aiheuttama kakeksia, geeni profiileja quadriceps valvonta-, keskivaikea ja vaikea kakeksia analysoitiin käyttämällä NextBio (kuva 4). Top 20 Broad MSigDB kanoninen väyliä säädellään ylöspäin sekä keskivaikea ja vaikea paksusuolen-26 kuihtuminen, kahdeksan liittyivät tulehdukseen, kuten komplementti ja hyytymistä polkuja, IL-6, STAT3, JAK-STAT, sytokiinien ja Toll-like-reseptori reittejä. Väylät liittyvät proteasomin, mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi (MAPK), solusyklin, lihasten supistumisen, epidermaalinen kasvutekijä, ErB ja mTOR signalointi lisättiin myös.

. Top 20 Broad MSigDB kanoninen väyliä merkittävästi säädellään ylöspäin kohtalaista tai vaikeaa kakeksia vastaan ​​kontrollit. Pink palkit (ylempi akseli) edustaa merkitys päällekkäisyys. Kolmiot (kohtalainen kakeksia) ja ympyrät (vakava kakeksia) (alempi akseli) ilmi useita geenejä differentiaalisesti ilmaistut että polku. Punaiset nuolet osoittavat polkuja, jotka liittyvät IL-6 /STAT3 /tulehdus. B, Top 20 Broad MSigDB kanoninen väyliä merkittävästi säädellä vähentävästi kohtalaista tai vaikeaa kakeksia vastaan ​​kontrollit. Vihreät palkit (yläakselit) edustavat merkitystä päällekkäisyys. Kolmiot (kohtalainen kakeksia) ja ympyrät (vakava kakeksia) (alempi akseli) kuten edellä.

ylhäältä kanoninen reitit alassäädetty liittyi luuston lihasten supistumisen, peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin-γ koaktivaattorikompleksien -1α, kalsium sääntely, soluväliainevuorovaikutuksia, luuston myogeneesin, ja insuliinin ja WNT signalointi, mm.

STAT3 aktivointi ja kohdegeenin ilmentymisen C26 kuihtuminen

Koska näkyvyyden sytokiinin /IL-6 /STAT3 pääsyväylistä mikrosiruanalyysi etsittiin ilmentymisen karakterisointiin STST3 vuorovaikutuksessa geenien mallimme. Genomatix Bibliosphere käytettiin tuottamaan luettelon 124 dokumentoitua fyysisen ja toiminnallisen vuorovaikutukset STST3 erilaisissa järjestelmissä (taulukko S5). Näistä 26 geenit osoittivat merkittävää sääntelyn maltillinen ja vakavasti hukkaan näytteistä (kuvio 5A).

V: Heat kartta geeniekspression muutoksia Stat3 ja yhteistyön mainittu geenituotteita, jonka osoittaa Genomatix Bibliosphere. Sininen merkitsee sääteli geenejä, keltainen ylös säänneltyä, ja musta ei muutosta. Vain geenit P 0,05 yksisuuntaisella ANOVA näkyvät. B: osajoukko STAT3 kohdegeenien tunnistetut kirjallisuudessa differentiaalisesti säännellään kohtalaista tai vaikeaa kakeksia vastaan ​​kontrollit. C: STAT3 ja sen kohdegeenien SOCS3 ja CEBPD kasvavat mRNA-tasolla microarray ja qPCR. D: Proteiini tasot p-STAT3 ja STAT3 uutteissa quadriceps, gastrocnemius ja maksan arvioitiin Western blotting-analyysi. E: SOCS3 proteiinin tasot. F: kvantitatiivinen analyysi p-STAT3 /STAT3 ja p-STAT3 /GAPDH-suhde (ilmaistuna kertamuutosta vs. kontrollit). G: kvantitatiivinen analyysi SOCS3 proteiinin tasot (ilmaistuna kertamuutosta vs. kontrollit). GAPDH käytettiin sisäisenä referenssinä vahvista yhtä suuri kuormitus. n = 3-5 ryhmää kohti; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 vs. Controls,

$ P 0,05 vs. kohtalainen.

Myös kysytään STST3 kohdegeenien olivat myös aiheuttama. Kirjallisuustutkimuksesta johti tunnistamiseen 186 validoitu STAT3 kohdegeenien tunnistettu useita eri lajeja ja järjestelmiä (taulukko S6) [41], [42], [43], [44], [45], [46]. Näistä 39 oli ilmaistu joko kohtalainen tai vaikea kakeksia tai molemmat (kuvio 5B).

Tunnettuja STST3 tavoitteita lisääntynyt quadriceps kohtalaista ja vakavaa kakeksia olivat STAT3 itsensä ja transkriptiotekijä CCAAT /tehostajana sitovan proteiini δ (C /EBP δ) [47]. Molemmat transkriptiotekijät osallistua induktioon ja ylläpitoon akuutin vaiheen vasteen geenien ilmentyminen, kuten fibrinogeenin, seerumin amyloidi A, haptoglobiini, ja lipidien sitova proteiini [47] – [48] [22]. C /EEBPδ on myös osoitettu ilmentymisen indusoimiseksi myostatiinin [49], negatiivinen säätelijä lihasmassan [3], [50]. Microarray tuloksia vahvistettiin qPCR ja osoitti vahvaa induktion STAT3, C /EBPδ ja akuutin vaiheen vasteen geenejä on keskivaikea tai vaikea kakeksia. STAT3 myös tiedetään indusoida oman palautteen estäjä, suppressori sytokiinisignaloinnin-3 (SOCS3). Itse asiassa, SOCS3 lisättiin mRNA-tasolla on kakeksia (kuvio 5C).

Kaikki tätä vahvaa STAT3 kohdegeenin ilmentymisen ehdotti, että STAT3 aktiivisuus lisääntyi kuihtuminen. STAT3 aktivoidaan osittain fosforylaation Y705, joka indusoi dimerointi, tumaansiirtymiseen ja DNA: ta sitovan [51], [52]. Western blotting-analyysi lihaksen uutteiden osoittivat lisääntynyttä pY705-STAT3 tasoilla sekä quadriceps ja gastrocne- hiiriä, joissa on C26 kasvain, sekä keskivaikea ja vaikea kakeksia (kuva 5 D). Analogisesti huomattavasti enemmän pY705-STAT3 tasot havaittiin maksassa (kuvio 5 D-F). Mielenkiintoista, SOCS3 todettiin olevan vain minimaalisesti ylös säädellään proteiini tasolla kohtalaisesti kakeksian quadriceps eikä lainkaan reisilihakseen vakavia kuihtuminen, kun se oli alassäädetty gastrocne- näytettä sekä kohtalaista tai vaikeaa kakeksia (kuva 5 E- G). Sen sijaan SOCS3 oli ennallaan maksan näytteet sekä ohjaus ja kakektisia hiirillä (kuva 5 E-G). Yhdenmukainen lihasten pY705-STAT3 tasoilla, yleinen lisääntynyt ydinvoiman pSTAT3 tasoilla ja myonuclei lokalisointi havaittiin lihaksen hiirten C26 kakeksia (Kuva 6A-B).

A, p-STAT3 proteiinin tasot ovat lisääntyneet ydin- uutteita valmistettiin loukkaantuneen vakavasti kakektisissa C26 kasvain hiirillä verrokkeihin verrattuna. n = 5 ryhmää kohden. B, Immunofluoresenssianalyysi suoritettiin paljastaa kasvoi pSTAT3 lokalisointiin myonuclei gastrocnemiuksen peräisin vakavasti kakektisia C26 kasvain-vaihteisto hiiriä (vihreä). Tumavärjäystä näkyy sinisenä (DAPI).

Luustolihakset on merkittävä tekijä akuutin vaiheen vasteen tuotantoa

Koska vankka induktio akuutin vaiheen geenin RNA kuihtuminen (kuva 5 ), pyrimme vahvistamaan ekspression proteiinitasolla. Western blotting-analyysi, tasot erittyvän proteiinin fibrinogeenin reisilihakseen uutteet kasvanut 2-12-kertaiseksi hiirissä C26 kakeksia vastaan ​​kontrollit, riippuen siitä, mikä bändi on määrällisesti (kuvio 7A). Maksan, fibrinogeeni proteiini kohoamiseen 2-5 kertaiseksi (kuvio 7A). Mittaus fibrinogeenin signaalin standardikäyrää vastaan ​​puhdistettua hiiren fibrinogeenin normaalin reisilihakseen sisälsi noin 0,9 ng fibrinogeenin per ug proteiinia, kun taas reisilihakseen on C26 kakeksian sisälsi 1,9 ng /ug (kuvio 7B), joka on ~ 2-kertainen. Maksan normaali sisälsi 1,8 ng /ug fibrinogeeni, kun taas maksan C26 kuihtuminen sisälsi 5,2 ng /ug fibrinogeeni, joka on ~ 3-kertainen. Fibrinogeeni ekspressio lisääntyi myös reisilihakseen sekä maksassa vasteena antoa IL-6 (kuvio 7B), mikä viittaa siihen, tämä voi olla yleinen vastaus korkeassa IL-6 ja ei rajoitu syöpää.

A. Western blotting ja kvantitointi fibrinogeenipitoisuutta valvonta- ja C26 quadriceps ja maksassa. Data (keskiarvo ± SEM) ilmaistaan ​​suhteellinen densitometrian arvo. ** P 0,01, *** P 0,001. B, Western blotting-analyysi fibrinogeenin standardin proteiinien ja quadriceps ja maksauutteista valvontaa, CHO-IL6 pistetään nude-hiiriin ja C26 pistetään CD2F1 hiirillä. Kvantifiointi suoritettiin bändi nuolella. Data (keskiarvo ± SEM) ilmaistaan ​​ng fibrinogeeni /ug proteiinia. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001. C, Western blotting analyysi osoittaa huomattavasti fibrinogeenin ja SAA1 proteiinin tasot quadriceps ja gastrocnemiuksen kohtalaista ja vakavaa C26 kakeksia. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Nämä tulokset kuviossa 7A ja 7B osoittavat, että suuruus fibrinogeenin induktion ja synteesin nelipäiseen on samanlainen kuin maksassa. Fibrinogeeni ekspressio lisääntyi myös gastrocnemiuksen kohtalaista ja vakavaa kakeksia (kuvio 7C), mikä osoittaa, että fibrinogeeni todennäköisesti laajasti ilmaistu luustolihasten. Proteiini tasot SAA1 lisääntyivät myös quadriceps ja gastrocne- Western blotting-analyysi viittaa siihen, että luurankolihasten voisi ilmaista proteiineja useimpien tai kaikkien akuutin vaiheen vasteen geeneistä indusoi mRNA-tasolla.

Viljellyt luustolihasten kuituja ilmaista akuutin vaiheen vasteen proteiineja vasteena IL-6: n tai STAT3 aktivointi

huolimatta induktio fibrinogeenin ja SAA mRNA lihaksen, proteiini akuutin vaiheen proteiinien luustolihasten uutteet teoriassa voisi johtua kontaminoivien plasmassa. Jotta edelleen testata hypoteesia, että fibrinogeeni on tuotettu suoraan luurankolihasten aktivaation IL-6 /STAT3-reitin, me tartunnan C2C12 Hiiren myotube viljelmien rekombinantti adenovirusta, joka ekspressoi konstitutiivisesti aktivoitua muotoa STAT3, cSTAT3 [53], sekä GFP merkkiaineena. Western blotting C2C12 otteita 48h tartunnan jälkeen osoitti merkittävän kohoamisen FibroGen Ad-cSTAT3-GFP kulttuureissa versus Ad-GFP viljelmät (+ 86% vs. GFP, p 0,01; kuvio 8A). Sen määrittämiseksi, onko fibrinogeeni tuotettiin jälkeen IL-6 haastava, C2C12 lihasputkia altistettiin hiiren rekombinantti-IL-6 jopa 48 tuntia. Tämä johti osaksi lisääntymiseen fibrinogeenin, sekä soluosastoon Western blottauksella (kuvio 8B) ja viljelyväliaineessa ELISA (kuvio 8C). Nämä kokeet osoittavat, että jopa ilman muiden solutyyppien ja kudoksissa, luustolihasten solut reagoivat IL-6 ja aktivointi STAT3 syntetisoimalla akuutin vaiheen proteiini, RNA: ita ja proteiinien eritys.

A, Western blotting -analyysi ja kvantitointi fibrinogeeniä C2C12 lihasputkia tartunnan Ad-cSTAT3-GFP tai Ad-GFP kontrollina. Fibrinogeeni ekspressio lisääntyi sopusoinnussa tasojen nousu on STAT3. ** P 0,01, *** P 0,001 vs. GFP. B, Western blotting -analyysi ja kvantitointi fibrinogeenin ilmaisun C2C12 käsitelty IL-6 (100 ng /ml) 1, 24, 48 h. GAPDH käytettiin latauskontrollina. Lisääntynyt ilmentyminen fibrinogeenin havaittiin kullakin ajanhetkellä sen jälkeen, kun IL-6-hoitoa. Data (keskiarvo ± SEM) ilmaistaan ​​suhteellinen densitometrian arvo. *** P 0,001 vs. verrokkeihin nähden. C, Fibrinogeeni tasot ELISAlla elatusaine C2C12 altistetaan IL-6: ssa 30 min, 1, 6, 24, 48 h. Fibrinogeeni tasot olivat merkittävästi koholla jälkeen 6, 24 ja 48 h IL-6 hoitoa. Data (keskiarvo ± SEM) ilmaistaan ​​ng /ml. ** P 0,01, *** P 0,001 kontrolleja (C).

Keskustelu

pyrittiin jäljittelemään korkea seerumin IL-6, akuutin vaiheen vaste ja lihasten kuihtumista syöpäpotilaiden hoitoa kuihtuminen. Valitsimme C26 adenokarsinooma, joka esittelee lisäsi verenkierrossa IL-6, joka samaan aikaan lihasten kuihtumista [15]. Tiettyjä klooneja C26, jotka eivät aiheuta kakeksia sattumalta eivät tuota IL-6 [54], [55], [56]. Yhdenmukainen kausaalinen rooli lihasten kuihtumista ihmisillä, verenkierrossa IL-6 on raportoitu olevan markkeri laihtuminen kärsivillä potilailla eri syöpätyyppien [19]. Lisäksi suora anto IL-6 hiirille indusoi systeemistä lihasten kuihtumista. Johdonmukaisuutta tällaisten lihassurkastumatilaan poikki eri reittejä IL-6 antamisesta myös injektoimalla yhdistelmä-IL-6 [11], jonka transgeneesin [57], jonka istuttaminen osmoottisen pumpun tuottaa yhdistelmä-IL-6 [13], injektiona IL-6 ilmentävien CHO-solujen kateenkorvattomiin nude-hiirissä [12] – [13], ja transfektion plasmidi-DNA, joka koodaa IL-6 [14], [58], on osoitus teho, jonka IL-6 aiheuttaa sen, että kakektisilla fenotyyppi .

Riippumatta, IL-6 on todennäköisesti ole ainoa sytokiini välittäjänä lihassurkastumatilaan syövän tai jopa C26 mallissa. Esto IL-6 vain osittain pelastaa lihassurkastumatilaan että C26 malli, jolloin jotkut päätellä, että IL-6 on vain yksi monista pelaajista mukana C26 mallissa ja voi itse indusoi koko kakeksiaoireyhtymän [16]. Toinen sytokiinien havaitsimme kasvoi C26 hiirillä, jotka saattavat myös olla rooli lihasten kuihtumista kuuluvat IL-6-perheen ligandit, kuten LIF, sekä TNF-a, IFN-gamma, jotka kaikki voivat aiheuttaa kuihtuminen itsenäisesti. Zhou et al. Hiljattain hypoteesi IL-6 voi toimia vain marginaalinen rooli kuihtuminen [59]. Sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten [60], he ilmoittivat, että myostatiinin inhibitio käyttäen liukoinen reseptori-fuusioproteiini kehittäneet Lee et ai. [61] vähensi lihaksen menetyksen C26 mallissa. Seerumin IL-6 tasot sellaiset hiiret eivät eronneet kontrollikäsitellyistä C26 hiirillä. Kuten hyvin, kirjoittajat eivät voineet aiheuttaa lihaksen menetys hiirillä, joille annettiin rekombinantti-IL-6 osmoottisen pumpun. He päättelevät, että lihas ehtyminen syöpäkakeksialle saattaa riippua myostatin ja niihin liittyvät ligandit sijaan proinflammatoristen sytokiinien yksin. Vaihtoehtoinen tulkinta näiden tietojen, kuitenkin se, että myostatiinin inhibitio johtaa lihasten hypertrofia, joka tasapainottaa IL-6: n tai muiden sytokiinien indusoima lihasten kuihtumista. Toiseksi, on myös todennäköistä, että kirjoittajat ole saavutettu riittävää annoksen IL-6 vaikutus tuhlaaminen. He käyttivät ihmisen IL-6, joka on 5- 10-kertaa pienempi aktiivisuus kuin hiiren IL-6 on hiiren soluja [62], tasolla 40-60 kertaa vähemmän kuin ne, jotka on raportoitu aiheuttavan vakavia tuhlaamatta [13]. (ED

50 ihmisen rekombinantti-IL-6 T1165.85.2.1 hiiren plasmasytoomasoluihin määrityksessä on 0,2-0,8 ng /ml, kun se on 0,02-0,06 ng /ml rekombinanttia hiiren IL-6.) Näin ollen voittopuolisesti todisteet osoittavat, että IL-6 voi aiheuttaa lihasten kuihtumista. Onko vaikutus on suora tai epäsuora on vielä epäselvää ja mitä mekanismi johtaa lihasten kuihtumista on vielä tuntematon.

Tässä dokumentoida että STAT3 polku aktivoituu luustolihaksessa C26 kantavien hiirten ja että ilmaus STAT3 tavoite geenejä, mukaan lukien akuutin vaiheen vaste geenit aktivoituvat.