Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä solujen aineenvaihduntaa reagoi androgeenien puute hoitoa (ADT) voidaan mukana kehittämässä ja etenemisen eturauhassyöpä ja lopullinen epäonnistuminen androgeenipuutteen hoito. Tutkia aineenvaihduntaa asetuksen vaikutuksia androgen riippumaton kasvu eturauhassyövän, vakiintunut LNCaP-s solu malli, joka muistuttaa kliininen skenaario kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä (CRPC), käytettiin tässä nykyisessä tutkimuksessa. Tämä solulinja oli viljellään androgen-herkkien LNCaP vanhempien soluja, androgeenista vähennetty ehto, joka muistuttaa kliininen androgeenien puute hoitoa. Vaikutusten arvioimiseksi on smsDX sen invasiivisuus eturauhassyöpäsolujen käytimme haavan paranemista määritys ja Matrigel ™ invaasiomääritys. Olemme arvioitiin differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien parentaalisten LNCaP ja LNCaP-s-soluissa sen jälkeen, kun ADT avulla kaksiulotteinen geelielektroforeesi (2-DE) ja sen jälkeen MALDI-TOF-massaspektrometrinen analyysi. Katettu alue haavan ja solujen lukumäärä tunkeutuvat läpi Matrigel kammion olivat merkittävästi pienempiä soluja käsiteltiin smsDX kuin ne olivat ohjaus soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä. 56 proteiinit havaittiin differentiaalisesti ilmaistut LNCaP-s soluja verrattuna LNCaP, suurin osa niistä alassäädetty jälkeen ADT hoidon. 104 proteiinit LNCaP-solujen ja 86 LNCaP-s-solut, erikseen, todettiin ilmentyvät differentiaalisesti hoidon jälkeen smsDX, Kun tutkimme näiden proteiinien toimintojen sivuston UniProtKB /Swiss-Prot, yllättäen, useimmat proteiinit havaittiin olevan osallisena että solujen aineenvaihduntaan ja mitokondrioiden toimintaan sääntelyä. LNCaP-s mahdollisina metastasoituneen androgeenista riippumaton syöpäsoluja, sen aineenvaihdunta ja mitokondrioiden toimintoja voitaisiin muuttaa uudella somatostatiini johdannainen smsDX, The smsDX sääntelyn vaikutuksia aineenvaihduntaan LNCaP-s antaa enemmän terapeuttista tietoa hoitoon CRPC.

Citation: Yan L, Xing Z, Guo Z, Fang Z, Jiao W, Guo X, et al. (2013) Somatostatiini Johdannaissopimukset (smsDX) tavoitteet Cellular Aineenvaihdunta eturauhassyöpäsoluissa jälkeen androgeenien puute Therapy. PLoS ONE 8 (2): e55790. doi: 10,1371 /journal.pone.0055790

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 12 syyskuu 2012; Hyväksytty: 31 joulukuu 2012; Julkaistu: 07 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant Sponsor : National Natural Science Foundation of China (nro 81172435) ja Shandong Natural Science Foundation (nro ZR2010HM026). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin pahanlaatuinen kasvain miehillä, ja suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta Yhdysvalloissa ja Euroopassa miehillä [1]. Kasvain etenemiseen CRPC vaihe on monimutkainen prosessi, joka voidaan mukana sekä kloonijalostus ja mukautuva mekanismit heterogeenisissä kasvaimet koostuvat soluista, jotka reagoivat eri androgeenien puute hoitoa (ADT). Kuitenkin mekanismit, joilla kasvaimet hankkia androgeeniriippumattomuuteen edelleen epäselviä ja on korjattava ennen tehokasta hoitoa ei voida kehittää.

ADT käytetään yleisesti edenneen eturauhassyövän. Mutta androgeenien puute hoito ei ole parantava [2], joten tappava CRPC on väistämätöntä. Merkkejä verisuonten rappeutumista, hypoksia, ja metabolisen stressin eturauhasen kasvainkudoksessa pahentaa leikkaushaavan tai kemiallinen kastraatio [3]. Lyhyen remission aikana, suurin osa eturauhassyövän tulee androgeenin riippumaton. CRPC solut jälkeen ADT ovat selvinneet alhaisesta hapen ja ravinteiden ympäristöön ja syntyy eri fenotyyppi. Androgeenideprivaatio tiedetään aiheuttavan neuroendokriini (NE) erilaistuminen LNCaP-soluissa, ja siihen siirryttäessä androgeeniriippumattomuuteen [4], [5]. NE kasvaimet ovat osoittautuneet yli-ilmentää somatostatiinireseptoriin (SSTRs) [6]. SSTR1-5 lauseke voidaan säännellä somatostatiini ja sen johdannainen smsDX mahdollista kautta sääntelyn mitokondrioissa LNCaP, joka lopulta voisi laukaista mitokondrio-välitteisen apoptoosin [7]. Somatostatiinianalogit sitoutuvat SSTRs ja uskotaan on kaksi kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta, sekä suoraan (anti-proliferatiivinen) ja epäsuoria (inhibitio eri peptidin hormonit kasvainsolut) [8], [9]. Somatostatiinianalogin, lanreotidi on osoitettu olevan huomattava antineoplastisen vaikutuksen erilaisissa kasvaimissa, mukaan lukien CRPC [10]. Mutta sääntelyssä somatostatiinianalogin eturauhassyöpään solun aineenvaihduntaan ei ole selvästi osoitettu.

väittävät, että esto androgeenireseptorin (AR) lauseke on sinänsä riittävä indusoimaan solukuolemaa AR-positiivisten solujen. Mutta kun nämä AR-positiivisten solujen vähitellen menettänyt AR ilmentymistä tai alemmassa AR ilmentymistä eturauhasen syöpäsolujen, ne CRPC solut voisivat saada energiahuollon kautta mitokondrioiden toimintaa. Tulosten mukaan on Sotgia F ryhmä [11], epiteelisyöpäsolujen voi kestää jopa energiaa runsaasti aineenvaihduntatuotteiden viereisistä strooman fibroblasteista joka antaa tarvittavaa energiaa runsaasti mikroympäristölle helpottaa kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä. Nämä nälkään solut riisuttu androgeenireseptorin voisivat käyttää näitä aineenvaihduntatuotteiden mitokondrion trikarboksyylihapposyklin (TCA), tuloksena on korkeampi proliferatiivisen kapasiteetin. CRPc solut syntymässä jälkeen ADT, säätää ylös entsyymejä, jotka muuntavat lisämunuaisen androgeenien testosteronin ja DHT (erityisesti AKR1C3) edistämään heidän kasvaimensisäisenä androgeenisynteesin ja aktivoiminen AR transkriptioaktiviteettia [12], AR uudelleenaktivointi on lisääntynyt kasvaimensisäisenä synteesiä testosteronin ja DHT heikot androgeenit tuottamat mahdollisesti

de novo

kolesterolista vastaanottavissa strooman ja solun aineenvaihduntatuotteita.

Suurin ongelma johtuvat eturauhasen syöpä on sen taipumus etäispesäkkeitä. Paikallinen hyökkäys on yksi keskeisistä varhaisen vaiheet etäpesäkkeitä, koska ilman sitä kasvain levinnyt ei voi tapahtua. Monivaiheisessa prosessissa hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden on kaavamaisesti sarjana erillisiä vaiheita, usein kutsutaan invaasio-etäpesäkkeen cascade [13], [14]. Tänä cascade metabolisen uudelleenohjelmointia tukemaan synteesi uusien proteiinien, lipidien ja nukleiinihappojen on kriittinen solujen kasvua ja jakautumista [15]. Me spekuloida, että solujen aineenvaihdunnan muutoksia olisi seurattava eturauhassyövän kehitykseen tappavia CRPC tila. Tutkimuksemme keskittyy smsDX inhiboivia vaikutuksia invasiivisuus eturauhassyövän ja säätelyyn liittyvien solun aineenvaihduntaan jälkeen eston AR aktiivisuuden välittämän androgen ehtyminen. Käyttämällä LNCaP ja LNCaP-s soluja tutkia proteiinien mukana solun aineenvaihduntaa ja energiaa toimintoihin eturauhassyövässä ja määrittää erityiset aiheuttamia somatostatiinin johdannainen smsDX, osoitimme ADT down-regulation useimmat mitokondrioiden proteiineista, mahdollisesti johtaa aktivoinnin mitokondrion välittämän apoptoottisen reitin. SmsDX vaikutukset ER johtaa yli-ilmentymisen GRP78 yhdessä kahden muun ER proteiinien PDIA1 ja PDIA3. smsDX kykenee sen vaikutuksia dysregulating metabolisia entsyymejä eri tasoilla, joka liittyy parhaillaan CRPC solujen invasiivisuus ja selviytymistä. Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että ADT säätelee mitokondrio-välitteistä ja ER stressiä signalointia LNCaP ja johtaa uudelleenohjelmointi aineenvaihdunnan CRPC soluissa, smsDX sääntelyn vaikutuksia CRPC soluihin antaa hyödyllistä tietoa hoitoon CRPC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinja (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) rutiininomaisesti yllä säännöllisesti väliaineessa (Phenol Red-positiivinen RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% FBS: ää, 1% glutamiinia ja 0,5% gentamysiini), kuten aikaisemmin on kuvattu, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Väliaine vaihdettiin kaksi kertaa viikossa ja solut trypsinoitiin ja subcultivated kerran viikossa. Kokeita varten androgeenireseptorin herkkä LNCaP-solujen jatkoviljelmälukemista 28-33 käytettiin. Perustaa androgeeni-riippumaton eturauhassyöpäsolulinja, me vil- LNCaP-s solulinja vanhempien eturauhassyövän LNCaP on androgeenipuutteen kunnossa. Jälkeen 8-12 kohtia, LNCaP-s-soluja käsiteltiin smsDX. Somatostatiini oli Ferring, Kiel, Saksa. Soluviljelmää käsiteltiin smsDX (professori Sten Nilsson Lab) tai somatostatiinin kolme päivää, 1 nM päivässä, kuten ovat kuvanneet Liu Z [7]. Anti-ihmis-AR, CGA ja NSE, anti-TOM40-vasta-aine (sc11414), β-aktiini (kanin anti-aktiini-vasta-aineen R-22) ostettiin Santa Cruz Biotecnology. TCTP (# 5128), STMN1 (# 3352) ja VDAC2 (# 9412) vasta-aineet hankittiin Cell Signaling kaupallisesti. CBX3 (HPA004902) ja GRP78 (G9043) vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma kaupallisesti.

Haavan paranemista määrityksessä

Solut kasvatettiin konfluenssiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille ja haava tehtiin kaapimalla keskellä yksisolukerros kanssa P200 pipetin kärki. Sen jälkeen, kun kelluvat solut poistettiin pesun jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella tuoretta täydellistä alustaa, joka sisälsi 10 nM smsDX tai vastaava määrä PBS: ää lisättiin. Kulkeutumista ja solujen liikkuvuus koko haava-alueen tutkittiin 24 tunnin kuluttua.

matrigeelin invaasiomääritys

Invasion analyysi suoritettiin käyttäen Matrigel päällystettyjä TranswellTM insertit (BD ™) 8 um huokosia 24 kuopan levyt, kuten valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, suspensioon, jossa oli 1 x 10

6 solua 100 ul: ssa seerumitonta alustaa lisättiin insertin ja 500 ui RPMI 1640 -alustaa, joka sisälsi 20% FBS: ää, johon oli lisätty 1-10 nM smsDX tai vastaava määrä suolaliuosta oli lisätään kaivon pohjalle. Sen jälkeen, kun levyjä inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa insertit kiinnitettiin metanolissa, suodattimet värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat läpi Matrigel päällystetyt Transwell-insertit laskettiin 40-kertaisella suurennuksella. Solujen lukumäärä laskettiin riippumaton rinnakkaisessa kokeessa vähintään 10 kenttää per kuoppa. Kokeet toistettiin 3 kertaa.

Western blot-analyysi

androgeeniriippuvaisissa LNCaP jälkeen ADT hoidon, me viljellä vakaa LNCaP-s solulinjassa. Androgen riippumaton eturauhasen syöpäsolun biomarkkereita ja proteiinit vaikuttavat smsDX testattiin. Western blottaus suoritettiin vahvistamaan useiden valittujen ilmentyvät eri proteiineja tunnistettiin 2-DE perustuva MS. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin seuraavia laimennoksia: vuohen anti-ihmis-AR, CGA ja NSE, 1:1000; p-aktiini, 1:1500; anti-TOM40-vasta-aine, 1:800. TCTP, 1:1000; STMN1, 1:1000; VDAC2, 1:1000; CBX3, 1:1000; GRP78, 1:1000. Western blotit suoritettiin, kuten on kuvattu [16]. Lyhyesti, solut hajotettiin puskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 250 mM NaCl, 0,1% NP-40: a ja 5 mM EGTA, 50 mM natrium-flunssa-oride, 60 mM β-glyseroli-fosfaatin, 0,5 mM natrium-vanadaattia, 0,1 mM PMSF, 10 ug /ml aprotiniinia ja 10 ug /ml leupeptiiniä. Proteiininäytteet (35 ug) tehtiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-kalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraanit inkuboitiin ensin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS). Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa 0,1% Tween 20-TBS (TBST), kalvoja inkuboitiin eri primaaristen vasta-aineiden erikseen 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen vastaavan sekundaarisen vasta-aineet erikseen (1:2000) 1 h huoneen lämpötilassa, ja vasta-aine-sitoutuneet proteiinit havaittiin ECL-järjestelmää (Amersham Biosciences, Little Chalfont Buckinghamshire, UK).

Näytteiden valmistus ja proteiiniuutto ja keskittyminen

Matkapuhelinverkko uuttamalla LNCaP ja LNCaP-s-solut ja valmistelu kokosolulysaattia suoritettiin, kuten on aiemmin kuvattu [17]. Proteiini määritys tehtiin käyttämällä Pierce BCA-proteiinimääritysreagenssilla (Rockford, IL, USA).

IEF ja SDS-PAGE

Näytteet laimennettiin kokonaistilavuuteen 250 ui, 0,2% Pharmalyte , 8 M ureaa, 0,3% DTT, 2 M CHAPS ja jälkeäkään bromifenolisinistä (Sigma). Määränä, joka on 100 ug proteiinia ladattiin kukin liuska kautta nesteytys käyttäen ei-lineaarista pH 3-10 Ready Strip IPG, nauhat (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Tarkennus tehtiin yhteensä 45500 Vh on PROTEAN IEF solu (Bio-Rad). Betonielementit geelit (12,5% homogeenisen tris-HCL Criterion) SDS-PAGE (Bio-Rad) ajettiin käyttäen Criterion Dodeca solun geeli laitteen (Bio-Rad). Yhteensä 4 ajettiin näytettä kohti ryhmää. Elektrodin Ajopuskuri oli 25 mM Tris, 192 mM glysiini, 0,1% paino /tilavuus SDS: ää. Geelit ajettiin 250 V noin 1 tunnin ajan, kunnes bromifenolisininen markkeri oli saavuttanut pohja geelin lämpötilassa noin 15 ° C: ssa. Proteiinit saatiin näkyviin hopeavärjäyksellä, kuten on kuvattu [18].

Gel skannaus ja kuva-analyysi

2-DE-geelit skannattiin 100 um resoluutio (12 bittiä /pikseli) käyttäen GS -710 laserdensitometrin (Bio-Rad). Aineisto analysoitiin PDQuest ™ ohjelmistoa version 7 (Bio-Rad). Sen jälkeen automaattinen tunnistus kaikista proteiinitäplien, geeli-kuvia huolellisesti muokattu. Yksittäiset proteiinit määrät ilmaistiin ppm koko integroidun OD. Kaikki 2-DE kartat Hyväksytty ja arvioitava riippumattomasti. Metodologinen toistettavuus 2-DE-analyysi määritettiin käyttämällä ryhmä korrelaatioanalyysiin. Lyhyesti, koko optinen tiheys korreloi suoraan koko proteiinipitoisuus. Pieniä eroja geelilatauspuskuria, käyttöolosuhteet, ja hopeavärjäyksellä voivat vaikuttaa näytteen vertailuja ja vaikuttavat 2-D geeli toistettavuus. Neljä ajettiin kustakin hoitoryhmässä ja vertailuja intensiteetti Hyväksytty kohdetta välillä 2-DE-geeleissä tehtiin käyttäen korrelaatiokertoimen analyysi. Korrelaatiokerroin mitattiin kahden geelien perustuu optisten tiheyksien saman paikkoja kaksi geelien vertailtavien. Korrelaatiokerroin 1 merkitsee, että kaksi näytettä verrataan ovat identtisiä. Ryhmässä, joka koostuu 4 näytettä, enintään kuusi pareittain vertailut ovat mahdollisia. Keskimääräinen korrelaatiokerroin joukossa smsDX näytteissä oli 0,85 (n = 6 geeli paria, alue 0,80-0,92).

Massaspektrometria-analyysi

Proteiinit tunnistettiin kanssa vMALDI-LTQ väline (Thermo Electron , San Jose, CA, USA). Paikalla poiminta, värin poisto, ruoansulatus, louhinta, näytteen valmistus ja tiputtelua MALDI tähtäyslevyä suoritettiin käyttäen spothandling työasema (ETTAN Spothandling työasema, GE Healthcare) ja vakioprotokolla tarjoamia GE Healthcare. Levy, joka sisältää yhdistetyt uutteet haihdutettiin kuiviin. Kukin näyte valmistettiin muodostamalla kuivattu peptidejä 2,5 ui matriisiliuosta (2,5 mg /ml α-syano-4-hydroksi-kanelihappo (Sigma) 50% asetonitriiliä, joka sisälsi 0,05% TFA: ta). 2,0 ui näytettä huomattiin puhtaalle MALDI kohde liukupinta ja sen annettiin kuivua. Näytteet analysoitiin vMALDI-LTQ (Thermo Electron, San Jose, CA, USA). Analyysi tehtiin käyttäen Xcalibur 1.4 ohjelmiston data riippuvainen tilassa. Tutkimus skannaus (MS) seurasi MS /MS skannaa 5 runsain ioneja. Tämä merkkijono 6 scan tapahtumien toistettiin kuusi kertaa jokaisesta näytteestä paikalla. Dynamic poissulkeminen ™ varmistetaan, että yhteensä 30 eri peptidejä valittiin ja hajanainen jokaisesta näytteestä. MS spektrit kerättiin 900-2000 Da massa-alue, kun taas massan vaihteluväli MS /MS-spektrit automaattisesti valitsee järjestelmän, joka perustuu Q-arvo on 0,25. Standardi törmäys energiaa 38 asetettiin kaikille analyysiin. Määräaika on 5 minuuttia /otos valittiin, onko 30 MS /MS-spektri voitaisiin hankkia. Tietokantahakuihin tehtiin käyttäen sekä MASCOT ja Sequest hakualgoritmi vastaan ​​ihmisen istunnon IPI proteiinin tietokannan (versio 2.38). Molemmat haut vertailtiin talon kehitetty ohjelmisto Promiscuous MS /MS. Vähintään kaksi peptidejä ja A Mascot pisteet 45 tarvittiin proteiinia voidaan hyväksyä tunnistaa.

Tulokset

perustaminen androgeenista riippumaton solulinja, LNCaP-s ja havaitseminen AR , CGA ja NSE ilmaisun LNCaP-t solut

Vastatakseen luonnollisen kulun eturauhassyöpälääke androgeenireseptorin herkkiä androgeeniriippumattomaksi tilaan, eturauhasen syöpäsolu malli on erittäin tärkeää

in vitro

tutkimuksessa . Joten me vil- LNCaP-s solulinja vanhempien eturauhassyövän LNCaP on androgeenipuutteen kunnossa. NE solut ominaista hermosolujen kaltainen fenotyyppi, jotka tuottavat ja erittävät sarjan neuropeptidipitoisuudessa mukana kasvaimen leviäminen, transformaatio ja etäpesäkkeiden [19]. Morfologiset ominaisuudet osoittivat hermosolujen morfologia kompaktisti pyöristetty solurunkoa, joilla laajennetaan ja hieno haarautunut prosesseja. Näin androgen-herkkien LNCaP hankki NE kaltainen fenotyyppi (kuvio 1) LNCaP-s androgeenista vähentää kunnossa. NE kaltaisia ​​soluja, ominaisuudet arvioitiin testaamalla merkkiaineiden NED, kromograniini A (CGA) ja neuroni enolaasin (NSE). Viljelemisen jälkeen androgeeni-vähennetty kunnossa, LNCaP-solut osoittivat vähentynyttä ilmentymistä tason AR, lisääntynyt NSE ilmentymisen tasolla, mutta CGA joilla ei ole merkittävää ilmentymistä. Kuva 1 osoitti eri ilmentymiä AR, CGA ja NSE LNCaP-s soluja.

Lapsen LNCaP on epitheial morfologia ja LNCaP-s-solut osoittivat neuronaalinen morfologia. AR, CGA ja NSE ilmaisuja LNCaP ja LNCaP-t solut tutkittiin RT-PCR ja Western-blottaus.

smsDX esti invasiivisuus eturauhassyöpäsolujen

On hyvin tunnettua, että somatostatiini ja sen analoginen vaikutuksia proliferaatioon eturauhassyöpäsolujen [20]. Mutta somatostatiinin vaikutuksia invasiivisuus ei ollut tutkittu. Vaikutusten arvioimiseksi on smsDX sen invasiivisuus eturauhassyöpäsolujen käytimme haavojen määrityksessä ja Matrigel ™ invaasiomääritys, Piiriin alue haavan ja solujen lukumäärä valtaavat kautta Matrigel kammion olivat merkittävästi pienempiä soluja käsiteltiin smsDX kuin ne olivat kontrollisoluja käsiteltiin ajoneuvon LNCaP ja LNCaP-s-soluja (kuvio 2 ja 3). Inhibitio smsDX esittää annoksesta riippuvaisella tavalla solujen määrä hyökkääviä kyky sekä LNCaP ja LNCaP-s-soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että smsDX laski invasiivisuus eturauhasen syöpäsoluja.

edustajan mikrovalokuvia, osoittavat haavan LNCaP-soluissa (A) ja LNCaP-s-soluja (B). Yksikerroksiset LNCaP /LNCaP-s Solut hajotettiin steriilillä pipetinkärjen luoda uniformand käsitelty PBS tai 1-10 nM smsDX 24 tuntia.

matrigeelin invaasio data kun LNCap /LNCaP-s solujen ylempi hyvin inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa ja alemman hyvin täytettiin seerumittomalla alustalla ja 1-10 nM smsDX tai PBS: ää. 24 tunnin kuluttua solujen määrä, jotka hyökkäsi läpi Matrigel laskettiin vähintään 10 kenttää kohti. Edustavia valokuvia paljastaa LNCaP (A) ja LNCaP-s (B) soluista, jotka hyökkäsi läpi Matrigel. Vähentynyt × 100.

2D lielektroforeesianalyysi

Kuva 4 esittää edustaja 2D geelit valvonta- ja smsDX näytteiden LNCaP ja LNCaP-s soluja. Kolme rinnakkaista ajettiin kullekin ryhmälle, ohjaus ja smsDX. SmsDX vaikutukset LNCaP ja LNCaP-s-soluja verrattiin erikseen kontrolliryhmään käyttämällä Mann-Whitney testiä.

Koko-solulysaattia alistettiin 2-DE käyttäen IPG nauhat pH 3-10 ensimmäisessä ja 12,5% SDS-polyakryyliamidigeelillä toisessa ulottuvuudessa. A Vanhempien LNCaP-solut, B, johdannainen LNCaP-s soluja. C, LNCaP + smsDX, D, LNCaP-s + smsDX.

proteiinit ilmentyvät eri välillä LNCaP ja LNCaP-t solut

yhteensä 222 paikkoja onnistuneesti tunnistettu käyttäen 2DE- pohjainen MS. Ensimmäisessä analyysissä smsDX saaneilla LNCaP verrattiin LNCaP kontrolliryhmään käyttämällä Mann-Whitneyn testi. 56-proteiinit havaittiin ilmentyä erilailla LNCaP ja LNCaP-s (taulukko S1). Toisessa analyysissä, 104 ja 86 proteiinit, erikseen, havaittiin differentiaalisesti ilmaistut LNCaP ja LNCaP-t-soluissa smsDX hoidon (taulukko S2A ja taulukko S2B). Ilmaisu spesifisten isomuotojen metaboliaentsyymien on osoitti olevan ratkaiseva mukauttamaan kasvainsolujen muutoksiin ravinteiden saatavuus, erityisesti glykolyyttiset entsyymit [21]. Joten isomuotoja proteiineja myös tässä taulukossa. Sama proteiini joskus löytyy useita sulkeminen läiskät 2DE geelit, se on mahdollista, koska posttranslational muutos proteiinia jälkeen stressiä.

Viisikymmentäkuusi proteiinit havaittiin alas-ilmaistaan ​​(yli 1,2-kertainen muutos) in LNCaP-s soluja verrattuna vanhempien LNCaP, jotka on lueteltu taulukossa S1.

proteiinit sekä LNCaP ja LNCaP-t solut vaikuttavat smsDX inkuboimalla kertamuutos ≥1.2 lueteltiin taulukossa S2A ja pöytä S2B .

Lajittelu toiminnot proteiinien vaikutusta smsDX eturauhassyöpään (LNCaP-t) solujen jälkeen ADT hoidon

erilaiset toiminnot proteiinien liittymisen koodi viittaavat verkkosivuilla, http: //www.uniprot.org/uniprot/. Proteiinit tunnistettiin luokiteltiin perusteella niiden tunnettujen biokemiallisia toimintoja, kuten aineenvaihdunta, signalointi transduktio, ylläpito solurakenne, kopioinnin säätely ja solukierron säätelyssä. Useimmat androgeenideprivaatio korosti proteiinit alassäädetty jälkeen ADT hoidon. Kun tutkimme näitä proteiinin toimintojen sivuston UniProtKB /Swiss-Prot, yllättäen, useimmat proteiinit vaikuttavat ADT hoidon havaittiin olevan osallisena solujen aineenvaihduntaa ja mitokondrioiden toimintaan sääntelyä. Perustuen otaksuttu toiminnot Kegg reitin tietokanta (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), taulukko S3 (A, B, C) on johdettu taulukosta S2A ja pöytä S2B korostaa yhtäläisyydet /erot vaikutus smsDX välillä LNCaP ja LNCaP-s solulinjat. Taulukko S3A listattu neljäkymmentäkahdeksan yhteinen proteiinien välillä LNCaP ja LNCaP-s solujen altistuksen jälkeen smsDX. Taulukko S3B, S3C lueteltu differentiaalisesti vaikuttaa proteiinien LNCaP ja LNCaP-s-soluja, erikseen.

Androgeenien puute voisi vaikuttaa mitokondrion proteiinin ekspressiota, esimerkiksi HSPD1, ETFA, GLUD1, PMPCB ja et ai. Nämä proteiinit todettiin kuuluvan mitokondrioiden proteiinien mukana ovat glukoosiaineenvaihdunnan, tuotanto reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja luontainen mitokondriaalisen välittämän apoptoottisen funktion. Proteiinit, joilla on tärkeä rooli solun aineenvaihduntaa, mukaan lukien energia (APRT, ATP5B, CKB, TUBB), lipidejä (ACAT2, ACADM, PRDX6), glukoosi (ENO1, TPI1-) ja aminohappo ja proteiinien biosynteesiä (PHGDH, EIF5A, EIF1AY) , havaittiin alassäädetty LNCaP-s soluja. Jotkut metabolisia entsyymejä mukana TCA tunnistettiin myös. ADT hoito johtaa laskuun proteiinin ilmentyminen useiden ER saattajia, kuten GRP78, ERP29, PDIA1 ja PDIA3 proteiinia.

Validation proteiinien vaikuttavat smsDX ja ADT hoito eturauhasen syöpäsolujen kanssa Western blotting

proteiinit LNCaP-s soluja, joihin eri signaalireitteihin tunnistettiin tässä nykyisessä tutkimuksessa, nämä proteiinit voitaisiin säädellä smsDX eri muutosta kertainen lueteltuja taulukossa S2. Validointi proteiinien vaikuttavat smsDX ja ADT kohtelun eturauhassyövän soluissa suoritettiin Western blotting -tekniikalla. Useita mitokondrion proteiinit, ER proteiinit ja proteiinit, joissa aineenvaihdunta valittiin havaita validointia kanssa immunoblottauksella. Kuva 5 osoitti TCTP, STMN1, ja CXB3 LNCaP-soluissa, kun ADT oli alassäädetty ja TOM40, GRP78 ja VDAC2 joka liittyy mitokondrioiden toiminnan LNCaP-t solut up-säännellään hoidetuilla smsDX.

Lower ilmauksia proteiinin TCTP, STMN1, ja CXB3 LNCaP-soluissa, kun ADT LNCaP-s soluja. B, Down säännelty ilmauksia TOM40, GRP78 ja VDAC2 LNCaP-soluissa androgeenipuutteen, up säänneltyjen ilmaisuja LNCaP-s solujen smsDX hoitoon.

Metaboliareittejä säännellään somatostatiinin johdannainen (smsDX) in eturauhassyövän solut

Perustuu Kegg koulutusjakson tietokanta (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), esitimme kaavio metaboliatiet säätelevät smsDX eturauhasen syövän androgeeniriippuvaisessa kohteeseen CRPC tila (kuvio 6). Entsyymit ympyrän tunnistettiin 2-DE MS tässä nykyisessä tutkimuksessa.

Entsyymit ja aineenvaihduntatuotteiden, jotka ovat osa glycosis, rasva acide synteesi ja TCA sykli on esitetty. G6PD, glukoosi-6-fosfaatti-1-dehydrogenaasi. ENO1, Alpha enolaasi. PPP, pentoosifosfaattireitistä. ACAT2, asetyyli-CoA-asetyylitransferaasi. ACAMD, Asyyli-CoA-dehydrogenaasi. IDH2, isositraattidehydrogenaasin [NADP]. MDHM, malaattidehydrogenaasin. GLUD1, Glutamaatti dehydrogenase1. α-KG, α-ketoglutaraatti. Tämä yksinkertaistettu kaavio perustuu Kegg koulutusjakson tietokanta (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html). Entsyymit ympyrän tunnistettiin 2-DE MS tässä nykyisessä tutkimuksessa.

Keskustelu

Androgeenien on keskeinen rooli eturauhassyövän kasvua, joten androgeenideprivaatio ja saartoa AR signalointi akseli on tällä hetkellä tärkein hoito eturauhasen syöpä ja sen etenemistä. On hyvin dokumentoitu, että kliininen androgeenipuutteen hoito liittyy lisääntynyt NE erilaistumista eturauhaskarsinoomien, ja mukana siirryttäessä androgeeniriippumattomuuteen [22], NE solut on ominaista hermosolujen kaltainen fenotyyppi: ne ovat ei-proliferatiivisia ja express hermosolujen kaltaisia ​​proteiineja, kuten NSE ja CGA. Androgeenideprivaatio voivat vaikuttaa seerumin CGA tasot eri tahtiin eturauhassyövässä [23]. Yli-ilmentyminen NSE LNCaP-s tutkimuksessamme todettiin etenemisessä NED peräisin androgeeniriippuvaisessa LNCaP. Tässä nykyisessä tutkimuksessa, kun jopa 10 kohtiin LNCaP pelkistettynä androgeenin kunnossa, NE kaltaisiin piirteisiin LNCaP-t tunnistettiin hermosolujen morfologia ja muuttanut ilmauksia AR ja NSE.

Vaikutukset somatostatiinin estoa syöpäsolujen elinkelpoisuutta ja lisääntymistä on hyvin tutkittu, mutta tietojemme mukaan sen vaikutukset invasiivisuus ei ollut tutkittu. Käyttämällä haavan paranemista ja Matrigel invaasiomääritys havaitsimme, että smsDX esti invasiivisuus sekä LNCaP ja LNCaP-s soluja. Vaikka tarkkaa mekanismeja smsDX aiheuttama tukahduttaminen invaasiokyvyn eivät ole tällä hetkellä selvä, se saattaa johtua vastauksia vaurioitunut mitokondrioiden toimintoja. Aiemmissa tutkimuksissa [7], [24], smsDX säännelty mitokondrioiden ja liittyvät proteiinit sekä androgeeniriippuvaisessa ja riippumattoman eturauhassyövän solut, joten syöpään liittyvän muutoksiin aineenvaihduntaan ovat mahdollisesti vastuussa solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen signaaleja toistuvia eturauhassyöpää ja CRPC.

määrittämiseksi aineenvaihdunnan sääntely vaikutuksia smsDX etenemiseen eturauhassyöpä peräisin androgeeniriippuvaisissa androgeenipuutokseen riippumattoman aseman, suoritimme kaksiulotteinen geelielektroforeesi (2-DE) ja sen jälkeen MALDI-TOF massaspektrometrinen analyysi. Sen jälkeen kun vertailu-proteiinin ilmentymisen LNCaP-s ja vanhempien LNCaP-solut, kuusikuudettakymmentä proteiinit havaittiin ilmentyä erilailla jopa 1,2-kertainen muutos ilmi taulukosta S1. Nämä proteiinit lajiteltu niiden erilaisia ​​toimintoja solujen aineenvaihdunnassa, kuten sokeri, energia, lipidien ja aminohappojen prosessi. Tulokset viittaavat siihen, että androgeenisäädellyn metabolinen muutos on suurimmat erot kehittämisen aikana eturauhassyöpälääke androgeenista herkkä androgeeni-resistenteiksi. Samanlainen ja eri aiheuttamat smsDX havaittiin välillä LNCaP ja LNCaP-s soluja. Aiheuttamaa stressiä androgeenideprivaatio ja smsDX eturauhasen syöpäsolun ympäristössä saattaa mahdollisesti aiheuttamia mitokondrioiden toimintaan vahinkoja ja aktivoida AMPK väylän eturauhasen syöpäsoluja. Mitokondrioiden prosessit ovat tärkeässä osassa kasvaimen aloittamista ja etenemistä. Lisääntynyt metabolinen aktiivisuus on tunnusmerkki lisääntyvien syöpäsolujen [25]. Joten tukahduttaa syöpäsolujen aineenvaihdunta tarjoaa vaihtoehtoisen strategian CRPC vaiheessa. ADT eturauhassyövän aiheuttamia epänormaalin mikroympäristölle kunnossa saada vastauksia kasvainsolu vaikuttaa aineenvaihdunta. Nämä muutokset optimoida kasvain solujen aineenvaihduntaa saada energiaa ja ravinteita kasvain microenvironment. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että androgeenien biosynteesissä ja AR signalointia eturauhassyövän solut läheisesti vaikuttavat lipogeneesiin [26] – [28]. Joten kohdistaminen mahdolliset taustalla molekyylitason mekanismeja, jotka kytkevät aineenvaihdunta saattaa helpottaa edelleen kehittäminen lupaavia terapeuttisia lähestymistapoja CRPC tila.

tietojen perusteella keräsimme täällä, löysimme smsDX PI3K /AKT /mTORC1 reitin ja TCA cycle kautta ylös ja alas säännellä eri aineenvaihdunnan lueteltuja proteiineja tbale S2A ja pöytä S2B. Eturauhasen syöpä Akt aktivoidaan PI3K polku, joka on tullut kriittinen polku solun eloonjäämisen. Poistaminen androgeenien tukea LNCaP laukaisee useita tapahtumia, kuten solusyklin pysähtymiseen ja lisääntynyt PI3K /Akt-aktiivisuutta, joka huipentui lopulta hankinnan androgeeni- riippumattoman fenotyyppi [29]. PI3K /AKT johtaa tehostetun glukoosin sisäänottoa ja glykolyysiin [30] .Tämä koulutusjakson edistää myös glukoosi hiilivirrastaan ​​osaksi biosynteesireiteissä että luottaa toiminnallinen mitokondrion aineenvaihduntaa, kuten rasvahappojen, kolesterolin ja isopronoid synteesi edellyttävät asetyyli-CoA. Akt aktivoi myös ATP-citratelyase (ACL) edistämällä konversio mitokondrion johdettujen sitraatti asetyyli-CoA lipidisynteesiin. mTORC1 on hyvin tunnettu solukasvunsäätelijää toimii alavirtaan PI3K /AKT, on monia vaikutuksia interwined kanssa mitokondrioiden aineenvaihduntaa. mTORC1 tunnetaan parhaiten parantaa proteiinisynteesiä [25]. Alfa-enolaasi (ENO1), joka tunnetaan myös nimellä pyruvaattidehydrogenaasin fosfataasi, se on ratkaiseva solun energia-aineenvaihdunnan [31]. ENO1, keskeisenä glykolyyttistä entsyymiä, on keskeisessä asemassa anaerobinen Glykolyysivaiheen. Tässä nykyisessä tutkimuksessa, ENO1 voi jopa säädellä smsDX, jotka osoittivat, että smsDX on sääntelyn vaikutus glykolyysin eturauhassyöpäsoluissa.

TCA sykli on keskeinen polku metaboliaan sokerit, lipidit ja amino happo, TCA cycle metablites tuloksena vähentynyttä solujen erilaistumista.