Krooninen sairaus

tiivistelmä

munasarjasyöpä on tulehdukseen liittyvä maligniteetti on korkea kuolleisuus. CXCR2 ilmentävät munasarjasyöpiä aggressiivisia köyhempiä tuloksia. Siksi tutkittiin molekyylitason mekanismeja CXCR2 rakentuvassa syövän etenemisen vertaamalla CXCR2 positiiviset ja negatiiviset munasarjasyövän solulinjoissa. Pysyvästi CXCR2 transfektoidut SKOV-3-soluissa oli nopeampi kasvu verrattuna ohjata soluihin transfektoitu tyhjällä vektorilla. Erityisesti, tuumorinekroositekijä (TNF), ilmentyy runsaana munasarjasyövän, solujen lisääntymisen tehostuneen vähentämällä G0-G1 vaihe CXCR2 transfektoiduissa soluissa. TNF lisääntynyt Nukleaaritekijä-KB (NF-KB) aktiivisuus suuremmassa määrin CXCR2 transfektoiduissa soluissa kuin kontrolli soluja sekä tarjotaan suurempi aktivointi lKB. CXCR2 transfektoidut solut ilmensivät korkeampia tasoja sen proinflammatoristen ligandien, CXCL1 /2 ja tehostettu enemmän proliferaatiota, migraatiota, invaasio ja pesäkkeiden muodostumista. CXCR2 positiivisia soluja aktivoidaan myös enemmän EGFR, mikä johti korkeampiin Akt aktivointia. Parannettu NF-KB aktiivisuuden CXCR2 positiivisten solujen väheni PI3K /Akt estäjän sijaan Erk estäjä. CXCL1 lisätään CXCR2 positiivisten solujen lisäsi aktivointi lKB. CXCL1 johti myös merkittävästi suurempi määrä invasiivisen solujen CXCR2 transfektoiduissa soluissa, mikä esti NF-KB-estäjä, Bay 11-7082. Lisäksi, solujen lisääntymisen tehostuneen on CXCR2-positiivisten solujen oli herkempi CXCL1 vasta-aine tai NF-KB: n estäjä. Lopuksi CXCR2 transfektio vanhemmaissolujen lisääntynyt CXCL1 promoottorin aktiivisuuden kautta NF-KB päällä. Näin augmentation proinflammatoristen kemokiinien CXCL1 /2, jonka tehostava NF-KB: n aktivoitumisen kautta EGFR-transaktivoituun Akt, edistää CXCR2 perustuva munasarjasyöpään etenemistä.

Citation: Dong YL, Kabir SM, Lee ES, Son DS ( 2013) CXCR2-Driven munasarjasyöpä eteneminen Koskee lisääntymisen merkkejä Esitulehduksellisten kemokiinit mukaan tehostava NF-KB aktivointi EGFR-transaktivoituun Akt Signaling. PLoS ONE 8 (12): e83789. doi: 10,1371 /journal.pone.0083789

Editor: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 5. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 08 marraskuu 2013; Julkaistu: 20 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Dong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) SC1 089630 (EL) ja National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) SC1AI089073 (DS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä, yksi useista tulehdukseen liittyvä syöpiä, on viides johtava syöpäkuolemien syy naisten keskuudessa. Se on salakavala sairaus, koska se on yleensä aiheuta oireita ennen kuin kasvaimia on levinnyt kauas munasarjat [1]. Tulehdusta edistäviä kasvain microenvironment munasarjasyövän on kliinisesti liittyy vatsakalvon kasvain levittämiseen ja massiivinen askites, jota seuraa korkea kuolleisuus. Munasarjasyöpäsoluja ilmentävät korkeita tuumorinekroositekijän (TNF), mikä osoittaa mahdollista merkitystä TNF säätelijänä tulehdusta edistäviä kasvaimen mikroympäris- tässä maligniteetti [2] – [4]. Erityisesti TNF on osoitettu säätelevän kemokiinia verkkojen munasarjasyöpäsoluja kautta tumatekijä-KB (NF-KB) signalointireitin [5] – [6]. Kemokiinit voivat olla kriittisiä välittäjinä kasvaimen mikroympäristön edistämällä syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [7] – [8]. Niistä kemokiinireseptorit, munasarjasyöpäsoluja usein ilmaista CXCR2, jonka vuoksi munasarjasyöpä etenemistä [9]. CXCR2 on myös hyvin ilmaistaan ​​eräiden muiden syöpäsolujen tyyppejä, kuten keuhkojen adenokarsinooma [10], kurkunpään okasolusyöpä [11], kohdun limakalvon karsinooma [12], peräsuolen syöpä [13], maksasyövän [14] ja mahasyövän [15] . Tämän vuoksi yhdistys, se saattaa pystyä palvelemaan itsenäisenä prognostinen markkeri. Täten CXCR2 hiirten on merkittävästi vähentynyt tuumorikuorma eturauhassyövässä [16], hiiren Lewis keuhkosyöpä [17] ja munuaisten kasvainmuodoista [18] verrattuna CXCR2 villityypin hiirillä. Lisäksi CXCR2 puutos täysin vaimentaa tulehdusta perustuva tuumorigeneesiä ihon ja suoliston [19]. Koska CXCR2 kasvaimen mikroympäristössä estänyt myös paksusuolen syövän solujen kasvua [20]. Lopuksi, CXCL1, joka on CXCR2 ligandi oli käänteisesti yhteydessä uusiutumista elinaika peräsuolen syöpäpotilailla [21].

Nämä tosiasiat osoittavat, että CXCR2 välittämä signalointireitin läheisesti liittyy syövän etenemiseen. Vaikka useita eri reittejä pitkin, kuten apoptoosin, EGFR aktivointi ja angiogeneesin osallistuvat CXCR2-välitteisen signaloinnin [9], [16] – [20], on vielä suuri kuilu molekyylimekanismeihin yhdistävällä CXCR2 ja sen useita eri reittejä pitkin. Edellisessä tutkimuksessa, munasarjasyövän solulinjoissa ilmentyy voimakkaasti CXCL1-3 ja CXCL8 [5] – [6], joilla kaikilla on suuri affiniteetti CXCR2 [22]. Vaikka nämä CXCR2 ligandit ovat tiukasti säännelty NF-KB: n signalointi [5], [23], on epäselvää, miten CXCR2 ja NF-KB mekaanisesti mukana munasarjasyövän etenemiseen. Tässä käytimme vanhempien munasarjasyövän solulinjoissa ja syntyy vakaa CXCR2 transfektoidut solut sekä ohjaus transfektoitu tyhjällä vektorilla. Sitten määritellään vaikutusta NF-KB signalointi, tärkein proinflammatoristen reitissä mahdollisesta osuudesta CXCR2 munasarjasyöpään etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Yhdistelmä ihmisen TNF, CXCL1 ja CXCL1 /2/3 pan spesifistä vasta-ainetta neutralointiin saatiin R muuttaa tai tunkeutuvat solujen suodatin fiksoitiin 3,7% formaldehydiä, ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla, jota seuraa pesu solut PBS: llä. Määrä muuttaa tai tunkeutuvat solut laskettiin mikroskoopin alla (X400) käyttäen 5 satunnaisesti valitun kentät.

Colony Formation

Solut suspendoitiin RPMI, joka sisälsi 0,4% agaroosia pitoisuuksilla 2 x 10

3 solua kuoppaa kohden kuuden kuoppalevylle. Keskeytetty solut päällekkäin päälle pohjakerros jähmettyi 0,8% agaroosia RPMI 5% FBS: ää, ja inkuboitiin 14 päivää. Pesäkkeet värjättiin 0,05% kristalliviolettia, valokuvataan, ja määrällisesti.

knockdovvn CXCR2 tekijänä CXCR2 shRNA

munasarjasyöpäsoluja noin 50% yhteensulautumisesta 24- tai 6-kuoppaisilla levyillä pestiin kerran 1% FBS: ää tuoretta väliainetta ilman lisäaineita ja sitten transfektoitiin ohimenevästi ohjaus tai CXCR2 shRNA (lopullinen pitoisuus: 1 ug /ml) 72 tunnin ajan 37 ° C: ssa lipofektamiinia käyttäen liuosta. Transfektoidut solut vahvistettiin knockdovvn CXCR2 proteiinia ja käsitellään hahmoteltu tulokset mukaan erilaisia ​​kokeiluja.

Tilastollinen analyysi

Data analysoitiin pariksi Studentin

t

-testi ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), kuten on tarkoituksenmukaista. Jos tilastollinen merkitsevyys (p≤0.05) määritettiin ANOVA, data analysoitiin edelleen Tukeyn pareittain vertailut havaita eroja hoitojen välillä.

Tulokset

CXCR2 positiivisissa soluissa on nopeampi kasvu Luokitus ja vastaavat paremmin TNF-stimuloidun Cell Proliferation verrattuna CXCR2 negatiivinen Cells

syntyy CXCR2 positiivinen (SKCXCR2) ja negatiivinen (SKA) solulinjoja transfektoimalla CXCR2 tai tyhjiä vektoreita vanhempien SKOV-3 munasarjasyöpä solut (kuviot 1A ja 1B). Kasvuvauhti SKCXCR2 ja SKA solut olivat samankaltaisia ​​ensimmäisen 24 tunnin viljelyn vaan 48 ja 72 tuntia, SKCXCR2 solujen kasvu oli noin kaksinkertainen verrattuna SKA soluihin (kuvio 1 C). Koska TNF on hyvin tiedetään olevan tulehdusta edistävä sytokiini ilmentyy runsaana munasarjasyöpä [2] – [4], testasimme vaikutuksia TNF soluproliferaation SKA ja SKCXCR2 soluja. Tulokset osoittivat, että TNF huomattavasti soluproliferaation SKCXCR2 soluissa, mutta ei ollut vaikutusta proliferaatioon SKA soluja (kuvio 1 D). Perustuen FACS-analyysi, SKCXCR2 solut oli alennettu G0-G1 vaiheessa ja lisääntynyt S-faasin (jossa on hieman enemmän G2-M-vaihe) verrattuna SKA soluihin (kuvio 1 E). TNF sinänsä kuitenkin selvästi vähentynyt SKCXCR2 G0-G1 faasin (jossa on hieman enemmän S ja G2-M vaiheet), kun taas se ei ollut vaikutusta SKA soluihin (kuvio 1 E).

(A) CXCR2 proteiinin ilmentymistä SKA versus SKCXCR2 soluja. Kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot suoritetaan käyttäen spesifisiä vasta-aineita CXCR2 ja β-aktiini latauskontrollina. (B) edustaja immunofluoresenssivärjäyksellä SKA versus SKCXCR2 soluihin, mikä osoittaa CXCR2 proteiinin ekspressiotasot (vihreä). (C) vertailu kasvuvauhdin SKA versus SKCXCR2 soluja. Soluja inkuboitiin 0, 24, 48 ja 72 tuntia ja kasvu normalisoidaan 0 h tiheys kussakin solulinjassa. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± S.E. * Ja ** (p≤0.05) kussakin ryhmässä ANOVA ja Tukeyn pairwise vertailuja. # (P≤0.05) välillä SKA ja SKCXCR2 solujen pariksi Studentin

t

-testi. (D) vaikutus TNF soluproliferaation SKA versus SKCXCR2 soluja. Soluja inkuboitiin ajoneuvon (Control) tai TNF: n (10 ng /ml) 48 tuntia. Soluproliferaation määritys suoritettiin käyttäen MTT: n ja arvot normalisoitu käsittelemättömiin kontrolleihin. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± S.E. * (P≤0.05) Studentin

t

-testi. (E) TNF vaikutukset solujen elinkaaren vaiheisiin G0-G1, S ja G2-M SKA versus SKCXCR2 soluja. Soluja käsiteltiin ajoneuvon (Control) tai TNF: n (10 ng /ml) 48 tuntia. Virtaussytometria analyysit suoritettiin määrittämiseksi% soluista kussakin vaiheessa. Edustavia histogrammit näkyvät. Kokeet suoritettiin 5 riippumatonta kertaa ja datan kukin välike on esitetty keskiarvona ± S.E. Sininen ja punainen kirjaimet tarkoittavat merkitys (p≤0.05) verrattuna SKA ohjaus ja TNF-hoidon vastaavasti Studentin

t

-testissä.

Lisäksi testasimme vaikutukset TNF solusyklin liittyvien geenien SKA versus SKCXCR2 soluja. SKCXCR2 solut oli yli 50%: n lasku sykliini B1 (0,49), sykliini F (0,38), sykliini G2 (0,47) ja p21 (0,25) verrattuna SKA soluihin. TNF ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin liittyvien geenien Ohjaus SKA soluissa, mutta se aiheutti 2 kertaiseen GADD45α vuonna SKCXCR2 soluissa (taulukko S1). GADD45α on osoitettu olevan välittäjänä synteettinen retinoidi indusoiman apoptoosin munasarjakarsinoomasolut [24]. Näin ollen häiriö GADD45α on osoitettu edistävän putken muodostumiseen ja endoteelisolujen migraation [25]. Solujen vaeltamiseen ja invasiivisia kyvyt olivat todellakin huomattavasti korkeammat GADD45α puutosta hiiren alkion fibroblasteissa [26]. Perustuen nämä toiminnalliset ominaisuudet GADD45α, TNF aiheuttama lisäys GADD45α ei todennäköisesti liittyvän tehostetun soluproliferaatiota SKCXCR2 soluissa.

CXCR2 positiiviset solut Paranna NF-KB aktivoituminen seurata nousu CXCR2 Ligands (CXCL1 ja 2), verrattuna CXCR2 negatiivinen Cells

NF-KB on ensisijainen signalointireitin TNF: n toimintojen, siksi tutkittava, jos TNF-indusoidun solun proliferaation SKCXCR2 osallistuvien solujen NF-KB: n signalointia. Sekä perus- että TNF-indusoidun tasot NF-KB: n promoottorin aktiivisuus oli suurempi SKCXCR2 soluissa (kuvio 2A). Immunofluoresenssivärjäyksellä paljasti, että SKCXCR2 soluja oli enemmän fosforyloidun IKB verrattuna SKA-soluja (kuvio 2B). Toisaalta, IKB-ekspressio oli suurempi SKA-soluissa verrattuna SKCXCR2 soluja (kuvio 2B). Western blot-analyysi osoitti, että CXCR2 ilmentävät solut oli enemmän fosforyloidun IKK ja IKB (suorana loppupään vaikutus IKK) sekä niiden pohjapinta valtioiden sekä vastauksena TNF ajan myötä (kuvio 2C). CXCR2-välitteinen NF-KB: n aktivaatio voi liittyä kemokiini ligandeja, jotka sisältävät KB: n alueita niiden promoottorien [5] – [6], [23]. Siksi vertasimme kemokiiniverkosto profiilit SKA ja SKCXCR2 solut oli PCR array. Tulokset osoittivat, että SKCXCR2 solut oli 2 kertainen nousu proinflammatoristen kemokiinien CXCL1 ja CXCL2 verrattuna SKA soluihin (kuvio 2D).

(A) vaikutus TNF NF-KB lusiferaasin toimintaa SKA ja SKCXCR2 soluja. Transfektion jälkeen käyttäen NF-KB: n sivektorissa yön yli, solut käsiteltiin TNF (10 ng /ml) 4 tuntia. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset esitetään keskiarvona ± S.E. * Ja # (p≤0.05) verrattuna valvonta ja SKA soluja, vastaavasti, jonka pariksi Studentin

t

-testi. (B) edustaja immunofluoresenssivärjäyksellä SKA ja SKCXCR2 solut osoittavat IKB aktivointi ja CXCR2 proteiinin ekspressiotasot (vihreä). (C) vaikutus TNF (10 ng /ml) ajan (0-120 min) on NF-KB: n aktivaation SKA ja SKCXCR2 soluja. Kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot-suoritetaan käyttämällä spesifisiä vasta-aineita IKB ja IKK sekä niiden fosforyloitu muotoja (pIκB ja Pikk). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (D) Kemokiini profiili vertailut SKCXCR2 suhteessa SKA soluihin. Eristämisen jälkeen kokonais-RNA, ihmisen kemokiini PCR array suoritettiin. Katkoviiva 2-kertainen; ne, joilla on 2-kertainen lisäys ja keskimääräinen kierto kynnys 30 tunnustetaan aiheuttama kemokiinien, ja tässä tapauksessa edustaa CXCL1 ja 2 (*).

CXCR2 positiiviset solut Kasvata CXCL1 /2 , ja ovat mukana solun lisääntymis- ja muuttoliikkeitä, invaasio ja Colony Formation verrattuna CXCR2 Negatiivinen Cells

vahvistaneet SKCXCR2 solut tuottivat enemmän CXCL1 ja CXCL2 kuin SKA solujen qRT-PCR ja ELISA-määritystä (kuviot 3A ja 3B). Vaikka SKCXCR2 solut oli suurempi kasvu CXCL2 kuin CXCL1 mRNA-tasolla (kuvio 3A), niin pitkälle kuin kokonaisproteiinia, oli enemmän yhteensä CXCL1 proteiinia (kuvio 3B) kuin CXCL2, luultavasti tuloksena suuremman määrän CXCL1 mRNA: ta (kuvio 2D ). Perustuen oletetun CXCR2-NF-KB-CXCL1 /2 liitäntä, testasimme jos CXCL1 tai sen vasta vaikuttaa solujen lisääntymistä eri tavalla SKA ja SKCXCR2 soluja. Lisäämällä CXCL1 ei ollut vaikutusta solujen lisääntymiseen SKA soluissa, mutta lisäsi merkittävästi leviämisen SKCXCR2 soluja (kuvio 3C). Myös samalla pannulla vasta-ainetta CXCL1 /2/3 ei ollut vaikutusta solujen lisääntymiseen SKA soluissa se merkittävästi vähentynyt proliferaatio SKCXCR2 soluissa (kuvio 3D). Lisäksi olemme vahvistaneet, että pannu vasta-alennettu CXCL1 ja CXCL2 mRNA SKCXCR2 soluissa (kuvio 3E). Koska CXCL1-CXCR2 akseli havaittiin edistämään mahakasvaimen invaasio [15], vertasimme muuttoliikettä ja hyökkäys valmiuksia SKA ja SKCXCR2 soluja. SKCXCR2 solut oli lisätä maastamuuttoa ja invaasio ominaisuudet verrattuna SKA soluihin (kuviot 3F ja 3G). Perustuen lisääntynyt liikkuvuus ja hyökkäyksen SKCXCR2 soluissa, testasimme lisäksi pehmytagar pesäkkeiden muodostumisen havaitsemiseksi, jos oli korkeampi pahanlaatuisen muutoksen SKCXCR2 soluissa, ja totesi, että SKCXCR2 solut tuottivat enemmän pesäkkeitä kuin SKA soluja (kuvio 3H).

(A) vahvistaminen CXCL1 ja CXCL2 ilmaisun SKA ja SKCXCR2 solujen qRT-PCR. Eristämisen jälkeen kokonais-RNA, qRT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita CXCL1 ja CXCL2. (B) Cellular CXCL1 ja CXCL2 pitoisuudet SKA ja SKCXCR2 solujen ajan 24 tuntia. Kokosolulysaateille valmistettiin ja ELISA suoritettiin käyttäen vasta-aineita spesifisiä CXCL1 ja CXCL2 ja arvot normalisoitiin proteiinin kokonaismäärän. (C) vaikutus CXCL1 soluproliferaatioon in SKA ja SKCXCR2 soluja 48 tunnin inkuboinnin. (D) vaikutus pan vasta-aineen CXCL1 /2/3-solujen lisääntyminen SKA ja SKCXCR2 soluja. Soluja inkuboitiin normaalin lgG (Control) ja koko vasta-aineen (1:100 laimennos) 48 tuntia. Solulisäkasvumääritykselle suoritettiin käyttäen MTT: n ja normalisoitiin käsittelemättömiin kontrolleihin. (E) vaikutus pan vasta-aineen CXCL1 /2/3 CXCL1 ja CXCL2 ilmentymistä SKCXCR2 soluissa qRT-PCR. Käsittelyn jälkeen pan-vasta-aineen 24 tuntia ja sitten eristämällä kokonais-RNA, qRT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita CXCL1 ja CXCL2. (F) Migration ominaisuuksien väliset SKA ja SKCXCR2 soluja. (G) Invasion ominaisuuksien väliset SKA ja SKCXCR2 soluja. (H) vertailu pesäkkeiden muodostumisen välillä SKA ja SKCXCR2 soluja. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena ja tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe * Ja # (p≤0.05) laskettuna Studentin

t

-testissä.

CXCR2 positiiviset solut transaktivoimaan EGFR suurempaan, jolloin Akt Aktivointi joka edistää NF KB Signaling

Koska on osoitettu, että CXCL1 voi indusoida proliferaatiota munasarjan epiteelin syöpäsoluissa transaktivaatiota EGFR [27], vertasimme EGFR transaktivaatiota SKA ja SKCXCR2 soluja. SKCXCR2 solut oli korkeammalle fosforyloidun EGFR, tuloksena korkeampien Akt aktivointia, mutta ei ollut juurikaan vaikutusta Perk tasolla (kuvio 4A). Confocal imaging paljasti, että SKCXCR2 soluja oli enemmän fosforyloidun Akt verrattuna SKA soluihin (kuvio 4B). Koska Akt ja Erk väyliä liittyvät solujen selviytymiseen ja leviäminen, tarkistimme vertaileva vaikutukset PI3K /Akt tai Erk estäjien soluproliferaatioon in SKA ja SKCXCR2 soluja. Vaikka AG-1478, LY294002 ja PD98059 heikennetty solujen proliferaatiota sekä SKA ja SKCXCR2 solut, niiden vaikutukset leviämisen olivat huomattavasti suuremmat SKCXCR2 soluissa (kuvio 4C). Sitten määritetään, onko EGFR loppupään inhibiittorit vaikuttavat NF-KB promoottorin aktiivisuus SKA ja SKCXCR2 soluja. AG-1478, tietyn EGFR estäjä, ei ollut merkittävää vaikutusta NF-KB promoottorin aktiivisuutta SKA soluissa, mutta se lievensi aktiivisuus CXCR2 positiivisissa soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4D). Vaikka LY294002, erittäin selektiivinen PI3K: n estäjä, joka estää Akt aktivointi, heikennettyjä NF-KB: n promoottorin aktiivisuutta molemmissa solutyypeissä annoksesta riippuvalla tavalla, sillä oli suurempi inhiboiva vaikutus tätä toimintaa SKCXCR2 soluissa. Mielenkiintoista, PD98059, tietyn Erk estäjä, ei ollut merkittävää vaikutusta NF-KB promoottorin aktiivisuutta joko solutyypin (kuvio 4D). Olemme vahvistaneet vaikutukset erityisten estäjien on EGFR, Akt ja Erk aktivointi (kuvio 4E).

(A) vertailu EGFR aktivaation SKA ja SKCXCR2 soluja. Kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot-suoritetaan käyttämällä spesifisiä vasta-aineita EGFR, Akt, Erk ja fosforyloidun muodot (pEGFR, Pakt ja Perk). Ei-fosforyloitu lomakkeita käytettiin lastaus valvontaa. (B) edustaja immunofluoresenssivärjäyksellä kuviot osoittavat Akt aktivointi ja CXCR2 proteiinin ekspressiotasot SKA ja SKCXCR2 soluja. (C) Comparative vaikutukset AG-1478, LY294002 ja PD98059 soluproliferaatioon in SKA ja SKCXCR2 soluja. Soluja inkuboitiin ajoneuvon (Control), AG-1478 (AG, 2 uM), LY294002 (LY, 2 uM) tai PD98059 (PD, 20 uM) 48 tunnin ajan. Solulisäkasvumääritykselle suoritettiin käyttäen MTT: n ja normalisoitiin käsittelemättömiin kontrolleihin. * Ja # (p≤0.05) verrattuna Controls (C) ja SKA soluja, vastaavasti, Studentin

t

-testi. (D) annosriippuvaisesti vaikutukset EGFR loppupään estäjien NF-KB lusiferaasin toimintaa SKA ja SKCXCR2 soluja. Transfektion jälkeen NF-KB sivektorissa yön yli, solut käsiteltiin AG-1478 (EGFR-inhibiittoria, 0, 0,5, 1 ja 2 uM), LY294002 (Akt-inhibiittori, 0, 0,5, 1 ja 2 uM) tai PD98059 (Erk estäjä , 0, 5, 10 ja 20 uM) 4 tunnin ajan. * Ja # (p≤0.05) verrattuna Controls (0 h) ja SKA soluja, vastaavasti, Studentin

t

-testi. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena ja tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe (E) Vahvistus erityisten estäjien EGFR, Akt ja Erk aktivaatio SKA ja SKCXCR2 soluja. Soluja käsiteltiin AG-1478 (2 uM), LY294002 (2 uM) ja PD98059 (20 pM), 4 tunnin ajan. Kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot suoritettiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita EGFR, Akt, Erk ja fosforyloidun muotoja (pEGFR, Pakt ja Perk). Non-fosforyloitu lomakkeita käytettiin lastaus valvontaa.

CXCL1 Parantaa NF-KB Aktivointi CXCR2 ilmentävät solut mikä lisää CXCL1 Promoottori Activity kautta NF-KB Site

selvennetään osallistumisen NF-KB: n signaloinnin CXCL1-CXCR2 akselilla, testasimme vertaileva vaikutuksia lisätty CXCL1 NF-KB: n aktivaation SKA ja SKCXCR2 soluja. CXCL1 tuotetaan lisää fosforyloidun IKB in SKCXCR2 soluissa verrattuna SKA-soluja (kuvio 5A). Lisäksi CXCL1 /2/3-aineella ei ollut vaikutusta NF-KB: n promoottorin aktiivisuutta SKA-soluissa mutta laskivat merkittävästi tätä toimintaa SKCXCR2 soluissa (kuvio 5B). Perustuen osallistumista NF-KB on CXCL1-CXCR2 akseli, vertasimme vaikutukset Bay11-7082 erityinen NF-KB-estäjä, soluproliferaatioon in SKA ja SKCXCR2 soluja. Bay11-7082 ei ollut vaikutusta solujen lisääntymiseen SKA soluissa mutta laskivat merkittävästi proliferaatiota SKCXCR2 soluissa (kuvio 5C). Inhibitio oli suurinta SKCXCR2 soluissa, johtuu luultavasti korkeampi NF-KB: n näissä soluissa (kuviot 2A-C). Lisäksi olemme verrattiin Bay11-7082 on CXCL1 aiheuttama solujen invaasiota. Vaikka CXCL1 oli pieni vaikutus solujen invaasiota SKA soluissa, erot eivät olleet merkittäviä (kuvio 5D). Toisaalta, SKCXCR2 solut oli ainakin kaksinkertaistaa soluinvaasion numerot vastauksena CXCL1 verrattuna kontrolleihin (kuvio 5D). Bay11-7082 myös esti CXCL1-indusoidun solujen invaasiota in SKCXCR2 soluissa (kuvio 5D), mikä osoittaa, osallistuminen NF-KB: n signalointia.

(A) Comparative vaikutukset CXCL1 NF-KB: n aktivaation SKA ja SKCXCR2 solujen . Soluja käsiteltiin CXCL1 (100 ng /ml), ja tulokset tutkittiin aika-riippuvaisella tavalla. Kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot-suoritetaan käyttämällä spesifisiä vasta-aineita IKB, fosforyloidun IKB (pIκB) ja CXCR2. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.