Krooninen sairaus

tiivistelmä

Päällekkäistä Kromosomi varren 20q esiintyy eturauhasen, kohdunkaulan, paksusuolen, mahalaukun, virtsarakon, melanooma, haima ja rintojen syöpä, mikä viittaa siihen, että 20q vahvistus voi olla syy rooli kasvainten synnyssä. Erään vaihtoehtoisen näkemyksen, kromosomi epätasapaino on lähinnä yleinen haittavaikutus syövän etenemisen. Testata, onko tietty genominen poikkeavuus voisi toimia syövän alkutapahtumaa perustimme in vitro, joka mallintaa evoluutioprosessin alkuvaiheessa eturauhasen kasvaimen muodostumisen; normaalin eturauhasen solut kuolemattomiksi yli-ilmentyminen ihmisen telomeraasin katalyyttisen alayksikön hTERT, ja viljeltiin 650 päivää till useita muutosta tunnusmerkkejä havaittu. Geeniekspressiomalleja mitattiin ja kromosomiaberraatiot seurattiin spektrin karyotyyppi analyysin eri aikoina. Useita kromosomipoikkeamakoe, erityisesti päällekkäisen kromosomi varren 20q, tapahtui prosessin alkuvaiheessa ja kiinnitettiin solupopulaatioiden, kun taas muut poikkeamia kuolivat sukupuuttoon pian sen jälkeen niiden ulkonäköä. Monenlaisia ​​bioinformatiikan välineitä, sovelletaan tietomme ja tietoja useista syöpään tietokannoista, paljasti, että spontaani 20q vahvistus voi edistää syövän aloittamista. Meidän laskennallinen malli viittaa siihen, että 20q vahvistus aiheuttama vapautuminen useita erityisiä syöpään liittyvien reittien mukaan lukien MAPK-reitin, p53-reitin ja Polycomb- ryhmä tekijät. Lisäksi aktivointi Myc, AML, B-kateniinin ja ETS perheen transkriptiotekijöiden tunnistettiin merkittävä askel syövän kehitystä ohjaavat 20q vahvistusta. Lopuksi tunnistettiin 13 ”syöpä aloittamisen geenit”, joka sijaitsee 20q13, jotka olivat huomattavasti yli-ilmentynyt monissa kasvaimissa, joissa ekspressiotasoja korreloivat kasvaimen ja tulos viittaa siihen, että nämä geenit indusoivat pahanlaatuisia prosessi kun 20q vahvistusta.

Citation: Tabach Y, Kogan-Sakin I, Buganim Y, Solomon H, Goldfinger N, Hovland R, et al. (2011) monistaminen 20q Kromosomi Arm Ilmenee Aikaisin Kasvaimia synnyttävä Transformation ja voi aloittaa Cancer. PLoS ONE 6 (1): e14632. doi: 10,1371 /journal.pone.0014632

Editor: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2010 Julkaistu: 31 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Tabach et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Leir hyväntekeväisyysyhdistykseksi ja EY FP6 rahoitusta. Osittainen rahoitus saatiin Center for naisten Health Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Heikentynyt genomi vakaus on yksi tunnusmerkkejä syövän [1]. Paikallinen DNA kopioluvun poikkeamia on osoitettu ennustavan tuloksista [2], [3], [4], tai hoitovasteen [5], [6], [7] useissa syövissä. Vaikka useimmat syöpäsolut osoittavat voitto tai tappio kromosomialueita [8], vielä on keskustelu tiedemiesten onko genominen poikkeavuudet ovat välttämättömiä syövän aloittamista [9], [10] tai tuloksen kasvaimia prosessin [11], [12 ], [13]. Vaikka jotkut raportit viittaavat siihen, että voitto ylimääräinen kromosomi kykenee antiproliferatiivisia vaikutuksia [14], [15], toisten mukaan aneuploidia- aberraatioita tapahtuvat esiasteen [10], [16], [17], [18] jolloin kromosomi muunnelmia ja kasvainilmiasua [9].

Useat kromosomi päällekkäisyyksiä on usein havaittu monissa syöpien riskiä. Näistä toistuva vahvistuksen ja vahvistusta pitkän varren kromosomin 20 (20q) on havaittu 90% haiman solulinjojen [19], 15-83% haiman adenokarsinooma [20], noin 70% ensisijainen mahasyövistä [21] ja paksusuolen syöpä [18], [22], 50% munasarjojen ja kohdunkaulan ja 90% rintojen [23] syöpiä. Vahvistus 20q kromosomi varsi osoitettiin myös olevan hyvin yleinen tapahtuma varhaisessa vaiheessa eturauhasen syövän synnyn [24], [25]. Lisäksi voitto 20q geenivirhe havaittiin ohimenevästi alussa kulkua varastojen ihmisen rintarauhasen fibroblastien, kuolemattomiksi hTERT ja SV40: n suuren kasvaimen onkoproteiinin [26]. Huomattavasti, lähes kaikissa näissä tutkimuksissa 20q on yleisin vahvistusta, ja poistetaan tämä varsi on hyvin harvinaista. Lisäksi useat tutkimukset osoittavat, että monistamisen 20q korreloi huonon ennusteen [27], aggressiivinen kasvain fenotyyppi, eteneminen [28] ja etäpesäkkeiden muodostumisen [19], [29], [30].

Arvioitaessa, voisiko kromosomi epätasapaino olla kausaalinen rooli kasvainten synnyssä, sen sijaan, että sivullisia on vaikea tehtävä. Tutkimukset tehdään kliinistä näytettä, sekä kromosomipoikkeavuuksien ja geeniekspression, haittasivat useita sekoittavia tekijöitä, jotka johtuvat eri geneettisissä taustoissa potilaiden, vaihteleva ja tuntemattomia mutaatioita kasvaimissa, ja hallitsematon tartuntoja tulehdusta, endoteelin, ja strooman solut. Näiden esteiden voittamiseksi, me aiemmin määritettyyn in vitro muutos mallia, joka perustuu ihmisen keuhkojen fibroblastit, WI-38, joka johti tunnistamiseen geenien ilmentymisen allekirjoituksia [31], [32], [33] liittyviä geneettisiä poikkeavuuksia [ ,,,0],34]. Lisäksi ihmisen kiinteiden kasvainten kerätään yleensä asemointia suoritetaan samaan aikaan, kun kasvain on jo täysin kehittynyt, joka sulkee pääsyn kannalta välttämätöntä tietoa kasvaimen aloittamista ja etenemistä.

Saadakseen uusia oivalluksia alkuvaiheessa muutoksen ja geneettisen verkot liittyvät kromosomipoikkeavuuksien, käytimme in vitro -mallia eturauhasen solutransformaatioon. Tässä mallissa ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen, jotka aiemmin ikuistettu esittelemällä katalyyttinen alayksikkö telomeraasin, hTERT (EP156T) [35] kasvatettiin viljelmässä valvotuissa olosuhteissa. Erityinen Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää hypoteesin, että tietty genominen poikkeavuus esiintyvät varhaisessa vaiheessa syövän liittyy muutoksia geenien ilmentyminen, joka voisi olla liikkeellepanevana voimana kasvaimien synnyn. Sen jälkeen kun 650 päivää viljelmässä EP156T peräisin olevia soluja jaettu useita fenotyypin, kromosomi- ja transkription attribuutteja eturauhassyöpänäytteissä. Raportoimme tässä pääasiassa kahteen havainnoista. Ensimmäinen on merkittävä ja varhainen rooli 20q vahvistus kehittämisessä meidän in vitro soluviljelmässä kohti premaligneja fenotyyppi, jossa on parannettu leviämisen määrä. Toiseksi, selitämme pahanlaatuistumisriskin 20q päällekkäisyyttä tunnistamalla 13 ”syöpä aloittamisen geenit”, joka sijaitsee 20q13, jotka yli-ilmentynyt useissa syöpätyyppien, ja jonka ilmentyminen korreloi kasvaimen ja lopputulos.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen solulinjojen

Normaalit ihmisen eturauhasen solujen kuolemattomiksi telomeraasin käyttöönotto [35] kasvatettiin viljelmässä 650 päivää, jonka aikana ne analysoitiin solujen kasvu, kromosomi muutokset ja ilmentymisen profilointia. hTERT pitenee kromosomaalisen päättyy estämällä monistus vanhenemista useita erilaisia ​​normaaleihin ihmisen soluihin [36]. hTERT kuolemattomiksi EP156T soluja nimitetään tässä N line (kuvio 1). C, G ja M linjat olivat peräisin N line (kuva 1) sen jälkeen, kun 25 kohtia (joka vastaa noin 150 päivää). tätä tarkoitusta varten, mutantti kasvaimen p53 (p53R175H) kloonattiin retrovirusvektoriin pLXSN tuotiin N linja. uudet solut, jotka ilmentävät stabiilisti p53R175H mutantti, nimettiin M linja. Samanaikaisesti N solut myös infektoitiin pLXSN vektorin sisältävä GSE56 koodaava lyhyt peptidi, joka inaktivoi p53 tuumorisuppressorigeeni määräävässä negatiivisesti [37], joka johti G linja. Tyhjät pLXSN plasmidia käytettiin kontrollina tuottaa C linja. Onkogeeniset H-RasV12 kloonattiin pBabe-hygro retroviruksen plasmidia käytettiin tartunnan C, G ja M riviä juuri ennen kanavan 80 tuottaa C8R, The G8R ja M8R soluja, vastaavasti. Rivejä luotiin infektion myöhäisen passage N solut pLXSN plasmidi, joka koodaa joko p53R175H mutantti (N8M), The GSE56 (N8G) tai tyhjä plasmidi (N8C) (kuvio 1). Tartunnan jälkeen pitämällä solut kaksi viikkoa, kun läsnä oli 400 ug /ml neomysiiniä (solujen, jotka oli infektoitu pLXSN-vektori) tai 50 ug /ml hygromysiiniä (solujen, jotka oli infektoitu pBabe-hygro vektori), jotta valitse vakaan ilmentymisen käyttöön plasmideja. Retroviruksen infektion menettely on yksityiskohtaisesti [32]. Kasvuolosuhteet ja media komponentit ovat yksityiskohtaisesti [35].

Kaaviokuva tärkeimmistä johdannaisen kulttuurien EP156T eturauhasen epiteelisolujen. Jokainen rivi edustaa alakulttuurin syntyy in vitro käyttöön erityisiä geneettisiä muunnoksia. X-akseli edustaa kanavien määrällä viljelmässä (noin yksi viikko passage). Siru symbolit edustavat paikat, joissa solut kerättiin ja niiden RNA hybridisoitiin mikrosiruja; koodin saatu näyte, esim. G5 edustaa viiva (G) ja arvioitu määrä (50) kanavien viljelmässä jaettuna kymmenellä. Kromosomissa Symboli osoittaa SKY mittaus.

geeniekspressioprofilointi pitkin evoluution prosessi EP156T johdettujen kulttuurien

geeniekspressioprofilointi, otettiin näytteitä 32 pistettä pitkin viljely prosessi ja hybridisoitiin GeneChip Human Genome U133A 2,0 Array (kuvio 1). Mikrosiruissa olivat esikäsitellyt käyttäen RMA [38] ja normalisoitu. Kaikki tiedot on MIAME mukainen; raakadata on talletettu GEO tietokantaan. GEO Ennätysmäärä on- GSE23038. 5000 kaikkein vaihtelevia geenejä lajiteltiin SPIN algoritmilla [39] ja aihekokonaisuuksien avulla SPC [40] tunnistaa 2 vakaana klustereita geenien kanssa korreloi kuvion ilmaisun.

Spectral Karyotyyppi Analysis (SKY)

Eksponentiaalisesti kasvavat solut inkuboitiin Kolkisiinia (0,1 ug /ml) yön yli, trypsinoitiin, lyysattiin hypotonisella puskurilla ja kiinnitettiin jääetikkaa /metanolia (01:03). Kromosomit olivat samanaikaisesti hybridisoitiin 24 combinatorially leimatun kromosomi maalaus antureista ja analysoitiin käyttäen SD200 spektrin kuvantamiseen järjestelmä (Applied Spectral Imaging Ltd., Migdal Haemek, Israel).

S-vaiheen analyysin

aliyhtyvät viljelmät leimattiin tunti 10 uM BrdUrd (Sigma). Solut irrotettiin trypsiinillä, kiinnitettiin 70% etanolilla, ja sitä käsiteltiin seuraavalla tavalla (PBS pesua kunkin vaiheen välillä): 2 M HCl: ää ja 0,5% Triton X-100: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa; 0,1 M Na

2Br

4O

7 pH 8,5; FITC-konjugoitu anti-BrdUrd (Becton Dickinson) laimennettuna 1:03 PBS /1% BSA /0,5% Tween 20: ssa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä; ja lopuksi, 5 ug /ml propidiumjodidia ja 0,1 mg /ml RNaasi A Näytteet analysoitiin kaksiulotteisella virtaussytometrialla havaita sekä fluoreseiini ja propidiumjodidilla fluoresenssi fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelija (FACS) (Becton Dickinson). Ainakin 10000 solut analysoitiin näytettä kohti.

eristäminen Kokonais-RNA

Yhteensä RNA microarray kokeilu ja kvantitatiivinen Real Time PCR (QRT-PCR) eristettiin käyttäen NucleoSpin RNA uutetta Kit (Macherey -Nagel), mukaisesti valmistajan protokollan.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (QRT-PCR) B

2 ug: n näyte kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttäen MMLV RT (Promega) ja satunnaisia heksameerialukkeita. QRT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR-Green PCR Master Mix reagenssia (Applied Biosystems) ABI 7300 väline (Applied Biosystems). Ilmaisu tasolla kunkin geenin normalisoida, että GAPDH housekeeping-geenin samasta näytteestä. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Express -ohjelmisto. Primer sekvenssit ovat saatavilla pyynnöstä.

Expression Karyotyyppi

Expression tietoja käytettiin aikaisemmin päätellä kromosomimuutokset [41], [42]. Meidän työhypoteesin on, että muutokset kopioluku DNA täyden kromosomin tai sen osan heijastuvat geenin ilmentymisen. Poistaminen kromosomi aiheuttaa, keskimäärin, alas sääntelyä geenien ilmentymistä tuon kromosomi, vaikka päällekkäisyyttä tulisi liittyy suurempi ekspressiotaso. Jotta voitaisiin tunnistaa kromosomi-epätasapaino, vertasimme ekspressiotasot geenien, jotka sijaitsevat kukin kromosomi-varren, jokaisen näytteen, vertailunäytteeseen normaalien solujen (N0), ja etsitään merkittäviä eroja ekspressiotasot. Otimme tässä menetelmässä kromosomaalinen Epätasapaino Analysis, joka perustuu pariksi t-testiä, johtamiseksi kromosomi kopioluvun tietoja ekspressiotietojen. Kromosomi epätasapaino Analysis menetelmä kuvataan, testataan ja verrataan aiemmin johdettu tekniikka [42] täydentävässä teksti S1, katso kuvat S1 ja S2.

Verrattaessa kahta laskennallisten menetelmien SKY

Kaksi menetelmiä on käytetty tunnistamaan ”ilmaisun karyotyyppi” näytteissä. Käyttämällä Kromosominen Imbalance Analyysi me lasketaan kunkin näytteen

s

, P-arvon kullekin kromosomi testata, jos keskimääräinen ero geenien N0, verrattuna näytteen

s

, on nollasta poikkeava. Binomisen lähestymistapa [42] määrittää, onko merkittävä osa geenien kromosomi on yliekspressoitu

s

vs. N0 (tai alle ilmaistuna). Lisätietoja eroista näiden kahden lähestymistavan nähdä täydentävää teksti S1.

saatuja tuloksia SKY, joita käytettiin arvioimaan ennusteita kahden laskennallisia menetelmiä, analysoitiin seuraavasti. Jos kromosomivirhetutkimuksessa havaittiin yli 50%: n karyotyypitetty soluissa se pitää todellisena poikkeavuus; muuten se tulkittiin melua ja poistettiin analyysistä. Käyttämällä tätä määritelmää SKY tuloksiin kuin ”kentällä totuus”, vertasimme suorituskykyä kahden laskennallisia menetelmiä käyttäen vastaanotin käyttöominaisuudet (ROC) analyysi (katso kuva S2). Esitykset Kahden menetelmät olivat samanlaisia, ja hyväksyimme Kromosomi Imbalance Analysis täällä.

Kromosomi Epätasapaino Analyysi korrelaatio

Ilmi

E

gs

ilmentymistason (sen jälkeen kun log ja kynnystys) sekä probeset

g

näytteessä

s

. Kutakin probeset gramman näytteessä

s

laskemme Δ

E

gs

=

E

gs

–

E

g,

N0. Laske kunkin näytteen

s

mediaani Δ

E

gs

varten merkittävästi muuttumassa probeset peräisin 20q (määritelty täydentävässä Teksti S1 Kromosomi Epätasapaino Analysis), saada

M

s

. Jokaista probeset

g myynnissä maassa 20q laskemme Pearsonin korrelaatio kaksi numero-:

E

gs

ja

M

s

, ja puhelu tämän koska kromosomi Imbalance Analyysi korrelaatio probeset

g

(ilmiasun kanssa karyotyyppi on 20q).

rakentaminen karyotyypin evoluution puu

rakennettu ”karyotyyppi kehittyvä puu” Yhdistämällä tietoja SKY tuloksista ja ilmaisua karyotyyppi. Normaali karyotyyppi ”lajit” (46, XY) oli juuri /kantaisä kaikkien kehittyneet karyotyyppejä. Puu on rakennettu käsin käyttäen tietoja molemmista ilmaisua karyotyyppi ja SKY. Jos tiedot ilmaisua karyotype eivät olleet yhdenmukaisia ​​SKY datan tietyssä kohdassa, me interpoloitu käyttäytymistä kahden vierekkäisen pistettä, olettaen että olimme tekemisissä jatkuvan prosessin.

Kopioi numero analyysi

Ultra-korkearesoluutioinen Affymetrix genominlaajuisten ihmisen SNP paneelit 6.0 käytettiin tutkimaan hankittu genomista kopiomäärä muutoksia ja menetyksen hetero- EP156T soluja. Genominen DNA puhdistettiin käyttämällä Tissue DNAkit (Cat. # D3396-02, EZNA, Omega Biotek). DNA prehandling ja array hybridisaatio suoritettiin valmistajan ohjeiden (P /N 702504, Rev3, Affymetrix, Santa Clara, CA), ja skannattu käytettäessä Affymetrix GeneChip- Scanner 3000. Laadunvalvonta, genotyyppi kutsumus, koetin taso normalisointi ja kopion numero normalisointi tuottaa log

2 suhdelukuja tehtiin Affymetrix GeneChip® genotyypin Console v3.0.1. In-house viitetiedoston tuotetaan 59 tervettä verenluovuttajien käytettiin. Tietojen analysointi ja visualisointi suoritettiin Kromosomianalyysi sviitissä, jonka kynnys on vähintään 100 kb ja 20 markkereita. Poikkeamiin raportoitu mukaan ICSN nimikkeistön ja NCBI rakentaa 36.

Verkot ja graafisen esittämisen

Tiedot analysoitiin käyttämällä Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Verkko on graafinen esitys molekyylien väliset suhteet geenien /geenituotteiden. Tai geenituotteiden ovat edustettuina solmuja, ja biologisen suhde kahden solmun on edustettuna reunan (viiva). Kaikki reunat tukevat ainakin yhden viite kirjallisuudesta, oppikirjasta, tai kanoninen tallennetut tiedot Ingenuity Pathways Knowledge Base. Ihmisen, hiiren ja rotan ortologeihin geenin tallennetaan erillisinä esineitä Ingenuity Pathways Knowledge Base, mutta esittää yhtenä verkon solmuun. Solmut näytetään käyttäen erilaisia ​​muotoja, jotka edustavat toiminnallinen luokka geenituotteen.

Tulokset

In vitro malli varhaisen eturauhasen syövän synnyn

Jotta seurata alkuperäistä etenemistä vaiheita kohti maligniteetti eturauhasen syövän synnyn, olemme luoneet järjestelmän, joka perustuu hTERT kuolemattomiksi hyvänlaatuista eturauhasen epiteelisolujen (EP156T) soluihin [35]. Nämä ikuisti solut tässä nimitystä N line. Klo kanavan 25, N-soluja manipuloidaan yli-express reagenssit, jotka inaktivoivat kasvain p53. Tätä varten, p53R175H mutantti kasvaimen p53 kloonattiin retrovirusvektoriin pLXSN tuotiin N linjan rinnalla GSE56, p53-inaktivoivan peptidi, kloonattiin pLXSN-vektoriin, ja tyhjällä pLXSN plasmidi kontrollina . Neljä kuolemattomia solulinjoja, mukaan lukien normaali (N), transdusoitu GSE56 (G), jossa on mutant- p53R175H (M) ja tyhjällä vektorilla valvonnan (C) viljeltiin vielä 500 päivää in vitro. Kuvio 1 esittää kaavamaisesti tätä mallia. Koko tämän käsikirjoitus, näytteet merkitään LX, jossa L = N, G, M tai C ja viitenumero X tarkoittaa kanavien määrällä (± 3), jolla tietty näyte otettiin, jaetaan kymmenellä (esim G4 edustavat otettu näyte alkaen GSE linjan passage -40). Juuri ennen kanavan 80, onkogeeninen Ras (H-RasV12) vietiin C, M ja G linjat saatiin C8R, M8R ja G8R viivoja, kuten on kuvattu kuviossa 1. Sen vuoksi, H-RasV12 onkogeenin kloonattiin pBabe- hygro retrovirusvektori on käytetty. Lisäksi, retroviruksen reagenssit on kuvattu edellä käytettiin yli-ilmentämään GSE56 ja mutantti p53R175H soluissa N linjan myöhäisessä passage, generoidaan N8G, N8M ja N8C linjat (kuvio 1). Retrovirusinfektiota seurasi kaksi viikkoa lääkkeen valinta aiheuttaa stabiilin ilmentymisen (katso materiaalit ja menetelmät). Jos haluat kattavan kuvan evoluutiomuutoksiin aikana pitkittynyt viljelyn soluviljelmissä, halusimme yhdistää analyysejä solun kasvu, kromosomaalisia muutoksia ja ilmaisun profilointi pitkin 650 päivää viljelmässä N, C, G ja M riviä. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, solut otettiin näytteet pitkin tämän ajan ja analyysit soluproliferaation, geenin ilmentymisen ja karyotyyppi suoritettiin (kuva 1).

Kun perustamista meidän osoittamalla in vitro mallissa, oli tärkeää arvioida onko tämä järjestelmä voi edustaa in vivo ihmisen syövän luotettavalla tavalla. Tätä varten tutkimme onko pitkin 650 päivää Viljelyn EP156T solut hankittiin molekyyli- ja fenotyypin ominaisuuksia tyypillisiä todellisen kasvaimia. Koska solujen lisääntymistä on perusominaisuus syöpä- transformaation, solujen kasvu ja prosenttiosuus lisääntyvien solujen (i. E., Solujen S-vaiheen solusyklin), arvioitiin. Todellakin, lisäys solujen kasvu oli ilmeistä, koska solujen viljelyn edetessä (kuvio 2A). Tästä samaa mieltä, suurempi osuus lisääntyvien solujen havaittiin myöhemmin kohtia, arvioituna BrdU merkintöjen ja FACS-analyysi (kuvio 2B). Lisäksi ilmaus p16INK4a tuumorisuppressorigeenin väheni ajan viljelmässä kaikissa neljässä solulinjoissa (kuvio 2C). Alentuneita p16INK4a havainnoidaan yleisesti kehittyneen eturauhaskasvaimissa [43] ja todettiin olevan yksi keskeisistä tapahtumista in vitro muutosprosessissa ihmisen WI-38 fibroblastit [31], [32], [33]. Sitten halusimme tutkia geeniekspressiomalli of EP156T johdettuja viljelmiä muistuttaa in vivo kasvaimia. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, seuraava analyysi tehtiin. Kun geenin ilmentymisen profilointi EP156T soluja, klusterointi analyysi suoritettiin tunnistaa geenien vastaaviin ilmentymismalli. Ilmaisu kuviot kaksi merkittävintä klusterit esitetään kuvissa 2D ja 2E. Ensimmäisen keskittymän (kuvio 2D) sisälsi 177 selostukset, jotka jopa säädellä viljelmässä ajan mittaan. Tarkasteltaessa Gene ontologia (GO) rikastukseen David ohjelmistoa [44], huomasimme, että nämä geenit liittyvät soluproliferaatioon. Siten tämä klusteri nimitetään ”leviämisen klusteri” pitkin käsikirjoitus. Tämä suuntaus ilmentyminen oli vahvistanut QRT-PCR kolmeen edustaja geeneistä (kuvio S3). Toinen ryhmä (kuvio 2E) sisälsi 296 glykoproteiiniin ja adheesiomolekyyli selostukset ja niiden ilmaisun korreloi negatiivisesti leviämisen klusterin. Arvioida, nämä muutokset geeni-ilmentymisessä voidaan liittyvät muutosprosessia EP156T soluja, tutkimme geenien ilmentymistä sekä klustereita on aineisto 99 näytettä, joka on saatu normaalissa eturauhasessa, kasvain ja etäpesäke eturauhassyöpäpotilaalla [45 ]. Huomiota herättävää on, geenien ilmentymistä sekä klustereiden merkittävästi korreloi niiden ilmaisun tämän joukon kliinisiä syövän etenemisen näytteistä (kuvio 2D ja 2E, alhaalla). Toteamus siitä, että geeniekspressiomalli meidän in vitro malli muistuttaa edenneen eturauhassyövän, viittaa siihen, että tämä malli esitetään yhteenveto molekyylitason tapahtumia, joita tapahtuu in vivo pahanlaatuisia eturauhanen. Yksityiskohtainen analyysi näiden klustereiden ja vertailu in vivo-tiedot ovat saatavilla Teksti S1. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että aikana pidentynyt in vitro viljelemällä EP156T eturauhasen kuolemattomien solujen, valintaprosessi tapahtui suosimalla eloonjäämistä solujen suurempi proliferatiivinen kapasiteettia, joka saattaa johtaa transformoidun fenotyypin.

. Määrä populaatio kaksinkertaistuu EP156T johdettujen viljelmät (C, G ja M), joka lasketaan 50 päivän välein aikana 650-päivän viljelemisen jakson jälkeen hTERT-infektion, rinnalla määrä populaation kaksinkertaistumista suoritetaan ei-tartunnan EP156 solujen ensimmäisessä 50 päivää viljelmässä ja EP156T (N) solujen aikana seuraavien 100 päivän viljelyn. B. Prosenttiosuus lisääntyvien solujen (S-vaihe) mitattiin BrdU merkintöjä varhaisen passage (C4) ja myöhäinen passage (C8) soluja. C. Reaaliaikainen QRT-PCR p16INK4a ilmentymistä eri näytteitä EP156T järjestelmän. D. Top: Expression matriisi klusterin geenejä, joiden ilmentyminen kasvoi muutosprosessia. Kussakin näytteitä tilataan aikaista myöhään kohtia. Alempi paneeli: keskimääräinen ekspressiokuviota näiden geenien näytteissä eturauhassyövän potilaista [45]. P-arvo ero ilmaisun välillä normaalin ja syöpä on p = 0.00024 ja normaalista ja syövän etäpesäkkeiden on p = 0.00013. E. Top: Cluster sisältävien geenien yliedustettuja glykoproteiinin ja solunulkoisen alueen geenit, näytteet kunkin linjan tilataan aikaista myöhään kohtia. Klusteri on alassäädetty aikana muutosprosessin. Alempi kaavio esitetään keskimääräinen ilmentyminen klusterin geenit syöpänäytteissä [45]. P-arvo ero ilmaisun välillä normaalin ja syöpä on p = 0.00013 ja normaalista ja syövän etäpesäkkeiden on p = 0.00023.

Eksogeeninen käyttöönoton telomeraasin indusoi kuolemattomaksi EP156T solujen takia telomere venymä, joka oli ilmeistä, kun säilytetään solujen pitkän ajan in vitro [35]. Lisäksi yli-ilmentyminen mutanttimuotoon p53 tuumorisuppressorin ja p53 Inaktivoivan peptidin GSE56 myös säilyy pitkään sen jälkeen, kun niiden käyttöönottoa soluihin. Yksityiskohtainen analyysi tiettyjä toimintoja mutantti p53R175H yli-ilmaistu EP156T soluissa esitetään [46]. Pidättyminen telomeraasi ja muuttunut muotoja p53 EP156T soluissa ajan viittaa siihen, että nämä geenit voivat olla rooli ylläpitoon muutosta.

20q vahvistusta syntyi ja hallitsi solupopulaation varhaisessa vaiheessa prosessin

kromosomipoikkeavuuksien.

kääntyi tutkia kromosomin kopiomäärä vaihtelut meidän solut, koska ne on todettu liittyvän syöpään fenotyypit. Tämän vuoksi arvioimme kromosomipoikkeavuustestissä kuvio väestötasolla käyttämällä laskennallisen analyysin ilmaisun tietoja (katso menetelmät), ja tasolla yksittäisten solujen avulla spektrin karyotyping (SKY). Käytimme tietomme seurata ajallista kehitystä ”ilmaisun karyotyyppi” – eli kromosomipoikkeamakoe, koska ne näkyivät geeniekspressiomalli. Meidän data muodostavat reaaliaikaisen sarja, joka antaa meille merkittäviä etuja tunnistamisessa etenemistä hallitseva kromosomipoikkeavuuksien.

”ilmaisu karyotyyppi” paljasti merkittävän ajallista vaihtelua ekspressiotasoja geenien useiden kromosomaalisten aseiden eri viivat (kuvio 3). Kromosominen varsi 20q osoitti voimakkainta muutokset ilmaisu- ja liittyi merkittävimmät p-arvot kaikki linjat. Verrattuna N0, ilmaus 20q osoitti noin 1,5 kertaiseksi N linjan ja varhain kohdat M, G ja C linjat. Mielenkiintoista, myöhään kohdat M, G, ja C linjat tämän kertainen muutos kasvoi ~1.8. Nämä tulokset viittaavat siihen, että solut trisomia on 20q hallitsi solupopulaation varhaisessa vaiheissa, ja C, G ja M riviä toissijainen tapahtumia seurannut ja luonut yli 3 kappaletta 20q käsivarteen. Muita poikkeamia, jotka havaittiin olivat amplifikaatioita 9q ja 13q on N rivi; of 7p, 7q, 18q ja myöhemmin prosessissa, on 3p C rivi; monistuminen 9p, 11p ja vähemmän merkittävästi, ja 13q G rivi; että M linja tunnistimme lisäksi amplifikaatioita 13q ja 20p, myös deleetiot 10p ja kromosomin 16 (läpikulun jälkeen 60).

Expression taso kunkin geenin selityksineen tietylle kromosomi varsi verrattiin sen ekspressiotaso N0 näytteessä (EP156 ensisijainen solujen passage 8), joka edustaa vanhempien kulttuurin kaikkien neljän riviä. Kunkin N, C, G ja M riviä (katso teksti) ylempi paneeli esittää koordinoidun muutoksia mediaanin geenien ilmentymisen annotoituna tiettyjen kromosomaalisten alueiden, jaettuna niiden mediaani ilmaisun N0. Alempi paneeli on -log

10 (p-arvo) pariksi t-testiä välillä geenien N0 ja muiden näytteiden (x-akseli) tietylle kromosomi käsivarteen. Kuvassa esitetään tilastollisesti merkitsevä kromosomi käsivarret (p-arvo 0,001 ja mediaani kertaluokkamuutos 1,5 tai 0,5 ainakin yhdessä pisteessä).

Me tehdään 24 SKY mittauksia eri vaiheissa prosessi; Kunkin tutkimme välillä 4-10 solut (tulokset on esitetty taulukossa 1). SKY, yhteisymmärryksessä ilme karyotyyppi, jonka tunnuksena päällekkäistä kromosomeja 20, 3, 7, 9, 18 ja poisto 16 pitkin eri linjat. Lisäksi translokaatiot joista kromosomien 10, 11 ja 20, jotka tunnistettiin SKY, tunnustettiin poistot /duplikaatioita ilmaisu karyotyyppi (kuten alla selitetään).

useissa kohdissa SKY tulokset eivät käyttäydy odotusten mukaisesti (taulukko 1). Suorittamaan SKY analyysiä varten solut sulatettiin ja uudelleen kasvatettiin useista kohdista sijaan käyttämällä täsmälleen samaa väestön otettiin mikrosiruja. Siten perustaja vaikutukset voivat olla vastuussa epäjohdonmukaisuuksia eri SKY tuloksia (esim päällekkäisiä kromosomissa 7 kanavassa 41 on ristiriidassa kohtia 31 ja 52) sekä SKY ja ilmaisun karyotyyppi havaittiin joissakin kohdissa (esimerkiksi päällekkäisiä kromosomi 18. C linja tai poistoista kromosomien 13 ja 5 näytteessä N8).

Euroopan karyotype evoluution puu.

Ymmärtääkseen paremmin evoluutioprosessien joka tapahtui aikana meidän kokeen rakensimme ”karyotyyppi kehittyvä puu” (kuva 4) yhdistetään tietoja SKY tuloksista ja ilme. Samoin muita evoluution puita, ”karyotyyppi kehittyvä puu” auttaa ymmärtämään paremmin johon karyotyyppi ”laji” syntyä, kehittyä tai sukupuuttoon prosessin aikana. Evoluution puu muistuttaa ominaisuus (tässä tapauksessa erityisen lisäys, poisto tai poikkeavuus), joka antaa valitun karyotyyppi kasvu etu muihin karyotyyppejä. Jos tiedot ilmaisun karyotyyppi eivät olleet yhdenmukaisia ​​tietoja SKY analyysin tietyssä vaiheessa meidän interpoloitu käyttäytymistä kahden vierekkäisen pistettä (katso menetelmät). Esimerkiksi SKY tulokset C mukaisesti osoittivat solujen yhdistelmiä ylimääräisiä monistukset ja poistot. Vaikka useita mahdollisia konstruktioita C linjan puu olisikin mahdollista, todisteet sekä ilmaisun karyotyyppi ja SKY ehdotti, että kaikkein hallitseva vaikutus näissä soluissa oli päällekkäistä kromosomissa 7 (at passage 40) seuraa päällekkäisyyttä kromosomi 18, joka myöhemmin oli seuraa päällekkäisyyttä kromosomin 3. Toisaalta ilmaisun karyotype näytteissä C6 ja C7 osoittivat odottamaton lasku mediaani kertamuutoksia kaikkien poikkeavien kromosomeja (katso kuva 3). Uskomme, että SKY täsmällisemmän kuvan todellinen karyotyyppi näissä ajankohtina.

Lukuun synnytettiin perusteella 24 SKY tuloksia pitkin eturauhassyövän muutosprosessia ja ilmaisua karyotyyppi. Normaalissa eturauhasessa ihmisen soluja (vasemmalla puolella kuva) käytettiin luomaan 4 kuolemattomaksi eri linjaa: GSE, ohjaus, normaali, ja Mutant p53 (katso teksti) että lisääntyvät aikana 80 kohtia (x-akseli).