Krooninen sairaus

tiivistelmä

Perinteisesti GRP78 on pidetty Endoplasmakalvosto (ER) luumenin proteiinia, koska sen karboksyyli- KDEL säilyttäminen motiivi. Äskettäin alafraktio GRP78 on havaittu paikallistaa pintaan spesifisiin solutyyppeihin, joka toimii yhteistyössä reseptorit ja säätö- signalointia. Kuitenkin fysiologinen merkitys solun pinnan GRP78 (sGRP78) ilmentyminen syövän ja sen toiminnallinen vuorovaikutuksia solun pinnalla ovat vasta kehittymässä. Tässä raportissa yhdistimme biokemiallisia, kuvantaminen ja mutaatiostatuksesta keinoja vastata näihin kysymyksiin. Havaitsemiseksi sGRP78, käytimme hiiren monoklonaalinen vasta-aine erittäin voimakkaita ja spesifisiä GRP78 tai epitooppimerkittyjen GRP78 yhdistettynä kuvantamiseen ja biokemiallisia tekniikoita, jotka mahdollistivat havaitseminen sGRP78 mutta ei solunsisäistä GRP78. Tutkimuksemme paljastivat, että rinta- ja eturauhassyöpää solujen resistenttejä hormonihoidon aktiivisesti GRP78 solun pintaan, joka voidaan edelleen kohotetaan erilaisia ​​ER stressiä aiheuttaville olosuhteille. Osoitimme, että sGRP78 muodostaa kompleksin PI3K, ja yli-ilmentyminen sGRP78 edistää PIP3 muodostumista, osoittaa PI3K aktivointia. Olemme lisäksi havainneet, että insertio mutantin GRP78 sen N-päähän domeenin, säilyttäen vakaa ilmentyminen ja kyky translokoida solun pinnalle kuin villityypin proteiini, oli vähemmän kompleksin muodostumista p85 ja tuotannon PIP3. Siten meidän tutkimukset antavat mekanistinen selitys sääntelyn PI3K /AKT opastinjärjestelmillä sGRP78. Tulosten perusteella näyttää, että kohdentaminen sGRP78 voi tukahduttaa terapeuttista vastus syöpäsoluissa ja tarjoavat uudenlaisen strategian tukahduttaa PI3K.

Citation: Zhang Y, Tseng CC, Tsai YL, Fu X, Schiff R, Lee AS (2013 ) Syöpäsolut Kestää Therapy edistää solujen pinta Relocalization of GRP78 Mitkä komplekseja PI3K ja Parantaa PI (3,4,5) P3 Production. PLoS ONE 8 (11): e80071. doi: 10,1371 /journal.pone.0080071

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 elokuu 2013; Hyväksytty: 08 lokakuu 2013; Julkaistu: 11 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health (NIH) myöntää R01 CA027607 ja P01 AG034906 ASL; P50 CA058183 (Breast Cancer SPORE), P01 CA030195, The Breast Cancer Research Foundation ja SU2C /Rintojen ohjelma RS; P30 CA014089 (USC Norris Kattava Cancer Center Cell and Tissue Imaging Core) ja P30 DK048522 (USC Research Center for maksasairaus Cell and Tissue Imaging Core). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

78 kDa glukoosin säätelemä proteiini (GRP78), kutsutaan myös BiP /HSPA5, on merkittävä Endoplasmakalvosto (ER) kaperonia anti-apoptoottinen ominaisuudet [1] ja master säädin ER stressin signalointi [2], [3]. Kasvainsolut altistetaan ER stressin takia sisäisiä piirteitä muuttunut aineenvaihdunta ja ulkoisten tekijöiden hypoksia ja ravinteiden puutetta. ER stressin induktio GRP78 syöpäsoluissa suosii solujen eloonjäämistä, syövän etenemistä [4], [5] ja antaa lääkeresistenssin sekä lisääntyvien ja lepotilassa syöpäsolujen sekä kasvaimeen liittyvien endoteelisolujen [6] – [11]. Siksi ymmärtää, miten GRP78 kykenee sen pleiotrooppisia vaikutuksia soluproliferaatioon ja selviytyminen on suuri merkitys.

Perinteisesti GRP78 on pidetty ER luumenin proteiinin ansiosta karboksyyli- KDEL säilyttäminen motiivi [12]. Äskettäin alafraktio GRP78 havaittiin paikallistaa pintaan spesifisiin solutyyppeihin, etenkin syöpäsoluissa [13] – [16]. Solun pinta proteomia profilointi kasvainsolujen paljasti suhteellinen runsaus lämpöshokin chaperones ja glukoosin säätelemä proteiineja, mukaan lukien GRP78 [17]. Tärkeää on, edulliseen ilmentyminen GRP78 pinnalla kasvainsolujen, mutta ei normaalissa elinten mahdollistaa tietyn kasvaimen kohdistus, mikä johtaa kasvaimen poistaminen ilman haitallisia vaikutuksia normaaleihin kudoksiin [18] – [21].

Evidence on kehittymässä, että sGRP78 muodostavat komplekseja erityisiä solunpintaproteiinit ja säädellä signaalitransduktion [13], [14], [16], kuten on co-reseptori proteinaasinestäjä α2-makroglobuliini- (α2-M *) aiheuttama signaalitransduktion syöpään selviytyminen ja etäpesäkkeiden [22], [23]. Cripto, GPI-ankkuroituja solun pinnan proteiinin avain ihmisen kasvaimen etenemiseen, ja sGRP78 muodostavat kompleksin ja yhteistyötä estävän TGF-β signalointi ja parantaa solujen kasvua ja PI3K /AKT aktivointi [24], [25]. Lisäksi, sGRP78 tarvitaan T-kadheriinin riippuva endoteelisolujen selviytymisen [26], apoptoosin aktivaatiosta välittävät kringle 5 [27], [28] ja solun Par-4 ja TRAIL [29], samoin kuin viruksen pääsyä isännän soluihin [30], [31]. Viime aikoina olemme osoittaneet solun pinnalla lokalisoinnin GRP78 säätelee ER haku koneet ja parantaa ehtyminen Ca

2+ päässä ER [32]. Syöpäsolut joutuvat usein ER stressiä, jotka pahentavat sytostaattihoidossa johtaa vastarintaa. Kuitenkin myös patologinen stressi, kuten kehittäminen terapeuttisen resistenssin johtaa relocalization of GRP78 solun pintaan ei ole tiedossa.

PI3K /AKT reitin aktivoidaan monenlaisia ​​syöpiä johtaa lisääntymistä ja terapeuttinen vastus [33]. PI3K on kahdesta alayksiköstä, p85 säätelyalayksikön ja P110 katalyyttinen alayksikkö. Sillä PI3K aktivointi, tyrosiinifosforylaation p85 sääntelyn alayksikön PI3K vapauttaa sen estävää vaikutusta PI3K, mikä johtaa sen aktivoinnin. Sitoutuessaan aktivoida kasvutekijän reseptorin, PI3K on rekrytoidaan plasmamembraanin. PI (4,5) P2 fosforyloituu PI3K antamaan PI (3,4,5) P3, joka edistää kalvo lokalisointia PDK1, joka sitten fosforyloi ja aktivoi AKT. Kautta knockdovvn GRP78 siRNA, ligatoimalla solun pinnan GRP78 vasta-aineella ja geneettisissä malleissa syövän, GRP78 on perustettu uutena säätelijänä PI3K signaloinnin sekä in vitro että in vivo [16], [25], [34], [35]. Vaikka voi olla useita mekanismeja, joiden avulla GRP78 voi vaikuttaa AKT aktivointia, on raportoitu, että vasta-aine on kohdistettu N-päähän GRP78 jäljittelee reseptorin tunnustettu muotoja α2-M * ligandina ja ajaa PI3K-riippuvainen aktivaatio AKT ja sen jälkeen stimulaatio solujen lisääntymisen in vitro [21], [36]. Toisaalta, karboksyyliryhmä pään domeeni-vasta-aineen toimii antagonistina α2-M * ja estää α2-M * aiheuttama AKT-fosforylaation [21]. Äskettäin monoklonaalinen vasta-aine suunnattu solun pinnalla GRP78 näkyy tukahduttaa PI3K /AKT signalointi, kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden useita syövän malleissa [37]. Näistä edistysaskeleista huolimatta tiedetään vähän miten sGRP78 säätelee PI3K. Tässä raportissa, analysoimme sGRP78 ilmentymisen rinta- ja eturauhassyövän solulinjoissa resistenttejä hormonihoidon, ja tutkitaan sen sääntely PIP3 tuotantoa. Nämä tulokset laajentaa tietämystä sGRP78 ja vaikuttavat merkittävästi syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki protokollat ​​eläinten käyttöä tarkistettiin ja hyväksyttiin USC Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Eläin varmuus määrä on A3518-01. Protokolla numero on 9964.

Solulinjat ja kulttuuri

Hiiren alkion fibroblasti (MEF) soluihin [38], ihmisen solulinjoja, HEK293T- [32] ja HeLa [32], viljeltiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Ihmisen solulinjoja, LNCaP (ATCC, Manassas, VA) ja C4-2B (Viromed Lab, Minneapolis, MN), pidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. MCF7L emosoluilta [39] viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% kuumentamalla inaktivoitua FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiini /glutamiini; MCF7L-Tamr solut olivat samassa väliaineessa paitsi fenolipunaista (PRF) RPMI 1640 ja 10% puuhiilellä dekstraania riisuttu (CS) -FBS. Vanhempien MCF7 /HER2-18 soluihin [40] viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää, 1% penisilliini /streptomysiiniä, 0,4% genetisiini (Life Technologies, Grand Island, NY) ja 15 ug /ml insuliinia (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO); MCF7 /HER2-18-Tamr solut olivat samassa väliaineessa paitsi PRF DMEM ja 10% CS-FBS: ää. Tamr solut Sekä MCF7L ja MCF7-HER2-18 malleja ylläpidettiin alustassa, joka sisälsi 100 nM 4-hydroksitamoksi- (Sigma-Aldrich) kuin lopullinen konsentraatio. Estrogeeni-riippuvaa solulinjaa, MCF-7 /BUS, oli ystävällisesti A.M. Soto (Tufts University, Medford, MA) ja se on kuvattu [41], [42]. Eristäminen ja viljelyolosuhteet varten estrogeenin nälkään kestävä klooni MCF-7 /BUS-10 on kuvattu [43]. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2, 95% ilmaa. Stressin hoitoon, soluja käsiteltiin thapsigargin (Tg) on ​​300 nM, tunikamysiini (Tu) 1,5 ug /ml 16 h, tai 2-deoksiglukoosi (2DG) 10 mM: ssa 24 tuntia.

plasmidit

rakentaminen FLAG-GRP78 FLAG-tag lisätään jälkeen ER signaalipeptidi (aa 1-18), ja ihmisen täyspitkän GRP78 (aa 1-654) on kuvattu [32]. GRP78-103F sisältää FLAG-tag lisätään heti aa 103 ihmisen GRP78 rakennettiin seuraavasti: täyspitkä ihmisen GRP78 in pcDNA3 (Life Technologies) selkäranka käytettiin templaattina QuikChange mutageneesillä (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Ihmisen täyspitkän PI3K-säätelyalayksikön, p85 alfa-cDNA, monistettiin RT-PCR: llä ihmisen HEK293-RNA: n ja subkloonattiin pcDNA3 BamHI ja Xbal.

Transfektio olosuhteissa

Soluja viljeltiin 60-80% konfluenssiin ja transfektoitu Biot (Bioland Scientific, Paramount, CA) seuraten valmistajan ohjeita kuvatulla [32].

immunoblottianalyysi

Solut hajotettiin radioimmunosaostuksella (RIPA) puskuri täydennetty toimivaltaisten proteaasinestäjä (Thermo Scientific, Rockford, IL). Solulysaatit altistettiin 10% SDS-geeleissä ja Western blot -analyysit, kuten on kuvattu [32]. Käytetyt vasta-aineet olivat: hiiren anti-FLAG-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich), 1:1000; Hiiren anti-GRP78-vasta MAb159 (lahja P. Gill, USC), 1:2000; kanin anti-PI3K p85-vasta-ainetta (# 4292, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; kanin anti-PI3K p110α-vasta-ainetta (# 4249, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; Hiiren anti-EphB4 vasta-aine (lahja P. Gill, USC), 1:1000; kanin anti-NKA α1 (Na, K-ATPaasi α1) vasta-aine (Cell Signaling Technology), 1:1000; hiiren anti-β-aktiini-vasta-aineen (Sigma-Aldrich), 1:5000. Kokeet toistettiin 2-3 kertaa. Proteiini tasot havaittiin joko tehostetun kemiluminesenssin (ECL) tai fluoresenssi värjäys, ja visualisoida ja kvantitatiivisesti Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) tai Licor Odyssey.

Immunofluoresenssi- ja konfokaalimikroskopia

havaitsemiseksi endogeenisen sGRP78, C4-2B-soluja ympättiin 5 x 10

3 kuoppaa kohti 8-kuoppaisen kammion dia (Millipore, Billerica, MA) 24 tuntia ja sitten käsiteltiin Tg 8 tuntia . Sitten solut fiksoitiin kylmässä 4% paraformaldehydillä 10 min ajan, pestiin kylmällä PBS: llä, ja sitten blokattiin 5% BSA: ta PBS: ssä (BSA /PBS) jäillä 30 minuutin ajan. Solut värjättiin hiiren anti-GRP78 monoklonaalinen vasta-aine (MAb159) 1% BSA /PBS: llä 10 ug /ml 4 ° C: ssa yön yli ilman läpäiseväksi. Solut pestiin kylmällä PBS: llä ja värjättiin AlexaFluor-488 vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (Life Technologies) 1% BSA /PBS: ssä 4 ° C: ssa 1 h. Myöhemmin immuunivärjäykseen p85, joka on solunsisäinen, solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% (w /v) saponiini PBS: ssä huoneenlämpötilassa (RT) 15 min. Solut pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,01% saponiinia (PBS /SAP), ja sitten blokattiin 5% BSA: lla PBS /SAP huoneenlämpötilassa 1 tunti. Solut värjättiin kaniinin anti-p85-vasta-ainetta (1:50, Cell Signaling Technology) 1% BSA: lla PBS /SAP huoneenlämpötilassa 2 h, mitä seurasi värjäys AlexaFluor-594 vuohen anti-kani-vasta-ainetta (Life Technologies) in 1% BSA: lla PBS /SAP huoneenlämpötilassa 1 h.

havaitsemiseksi ektooppisesti ilmaistuna FLAG-merkitty GRP78 solun pinnalla, HeLa-solut ympättiin 5 x 10

3 per kuoppa 8- kaivokammio liukuu 24 tuntia ennen transfektiota. Transfektio suoritettiin käyttämällä Biot. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, ei-läpäiseviksi solut kiinnitettiin ja lukittu edellä kuvatulla tavalla ja inkuboitiin sitten hiiren anti-FLAG-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) 1% BSA /PBS: ssä 4 ° C: ssa 1 h, mitä seurasi inkubointi AlexaFluor -488 vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (Life Technologies) 1% BSA /PBS: ssä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Havaitsemiseksi fosfatidyyli 3,4,5-trifosfaatti (PI (3,4,5) P3), sitten solut käsiteltiin MOM ™ Mouse Ig Blocking Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) huoneenlämpötilassa 1 h lohkoon hiiri immunoglobuliini peruskoulusta hiiren anti-FLAG-vasta. Seuraavaksi solut läpäiseviksi, kuten yllä on kuvattu, ja solunsisäinen PI (3,4,5) P3 värjäys suoritettiin kuten on kuvattu [35]. Havaitsemiseksi p85 HeLa-soluissa, solut läpäiseviksi ja värjättiin primaarisen vasta-aineen 37 ° C: ssa 1 h, ja sekundaarisen vasta-aineen 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan.

Kaikki immuno- solut asennettu Vectashield antihäipyminen alustassa, joka sisälsi DAPI (Vector Laboratories), ja analysoitiin Zeiss LSM510 -konfokaalimikroskoopilla varustettu LSM 510 Versio 4.2 SP1 hankinta ohjelmisto (Carl Zeiss). Kuvat ovat otettu mukaan EY Plan-Neofluar 40 × /1,30 öljy tavoite tai Plan-Apochromat 100 × /1,4 öljy DIC tavoite. Z-pino kuvat oli otettu Plan-Apochromat 100 × /1,4 öljy DIC tavoite.

solupintaproteiini biotinyloinnilla ja eristäminen

solunpintaproteiinit biotinyloitiin läpäisemätön biotiinia, hajotettiin RIPA-puskuria ja puhdistettiin NeutrAvidin agaroosi- helmiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [32].

Co-immuunisaostustesti

transfektoidut solut biotinyloitiin ja lyysattiin immunosaostuksella (IP) puskurissa (25 mM Tris- Cl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40). Solulysaatit altistettiin monomeerisen avidiinin kolonniin (Thermo Scientific) ja eluoitiin 2 mM D-biotiini-PBS: ssä valmistajan ohjeita noudattaen. Eluaatti konsentroitiin Vivaspin-6 keskittimien (10 kDa MWCO, Sartorius STEDIM Biotech, Concord, CA), esikirkastettiin 50 ui Dynabeads-proteiini G: tä (Life Technologies) ja sille suoritettiin inkubaatio 1 ug hiiren anti-FLAG-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) tai normaalin hiiren lgG: ssa yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin 50 ui Dynabeads-proteiini G: ssa 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen helmiä keitettiin 5 min 2 x SDS-näytepuskuria, näytteet tehtiin 10% SDS-PAGE-elektroforeesilla ja Western blot.

Fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) -määritys

solut irrotettiin ei-entsymaattisen soluhajotusprosessin liuosta (Sigma-Aldrich), 37 ° C: ssa 15 minuuttia ja jaettiin eriin 1 x 10

6 solua /putki, ja inkuboitiin 10% normaalin ihmisen seerumilla PBS: ssä 20 min jäillä estää Fc-reseptoreihin solun pinnalla. Soluja inkuboitiin kyllästävä määrä hiiren anti-GRP78-vasta-aine (MAb159) (1 ug) 40 minuutin ajan jäillä 100 ul: ssa värjäyspuskuria (Dulbeccon PBS, 2% lämmöllä inaktivoitua vasikan sikiön seerumia, 0,09% natriumatsidia) ja sen jälkeen AlexaFluor-488-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (0,5 ug, Life Technologies) ja suspendoitiin jääkylmään PBS: ään, joka sisälsi 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI, 1 ug /ml, Sigma-Aldrich) ja altistettiin FACS. Tiedot hankittiin LSR II virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA) ja analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa.

Tulokset

aktiivinen edistäminen solun pinnalla GRP78 ilmentymistä syöpäsoluissa resistenttejä hormonaalista terapia

sen testaamiseksi, onko resistenssin kehittyminen terapeuttisen hoidon muuttaa ilmentymistä sGRP78 syöpäsoluissa, käytimme kolme sarjaa syöpäsolulinjoista ja niiden johdannaiset, jotka ovat hankkineet resistenssin hoito. Ihmisen rintasyövän solulinjaa MCF7L vanhempien linja (MCF7L-P) ja johdannainen tamoksifeenin kestävä linja (MCF7L-Tamr) tuotettiin pitkän aikavälin kulttuuri MCF7L-P soluja PRF-alustassa, joka sisälsi 10% CS-FBS ja 100 nM tamoksifeenin (Tam), kunnes solujen kasvu jatkui (jälkeen 4 mo). Toisin kuin MCF7L-P-soluissa, jotka kasvoivat väliaineessa, joka sisältää E2, mutta ei elatusaineessa, joka sisälsi Tam, MCF7L-Tamr solut osoittivat yhtä kasvu, kun se altistetaan joko estrogeenin (E2) tai Tam (kuvio 1A). Ihmisen rintasyöpä MCF7 /HER2-18-P, joka on HER2-yliekspressoivassa klooni ja sen Tam-R johdannainen eristettiin, kun pitkäaikainen Tam noin 11 mo. Kolmas soluparille on vakiintunut androgen-herkkien ihmisen eturauhasen adenokarsinooma soluissa, LNCaP ja sen johdannainen, androgeeni-riippumaton solulinja, C4-2B.

(A) validointi Tam resistenttien fenotyypin MCF7L-Tamr soluja. MCF7L-vanhempien (P) ja -TamR soluja esi-nälkiinnytettiin fenolipunattomalla (PRF) väliaineessa, joka sisälsi 5% CS-FBS 5 d, ennen kuin altistetaan estrogeenin (E2) (1 nM) tai Tam (100 nM) käsittely 8 d. Solut ympättiin neljänä rinnakkaisena 96-kuoppaiselle levylle ja solujen lukumäärät laskettiin in situ solussa sytometrin. Päivänä 8 solut värjättiin metyleenisineä, kuten on esitetty alemmassa paneelissa. Virhepylväät edustavat keskihajonta; * P 0,001, kaksipuolinen t-testin, solujen kasvua alle Tam vs. E2. (B) Immunoblotit MEF-soluihin käyttäen MAb159, jossa β-aktiini kuin latauskontrollina. Vasen kaista osoitti MEF lysaatit

Grp78 Floxed /Floxed

hiirillä. Oikea kaista osoitti poistamistavoitetta GRP78 bändi infektion jälkeen adenovirus ilmentävät Cre-rekombinaasia tyrmäyksellä

Grp78 Floxed /floxed

alleeleja. (C) edustaja Western blotit tehostetun sGRP78 tasolla resistenttejä syöpäsoluja. Vanhempien (P) ja Tamr johdannaisia ​​ihmisen rintasyöpäsolujen malleja MCF7L ja MCF7 /HER2-18, sekä vanhempien androgeenin herkkä LNCaP-solulinjasta ja androgeenin riippumaton C4-2B solut altistettiin biotinylaatio ja NeutrAvidin agaroosi pull supistettavissa rikastamiseksi solun pinnan proteiini. Solun pinnalla GRP78 (sGRP78) ja solunsisäiset kokonais-GRP78 (tGRP78) solulysaatissa seulottiin Western blot. Määrä yhteensä lysaattia oli 10% määrästä käytettiin avidiini avattavasta. β-aktiini toimi loading ohjaus tGRP78, kun kalvoproteiinia, EphB4 tai Na, K-ATPaasi-α1 (NKA α1) toimi lastaus valvonta solun pinnan proteiinien rinta- tai eturauhassyövän soluissa (PCa), vastaavasti. Kokeet toistettiin kahdesti. Proteiinivyöhykkeet kvantitoitiin ja suhteellisten tasojen tGRP78 että vanhempien ja resistenttejä solulinjoja normalisoitiin vastaan ​​β-aktiini, ja sGRP78 taso normalisoidaan vastaan ​​EphB4 tai NKA α1, joita yhdisteitä esitetty keskiarvo ± keskihajonta (SD) in kaaviosta. Tasot vanhempien solulinjoissa ja androgeenien herkkä solulinjassa, LNCaP asetetaan 1.

havaitsemiseksi GRP78, käytimme korkean affiniteetin monoklonaalinen vasta MAb159 suunnattu ihmisen GRP78 että tunnustettu vain GRP78 proteiini band (kuvio 1 B). Kun tyrmäys

Grp78

floxed alleelien MEF infektio adenovirus ilmentävät Cre-rekombinaasia, grp78- bändi lakkautettiin, jossa vahvistetaan, että MAb159 tunnistaa spesifisesti GRP78. Havaitsemiseksi sGRP78 solut biotinyloitiin ja solun pinnan proteiinit puhdistettiin NeutrAvidin agaroosi pull-down. Western blot-analyysi biotinyloidun proteiinien ja koko lysaatin tasot sGRP78 ja solunsisäiset kokonais-GRP78 määritettiin kustakin solulinjasta, jossa EphB4 ja NKA α1 toimii loading säätimet solun pinnan proteiinien rintasyövän ja eturauhassyövän solulinjoissa, vastaavasti. β-aktiini, sytosolin proteiiniin, toimi lastaus kontrollina kokosoluliuotteista. Edustavia Western blot analyysit havaitsemiseksi sGRP78 ja koko GRP78 näkyvät, jossa GRP78 tasot jälkeen määritysrajan ja normalisointi vastaaviin lastaus valvonta piirretään alla ja näytetään keskihajonnat (kuvio 1 C). Puuttuminen β-aktiini in proteiinien pull-down by NeutrAvidin vahvisti puute solunsisäisen proteiinin saastumisen solunpintaproteiinia jakeet. Sillä MCF7L-P-solut, jotka ilmensivät kohtuullisella pohjapinta taso GRP78, oli 3-kertainen yhteensä GRP78 mutta 7-kertainen sGRP78 että Tamr soluissa. Sillä MCF7 /HER2-18-P-solut, jotka ilmensivät suurempaa pohjapinta taso GRP78, The Tamr solut osoittivat vain vähäistä lisäystä yhteensä GRP78 mutta 4-kertainen nousu sGRP78. Androgeeni- riippumaton C4-2B solujen kokonaismäärä GRP78 kasvua androgen-herkkien LNCaP-soluissa oli vähäinen, mutta siellä oli noin 7-kertainen sGRP78. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kasvu sGRP78 vastustuskykyisten solulinjoissa ei pelkästään rinnakkain kasvu kokonaismäärän GRP78 pikemminkin resistenssin kehittyminen edistää erityisen mekanismin (t) parantaa GRP78 lokalisointi solun pintaan.

ER stressiä edelleen nostaa solun pinnan GRP78 tasolla resistenttien syöpäsolujen

Aiemmin raportoitu, että Tg, joka estää ER ATPaasi aiheuttaen Ca

2 + ulosvirtausta ER, edistää translokaatiota GRP78 alkaen ER solun pinnalla ihmisen alkion munuaisen 293T-soluissa [32]. Se, onko tämä pätee syöpäsolun linjat, jotka jo omaavat kohtalainen tai korkea GRP78 ei tiedetä. Koska syöpäsolut rutiininomaisesti alttiiksi ER stressiä kasvaimen mikroympäristössä, on tärkeää määrittää, onko syöpäsoluja, jotka ovat kehittäneet resistenssin hoidon pystyvät edelleen nostavan sGRP78 ilmentymistä vasteena ER stressiä. Testata näitä, käsittelimme resistenttien solujen erilaisilla indusoijien ER stressin ja mitataan sGRP78 FACS sekä biokemiallisia lähestymistapoja. Ensimmäisessä lähestymistavassa MCF7L-P ja Tamr solulinjoja käsiteltiin Tg. Solun pinnan GRP78 havaittiin FACS-analyysillä (kuvio 2A). Jotta MCF7L-P-solulinja, hoidon Tg johti 4,8-kertaiseen kasvuun sGRP78. Jotta MCF7L-Tamr solulinja, joka jo esiintyy 12-kertaisesti korkeampi sGRP78 verrattuna emo MCF7L-P-soluissa, Tg hoito edelleen nostaa sGRP78 ilmentymisen 20-kertaiseksi (kuvio 2A).

(A) vanhempien ja tamoksifeeni kestävä MCF7L solut olivat joko käsittelemättömiä (Ctrl) tai käsiteltiin 300 nM thapsigargin (Tg) 16 tuntia. Solun pinta GRP78 mitattiin FACS. Edustavia FACS-profiilit näkyvät ja prosenttiosuudet positiivisia soluja merkitty oikeassa yläkulmassa. Sininen katkoviiva, isotyyppikontrollilla; punainen yhtenäinen viiva, anti-GRP78 Ab. (B) Estrogeeni nälkään herkkä ihmisen rintasyöpäsolulinjaa, MCF7 /BUS, ja sen fenikoliresistenttiin klooni, MCF7 /BUS-10, olivat joko käsittelemättömiä (Ctrl) tai käsiteltiin 10 mM 2-deoksiglukoosi (2DG) 24 tuntia. Solut biotinyloitua ja solunpintaproteiinit puhdistettiin NeutrAvidin agaroosilla avattavan. sGRP78 ja tGRP78 havaittiin Western Blot. β-aktiini toimi latauskontrollina. Taitteen muutokset sGRP78 ja tGRP78 on esitetty alla ja valvonta kunnossa MCF7 /BUS soluja asetettiin 1. (C) Sama kuin (B) lukuun ottamatta C4-2B käsiteltyjä soluja Tg, Tu (tunikamysiinillä) tai 2DG. NKA α1 toimi solunpintaproteiinia latauskontrollina. Suhteelliset tasot tGRP78 ja sGRP78 normalisoidaan vastaan ​​β-aktiini tai NKA α1, vastaavasti, ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. kahdesta riippumattomasta kokeesta kaaviossa (oikealla).

Toisessa lähestymistavassa käytimme estrogeeniriippuvainen MCF-7 /BUS ja sen johdannainen MCF-7 /BUS-10 solulinja, joka on kehittynyt resistenssi estrogeenin nälkään [43]. Solut biotinyloitua ja solunpintaproteiinit alistettiin NeutrAvidin agaroosihelmiin pull-down. Tasot sGRP78 ja solunsisäiset kokonais-GRP78 määritettiin Western Blot (kuvio 2B). Suostumuksella MCF7L ja MCF7 /HER2-18 solulinjat, resistenssin kehittyminen MCF-7 /BUS-10 malli lisäsi huomattavasti määrää sGRP78 (9-kertainen), kun taas solunsisäiset kokonais määrä oli kohtalaisesti lisääntynyt (by 1,3-kertainen). Sekä vanhempien ja kestävät solulinjat, solujen käsittely 2DG, indusoija ER stressin eston kautta Glykolyysivaiheen ja glykosylaation, edelleen kohonnut sGRP78 ilmentyminen noin 5,2-kertaiseksi emolinjan ja 3,5-kertaisesti resistentti linjan (kuva 2B).

seuraavalle tutki tasolle sGRP78 ja koko GRP78 androgeenistä riippumattoman eturauhassyövän solulinjaa C4-2B kanssa tai ilman ER stressiä (kuvio 2C). Näissä tutkimuksissa on lisäksi Tg ja 2DG hoito, lisäsimme toinen ER stressin indusoija, tunikamysiini (Tu), joka luo ER stressiä estämällä N-sidottu proteiini glykosylaation, mikä aiheuttaa kertyminen underglycosylated proteiinien ER. Vuonna Western blot-analyysi, β-aktiini ja NKA α1 toimi lastaus säätimet koko ja solun pinnan proteiineihin. Kuten asianlaita rintasyövän soluja, ER stressin aiheuttama maltillista koko GRP78 (noin 2-kertaisesti) kuin nämä solut jo ilmaissut korkea pohjapinta taso GRP78 verrattuna niiden herkkä vanhempien soluja. Kaikissa kolmessa ER stressin olosuhteissa, sGRP78 taso nousi 5- 6-kertainen, verrattuna ei-korosti soluissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että erilaiset ER stressi ärsykkeiden kykenevät aktiivisesti edistää sGRP78 ilmentymistä sekä huumeiden herkkiä tai resistenttejä syöpäsoluja, ja että kehitys terapeuttisten resistenssin yhdistelmänä ER stressiä lisää entisestään sGRP78 ilme.

Solun pinnalla GRP78 muodostaa kompleksin PI3K

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että häiriön sGRP78 muuttaa PI3K /AKT-reitin, kuitenkin, miten se saavutetaan ei ole hyvin ymmärretty [14], [16]. Tilanteen korjaamiseksi, päätimme onko sGRP78 yhteistyössä paikallistaa PI3K solun pinnalla. C4-2B, korkea endogeeninen sGRP78 ja suhteellinen helppous kulttuurin, esittelee sopiva solumallin järjestelmään. Maksimoida sGRP78 ilmaisu, soluja käsiteltiin Tg. Ei-läpäiseviksi solut, vasta-aineen värjäys ensisijaisesti tunnistaa GRP78 solun pinnalla, sen sijaan, että erittäin runsaasti solunsisäisiä GRP78, joka lokalisoituu aikuinen on perinuclear ER alueella. Seuraavat 8 h Tg hoidon, endogeeninen sGRP78, kuten visualisoitiin immunofluoresenssivärjäyksen kanssa MAb159 monoklonaalinen vasta-aine, havaittiin hajallaan solun pinnalla C4-2B soluja (kuvio 3A). Havaitsemiseksi PI3K-säätelyalayksikkö p85, joka on solunsisäinen, The MAb159 immunovärjättiin solut läpäiseviksi seurasi värjäys vastaisella vasta-aineella p85. Kuten esitetään edustavat kuvat, kolokalisaation endogeenisen sGRP78 ja p85 useita sivustoja havaittiin alafraktioksi on sGRP78 ja p85 (kuvio 3A, nuolet).

(A) Konfokaalimikroskopia havaitseminen kolokalisaation endogeeninen sGRP78 kanssa p85 in C4-2B soluissa käsitelty Tg 8 tuntia. Non-Permeabilisoidut solut värjätään ensin anti-GRP78 vasta-aine (MAb159) havaitsemiseksi sGRP78 (

vihreä

) (vasemmalla). Sitten solut läpäiseviksi ja värjättiin sitten anti-p85-vasta-ainetta (

punainen

). (B) Co-paikallistaminen solun pinnalla F-GRP78 kanssa p85 HeLa-soluissa. Ei-läpäiseviksi HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu F-GRP78 ekspressiovektori ensin värjättiin anti-FLAG-vasta-aineen havaitsemiseksi pinta F-GRP78 (

vihreä

) (vasen), sitten permeabilisoitiin ja värjättiin anti-p85-vasta-ainetta (

punainen

). Molemmissa (A) ja (B), tumat värjättiin DAPI (

sininen

) ja boxed alueet (valkoinen neliö) pakatun Z-pinon kuvia (vasemmanpuoleiset paneelit) laajennettiin ja näkyvät oikea paneelit yhdellä confocal jaksossa lentokoneita (paksuus 0,38 gm) kantavassa yhdistettiin kuvat osoittivat yhteistyössä lokalisointi (

keltainen

) solun pinnan GRP78 ja p85 havaita useita vastaaviin kohtiin (

valkoisilla nuolilla

) . Mittaviivat edustaa 2 um. (C) järjestelmä havaitsemiseksi vuorovaikutusta solupinnan F-GRP78 ja p85. Biotinyloitu solun pinnan proteiinit puhdistettiin monomeerinen avidiini sarakkeen, jonka jälkeen immunosaostuksella (IP) ja Western blot. (D) 293T-solut transfektoitiin F-GRP78-ekspressiovektoriin. Solun pinnan proteiinit eluoidaan monomeerinen avidiini pylvääseen (panos), kuten on kuvattu (C) suoritettiin immunosaostus (IP) joko anti-FLAG-vasta-ainetta tai isotyypin IgG, joka toimii negatiivisena kontrollina. F-GRP78, p85 ja p110α tasot Immunopresipitoidun monimutkainen mitattiin Western blot anti-FLAG, anti-p85 ja anti-p110α aineita.

jatkaa näitä havaintoja, me transfektoituja HeLa-soluja kanssa ekspressiovektori FLAG-GRP78 (F-GRP78). Käyttö GRP78 merkitty FLAG-epitoopin sallittu käyttö erittäin spesifisiä anti-FLAG-vasta-aineen havaitsemiseksi solun pinnalla GRP78 ilmentymistä ei-läpäiseviksi soluissa. HeLa-soluja käytettiin, koska ne noudattavat voimakkaammin mikroskooppisen dioja, joka on kriittinen useissa vaiheissa kokeellisten manipulointi transfektoitujen solujen. Tulokset osoittavat runsaasti kolokalisaation solun pinnan F-GRP78 kanssa p85 (kuvio 3B).

Seuraavaksi, sen määrittämiseksi, biokemiallisesti, onko sGRP78 muodostettu kompleksi PI3K, 293T-solut transfektoitiin F-GRP78. 293T-soluja käytettiin, koska niiden korkea transfektiotehokkuuden. Käyttö F-GRP78 pystyimme immunopresipitoivan GRP78 suurella spesifisyydellä ja affiniteetti. Kokeellinen suunnittelu on esitetty kuvassa 3C. Transfektion jälkeen solut biotinyloitiin ja solulysaateista inkuboitiin monomeerisen avidiinin agaroosihelmiä, jotka sallivat eristyksen biotinyloidun solun pinnan proteiinien lievän eluoinnin edellytys sen heikon affiniteetti biotinyloidun proteiinin. Eluoitu solun pinnan proteiinit immunosaostettiin anti-FLAG-vasta-ainetta tai isotyypin IgG-ohjaus. Immunopresipitaatit alistettiin sitten Western blot ja tutkittiin vasta-aineiden p85 ja p110α, samoin kuin anti-FLAG-vasta-ainetta. Havaitsimme, että solun pinnan F-GRP78 muodostettu kompleksi sekä sääntely (p85) ja katalyyttinen (p110α) alayksiköiden PI3K, toisin kuin IgG-ohjain, joka ei osoittanut sitoutumista (kuvio 3D). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että sGRP78 suoraan tai epäsuorasti vuorovaikutuksessa p85 ja p110α.

Solun pinta GRP78 yliekspressio stimuloi PI (3,4,5) P3 tuotanto ja kolokalisaation

kompleksinmuodostuskyky välillä sGRP78 ja PI3K viittaa siihen, että se voi johtaa modulaatiota PI3K. Aktivoinnin PI3K paikantuu solun pintaan ja fosforyloi PI (4,5) P2 johtaa PI (3,4,5) P3 (jäljempänä PIP3) tuotantoa.