Krooninen sairaus

tiivistelmä

bioaktiivisia peptidejä, joko luonnosta peräisin varoista tai syntetisoida järkevä suunnittelu, on osoitettu altistavan terapeuttisia aineita vastaan ​​lukuisia ihmisen sairauksien, kuten syövän. Kuitenkin mekanismi terapeuttisten peptidien syöpää vastaan ​​ei ole hyvin selvitetty. Tässä osoitamme, että PGPIPN, heksapeptidin peräisin naudan β-kaseiini, inhiboivat ihmisen munasarjasyöpäsoluja kohdista jokin SKOV

3 sekä ensisijainen munasarjasyöpäsoluja

in vitro

. Johdonmukaisesti, PGPIPIN laski myös kasvaimen kasvu vierassiirrekokeissa munasarjasyövän mallissa hiirille annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi tutkimus osoitti, että kasvaimen vastainen vaikutus PGPIPN on osittain edistämällä solujen apoptoosia estämällä BCL2 kautta. Siten meidän tutkimus osoittaa, että PGPIPN on potentiaalinen terapeuttinen aine hoitoa varten munasarjasyöpä tai muiden syöpien.

Citation: Wang W, Gu F, Wei C, Tang Y, Zheng X, Ren M, et ai. (2013) PGPIPN, joka on terapeuttinen Hexapeptide, Tukahdetut Human munasarjasyöpä Kasvua Targeting BCL2. PLoS ONE 8 (4): e60701. doi: 10,1371 /journal.pone.0060701

Editor: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 marraskuu 2012; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2013; Julkaistu: 08 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (30872992) ja maakunnassa Natural Science Foundation of Anhui (03043802). 300000 RMB myönnettiin tätä tutkimusta varten National Natural Science Foundation of China, URL, joka on https://www.nsfc.gov.cn. Maakunta Natural Science Foundation of Anhui rahoitetaan 100000 RMB tutkimukseen. Rahoittajat oli rooli tutkimuksen suunnittelu, kokeet, tietojen keruu ja analysointi, valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on tappavin gynekologinen maligniteetti. Munasarjojen syöpä on kolmas gynecologic syövän jälkeen rinta- ja kohdunkaulan syöpä naisilla, mutta on kaikkein kuolonuhrien sisään gynekologiset syöpään. Tavanomainen hoitokuurin munasarjasyövän sisältää kirurgisen debulking kasvaimen massan seuraa adjuvanttihoitoa. Vaikka paljon edistystä on saavutettu kehittämisessä syöpähoitojen viime vuosina, yhä esiintyy ongelmia erityisesti suhteessa kemoterapian vuoksi sivuvaikutuksia, vastustuskyvyn ja alhainen spesifisyys olevia lääkkeitä [1]. Siksi on tarpeen kehittää turvallisia ja tehokkaita syöpälääkkeitä [2].

Peptide terapeuttiset on lupaava ala kehittyvillä syöpälääkkeet, lähinnä, että nämä peptidit voivat helposti saada joko luonnosta resursseja tai järkevä suunnittelu perustuu kohdeproteiinin rakennetta. Itse asiassa useat tutkimukset ovat osoittaneet, että useita bioaktiivisia peptidejä inhiboi kasvainsolujen kasvua kokeellisissa polkuja [3] – [5]. Erityisesti nämä terapeuttiset peptidit ovat yleensä vähän tai ei lainkaan toksisuutta [2]. Esimerkiksi syöpälääkkeiden bioaktiivinen peptidi (ACBP) uutettu vuohen pernat dramaattisesti inhiboivat ihmisen mahalaukun kasvaimen kasvua ksenograftimallia joilla ei ole selvää sytotoksisuutta isännöidä [3]. Myöhemmät tutkimukset ehdotti, että syöpää ehkäisevistä vaikutuksista joidenkin bioaktiivisten peptidien voisi johtua kykyjensä induktion apoptoosin ja solukierron pysähtymisen [3], [6] – [7]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat paljastaneet joitakin peptidit voivat heikentää tiettyä signalointireitin ja myöhemmin esti kasvaimen kasvua tai etäpesäke. Kuten peptidi SAH-BCL9 (stabiloitu alfaheliksi- B-solulymfooma 9) kohdistaminen beeta-kateniinin inhiboitu onkogeenistä Wnt toimintaa, tukahdutti kasvua ja etäpesäkkeiden paksusuolisyövän ja multippelimyelooma ksenografti, ja edistänyt kasvainsolujen apoptoosin [8] . Hiilivety-nitoa peptidi SAHM1 esti kokoonpano aktiivisen transkription monimutkainen Notch, ja näin ollen esti solujen lisääntymistä

in vitro

ja tuumorigeneesiä hiirimallissa Notch1-ajettu T-solujen akuuttia leukemiaa ja lymfoomaa [9].

lisäksi ensisijaisen ravintoarvot, maitoproteiineja ovat tärkeitä biologisesti aktiivisia peptidejä [10] – [11]. Maidon proteiinit ovat esiasteita monia biologisesti aktiivisia peptidejä, jotka ovat inaktiivisia prekursoriproteiinien, mutta voidaan vapauttaa ja aktivoida entsymaattisella proteolyysillä [12]. Jotkut johdettuja peptidejä maitoproteiinia ovat hyviä ehdokkaita kliinisen syöpälääkkeiden tai adjuvantti koska ne imeytyvät vähemmän mahdollinen toksisuus. Lisäksi täällä kasvaa tutkimukset osoittavat, että bioaktiiviset maito peptidejä voi imeytyä ehjänä suolistossa verenkiertoon – nämä voivat siten toimia uusia farmaseuttisia aineita, jotka eivät aiheuta merkittäviä sivuvaikutuksia terveillä ihmisen [13]. Itse asiassa tutkiminen syövän vaikutukset bioaktiivisten peptidien maitoproteiinia nousee yhdeksi kuumimmista alueiden äskettäin. Esimerkiksi talactoferrin (TLF), rekombinantti ihmisen laktoferriinin (LF), on uusi kehittynyt syöpälääke, joka on tullut faasin III kliinisissä kokeissa [14] – [15].

PGPIPN (Pro-Gly-Pro- -lle-Pro-Asn, tähteet 63-68 beta-kaseiini), immunomodulatorisen peptidi, oli löydetty aktiivisen peptidin naudan maitoproteiinia [16] – [18]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä peptidi on tärkeä rooli immuunipuolustuksen vasteen. Esimerkiksi peptidi fagosytoiva toimintaa makrofagien

in vitro

vastaan ​​lampaan punasoluja (SRBCrtä) ja suojasi hiiriä vastaan ​​infektiota Klebsiella pneumoniae

in vivo

. Viime vuosina laboratoriossamme omistettu tutkia fysiologiset tehtävät PGPIPN. Verrattuna muihin immunomoduloivissa peptidien PGPIPN kestää paremmin halventava-entsyymijärjestelmän koska sen rikasta proliinipitoisuus [19]. Lisäksi haaraketjuaminohapot (BCAA) tämän peptidin auttaa jossain määrin vastustaa mikro-organismeja. Aiemmat tutkimukset ehdotti, että PGPIPN merkittävästi edistänyt vatsakalvon makrofagien fagosytoosin ja punasolujen immuniteetin rotilla. Se voi myös stimuloida lymfosyyttien sekä rotilla ja hiirillä [20] – [21]. Lisäksi meidän myöhempi tutkimus osoitti, että tämä peptidi on hyvä antioksidantti vaikutus

in vivo

[22].

Tässä osoitamme, että heksapepti- PGPIPN voidaan tehokkaasti estää munasarjasyövän solujen lisääntymistä, aiheuttaa syöpäsolujen apoptoosin ja pienentää kasvaimen kasvua vierassiirrekokeissa munasarjasyövän mallissa. Havainnot esillä olevassa tutkimuksessa antavat proof of concept käyttää PGPIPN potentiaalisena terapeuttisena aineena munasarjasyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

PGPIPN (puhtaus varmistettiin RP-HPLC: llä olevan 99,5%) saatiin Shanghai Sangon Biological Engineering. Tunel kit ostettiin Roche. Gene Eluoidaan Nisäkkäiden Perimän DNA Miniprep Kit ostettiin Sigma. Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita BCL2, Bax, ja β-aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Soluviljelmät

Ihmisen munasarjasyövän solulinjaa SKOV

3 ja ihmisen normaali maksan solujen line LO2 alun perin hankittiin ATCC. Hiiren alkion fibroblastisoluja (MEF) alunperin Harvard Medical School Yhdysvalloissa,

p

53 geeniä, joka oli tyrmätty, esitteli professori Hongbing Zhang Kiina Academy of Medical Sciences Peking unionin Medical College, Kiina. Nämä solulinjat viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää, 5% CO

2 37 ° C: ssa. Ensisijaiset munasarjojen soluista kulttuuri, tuore primääri munasarjojen kasvain kudos, joka arvioitiin ja luokiteltu vakavien munasarjan adenokarsinooma (I-II luokan) mukaan WHO: n kriteerien, saatiin 5 munasarjasyöpäpotilaalle alkuperäisen debulking leikkauksen ensimmäisen Affiliated sairaala Anhui Medical University. Kaikki potilaat allekirjoittama suostumukset dokumentointia lahjoitus niiden kudoksen tutkimusta tarkoitukseen mukaan Helsingin julistuksen ennen kudoksen laskeuman. Tutkimus hyväksyi Anhui Medical University Review Board. Kasvaimen kudokset leikattiin pieniksi paloiksi noin 1,0 mm

3, ja huuhdeltiin PBS: lla kaksi kertaa ja pilkottiin 0,25% trypsiiniä steriilissä sentrifugiputkessa 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Saadakseen yhden suspension solut, edellä pilkottu kudokset suodatettiin 100 um solun siivilä. Sen jälkeen sentrifugoitiin 1000 rpm: llä viiden minuutin ajan, solupelletti suspendoitiin uudelleen DMEM täydentävä 10% ihmisen seerumia. Kun solut kasvoivat 70-80% konfluentteja, elatusaine pulloon valutettiin; solut hajotettiin 0,25% kollagenaasi II. Kun noin 1/3 solujen putoamisen tarkkailemalla mikroskoopilla, digestio välittömästi pysäyttää ja kasvualustaan ​​pulloon tyhjennettiin jälleen. Koska niiden irtoaminen ensimmäinen, useimmat fibroblasteja eliminoitu Kollagenaasikäsittelyn. THE säilyi Soluja viljeltiin alati soluproleferaatiomäärityksessä. Se osa näistä soluista tehtiin solun dia ja tunnistaa käyttämällä immunofluoresenssilla sytokeratiinin 7 määritystä niiden puhtauden.

proliferaatiomääritystä

SKOV

3-solut ympättiin 96- kuoppaisilla levyillä octuplicate lähtölämpötilan tiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa. Sen jälkeen yön yli kasvatettua viljelmää, PGPIPN lisättiin loppukonsentraatiot 0 (kontrollina), 3 x 10

-8, 3 x 10

-7, 3 x 10

-6, 3 x 10

-5, 3 x 10

-4, 3 x 10

-3 ja 3 x 10

-2 g /l. 5-fluorourasiili (5-FU), 3 x 10

-3 g /l, lisättiin samalla levyllä positiivisena kontrollina. Leviämisen solujen mitattiin eri ajankohtana, jonka MTT-menetelmällä, kuten on kuvattu [23]. Seuraavan kaavan avulla laskettiin solujen kasvun inhibition suhteen (IR): IR (%) = (1 – kokeellinen ryhmä A

490 nm-arvo /ohjaus ryhmä A

490 nm-arvo) x 100%. Kukin koe kolmena rinnakkaismäärityksenä itsenäisesti.

Käyttäen samaa menetelmää, kasvun inhibition PGPIPN ensisijaisesta munasarjasyöpäsoluja tutkittiin myös, lukuun ottamatta lopulliset pitoisuudet PGPIPN 0 (kontrollina), 3 x 10

-6, 3 x 10

-5, 3 x 10

-4, 3 x 10

-3 ja 3 x 10

-2 g /l. Kokeet monistaa ensisijainen munasarjasyöpäsoluja viideltä potilaalta, vastaavasti.

havaitsemiseksi myrkyllisyyttä PGPIPN kasvu estoja PGPIPN on transformoimattoman solulinjoissa LO2 ja MEF-soluihin analysoitiin samalla menettelyllä kuin SKOV

3-soluissa, paitsi lopulliset pitoisuudet PGPIPN 0 (verrokkina), 3 x 10

-4, 3 x 10

-3, 3 x 10

-2, 3 × 10

-1 ja 3 g /l. Kukin koe kolmena rinnakkaismäärityksenä itsenäisesti.

morfologinen havainnointi käsiteltyjen solujen PGPIPN

dynaaminen morfologiset muutokset SKOV

3: lla käsiteltyjen solujen PGPIPN havaittiin optisella mikroskoopilla. Suojalasi indeksoinnin solun oli valmis. Suojalasi lähes täynnä solun pinnallaan otettiin H A = suurin halkaisija kasvaimen; b = eniten polkuja kasvain. Neljännessä viikonloppuna istutuksen jälkeen kaikki nude hiiret lopetettiin, ja ksenograftikasvaimissa punnittiin. Ksenograftikasvaimissa jäädytettiin nestetyppeen myöhemmissä kokeissa.

TUNEL (TdT välittämää dUTP Nick-End Labeling) Pitoisuus

kasvain näytteet kiinnitettiin ja upotettu parafiiniin. TUNEL-määritys suoritettiin, kuten valmistajan käsikirjan (ROCHE). Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Apoptoottisia soluja kvantitoitiin valomikroskoopilla on hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjätään kohdat keskiarvoistamalla solujen määrä, joilla on tasaisen tiheä kromatiinin tai karyorektisen ydin- fragmentit valokuvissa viisi satunnaisesti valittua × 40 kentät. Tapaukset arvioitiin kaksi riippumatonta tarkastajaa. Apoptoosi-indeksi (AI) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: AI = (lukumäärä apoptoottista solua /kokonaismäärä solujen) x 100%.

Fragmentation määritys DNA agaroosigeelielektroforeesilla

DNA fragmentit kasvainkudoksessa analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla, menetelmän mukaisesti Sambrook Russell (2001) [27]. DNA kasvainkudoksessa uutettiin käyttäen Gene Eluoidaan Mammalian Genominen DNA Miniprep Kit (Sigma), ja suoritettiin elektroforeesi 1,5% agaroosigeelissä (sisälsi 0,25 ug /ml etidiumbromidia). Elektroforeettisen vyöhykkeet visualisoitiin ja valokuvattiin lähetetyn UV-valossa.

Western blot -analyysi BCL2 ja Bax proteiinit kasvainkudoksessa

proteiinit eristettiin xengrafted tuumorinäytteet ja erotettiin SDS -sivulta käyttäen vakioyhteyskäytäntöä. Sen jälkeen blokattiin 5% (w /v) kuivassa rasvaton maito, membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (hiiren monoklonaalinen Bax, BCL2 ja β-aktiini-vasta-aineita, 1:1000 laimennus) mukaisesti valmistajan ohjeiden (Santa Cruz Biotechnology), ja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vuohen anti-hiiri-IgG, 1:8000 laimennus). Proteiinit detektoitiin tehostetun kemiluminesenssin (ECL) järjestelmä (Pierce, Rockford, IL), jota seurasi altistus röntgenfilmille. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Digitaaliset kuvat otettiin vangiksi Gel Doc ™ geeli asiakirjajärjestelmä (Bio-Rad, USA) ja intensiteetit kvantitoitiin käyttämällä Määrä-One ohjelmistoversio 4,62 (Bio-Rad, USA).

Tilastollinen analyysi

Kaikki mitatut tiedot esitettiin keskiarvona ±

SD

. Erot ryhmien analysoitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA, jonka SPSS12.0 tilasto-ohjelmalla. Tilastollinen merkittävyys määritettiin

P

0,05.

Tulokset

PGPIPN indusoi Cell Proliferation esto ja apoptoosi SKOV

3 munasarjasyöpäsoluja

vuonna vitro

PGPIPN on osoitettu olevan tärkeä rooli immunomodulaarisia terapiassa ja muut vaikutukset monissa tutkimuksia [19] – [22], [28] – [29]. Tämä juonittelusta meitä tutkimaan, onko PGPIPN voidaan käyttää syöpälääke. Tätä varten olemme ensin tutkineet vaikutusta PGPIPN proliferaatioon SKOV

3-soluissa. Yllätykseksemme PGPIPN voidaan tehokkaasti estää SKOV

3-solujen kasvua jopa pieni annos 3 × 10

8 g ​​/l (kuvio 1A). Tämä inhibitio kapasiteetti PGPIPN verrattiin 5-FU hoitoon, kun solut altistettiin korkea pitoisuus 3 x 10

3 g /l. Estyminen vaikutus PGPIPN osoitti myös ajasta ja annoksesta riippuvaa kartanon. Lisäksi kontrolliin verrattuna, PGPIPN hoito johti ilmeisiä morfologisia muutoksia SKOV

3-soluissa, kuten solun kutistuu, karyopyknosis, ja ulkonäkö sytoplasmisen ontelot joissakin soluissa (päivämäärä ei esitetty). Siellä osoitti myös syvästi värjäytyneet ydin- osassa ja suuri määrä soluliman elinten tai pieniä paloja on PGPIPN käsiteltyjä soluja, jotka ovat tyypillisiä ominaisuuksia apoptoottisen soluja (tuloksia ei ole esitetty). Validoida Tämän havainnon olemme suorittaneet apoptoosimäärityksessä anneksiini V-TITC ja PI kaksinkertainen värjäys menetelmällä. PFPIPN hoito selvästi aiheuttama SKOV

3-soluissa tehtiin apoptoosia 48 h lääkealtistuksen eri pitoisuuksilla (kuvio 1 B).

(A) PGPIPN eri pitoisuuksina estää leviämisen SKOV

3-soluissa, mitattuna eri ajankohtina. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ±

SD

kolmen itsenäisen kokeen, *

P

0,05, **

P

0,01 verrattuna ohjaus (vehikkeliryhmässä). (B) Virtaussytometrianalyysi osoittaa, että PGPIPN indusoi SKOV

3-solujen apoptoosin kuluttua 48 h lääkealtistuksen. Tämä mittaus on biologisesti kolmena rinnakkaismäärityksenä.

PGPIPN voidaan tehokkaasti estää ihmisen Ensisijainen munasarjasyöpä Cell Growth

in vitro

Seuraavaksi edelleen testata, onko PGPIPN voi myös estää ihmisen ensisijainen syöpäsoluja kasvua. Olemme onnistuneesti eristettävä ja perustettu 5 ensisijainen syöpäsolujen 5 munasarjasyöpäpotilaalle alkuperäisen debulking leikkauksen ensimmäisen sidoksissa sairaalassa Anhuin lääketieteellinen yliopisto. Nämä ensisijainen soluja kulttuuri laboratoriossamme. Nämä solun morfologisesti esitetään tyypillinen epiteelin soluja (kuvio 2A vasen ja keskimmäinen paneeli). Nämä ensisijainen munasarjasyöpäsoluja tunnistettiin edelleen immunosolukemiallisella määrityksessä anti-sytokeratiini 7 värjäytymistä (kuvio 2A oikea paneeli). Keskimääräinen puhtaus munasarjakarsinoomasolut oli noin 85% perustuen sytokeratiini 7 värjäystä. Tutkia PGPIPN voi vähentää kasvua ensisijainen munasarjasyöpäsoluja, me ympättiin nämä solut 96-kuoppalevyille. Kun yli yön kasvua näitä soluja käsiteltiin PGPIPN eri pitoisuuksilla 24, 48 ja 72 tuntia. Kuten kuvassa 2B on esitetty, käsittelemällä eri pitoisuuksia PGPIPN johti merkittävään inhibitioon munasarjasyövän solujen lisääntymistä, ja eston vaikutuksen osoitti ajasta ja annoksesta riippuvaa kartano. Kaikki nämä osoittavat, että ensisijainen munasarjasyöpä solut ovat myös herkkiä PGPIPN hoitoon.

(A) edustavat morfologia munasarja- soluja potilaan kasvaa ensisijainen elatusaineessa (x 100, vasen paneeli), H 0,05, **

P

0,01 verrattuna ohjaus (vehikkeliryhmässä).

PGPIPN oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta Transformoimattomilla Cell Growth

in vitro

cytotoxicities of PGPIPN kohti transformoimattoman solulinjat tutkittiin . MTT-analyysi suoritettiin määrittämään vaikutuksia PGPIPN on planktonin kasvu ihmisen normaalia maksan solulinjasta LO2 ja hiiren alkion fibroblastisoluja (MEF). Peptidi havaittiin ei ole vaikutusta proliferaatioon LO2 soluja (kuvio 3A). Leviämisen MEF-solut oli hieman vaikuttanut PGPIPN, joka inhiboitui merkittävästi vain suuria annoksia (0,3 g /L) peptidin 72 tuntia, mutta vaikutus oli paljon pienempi verrattuna positiivisen kontrolliryhmän (5-FU ryhmässä) ( kuvio 3B). Näin ollen, PGPIPN esillä vähän tai ei lainkaan sytotoksisuutta kohti transformoimattoman solujen, verrattuna perinteiseen syöpälääkkeiden (5-FU).

(A) PGPIPN ei ollut vaikutusta proliferaatioon LO2 soluja. (B) PGPIPN vaikuttavat hieman leviämisen MEF, joka inhiboitui merkittävästi vain suuria annoksia (0,3 g /L) peptidin 72 tuntia. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ±

SD

kolmesta itsenäisestä kokeesta, *

P

0,05, **

P

0,01 verrattuna ohjaus (vehikkeliryhmässä) .

PGPIPN merkittävästi vähentynyt ksenosiirrettyjä tuumorikasvun

in vivo

Voit selvittää, onko PGPIPN on antituumorivaikutuksen

in vivo

, me Siirto tehty SKOV

3 soluja ihon alle nude-hiiriin. Kaksikymmentä neljä hiirtä jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: NS (normaali suolaliuos), pienen annoksen PGPIPN, suuren annoksen PGPIPN ja 5-FU (positiivisena kontrollina) ryhmät, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. PGPIPN intraperitoneaalisesti joka toinen päivä alkaen toisena päivänä siirrostuksen jälkeen tuumorisolujen. Suolaliuosta ja toimi negatiivisena kontrollina, ja 5-fluorourasiilin käytettiin positiivisena kontrollina. Näitä hiiriä käsiteltiin 4 viikkoa. Neljännessä viikonloppuna, kasvaimet poistettiin ja mitattiin. Molemmat annokset PGPIPN voi merkittävästi estää kasvaimen kasvua verrattuna NS ryhmään (kuvio 4A). Kasvaimia NS ryhmä kasvoi keskimäärin tilavuuteen (1370,25 ± 303,12) mm

3. Sen sijaan kasvaimia PGPIPN pienen annoksen ryhmä, PGPIPN korkean annoksen ryhmässä ja 5-FU ryhmä kasvoi keskimäärin tilavuuteen (845,43 ± 205,09) mm

3, (346,78 ± 97,16) mm

3 ja (705,82 ± 124,47) mm

3, (kuvio 4A). Verrattuna NS ryhmä, estoprosentit in PGPIPN pienen annoksen ryhmä, PGPIPN korkean annoksen ryhmässä ja 5-FU ryhmässä oli 36,92%, 68,46% ja 41,54% vastaavasti. Johdonmukaisesti, kasvain koot (kuva 4B) tai painot (kuvio 4C) on huomattavan laski kaikissa lääkkeet hoitoryhmissä verrattuna kontrolliryhmään. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että PGPIPN voidaan tehokkaasti estää ksenosiirrettyjä kasvaimen kasvua

in vivo

, joka on verrattuna perinteisiin anti-munasarja lääkettä, 5-fluorourasiilin kanssa.

PGPIPN estettiin merkittävästi kasvaimen kasvua sen jälkeen, kun 4 -weeks hoitoa (A) ja vähensi kasvaimen kokoa (B) ja kasvaimen paino (C) lopussa hoidon. Tiedot esitetään keskiarvona ±

SD

6 hiiren, *

P

0,05, **

P

0,01 verrattuna NS ryhmään.

Tumor Growth Inhibition indusoima PGPIPN liittyy solukuoleman

in vivo

Virtaussytometrianalyysi osoitti, että PGPIPN aiheuttama SKOV

3-soluissa tehtiin apoptoosin

vuonna vitro

(kuvio 1 B). Testata onko PGPIPN voi myös aiheuttaa solujen apoptoosin kasvaimen hoidossa

in vivo

teimme TUNEL määritys kasvaimen näytteistä uutetaan Siirto tehty nude-hiirissä. Määrä TUNEL-positiivisten solujen Tuumorinäytteissä erotettu PGPIPN hoitoryhmässä oli merkittävästi lisääntynyt (kuvio 5 A ja B). Vuonna sopusoinnussa tämän havainnon, DNA-fragmentti määritys osoitti myös merkittävä DNA huononemisen PGPIPN saaneilla kasvaimia näytteitä, osoittaa suuri osuus apoptoottisten solujen näistä näytteistä (kuvio 5 C). Sen sijaan, NS kasvaimen näytteet eivät näytä tätä tyypillistä DNA tikkaat kuvio elektroforeesissa (kuva 5 C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PGPIPN inhiboi kasvaimen kasvua induktion kautta kasvainsolujen apoptoosin.

(A) TUNEL-määritys osoittaa apoptoottisten kasvainsolujen PGPIPN-käsiteltyjen näytteiden uutetaan ksenograftin hiirillä (x 400). (B) apoptoottinen indeksi laskettiin seuraavalla kaavalla: AI = (lukumäärä apoptoottista solua /kokonaismäärä solujen) x 100% (keskiarvo ±

SD

, n = 6), **

P

0,01. (C) DNA-fragmentti, määritys osoittaa, että PGPIPN aiheuttama kasvain DNA hajoaminen suuren annoksen PGPIPN ryhmässä (korkea) ja matalan annoksen PGPIPN ryhmä (matala), mutta ei normaalissa suolaliuoksessa ryhmässä (NS). (D) Protein tasot BCL2 ja Bax tutkittiin western blot Tuumorinäytteissä uutettu ksenosiirrettyjä hiiristä (yläpaneeli). Bändi voimakkuudet mitattiin Imaging J ohjelmisto ja tiivistää (alapaneeli). Tiedot ovat peräisin 6 kasvaimia kunkin ryhmän, *

P

0,05, **

P

0,01 verrattuna NS ryhmään.

Edelleen vahvistavat, että apoptoosin induktio on mukana tuumorin kasvun jälkeen PGPIPN hoidon, kaksi apoptoosiin liittyvien geenien,

BCL2

ja

bax

, arvioitiin kautta western blotting -analyysi. Immunoblottaustesti kanssa BCL2 ja Bax vasta-aineilla osoittivat, että BCL2 proteiinipitoisuuden vähensi merkittävästi PGPIPN hoidetuissa ryhmissä (

P

0,05 tai

P

0,01) verrattuna kontrolliryhmään (Kuva 5D). Sen sijaan ilmaisuja Bax oli dramaattisesti säädellään ylöspäin PGPIPN saaneissa ryhmissä, verrattuna kontrolliin (kuvio 5D). Nämä tiedot osoittavat selvästi, että PGPIPN esti kasvaimen kasvua ainakin osittain läpi asiakkuutta apoptoosia.

Keskustelu

Monet bioaktiivisia peptidejä, jotka ovat peräisin maitoproteiinia ovat passiivisia emopankkiensa maitoproteiineja, ja siitä vapautuu ruuansulatuksen tai elintarvikkeiden jalostus, ne voivat toimia sääntelyn yhdisteitä biologiseen toimintaan. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensimmäinen osoittaa, että PGPIPN voi täysin estää ihmisen munasarjasyövän solujen sekä ksenografti hiirimallissa sekä ensisijainen syöpäsoluja ei-spesifisiä toksisia vaikutuksia, mikä viittaa siihen, PGPIPN voi olla uusi syöpälääke ja olisi harkitaan edelleen prekliinisissä oikeudenkäyntiä muissa syöpätyyppeihin.

terapeuttiset peptidit voivat erilaisten mekanismien kautta suoritettava syöpää ehkäisevistä vaikutuksista riippuu niiden ominaisuuksista. Jotkut peptidit vuorovaikuttavat hyvin nimenomaan sykliinejä ja /tai sykliiniriippuvaisten kinaasien tai jäsenten kanssa apoptoottisten laskeutuu [30] – [31]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että peptidit voivat heikentää tiettyjä signalointireittejä ja sen jälkeen esti kasvaimen kasvua tai etäpesäkkeiden [8] – [9], [32]. Meidän tutkimuksen antiovarian syöpä PGPIPN oli pääasiassa apoptoosin välittämän down-regulation of BCL2 (kuvio 5). Vuonna sopusoinnussa tämän havainnon, löysimme myös monia morfologisia muutoksia, jotka liittyvät solun apoptoosin, kuten solun piikkejä, pinta rakkuloita, blebs ja solujen pyöristys ja ydin- hajoamisen (päivämäärä ei esitetty).

Kuinka PGPIPN alaspäin säännelty BCL2 ilmaisu on vielä määrittelemättä. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että kaksi peptidiä, jotka on johdettu ihmisen β-kaseiini (GLF ja VEPIPY), voi sitoutua solukalvon [33] – [34]. Viimeaikaiset joitakin tutkimuksia osoitti, että bioaktiivisia peptidejä, jotka ovat peräisin naudan maidosta proteiinit, jotka kykenevät sitoutumaan ja vaikuttavat solujen [13], [35] – [38]. Esimerkiksi, Kreider RB et ai. [13] on raportoitu, että uusi maidon peptidin seos inhiboi tyrosiinikinaasiaktiivisuutta epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), verisuonen endoteelin kasvutekijän reseptori 2 (VEGFR2), ja insuliinin reseptorin (IR), vastaavasti. Tämä multi-estäjä aiheutti apoptoosin HT-29 koolonsyöpäsoluihin

in vitro

, kun taas maidon peptidien seos turvallisia kuluttaa suun kautta terveille vapaaehtoisille, eikä kliinisesti merkittäviä haittavaikutuksia on raportoitu [13]. Fiedorowicz E, et ai. raportoitiin bioaktiiviset peptidit Kasomorfiinipeptidit-7 (YPFPGPI), casoxin-D (YVPFPPF) ja casoxin-6 (SRYPSY) naudan kaseiineja voisi sitoa μ-opioidireseptorin on cytomembrane vaikuttaa proliferaation ja sytokiinien erityksen ihmisen perifeerisen veren mononukleaaristen solujen ( PBMC: t) [35]. Almansour NM et ai. [2], [39] kertoi, että myksoomaviruksen peptidianalogiin voi kohdistaa Akt signalointireitin mahdollisena solukuolemareittiin ihmisen ihon syöpäsoluja.

Pyrimme jatkuvasti kokeessa havaitsimme, että PGPIPN leimattu fluoreseiini (FITC) ilmennyt SKOV

3 solukalvon alle konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (CLSM) (päivämäärä ei esitetty), mikä osoittaa, tämä peptidi voisi sitoutua solukalvon, kuten jotkut muut peptidejä maitoproteiinia. Päättelimme, että PGPIPN voivat sitoutua solu- spesifiseen reseptoriin (t) ja dysregulate solun signaalitransduktion reittien, ja vähentää BCL ilmaisu, indusoidaan sitten solujen apoptoosia. Kaikki nämä on tutkittava tulevaisuudessa työtä. Tietenkin, PGPIPN voi kautta muiden mekanismien kautta vaikuttaa solujen kasvuun.

Yhteenvetona, heksapeptidin PGPIPN voi tehokkaasti esti munasarjasyövän solujen proliferaatiota sekä in vitro että in vivo. Tämä esto vaikutus on lähinnä PGPIPN indusoi syöpäsolun apoptoosin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että PGPIPN on voimakas terapeuttinen peptidi hoitoon munasarjasyöpä, ja antaa perustelut lisäarviointia klinikalla.

Kiitokset

Haluamme kiittää Lianfang Zhang ja Liyu Cao ensimmäisestä sidoksissa sairaalan Anhui Medical University, heidän apua poimien, arvioidaan ja luokitellaan tuoretta primääri munasarjojen kasvainkudoksen, 5 munasarjasyöpäpotilaalle alkuperäisen debulking leikkauksen ensimmäisen sidoksissa sairaalan Anhui Medical University.