Krooninen sairaus

tiivistelmä

CD133 on kalvo molekyyli, joka on ollut, kiistellysti, raportoidaan CSC markkeri kolorektaalisyövässä (CRC). Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet selvittämään ilmaisun ja roolia CD133 CRC. Aluksi koko CD133-ilmentävien (CD133 +) väestöstä kahdeksan hyvin kuvattu CRC solulinjoja mitattiin virtaussytometrialla ja sen havaittiin olevan välillä 0%: sta 95%. Solulinja HT29 on CD133 + populaatio 95% ja valittiin toiminnallinen arviointi CD133 jälkeen geenin pudotus RNA häiriöitä. Aika tietenkin testi osoitti, että CD133 esto ei ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon tai apoptoosin. Kuitenkin CD133 knockdown tuloksena oli suurempi alttius staurosporiinille indusoiman apoptoosin (p = 0,01) ja väheneminen soluliikkuvuus (p 0,04). Koska geeni Knockdown voi aiheuttaa ”off-tavoite” vaikutuksia, solulinjasta SW480 (joka on CD133 + väestöstä 40%) lajiteltiin puhtaaksi CD133 + ja CD133- väestön mahdollistaa toiminnallisen vertailun isogeenisen populaatioiden erottaa vain CD133 ilme. Yhdenmukaiset kanssa knockdown kokeissa ajankulku määrityksessä ei todettu merkitsevää proliferatiivisia eroja CD133 + /CD133- populaatiot. Myös suurempi resistenssi staurosporiinille aiheuttaman apoptoosin (p = 0,008), suurempi soluliikkuvuus (p = 0,03) ja suurempi pesäkkeenmuodostuskyvyn tehokkuutta nähtiin CD133 + väestöstä kuin CD133- väestön sekä 2D- että 3D-kulttuuri (p 0,0001 ja p Hyväksytty: 27 huhtikuu 2010; Julkaistu: toukokuu 19, 2010

Copyright: © 2010 Elsaba et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Nottinghamin yliopisto ja CR-UK. Tarek Elsaba on vastaanottaja PhD apurahan, joka on antanut Egyptin hallitus. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viime vuosina syntymistä ”syöpä kantasolu hypoteesi”, joka oletetaan, että vähemmistö populaatio solujen kasvain koostuu syövän kantasoluja (CSC) [1], [2]. Tämä kanta on oletettavasti vastuussa tuottaa suurimman kasvaimen, joka koostuu solujen vaihtelevalla erilaistumista. Hierarkiassa kasvaimen siis ajatellaan olevan samanlainen kudokseen, josta kasvain on peräisin, ja CSCS katsotaan neoplastisten vastineet kantasolujen normaalissa kudoksessa. Tässä suhteessa, CSCS voidaan olettaa olevan kantasolun kaltainen fenotyyppi (yleensä kutsutaan ”stemness”). Tämä on ominaista ominaisuuksia, kuten rajaton replikaatiomuotoon kyky, multipotenttisuus ja kestävyys apoptoosin [3]. Kantasolujen fenotyyppi voi myös cyto suojaavia strategioita, kuten kyky aktiivisesti pursottaa vaarallisia aineita solusta-ominaisuus, joka voi olla perustana vastustuskyvyn kemoterapia-aineiden [3], [4].

yhdensuuntainen syntymistä syövän kantasolujen hypoteesi on ollut kasvavaa kiinnostusta eristämiseen ja tutkimus CSCS. Useat tutkimukset väittävät on eristetty CSCS useasta eri kasvaintyypeille kuten aivojen [5], [6], rintojen [7], paksusuolen [8], [9], maksasyövän [10] ja haimasyövän [11] . Näissä tutkimuksissa on käytetty otaksuttu CSC merkkiaineita erottamaan kantasoluja erilaistumaan soluista kasvain. Eräs yleinen menetelmä erottaminen on väriaineen poistaminen menetelmällä (eli puolella väestöstä [12]), vaikka tunnistus solun pinnan markkereita (kuten CD24, CD44, CD166, ja integriinit) on sallittua käyttää fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) eristää CSCS [13]. Yksi markkeri johdonmukaisesti raportoitu kantasolujen markkerina kasvaimia eri alkuperää on CD133 (tunnetaan myös nimellä Prominin 1).

CD133-geeni (

PROM1

) kartoittaa kromosomiin 4p15 ja se koodaa 120 kD läpäisevä glykoproteiini (ENSG00000007062). CD133 proteiini on pentaspan solunpintareseptori vaikka kumpikaan sen ligandin eikä sen johdetun sanansaattajat ovat tiedossa. Se oli ensimmäinen tunnustettu pintamerkkiaine hematopoieettisten kantasolujen [14], [15]. Myöhemmin sitä käytettiin tunnistamaan syövän kantasoluja monissa kiinteitä kasvaimia, jotka johtuvat esimerkiksi, rinta- [13], haima [16] ja maksan [17].

Kaksi viimeaikaiset tutkimukset tunnistettu CD133 merkkiaineena kantasolujen kolorektaalisyövissä (CRC) [8], [9]. Näissä tutkimuksissa CD133 ilmennetään (CD133 +) solut eristettiin ensisijainen CRC ja osoitettiin olevan kyky muodostaa kasvaimia, kuten nude-hiirissä; Toisin CD133- solujen saman kasvaimia osoitettu olevan hyvin rajallinen kyky muodostaa ksenografteissa ja sekin johtui saastuttamia CD133 + -solujen. Analyysi ksenografteista joka oli muodostettu osoitti, että koko CD133 + väestöstä oli samanlainen kuin vuonna primaarikasvaimen ja lisäksi kyky jatkuvasti levittää -ksenografteissa tiukasti liittyy CD133 ilme. Myöhemmät tutkimukset eivät kuitenkaan ole validoitu nämä havainnot [18] ja yhdessä tutkimuksessa on raportoitu, että, itse asiassa CD133- väestö on suurempi pesäkkeenmuodostuskyvyn [19]. Tutkimuksemme pyrki edelleen selkeyttää ilmaisun ja roolia CD133 CRC. Kahta lähestymistapaa käytettiin: (i) CD133 ilmentyminen toiminnallisesti arvioitiin HT29 jälkeen geeni taintumisen ja (ii) SW480 koki solulajittelusta osaksi CD133 + väestö ja CD133- väestö seuraa vertaileva toiminnallinen analyysi kahden populaation.

Materiaalit ja menetelmät

Kudosviljelytutkimusten, virtaussytometrialla ja fluoresenssi solulajittelun

Kahdeksan paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa (Caco2, DLD1, HT29, Lovo, LS1034, SW480, SW620, SW837) olivat ylläpidetään kuten aiemmin on kuvattu [20]. Identity kaikista solulinjoissa vahvistettiin sormenjälkien mutaatioita

KRAS, BRAF, PI3KCA, CDC4, TP53

ja testaus Mikrosatelliittimarkkerien epävakautta.

arviointi koon CD133 ilmentävien (CD133 +) väestö kussakin solulinjassa tehtiin virtaussytometrialla käyttämällä fykoerytriini (PE) leimattua vasta-ainetta – CD133 /1 (klooni AC133 /1, Miltenyi Biotec, Iso-Britannia). Solut irrotettiin käyttäen ei-entsymaattista soluhajotusprosessin liuosta (Sigma) ja noin 5 x 10

5-soluja inkuboitiin vasta-aineella (laimennettu 1:100 FACS pestä (0,5% naudan seerumialbumiinia, 2 mM NaN

3; 5 mM EDTA)) 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Isotyypin ja keskittyminen Hyväksytty PE leimattua kontrolli vasta-aineella (Miltenyi Biotec, UK) käytettiin ja näytteet leimattiin tätä vasta-ainetta käytetään asettamaan gating tasolle. Kolmen 5 minuutin pesua FACS pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen ja vahvistetaan sisältävä liuos FACS pestään 1% formaldehydiä. Määrittäminen prosenttiosuus CD133 + solujen ja lajittelu solujen rivit CD133 + /CD133- populaatiot suoritettiin EPICS Altra virtaussytometrialla kone (Beckman Coulter). Tulokset analysoitiin käyttäen WinMDi 2,9 tietokoneohjelmia.

fluoresenssiaktivoidulla solujen lajittelu (FACS) ja SW480, solut leimattiin käyttäen samaa protokollaa, mutta ilman lopullista kiinnitystä vaiheessa. Jotta voitaisiin arvioida plastisuus CD133 ilmaisun, lajitellaan soluja ylläpidettiin viljelmässä 3 viikkoa ennen leikkausta uudelleenarviointia. Kaikkien muiden kokeissa CD133 + /CD133- populaatiot testattiin välittömästi lajittelun jälkeen.

RNA, havaitseminen silmukointivarianttien ja mRNA: n määrän

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) seuraten valmistajan ohjeita. Näytteitä normaalin paksusuolen limakalvon kerättiin täydellä suostumuksella paikallisen eettisen komitean (Oxford Research Ethics komitea B, REC viite C02.310). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta, joiden näytteet testattiin CD133 ilmentyminen ja silmukointivariantit. RNA uutettiin ja komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [20].

Kaksi keskeistä silmukointivariantit on kuvattu CD133: a. Suurempi variantti AC133-1 (NM_006017) tunnistettiin ensin ja se sisältää kaikki eksonit [15]. Toinen variantti, AC133-2, jatkosten ulos eksoni 4, joka on 27 emäsparia pitkä ja se koodaa 9 aminohapposekvenssiä ensimmäisellä solunulkoisen domeenin CD133. Expression of silmukointivarianttien testattiin RT-PCR: llä käyttäen ylävirran aluketta eksonissa 3 ja alavirran alukkeen eksonissa 5 (alukesekvensseissä saatavissa kirjoittajien). Tämä tuottaa tuotteen 199 emäsparia AC133-1 ja 172 bp AC133-2. Päätepiste PCR-analyysi suoritettiin tarkastelemalla PCR-tuotteita agaroosigeeleillä. Koska kuitenkin edullinen monistuminen pienemmän tuote voi tuottaa dataa esineitä, tutkimus toistettiin käyttäen reaaliaikaista PCR (jossa SYBR vihreä, kun toimittaja väriaine) on MX3005P lämpösyklilaite (Stratagene, UK). Erityisyys PCR vahvistanut kaksisuuntaisen suoralla sekvensoinnilla. Läsnäolo silmukointivarianttien testattiin cDNA saatu CRC solulinjojen järjestetty CD133 + ja CD133- populaatioita SW480 sekä 10 näytettä on normaalia koolonin limakalvoa

Lajiteltu CD133 +/- populaatiot tehtiin analyysi mRNA-tasojen kvantitatiivisella RT-PCR-analyysi käyttäen standardikäyrää menetelmällä. Analyysi suoritettiin kolminkertaisesti kullekin näytteelle ja

CD133

arvot normalisoituivat taloudenhoito geeni

HPRT

. Jokainen reaktio suoritettiin lopullisessa tilavuudessa 25 ui on MX3005P lämpösyklilaitteessa (Stratagene, UK). Datan Q-PCR analysoitiin käyttämällä MxPro-QPCR-ohjelmisto.

Gene pudotus

Gene pudotus saatiin aikaan transfektoimalla HT29-soluja (osoitettu olevan korkea CD133 ilmentyminen), jossa CD133-spesifisiä pieni häiritsevä RNA (siRNA: t). Noin 2 x 10

5-solut ympättiin 2 ml: aan DMEM, jossa oli 10% FBS: ää 6-kuoppaisille levyille (Corning) 24 tuntia ennen transfektiota. Solut transfektoitiin CD133-spesifisiä stealth siRNA-dupleksit (sekvenssi: 5′-GAGUCGGAAACUGGCAGAUAGCAAU-3 ’, Invitrogen), jonka lopullinen pitoisuus on 33 nM käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Nämä ovat tästä lähtien selityksin kuten HT29

CD133-. Kontrollina solut transfektoitiin sekoitetun ohjaus siRNA (sekvenssi: 5′-GAGGGAACAGUCGGAUAGACCUAAU-3 ’) ja on vastedes olevaksi, HT29

ssc (salattu siRNA kontrolli).

Western blotting

Western blotting, lysaatit valmistettiin ja kvantitoitiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Näytteet (30 ug) altistettiin natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidi- polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) käyttäen 10% ratkaisemiseksi polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin Hybond-P PVDF-kalvolle (Amersham Bioscience). Kun oli salvattu 5% naudan seerumialbumiinia (BSA) /0.1% TPBS (Tween 20: tä PBS: ssä liuos) 60 minuutin ajan, sitten membraania inkuboitiin yli yön huoneen lämpötilassa CD133 (C24B9) Rabbit mAB (Cell Signaling) pitoisuutena 1:1000. Membraani pestiin 0,1% TPBS: llä 3 kertaa, kukin 5 minuuttia sen jälkeen inkuboitiin 1 h huoneen lämpötilassa piparjuuriperoksidaasi-sidottu sekundaarista vasta-ainetta (Sigma Aldrich) (1:10000, anti-kani-IgG) laimennettiin 5% BSA /PBS, joka sisältää 0,1% Tween 20: tä. Vielä 3 pesua, kalvo visualisoitiin parannetun kemiluminesenssin reagenssit (Thermo tieteellinen) Jotta lastaus ohjaus, monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-ainetta (Sigma Aldrich) laimennus 1:2000 vastaan ​​β-aktiini proteiinia käytettiin.

Proliferaatiomääritykset

aika tietysti määritys leviämisen suoritettiin jälkeen geeni knockdown jälkeen solujen lajittelun. HT29, jokaiseen kuoppaan 24-kuoppalevyllä ympättiin 10

4 solut 24 tuntia transfektion jälkeen joko CD133 erityisiä tai sekoitetun ohjaus siRNA. Solujen määrä arvioitiin päivinä 1, 3 ja 5. SW480 lajiteltuja CD133 + ja CD133- populaatiot ympättiin 10

4 solua kuoppaa kohti ja solujen määrä arvioitiin päivinä 1, 3, 5, 7 ja 9. Ainakin kaksi erillistä koetta, kukin kolmena rinnakkaisena, suoritettiin. Metyleenisininen määritys [21], [22], käytettiin määrittämään numerot kiinnittyneet eläviä soluja.

Stauropsorine indusoiman apoptoosin

Staurosporiini käytettiin arvioimaan vastuksen myönnetty CD133 ulkoapäin apoptoottista rasituksia . HT29, kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä (Costar), ympättiin joko HT29

CD133- tai HT29

ssc soluja 72 tuntia transfektion jälkeen. Noin 5 x 10

4-solut ympättiin kuoppaa kohti ja inkuboitiin staurosporiini (Sigma) lopulliseen konsentraatioon 8 uM 24 tunnin ajan. Tämän ajanjakson jälkeen elinkelpoisia ja apoptoottisten solujen mitattiin. Sillä SW480, jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaiselle levylle ympättiin 10

5-solut lajitellun solujen ja staurosporiini, lisättiin 24 tuntia myöhemmin pitoisuutena 8 uM. 24 tunnin jälkeen, numerot elinkelpoisten solujen /apoptoottisten kappaleiden arvioitiin. Määritys suoritettiin kolminkertaisena ja toistetaan vähintään kahdessa riippumattomassa kokeessa.

2 ulotteinen (2D) ja 3 (3D) kolmiulotteinen pesäkkeenmuodostuskyvyn määrityksessä

Kyky eristetyt yksittäiset CD133 + ja CD133- solut muodostavat pesäkkeitä testattiin molemmissa 2 ulotteinen (2D) kulttuuri ja 3-ulotteinen (3D) kulttuuri. 2D-kulttuuri, 300 juuri lajitellut solut ympättiin yksittäisiin kuoppiin 6-kuoppaisen levyn ja viljeltiin 14 päivää. Sitten solut värjättiin metyleenisinisellä ja pesäkkeet, joissa on enemmän kuin 20 solusta, laskettiin. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja kahteen otteeseen.

3D kasvatus suoritettiin arvioimaan colonogenic kyky lajitellut väestön ei kiinnittynyt olosuhteissa. Soluja (2500 kustakin väestöstä CD133 + ja CD133-soluja) laskettiin ja suspendoitiin uudelleen yksittäisinä soluja 0,7% DNA grade agaroosia (Sigma Aldrich) .Tämä oli päällekkäin pohja on 1% DNA grade agar (Sigma Aldrich) ja sekä ylä- ja Alustana sekoitettiin 2X DMEM. Kokeet perustettiin kolmena kappaleena ja keskisuurten vaihdetaan kahdesti viikossa. Kahden viikon kuluttua pesäkkeiden määrä, joka kehittyi kussakin kuopassa laskettiin ja visualisoitiin mikroskoopilla värjäyksen jälkeen 0,05% kristalliviolettia 1 tunnin ajan ja edustavat kentät valokuvattiin. Sekä 3D- ja 2D-kulttuuri, prosenttia pesäkettä muodostavaa tehokkuutta (TAE) laskettiin seuraa,% CFE = (lukumäärä pesäkkeistä /lukumäärä viljeltyjen solujen) X 100 [23]. Log muunnettuja arvoja käytettiin sitten tilastollisiin analyyseihin.

In vitro

migraatiokokeessa

TranswellTM solujen vaeltamiseen analyysit suoritettiin käyttäen Boyden sisältävän kammion polykarbonaatin suodatin, jossa on 8 um huokoskoko (Costar). Viljelyalustaan ​​(600 ui), jota oli täydennetty 20% FBS: ää, lisättiin alempaan kammioon ja 2,5 × 10

5-solut lajitellun populaatiot lisättiin ylempään kammioon (100 ul: ssa viljelyalustaa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää). Solujen lukumäärä vaeltavat kalvon läpi laskettiin manuaalisesti 24 tunnin kuluttua. Määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja kahteen otteeseen. Solumigraation mitattiin myös käyttämällä solun haavoittaen määritys suoritettiin 6 (Costar). Solut kasvatettiin konfluenssiin ja sitten nälässä 24 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa. Steriili 200 ul pipetinkärjen käytettiin luoda kolme erillistä rinnakkaista haavoja ja kulkeutumista solujen poikki haavan linjan arvioitiin 24 tunnin kuluttua. Valokuvat otettiin käyttämällä CCD-kenno (CCD) kamera (Canon, Japani) kiinnitetty käännetyn faasikontrastimikroskoopissa teholla X40. Välinen etäisyys reunojen mitattiin 6 tasaisesti pistettä käyttämällä ImageJ ohjelmiston [33], ja sitten analysoitiin käyttämällä kahden tailed t-testiä. Kokeet toistettiin kahteen otteeseen.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen SPSS 13.0 Software. Kaikki arvioinnit tehtiin käyttäen paritonta kaksi tailed Studentin T-testi. Tutkimuksiin liittyy solujen ja pesäkkeiden laskenta, solujen lukumäärät analysoitiin. Käyttävissä tutkimuksissa numeerisen fluoresenssi lähtö, raaka Fluoresenssiarvot käytettiin.

Tulokset

CD133 ilmentävien populaatioiden solulinjoissa

koko CD133 + väestö testattiin 8 CRC solulinjat virtaussytometrillä ja kussakin tapauksessa noin 500 000 solua analysoitiin. Kahdessa solulinjoissa (DLD1 ja SW837), CD133 + solut eivät olleet havaittavissa. Koko CD133 + väestöstä havaittiin olevan 95% kahdessa solulinjoissa (Caco2 ja HT29). Muissa solulinjoissa, on bimodaalinen populaatio oli läsnä kanssa CD133 + väestöstä vaihtelee 32-64% (kuva 1).

kahdeksan CRC solulinjat testattiin ja osoitti erikokoisia väestöstä CD133 + soluja. (A) Näyte virtaussytometria kuvat näkyvät Caco2 (vasemmanpuoleiset paneelit, 95% positiivisia soluja) ja SW837 (oikea paneeli). Analyysi tehtiin käyttämällä AC133 /1 vasta-ainetta (yläpaneeli) ja ruiskutus suoritettiin kustakin solulinjasta käyttäen isotyyppikontrolli (alapaneeli), PMTLin 1 on photmultiplier putki lineaarinen 1, joka osoittaa, sivusironta) (b) osoittaa, että kahden solulinjan ei ollut CD133 + solut tunnistettiin taas kahdessa solulinjassa lähes kaikki solut olivat CD133 +. Loput solulinjat olivat erikokoisia populaatio CD133 + solujen.

Splice variantteja CD133 CRC solulinjoissa ja normaali limakalvo

Expression Kahden tärkeimmän silmukoitumisvarianttia CD133 (AC133- 1 ja AC133-2) testattiin RT-PCR: llä sekä solulinjoissa ja näytteitä normaalin limakalvon. Vain yksi tuote nähtiin agaroosigeeleillä, jotka on sekvensointi, todettiin olevan lyhyempi AC133-2 silmukointivariantin, josta eksonia 4 on saumattu ulos (kuvio 2a ja 2c). Kuitenkin lyhyempi PCR-tuotteet tehdään edullinen monistuminen ja on mahdollista, että suuremmat tuotteita voidaan hukata sekä agaroosigeelielektroforeesilla ja sekvensointi (erityisesti, jos läsnä alhaisilla tasoilla). Analyysi puhdistettu suorittamalla PCR käyttämällä SYBR vihreä reportterina väriainetta. Arviointi dissosiaatiokäyrä osoitti, että läsnä on yksittäinen PCR-tuotetta vain (kuvio 2b).

Solulinjat ja normaalin limakalvon näytteet testattiin ekspressiota kaksi CD133 silmukointivariantit RT-PCR: llä alukkeilla ankkuroitu kummallakin puolella saumattu ulos eksonin (eksoni 4). Näytteen tiedot on esitetty, joka osoittaa, vain yksi tuote todettiin, kun PCR-tuotteet analysoitiin sekä (a) agaroosigeelillä ja (b) herkempi Q-PCR-tekniikkaa käyttäen SYBR green reportterina. M = Kokomarkkerina, nc = negatiivinen kontrolli, * edustaa DLD1. (C) sekvensointi tuotteiden osoittivat, että eksoni 4 oli saumattu ulos koodaavan sekvenssin siten vain lyhyemmän silmukointivariantti (AC133-2) oli ilmaistaan. Sekvenssi yläpuolella elektroferogrammi on AC133-1 eksoni 4 näkyy rivien välissä.

knockdovvn CD133

HT29 on korkeatasoinen CD133 ilmaisua. Solut transfektoitiin joko CD133 erityisiä tai sekoitetun ohjaus siRNA ja testattiin 72 tuntia transfektion jälkeen. Western blot osoitti, että proteiini oli lähes huomaamaton, että kun CD133 erityinen siRNA käytettiin. Sen sijaan, transfektio ohjaus siRNA ei ole vaikutusta proteiinin ilmentymiseen (kuvio 3).

HT29-soluja transfektoitiin joko CD133 erityisiä siRNA (HT29

CD133-) tai sekoitettua kontrollipeptidiä ((HT29

SSC). Western blotting vahvisti menetys CD133 ilmentymisen geeni knockdown. p-Actin osoittaa samanlaista proteiinia lastaus.

Association of CD133 ilmaisun soluproliferaatioon

Vertasimme leviämisen korko solujen välillä korkea ja matala CD133 tasolla kahdella kokeellisia lähestymistapoja. Vuonna HT29 CD133-proteiinin joka pudotettiin ja solujen määrä seurattiin 5 päivää (kuvio 4a), kun taas SW480 on lajiteltu CD133 + /CD133- väestön ja solumäärät seurattiin yli 9 päivää (kuvio 4b). Molemmat kokeet osoittivat samat tulokset eli ei ollut merkittävää eroa solujen, joilla on korkea tai matala CD133 ilmaisua. Vastaavasti laskee kelluva apoptoottisten kappaleiden tänä aikana ei ilmennyt mitään eroa (tuloksia ei ole esitetty).

Solulisääntyminen arvioitiin jälkeen knockdovvn CD133 vuonna HT29 (kuvio 4a) ja lajittelun SW480 puhtaaksi CD133 + ja CD133- väestön (kuva 4b). Aika tietenkin koe suoritettiin usean päivän ilman yhdistyksen välillä nähdään CD133 ja solujen määrä.

Association of CD133 ilmaisun kanssa staurosporiinille aiheuttaman apoptoosin ja pesäkkeiden muodostumista

Ominaisuus, joka voi olla odotetaan kantasoluja on vastustuskykyä apoptoosin seuraavia eksogeenisen stressiä. Molemmat kokeelliset lähestymistavat käytettiin testata vaikutusta CD133 tasojen resistenssin apoptoosia, kun se altistetaan staurosporiini 24 tuntia. Lihavien tuloksia saatiin osoittaa, että korkea CD133 siirrettävä staurosporiinin vastus. Vähemmän kannattavia HT29

CD133- solut olivat läsnä kuin HT29

SSC soluja (kuvio 5a, p = 0,01); päinvastoin suurempi määrä eläviä soluja oli läsnä järjestetty CD133 + väestöstä kuin CD133- väestöstä (Fig. 5b, p = 0,008). Ei kuitenkaan ollut eroa solujen altistuessaan DMSO yksin.

CD133 antoi vastustuskyvyn staurosporiinille aiheuttamaa apoptoosia. Kuviossa 5a on esitetty, että kun altistuminen staurosporiinille oli vähemmän elävät solut transfektion jälkeen CD133 erityisiä siRNA (HT29

CD133-) kuin salattu ohjaus (HT29

SSC) (p = 0,01). Ei ollut eroja solujen altistuksen jälkeen DMSO: ta. Kuviossa 5b on esitetty, että CD133 + populaatio SW480 osoitti solut osoittivat merkitsevästi suurempaa vastusta kuin CD133- populaatio (p = 0,008). Kuva 5c ja 5d esittävät CD133 + -soluja huomattavasti enemmän klonogeeniset kuin CD133- soluja (p 0,0001 ja p 0,003) 2D- ja 3D-kulttuuri vastaavasti. Luvut 5e (pesäkkeitä muodostettu CD133 + -solut) ja 5F (pesäkkeitä muodostettu CD133- solut) osoittavat, että sekä CD133 + ja CD133- populaatioiden SW480 pystyivät muodostamaan pesäkkeitä yksittäisistä soluista (tyypilliset pesäkkeet esitetty).

Toinen piirteitä ”stemness” on kyky muodostaa pesäkkeitä. Tämä testattiin kasvattamalla yhdellä solujen pehmeässä agarissa kahden viikon ajan (3D kulttuuri) ja 2D kulttuurin ja lajitellaan CD133 + ja CD133 – soluja verrattiin. Molemmissa tapauksissa, pesäkkeet olivat nähtävissä sen jälkeen, kun kaksi viikkoa, mutta pesäkkeiden määrä oli merkittävästi suurempi CD133 + soluissa (P 0,0001, ja P 0,003), 2D- ja 3D-viljelmissä (kuvio 5c ja 5d).

Association of CD133 ilmaisun kanssa solujen vaeltamiseen

Vertaileva soluliikkuvuus solujen välillä korkea ja matala CD133 ilmentyminen testattiin siirtokuoppaan muuttoliike määrityksiä. Molemmat koeolosuhteissa tuottanut yhtäpitäviä tuloksia. Merkittävästi vähemmän HT29

CD133- solujen kalvon läpi vaeltaneet kuin HT29

ssc-soluja (kuvio 6a, p = 0,04). Toisaalta huomattavasti suuremmalle joukolle CD133 + solujen vaeltaneet kuin CD133- soluja (kuvio 6b, p = 0,03). Solu haavoittaen määritystä käytettiin myös seuraavanlaista geenin Knockdown joka osoitti haavan reunat olivat merkittävästi lähempänä HT29

SSC soluissa kuin HT29

CD133- soluja (p 0,001) Tämä vahvistaa suhdetta korkea CD133 ilmaisun ja lisääntynyt soluliikkuvuus (kuva 6c).

TranswellTM muuttoliike mitattiin knockdovvn CD133 vuonna HT29 ja lajittelu SW480 osaksi CD133 +/- populaatiot. Merkittävästi vähemmän HT29

CD133- solujen kalvon läpi vaeltaneet kuin HT29

ssc-soluja (kuvio 6a, p = 0,04). Toisaalta suuremmalle joukolle lajitellun CD133 + solut vaelsivat kuin CD133- soluja (kuvio 6b, p = 0,03). Haavoittaen määritys myös sitoutunut ja geeni knockdown liittyi merkittävästi viivästynyt sulkeminen haavan joka oli visiually havaittavissa jälkeen vain 24 tuntia (kuvio 6c) ja tilastollisesti merkitsevä (p 0,001).

Plastisuus of CD133 ilmentyminen solulinjoissa

SW480-solulinja lajitellaan CD133 + ja CD133- populaatiot, jotka pidettiin vakio kudosviljelyolosuhteissa ja tehtiin säännöllinen analyysi virtaussytometrialla. Välittömästi uudelleen analyysi osoitti, että CD133 + ja CD133- populaatiot olivat vastaavasti 97,6% ja 99,9% puhdasta (kuvio 7a). Kvantitatiivinen PCR osoitti transkription tukahduttamisen CD133 että CD133- väestön ja vaikka CD133 mRNA oli edelleen havaittavissa, se oli vain 15% tasosta nähdään CD133 + väestöstä (kuvio 8).

SW480 oli lajitella CD133 positiiviset ja negatiiviset populaatiot jotka sitten kasvatettiin erikseen. (A) Gating oli asetettu niin, että vain äärimmäisen populaatiot kerättiin, jotka olivat välittömästi uusi koe, osoitettiin olevan erittäin puhtaita populaatioita. (B) pitkäaikaisessa kulttuuriin, molemmat lajitellut populaatioiden tuli kaksivaiheiseksi. Suhde ja CD133 + ja CD133- solujen vakiintui kolmen viikon kuluttua ei muuttunut sen jälkeen (vaikka ne eivät ole samat kuin alkuperäinen emosolulinjassa).

Q-RT-PCR-analyysi on lajiteltu populaatioiden kävi ilmi, että transkription tukahduttamisesta

CD133

vuonna CD133- väestöstä (vaikka alhainen mRNA oli vielä havaittavissa).

Pitkäaikainen kulttuuri johti molemmissa populaatioissa palaamista että bimodaalisen profiilin. CD133 + väestöstä, sen jälkeen 3 viikkoa, koostui 70%: CD133 + -soluja ja 30% CD133- soluja, taajuuksia, jotka pysyi vakaana sen jälkeen ainakin 3 kuukautta. Havainnot ristiriidassa julkaistut raportit, joissa puhdasta populaatioissa CD133 + solujen muuttaa normaaliksi suhde CD133 +/- populaatioiden [8]. CD133- solut kehittänyt populaation CD133 + soluja, jotka, 3 viikon kuluttua, oli 17%, mutta ei kasvanut sen jälkeen (kuva 7b).

Keskustelu

Euroopan CD133 + väestö on muuttuja CRC solussa linjat

seulotaan suuri määrä soluja kahdeksan vakiintunut CRC solulinjat virtaussytometrillä määrittää koko CD133 + väestöstä. Huomasimme, että kahdessa solulinjoissa (DLD1 ja SW837) ei ollut havaittavaa CD133 + soluja, kahdessa solulinjoissa (Caco2 ja HT29) CD133 + väestöstä oli 95% koko kasvainsolujen ja loput solulinjoissa oli väkiluvuista vaihtelee 32% -64%. Tuloksemme ovat yhtä mieltä tutkimukset letaet al. ja Dalerba et ai. [18], [24], jotka raportoivat samankaltaisista CD133 ilmentyminen solulinjoissa HT29, Lovo eikä ilmaisun DLD1. Tuloksemme ovat kuitenkin poikkeava niiden kanssa O’Brien ja Ricci-Vitiani [8], [9], vaikka syynä tähän ristiriita ei tunneta. Yksi mahdollisuus on, että meidän tutkimuksissa käytettiin pysyvien solulinjojen taas muissa tutkimuksissa käytetyt uudet solulinjoissa omissa laboratorioissa. On mahdollista, että pitkäaikainen kulttuuri voi aiheuttaa ylläpitää muutoksia CD133 sääntelyn vaikka tämä sinänsä viittaisi siihen, että CD133 ilmaisu ei ole kovin hyvä merkkiaine CSCS. Erot tekniikka voi tarjota toinen selitys vaikka käytimme samoja aineita kuin O’Brien ja Ricci-Vitiani ja pidimme inkubaation kertaa ensisijaisen vasta-alas 15 minuuttia. Joka tapauksessa, meidän tiedot ovat yksiselitteisesti ilmi, että 4/8 solulinjojen CD133 + väestöstä on joko poissa tai käsittää lähes koko tuumorisolupopulaatioon. Nämä tiedot yhdessä muiden esitettävät tiedot, johtaa meidät päättelemään, että CD133 ei luultavasti ole spesifinen merkki kantasolujen CRC.

Vain CD133 silmukointimuunnos AC133-2 ilmentyy koolonkudoksessa

Vaikka erilaisia ​​silmukointivarianttien on kuvattu CD133: a, vain yksi (kutsutaan AC133-1 ja joka oli ensimmäinen, joka on kloonattu) on myönnetty referenssisekvenssissä numero. Tämä sisältää täyspitkän koodaavan sekvenssin taas toinen silmukointivariantti (AC133-2, toinen kloonata) näyttää liitos pois eksonia 4. Analyysimme 8 CRC solulinjojen ja 10 näytettä normaalin limakalvon käyttäen sekä päätepiste ja reaaliaikaisia ​​menetelmiä, tunnistaa vain variantti AC133-2. Tämä olisi sopusoinnussa tutkimuksen Yu et al. [25], jossa AC133-2 raportoitiin kuin on silmukointivariantti, joka on läsnä monissa kantasolujen osastoihin, kun taas AC133-1 rajoittuu sikiön aivojen ja luustolihasten.

CD133 ilmentyminen liittyy joitakin ominaisuuksia kantasolujen fenotyyppi

jotta voitaisiin arvioida toiminnan CD133, solulinjan HT29 testattiin jälkeen knockdovvn CD133 RNA häiriöitä. Tätä menetelmää voidaan myös valmistaa ”off-kohde” vaikutuksia ja siten täydentävä lähestymistapa käytettiin erottamaan SW480-solulinjan kanssa CD133 + väestöstä 40% – puhtaaksi CD133 + ja CD133- populaatiot. Molemmat kokeet tulokset olivat samanlaiset. Ensinnäkin tasojen CD133 ei näytä muuttavan soluproliferaation tai apoptoosin. Oli kuitenkin merkittäviä eroja ominaisuuksia, joita voidaan pitää osana kantasolujen fenotyyppiä. Näin korkeita CD133 liittyvän kohonneeseen kyky muodostaa klooneja ja kestävyys staurosporiinille aiheuttamaa apoptoosia. Viimeksi mainittu voi johtua luontainen resistenssi apoptoosia (mahdollisesti välittämiä kuten raportoitiin yhteenliittymien välillä CD133 ilmaisun ja anti-apoptoottiset geenit, kuten FLIP (kaspaasi 8: n estäjä) ja Bcl-2 [26]. Vaihtoehtoisesti se voi johtua tehostettu soluja suojaava strategioita, kuten kyky aktiivisesti pursottaa myrkyllisten aineiden solulimassa [3].

Toinen ominaisuus löysimme liittyvän CD133 ilmentyminen parannettu solun liikkuvuus. Muut tutkimukset ovat osoittaneet rooli CD133 solun motiliteettia, koska se on klassisesti ilmaistaan ​​kalvon ulkonemat [27], [28]. tietyissä tilanteissa, kuten alkionkehityksessä ja haavan paranemisessa, kantasolut täytyy hankkia ominaisuuksia liikkuvuutta. in CSCS, ominaisuuksia parannettu liikkuvuus voi sallia invaasion ja metastaasin tapahtuvat-käsite tukema tutkimus Rappa ym joka löytyi CD133 ilmentyminen liittyi etäpesäke melanoomasolujen [29]. Tuloksemme eivät kuitenkaan ristiriidassa ne Horst ym. [30], joka ei havaittu, että CD133 ilmentyminen liittyi solun liikkuvuus in Caco2.