Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molecular analyysi solujen virtsasta tarjoaa kätevän lähestymistavan ei-invasiivisia havaitseminen virtsarakon syöpään. Käytännön käyttö virtsan solupohjaisten testien haittaa usein vaikeuksia käsitellä ja analysoida suuria näytevolyymit, tarvitaan nopeita näytteen käsittelyä hajoamisen välttämiseksi solun sisällön, ja matala herkkyys johtuu suuresta tausta normaalien solujen. Esitämme suodatus laite, joka on suunniteltu kotona tai point-of-care käyttö, joka mahdollistaa kerääminen, varastointi ja kuljetus virtsan soluja. Erikoista tämä laite on irrotettava kotelo kotelo kalvosuodattimella, joka suodatuksen jälkeen virtsaa voidaan siirtää varastointi yksikkö, joka sisältää sopivan säilyttämisen ratkaisu. Vuonna lisäystasot kokeissa tämän laitteen käytön edellyttäen tehokkaan talteenoton virtsarakon syövän solujen poistamiseen 99% ylimääräisen pienempikokoisten soluissa. Suorituskyky laitteen arvioitiin edelleen DNA-analyysi virtsan solujen kerätty 57 potilasta altistettiin höyläysleikkaus seuraavat joustava kystoskopian osoittaa kasvaimen. Kaikki näytteet testattiin

FGFR3

mutaatioita ja seitsemän DNA: n metylaatio markkereita (

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

POU4F2

,

SALL3

ja

VIM

). Vuonna potilasryhmässä, jossa siirtymäkauden kasvain varmistui histopatologisissa, virtsa DNA oli positiivinen yhdelle tai useammalle merkkiaineiden 29 ulos 31 tapauksessa (94%), joista 19 kanssa

FGFR3

mutaatio (61% ). Ryhmässä, joilla on hyvänlaatuinen histopatologia, virtsa DNA oli positiivinen metylaation merkkiaineiden 13 ulos 26 tapausta (50%). Vain yksi potilas tässä ryhmässä oli positiivinen

FGFR3

mutaatio. Tällä potilaalla oli vaihe Ta kasvain resektoitiin 6 kuukautta myöhemmin. Kyky helposti kerätä, tallentaa ja lähettää diagnostisia soluja virtsan esitetystä laite saattaa helpottaa ei-invasiivisia testaus virtsarakon syövän.

Citation: Andersson E, Dahmcke CM, Steven K, Larsen LK, Guldberg P ( 2015) Filtration Device for on-Site Collection, varastointi ja kuljetus Solut Virtsa ja sen soveltaminen DNA-Based havaitseminen virtsarakon syövän. PLoS ONE 10 (7): e0131889. doi: 10,1371 /journal.pone.0131889

Editor: Jorg Tost, CEA-Institut de Genomique, FRANCE

vastaanotettu: 01 lokakuu 2014; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2015; Julkaistu: 07 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Andersson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai apurahan tuella Candy Foundation.

Kilpailevat edut: KS ja PG on nimetty keksijöiden patenttihakemus arkistoi Cancer Research Technology Limited, joka koskee laitetta on kuvattu tässä artikkelissa: Julkaisun numero WO2015036781; PCT /GB2014 /052776; Julkaisupäivämäärä 19 maaliskuu 2015. Tämä patentti ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

analyysi harvinaisten solujen läsnä monimutkaisten biologisten nesteen näytteistä tarjoaa potentiaalisesti tehokas diagnostinen ja arviointi välineenä erilaisia ​​sairauksia ja tiloja. Erityisesti eristäminen, kvantitointi ja loppupään testaus syöpäsoluja läsnä potilaan kehon nesteen näytteistä hyvin lupaavilta ei-invasiivisia havaitseminen ja luonnehdinta kasvaimia ohjata diagnostisia ja terapeuttisia päätöksiä. Yhteinen lähestymistapa syöpädiagnostiikassa vähän invasiivisten näytteenotto on eristämällä ehjiä kasvainsolujen tai soluttoman kasvain DNA ääreisveren näytteistä [1,2]. Kyky analysoida verenkierrossa kasvainperäinen materiaali on nopeasti edennyt suurten tekniikan kehityksen ja löytö erittäin informatiivinen biomarkkereiden, joista osa edustaa tavoitteita tarkkuus syöpähoitojen [3].

urologiset syövät, kuten virtsarakon syöpä, virtsa tarjoaa helpompaa lähde diagnostisten materiaalia. Solut irtoa kasvaimia sijaitsee virtsateiden kerääntyä virtsarakon ja voidaan kerätä ja analysoida ei-invasiivisesti virtsan näytteenoton [4]. Virtsa sytologia on käytetty laajasti diagnosoida urologiset syöpien, erityisesti lisänä cystoscopy havaitsemiseen ja valvontaan virtsarakon syöpään. Kuitenkin huonolaatuisia rakkokasvaimista, sytologia on herkkyys niinkin alhainen kuin 10-20% [5] ja on luovuttu monet keskukset. Useita virtsan testit virtsarakon syöpä on hyväksynyt Yhdysvaltojen Food and Drug Administration (FDA), mutta niiden suorituskyky on edelleen huonompi kystoskopian kannalta herkkyys (tosi positiivinen rate) ja spesifisyys (tosi negatiivinen korko) [6]. Suurempi suorituskyky voidaan saavuttaa käyttämällä geenipohjaisten virtsan biomarkkerit kuten kuljettajan mutaatioita ja DNA: n metylaatio muutoksia, jotka ovat syöpää erityisiä ja vaikuttaa vähemmän tulehdusta ja muita lieviä olosuhteita [7-12]. Kynnyksellä parannettuja menetelmiä havaitsemiseksi ja kvantitoimiseksi harvinaisten DNA-molekyylejä, mukaan lukien seuraavan sukupolven sekvensointi ja digitaalisen PCR [13], herkkyys DNA perustuva tunnistus rakkokasvaimista voidaan edelleen lisätä.

Huolimatta lupauksen, käyttö virtsan soluihin perustuvissa määrityksissä havaitsemiseksi virtsarakon syöpä on rajoitettu luontainen haasteita kerätä ja käsitellä virtsanäytteitä. Yleisin menettely analysoimalla solun sisällön virtsan liittyy sedimentoitumisen solut sentrifugoimalla. Solujen hajoamisen välttämiseksi ja hajoamista solukomponenttien, näytteet on käsiteltävä nopeasti jälkeen virtsaamisen. Näistä käytännön syistä, näytteenotto suoritetaan yleensä oma sivusto erikoislaitteita ja koulutettua henkilöstöä. Toinen tärkeä näkökohta liittyy suorituskykyä virtsa-testien on korkea sisäinen ja yksilöiden välisiä eroja yhteensä virtsan solumäärän ja suhde kasvain-to-normaaleihin soluihin [14]. Korkea tausta normaalien solujen rajoittaa herkkyyttä kaikkein detektiomäärityksiä ja edellyttää suurempaa osa näytemateriaalin analysoitavaa lisätä mahdollisuus tunnistaa syöpäsoluja.

solukomponenttiin virtsa on hyvin heterogeeninen, joka koostuu solujen erityyppisiä ja kokoisia, kuten epiteelisolujen, okasolujen ja makrofagit [15,16]. Olemme [17] ja muut [18-20] ovat aiemmin osoittaneet, että pre-analyyttinen suodatus virtsan käyttäen kalvosuodatinta tarjoaa keinon tallentamiseen ja rikastaa virtsarakon syövän solujen virtsaan. Joiden huokoskoko on noin 8 um, kuten suodattimet voidaan kaapata normaalien ja malignien urothelial soluja, jotka on tyypillisesti halkaisijaltaan 20 um, kun taas ne poistaa joitakin pienempikokoisten soluja. Tyypillinen menettely suodattamalla, kuten se, jota käytettiin edellisessä tutkimuksessa [17], yhteydessä käytetään kertakäyttöisen ruiskun pakottaa virtsan kalvosuodattimen läpi, joka on asennettu asianmukainen suodatintelineeseen varustettu tuloaukko ja poistoaukko. Suodatuksen jälkeen suodatin poistetaan pinseteillä ja siirrettiin mikro-sentrifugiputkeen välittömästi käsittelyyn tai pakkasvarastoiksi. Tämä menettely edellyttää koulutusta, ei sovellu suurien määrien ja merkitsee vaara menettää materiaalin kautta vuoto ja käsittelyn aikana herkkä suodattimen läpi.

Esitämme suodatus laite näytteenottoon ja varastointiin solujen suurten volyymien virtsan tai muiden biologisten nesteiden kanssa. Suodatuksen jälkeen suodatin jää solut voidaan poistaa helposti suodattamalla laitteesta ja sijoitettiin vesitiiviin varastointi yksikkö, joka sisältää sopivan ratkaisun valmistamiseksi tai säilyttämiseksi vangitut solut. Muistiyksikkö voidaan sitten kuljetettiin koelaitosta asianmukaista alavirtaan analyysi solun sisällön. Osoitamme tämän laitteen käytön DNA-pohjainen karakterisointi, joilla on hyvänlaatuinen vaurioita ja pahanlaatuisia kasvaimia virtsarakon.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja virtsanäytteet

Virtsa kerättiin potilailta, joille rutiinia joustava kystoskopia poliklinikalla ilmeni merkkejä virtsarakon kasvain ja jotka myöhemmin viitataan höyläysleikkaus virtsarakon (TURB) Kööpenhaminan yliopistollisessa sairaalassa, Herlev, Tanska. Tutkimuksessa oli mukana sekä äskettäin diagnosoitu ja potilailla, joille tehdään rutiinitarkastuksen kystoskopian kuin seuranta aiemmin todettu siirtymäkauden kasvain virtsarakon. Näytteet kuljetettiin huoneenlämmössä Tanskan Cancer Society ja prosessoidaan 4-6 tunnin kuluttua virtsaamisen. Tutkimuksen hyväksyi valiokunta Biomedical Research Ethics n Pääkaupunkialue (H-2-2010-045), ja kirjallinen suostumus saatiin kaikki aiheet ennen tutkimukseen osallistumista.

kokoelma solujen ja DNA eristys

Mitätöity virtsanäytteistä (100-400 ml) tai suspensioita viljeltyjen solujen prosessoitiin käyttäen suodatus laite (kuvio 1) kiinnitetään paikalleen Nucleoporen track-syövytetty polykarbonaatti hydrofiilinen kalvosuodattimen (halkaisija 25 mm, huokoskoko 8 um, Whatman, Maidstone, UK). Suodatuksen jälkeen suodatinpatruuna siirrettiin varastointi kasetti, joka sitten asennetaan kannen peräisin Oragene DNA Self-Collection Kit sisältävä 1,7 ml: aan lysis /vakauttaminen puskuria (levyformaatti OG-250, DNA Genotek, Ottowa, Ontario, Kanada). Valmistajan mukaan, DNA on stabiili tässä liuoksessa 5 vuotta huoneenlämpötilassa. DNA puhdistettiin 0,5 ml näytettä käyttäen Oragene DNA puhdistava liuosta (DNA Genotek), mukaan etanolisaostus protokollaa valmistajan toimittamia. Keräämiseksi solun kokonais-komponentti, 25 ml virtsaa sentrifugoitiin 2000 g: ssä 10 min. Pelletti suspensoitiin uudelleen 200 ui: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa. DNA eristettiin käyttäen Qiagen Mini Prep Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden (protokolla DNA: n puhdistamiseen kudoksista). DNA tuotto arvioitiin kvantitatiivisella reaaliaikaista PCR-analyysiä käyttäen LightCycler 2.0 järjestelmä (Roche, Mannheim, Saksa) FastStart DNA Master

PLUS SYBR Green I Kit (Roche), ihmisen genomista DNA (Roche) referenssinä ja seuraavat alukkeet

GAPDH

: 5′-TAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAG-3 ’ja 5′-GGCGACGCAAAAGAAGATGC-3’.

laite koostuu suodatusyksikön (A, yksittäisiä komponentteja; B, koottu laite, C, suodatuksen jälkeen) ja vesitiiviin varastointi kasetti (D, yksittäisiä komponentteja, E, koottu kasetti).

Soluviljely ja malli järjestelmä

urothelial karsinooma -johdannainen solulinjoja 639V ja 97-7 olivat laboratoriosta Margaret A. Knowles ja satama

FGFR3

p.R248C ja p.S249C mutaatioita, vastaavasti [21]. Soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Lymfosyyttejä terveestä luovuttajasta valmistettiin ääreisveren mukaan aikaisemmin kuvatun protokollan [22]. Solut jäädytettiin AIM V Medium (Gibco), joka sisälsi 45% ihmisen-plasmasta peräisin seerumia + 10% DMSO: ta ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Pakastetut solut sulatettiin 37 ° C lämmitetty vesihauteessa, ja talteen AIM V Medium 37 ° C: ssa 30 minuuttia ennen käyttöä. Solut suspensiossa laskettiin ja niiden läpimitta mitattiin käyttäen Countess Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lymfosyytit ja syövän solut sekoitettiin eri suhteissa 100 ml: aan PBS: ää ja käsiteltiin käyttäen suodatuksen laitetta.

mutaatioanalyysi

havaitseminen ja kvantitointi

FGFR3

mutaatioita (s. R248C, p.S249C, p.G370C ja p.Y373C) ja vastaavat villityypin sekvenssit suoritettiin pisaran digitaalisen PCR (ddPCR), käyttäen QX200 järjestelmän (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ja hydrolyysikoetin perustuvissa määrityksissä ( PrimePCR ddPCR Mutation Detection määritykset, Bio-Rad). PCR-seos sisälsi 11 ui ddPCR pisaran SuperMix anturien (ei dUTPs), 1,1 ui mutaation aluke /koetin-seos (FAM), 1,1 ui villityypin aluke /koetin-seos (HEX) ja 2 ui DNA: ta lopputilavuudessa 22 ui. Kaksikymmentä mikrolitraa tätä seosta ja 70 ui pisaran sukupolven öljyä siirrettiin eri kuoppiin pisaran sukupolven kasetti. Muodostamisen jälkeen pisaroita käyttäen pisaran generaattori, näytteet siirrettiin 96-kuoppaiselle PCR-levylle, ja alistettiin vahvistus 40 sykliä 94 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. ja 55 ° C: ssa 60 sekuntia. Pisaroiden (keskimäärin ~ 16000 per reaktio) analysoitiin pisaran lukija, ja Quantasoft (versio 1.4.0.99) käytettiin DNA-analyysi pitoisuuksia. Sulku asetukset määritettiin käyttäen mutaation-positiivisten ja negatiivisten kontrolli DNA-näytteitä. Virtsan prosessoidut näytteet sekä suodattamalla ja sedimentoitumisen, ekvimolaariset määrät DNA: ta käytettiin templaattina.

DNA metylointianalyysi

DNA: ta (500 ng), käsiteltiin bisulfiitilla käyttäen EZ DNA Metylointi -kullattu Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA), eluoitiin 20 ul: aan M-eluutiopuskuria ja varastoitiin 80 ° C: ssa. Kvantitatiivinen analyysi metylaatiotasoilla klo promoottori CpG saaret

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

SALL3

ja

VIM

suoritettiin käyttäen TaqMan-pohjainen reaaliaikainen PCR (MethyLightTM) määritykset, käyttäen aikaisemmin kuvattuja alukkeita, koettimia ja olosuhteet [17]. Reaktiot suoritettiin LightCycler 480 alustalla käyttäen LightCycler 480 Probes Master Kit (Roche, Mannheim, Saksa) ja 1 ui bisulfiitti-käsitellyn DNA kohti reaktiota.

In vitro

metyloitua DNA (IVM; CpGenomeTM Universal Metyloidut DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) ja koko-genomin monistettu DNA toimi positiiviset ja negatiiviset kontrollit metylaation, vastaavasti. Metylaatiotasoilla laskettiin prosenttia metyloituja viite (PMR, Ref. [23]) normalisoimalla markkeri-spesifisen reaktion arvoja

ALUC4

arvot suhteessa samat arvot täysin metyloitu ohjaus (IVM). Näytteitä, joiden pitoisuudet ovat alle vastaa 0,25 ng /ul kuin bisulfiitti-käsitellyn DNA jätettiin pois. Kunkin merkki, cut-off-arvo, josta näyte pidettiin positiivisena määritettiin analysoimalla DNA suodatettua virtsaa 11 terveiden verrokkien [17]. Cut-off PMR-arvot

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

ja

VIM

olivat 3, 2, 0,5 ja 2, vastaavasti, kun taas ei tausta vahvistus havaittiin

BCL2

,

CCNA1

ja

EOMES

.

tulokset

pääpiirteet suodatuksen laitteen

prototyyppi suodatuksen laitteen ja sen yksittäiset komponentit on esitetty kuviossa 1. koko laite kokoonpano käsittää 1) suodatusyksikön suodattamiseksi biologisen nesteen näytteestä, 2) irrotettava suodatinpatruuna, joka sisältää suodattimen, joka soveltuu syömällä kyseisen aineiston ja 3) tallennusyksikön valmistelusta ja /tai säilyttää suodatin sisältöä. Suodatuslaitteisto on kokoelma kammio, jäte säiliö ja suodatin tukialusta asuntojen irrotettava suodatinpatruuna (kuvio 1A). Nämä kolme osaa on yhdistetty, jotta fluidin kokoamiskammiosta jätesäiliöön suodattimen läpi suodatinpatruunan (kuvio 1B). Keräyskotelo muodostuu sylinterimäisestä pussin ympäröi kierrejousi, joka voidaan manuaalisesti puristaa aikaan paineen, joka pakottaa nesteen suodattimen läpi (kuvio 1C). Suodatin tukialustan sisältää venttiilin, joka vapautuu korkeassa paineessa, jos suodatin tukkeutuu materiaalia, jotka mahdollistavat suoran fluidin kokoamiskammiosta jätesäiliöön. Jätesäiliöön sisältää vaimentavaa materiaalia, jotta hävittämiseen laitteen ja nesteen jäte. Prototyyppi laite on suunniteltu enintään nesteen tilavuus on 500 ml mahtuu ja käsitellä koko virtsan onteloita.

Suodatuksen jälkeen suodatinpatruuna suodatin voidaan poistaa suodatuksen yksikön ja työnnetään tallennusyksikköön (kuvio 1 D). Kansi säilytysyksikön sisältää sopivan käsittely tai varastointi ratkaisu, joka vapautuu suodattimen päälle, kun kansi on asennettu. Kun sitoutuneita suodatinpanos ja kansi, varastointi yksikkö muodostaa suljettu kokoonpano, joka voidaan helposti ja turvallisesti kuljettaa (kuvio 1 E). Kun vastaanotetaan analysaattori, otettu biologinen materiaali voidaan helposti hakea tallennusyksiköstä poistamalla kansi.

arviointi laitteen suorituskykyä

malli järjestelmä arvioi kykyä laitteen kaapata ja luetella kasvainsolujen nesteen näytteistä, käytimme 639V urothelial carcinoma cell line, jossa on pistemutaatio (p.R248C) koodaavan geenin fibroblastikasvutekijäreseptori 3 (

FGFR3

) menetys vastaavan villityypin alleelin (S1 Kuva). Ensimmäisessä koesarjassa, 100 ml PBS: ää, joka sisältää välillä 1,000 ja 5 x 10

6 639V soluja (halkaisija, 11-18 um) lisättiin kokoamiskammio laitteen ja pakotetaan polykarbonaattimembraanille suodatin huokoskoko 8 pm. Kvantifioimiseksi solujen lukumäärä jää suodattimen, poimimamme kokonais-DNA, ja määritetään määrä mutantti

FGFR3

molekyylejä käyttäen pisaran digitaalisen PCR (ddPCR) määritys. Tässä asetelmassa, yksi positiivinen tapahtuma vastaa yhden solun. Positiiviset signaalit toistettavasti saatiin kaikilla näytteillä, kun 2 ui (4%), uutetun DNA: ta käytettiin templaattina ddPCR (kuvio 2A). Erityisesti alimman solujen pitoisuus (1000 100 ml), elpyminen oli ~ 70% (kuvio 2B). Suuremmilla pitoisuuksilla solujen oli laskua hyötykäyttöaste, alas ~ 5% 5 x 10

6 solua /100 ml. Tämä alhaisempi saanto oli odotettavissa kyllästymistasona suodattimen aiheuttaa vapautumisen paineventtiili ja suoran virtauksen jäljellä nestettä ja sen solu- sisältö jätesäiliöön. Tämä alustava testaus viittasi siihen, että suodatus laitetta voidaan käyttää tehokkaasti vangita virtsarakon syöpäsolujen nestettä, ja että perintäaste on erityisen korkea pienillä pitoisuuksilla soluja, joissa kapasiteetti suodatin ei ole vielä saavutettu.

PBS: ää (100 ml), joka sisältää välillä 1,000 ja 5 x 10

6 639V soluja käsiteltiin käyttäen laitetta, johon on asennettu 8-um huokoskoko polykarbonaatti kalvosuodattimella. DNA uutettiin suodattimien ja testattu mutantti

FGFR3

(p.R248C) molekyylejä käyttäen ddPCR. DNA normaalista ääreisveren lymfosyytit käytettiin kontrollina villityypin

FGFR3

. A, ddPCR fluoresenssin amplitudi juoni. Pystysuorat viivat edustavat käsin sulku asetuksia. Esitetyt tulokset ovat yhdestä kahdessa riippumattomassa kokeessa. B, Bar kuvaava numero talteen solujen (laskettu mutanttien

FGFR3

molekyylit) suhteessa määrä syöttää soluja. Kokonaismäärät mutantti molekyylejä laskettu kolmen itsenäisen ddPCR testejä, joista kukin on mutantti molekyylejä 4% koko DNA-näytteen. Tiedot kolminkertaisten mittausten (kukin 4% koko DNA) yhden kokeesta esitetään keskiarvoina ± SD. Yläpuolella olevat prosenttiosuudet palkit edustavat useita talteen solujen suhteen syötettyjen soluja.

kyvyn testaamiseksi, että suodatuksen laitteen pitoisuuden lisäämiseksi virtsarakon syövän solujen läsnä taustalla pienempikokoisten normaalit solut, me piikki välillä 1000 ja 50000 639V solut 100 ml: aan PBS: ää, joka sisälsi 10

7 normaalia puhdistettua ihmisen viljeltyjen lymfosyyttien (halkaisija 7-8 um) ja käsitellään suspensiota käyttämällä suodatuslaitteessa. Analyysi DNA: ta suodattimia ddPCR osoitti signaaleja sekä mutantti (p.R248C) ja villityypin

FGFR3

(kuvio 3A). Mikä tärkeintä, hyötykäyttöaste on mutantti-DNA oli samanlainen kuin saavutetaan puhtaalla liuoksilla 639V soluissa (kuvio 3B). Vaikka näytteiden käsittelyä suodattamalla poisti suurimman osan lymfosyyttejä ( 99%), oli yhdenmukainen tausta villityypin

FGFR3

alleelit (kuvio 3), joka voi olla peräisin jäljellä monosyyteistä (halkaisija, 15-25 um) läsnä lymfosyyttivalmisteita.

välillä 1000 ja 50000 639V solut oli lisätty 10

7 normaalin lymfosyyttien 100 ml: aan PBS: ää, ja suspensiota käsiteltiin käyttäen suodatuksen laitetta. DNA uutettiin suodattimista ja testattu mutantti (p.R248C, mut) ja villityypin (WT)

FGFR3

avulla ddPCR. A, ddPCR fluoresenssi amplitudi kuvaajia

FGFR3

R248C-FAM-koetinta fluoresenssisignaalisuhteet (sininen, yläpaneeli) ja

FGFR3

WT-HEX koetin fluoresenssisignaalisuhteet (vihreä, alempi paneeli). Pystysuorat viivat edustavat käsin sulku asetuksia. Esitetyt tulokset ovat yhdestä kahdessa riippumattomassa kokeessa. B, Bar kuvaava numero talteen solujen (laskettu mutanttien ja WT

FGFR3

molekyylit) suhteessa määrä syöttää syöpäsoluja. Yhteensä määrä on

FGFR3

molekyylit laskettu kolmen itsenäisen ddPCR testejä, joista kukin käyttää 4% kokonais-DNA: ta templaattina, ja ne ovat edustettuina keskiarvoja ± SD. Prosenttiosuudet yläpuolella palkit edustavat useita talteen solujen suhteen syötettyjen soluja.

arvioimiseksi vaihtelun tulokset, olemme suodatettiin 100 ml: aan PBS: ää, joka sisälsi 500, 1000 tai 5000 97-7-soluja (halkaisija, 18-25 um), joissa jokaisessa on 3-5 datapistettä kolmen erillisen kokeen. DNA eristettiin ja määrä mutantti

FGFR3

(p.S249C) molekyylien kvantitoitiin käyttäen ddPCR. Tässä mallissa sisäiset näytteen vaihtelu oli yleensä alhainen ja laski suurempien solujen määrä (S2 Kuva).

Detection virtsarakon syövän virtsanäytteitä

vieressä arvioinut laitteen suorituskyky jalostamalla virtsaa kerättiin 59 potilasta välittömästi ennen TURB. Kaikki potilaat olivat ilmeni merkkejä virtsarakkokasvain kun tutkitaan ensin fluoresenssilla ohjatun joustava kystoskopia. Pohjalta histopatologisissa koepaloja, 33 potilasta oli diagnosoitu rakkokasvaimista, kun taas loput 26 potilailla oli hyvänlaatuinen vaurioita tai normaali virtsarakkoepiteeliin. Taulukot 1 ja 2 esittävät demografiset ja patologian tiedot näille potilaille. Suurin osa kasvaimista olivat invasiivisen (vaihe Ta; 73%), yksi oli papillaarinen urothelial kasvain alhainen pahanlaatuistumisriskin (PUNLMP), kaksi luokiteltiin kasvaimen in situ (Tis), neljä oli vaihe T1 ja kaksi vaiheessa T2. Kaksikymmentä kasvaimet (61%) oli huono laatu.

Sen testaamiseksi, onko suodatus voisi lisätä suhde normaali-to-kasvainsoluja, me testattiin ensin 13 virtsanäytteistä on split näyte setup, jossa 25 ml kutakin näytettä sentrifugoidaan, ja loput käsiteltiin suodattamalla. DNA eristettiin kaikista suodatin ja sedimenttinäytteet seulottiin neljä yhteistä

FGFR3

mutaatioita (p.R248C, p.S249C, p.G370C ja p.Y373C) käyttäen ddPCR. Kahdeksan näytettä (58%) olivat positiivisia yhdessä näistä mutaatioista (taulukko 1). Kvantitatiivinen analyysi käyttäen ekvimolaariset määrät yhteensä DNA suodattimet ja sedimenttien osoitti, että suhde mutantti-to-villityypin DNA oli suurempi suodatetuista näytteistä kuin vastaavalla sedimenttien (taulukko 3). Mikä tärkeintä, suurin rikastusta (6,5 ja 8,0 kertaa, vastaavasti) saavutettiin kahden näytteen edustava alin mutantti-to-villityypin suhteet (kuvio 4).

virtsanäytteet virtsarakon kasvaimia jaettiin kahteen osaan ja käsitellään laitteella suodattamalla ja sedimentaatio, vastaavasti. Ekvimolaariset määrät DNA suodattimien ja sedimenteistä testattiin

FGFR3

mutaatioita käyttämällä ddPCR.

Kaikki loput virtsanäytteet käsiteltiin suodattamalla yksin, ja DNA uutettiin ja tutkittiin for

FGFR3

mutaatioita käyttämällä ddPCR ja seitsemän DNA-metylaatio markkereita (

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

ja

VIM

) käyttäen MethyLightTM määrityksiä. Useat tutkimukset virtsarakon syövän ovat raportoineet korkeat herkkyydet ( 50%) ja erityispiirteet ( 90%) Näiden merkkiaineiden rakkokasvaimista [7,8,24], ja koska paneeli ne antoivat herkkyys on 94% [17 ].

mediaani DNA saanto virtsanäytteistä päässä 33 virtsarakon kasvaimia oli 138 ng (vaihteluväli 6,3 3600 ng). Vuonna kaksi näytettä potilailta on matala-asteinen Ta kasvainten määrä DNA jälkeen vetysulfiittikäsittelyä oli riittämätön analyysi koko biomarkkereiden paneeli. Taulukko 1 esittää tulokset jäljellä 31 näytettä. Yhdeksäntoista näytteet sisälsivät

FGFR3

mutaatioiden (61%), jossa suurin osa mutaatioista on p.Y373C (50%) ja p.S249C (45%). Yksi näyte sisälsi p.Y373C ja p.S249C. Kaikkiaan 118 promoottorin hypermetylaatio tapahtumaa löydettiin 29 näytettä (94%), ja keskimäärin 4,1 (vaihteluväli 1-7) tapahtumaa kohti näytettä. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [8,17], korkein herkkyys saatiin

VIM

, joka oli positiivinen 81%: ssa tapauksista. Kuusi muuta markkereita oli herkkyydet vaihtelevat 74% (

HOXA9

) ja 29% (

EOMES

). Nämä kaksi näytettä negatiivinen kaikkien mutaatiota ja metylaation merkkiaineet olivat potilaalta, jolla PUNLMP ja potilaan kanssa heikompilaatuisen Ta kasvain, vastaavasti.

Mediaani DNA saanto virtsanäytteistä kerätty 26 potilasta, joilla on hyvänlaatuinen histopatologia oli 271 ng (vaihteluväli 21 1605 ng). Yhteensä 30 promoottorin hypermetylaatio tapahtumaa löydettiin 13 näytettä (50%), ja keskimäärin 2,3 (vaihteluväli 1-5) tapahtumaa kohti näytettä. Loput näytteet olivat negatiivisia kaikki merkit. Profiili positiivinen merkkiaineiden tässä potilasryhmässä oli erilainen kuin potilailla, joilla on kasvaimia, joissa

SALL3

(26%),

CCNA1

(22%) ja

POU4F2

(19%) on yleisin. Positiiviset metylaatio markkereita havaittiin 8 ulos 12 potilaalla (67%), joka oli aiemmin hoidettu virtsarakon syövän ja otettiin seurata ja 5 ulos 14 potilaalla (36%), joilla ei ollut aiemmin ollut virtsarakon syöpä . Vain yksi, joilla on hyvänlaatuinen virtsarakon patologiaa, oli

FGFR3

mutaatio havaittavissa virtsassa. Tämä potilas oli myös positiivinen viisi metylaation markkereita ja oli diagnosoitu heikompilaatuisen Ta kasvainta toista kystoskopian 6 kk kuluttua negatiivisen TURB.

Keskustelu

Olemme kehittäneet ja testanneet suodatus laite helppojen ja edullinen keruu ja käsittely diagnostisten solujen virtsasta. Laitetta voidaan käyttää potilaiden tai terveydenhuollon tarjoaja voi näytteen jotka sopivat DNA-analyyseissä. Puskuri tallennusyksikköön takaa pitkän aikavälin vakaus DNA huoneenlämmössä, joka tarjoaa runsaasti aikaa lähettää näytteen testaus laitokseen käyttäen standardia postijärjestelmän. Yksinkertainen menettely tarjoaa virtsan solut voivat suuresti vähentää tarvetta välisen suoran kosketuksen potilaan ja terveydenhuollon järjestelmä, ja se voisi olla houkutteleva vaihtoehto alhainen resurssiasetukset jossa cystoscopy ei voida vakio- virtsarakon syövän havaitsemiseen. Painopiste tässä tutkimuksessa oli virtsarakon syöpä, mutta samaa lähestymistapaa voidaan soveltaa myös muihin urogenitaalinen syöpien, kuten ylempi virtsateiden kasvaimet [4] sekä muut olosuhteet, joissa analyysi virtsan solujen on diagnostinen, prognostista tai terapeuttista arvoa.

tippakokeilla, olemme osoittaneet, että suodatus laite oli, joka pystyy kaappaamaan kasvainsolujen samalla poistaa suuri ylimäärä pienempikokoisten soluja. Lisäksi analyysi virtsanäytteiden potilailla, joilla on virtsarakon syöpä osoittivat, että suodatus lisääntynyt suhde kasvaimen-to-normaaleihin soluihin verrattuna sedimentaatio solujen sentrifugoimalla, erityisesti näytteitä, joissa tämä suhde oli alhainen. Huomattakoon kuitenkin, että elpyminen ja rikastaminen solujen suodattamalla riippuu useista muuttujista, mukaan lukien solujen ominaisuudet (esim koko ja muodonmuutoksenkestoa), suodattimen ominaisuudet (esim huokoskoko, määrä huokosia, väli huokoset ja suodatin materiaali) [25] ja suodatuksen parametrit (esim, virtausnopeus ja paine-suodatin) [26].

saaneista potilaista, jotka oli virtsarakon kasvain vahvistettiin histopatologinen tutkimus, virtsa DNA oli positiivinen ainakin yhden testatuista biomarkkerit (

FGFR3

mutaatioita ja promoottori hypermetylaation tapahtumat) 94%: ssa tapauksista. Tämä luku oli rohkaisevaa ottaen huomioon, että suurin osa potilaista tässä kohortissa esittelyyn pienet ei-invasiivisia kasvaimia, jotka ovat yleensä vaikea havaita virtsasta, koska ne irtoa suhteellisen vähän soluja [27]. Silti suurempia mahdollisille tutkimuksia edellytetään edelleen arvioitava mahdollisuudet tämän lähestymistavan havaitsemiseksi virtsarakon syövän diagnostisessa ympäristössä. Korkea havaitsemisherkkyyden rakkokasvaimista saavutettu tässä tutkimuksessa voi ainakin osittain katsoa johtuvan suurten määrien (täynnä tyhjiä tiloja) virtsan käsitelty. Zuiverloon et ai. [14] osoitti, että herkkyys DNA-pohjainen havaitseminen rakkokasvaimista kasvoi suhteellisesti lisäämällä virtsan määrä ja että luotettavin koe saavutettiin pohjalta 24 tunnin kokoelma virtsan solujen samanlainen standardin menettelyjä kokoelma raa’an virtsan diagnosointiin muita ehtoja kuten porfyria ja munuaisten vajaatoiminta. Tässä suhteessa kuvattua laitetta tässä voi helpottaa usein ja toistuvasti näytteenotto.

Lähes puolet potilaista kohdistuu TURB johtuen kasvaimen rutiininomaisella joustava kystoskopian ei havaittu satama siirtymäajan kasvain on biopsianäytteistä . Mielenkiintoista on, virtsa- näytettä puolet näistä potilaista oli positiivisia yhdelle tai useammalle DNA-metylaatio markkereita, vaikka nämä merkit ovat negatiivisia virtsasta terveiltä yksilöiltä. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet promoottori hypermetylaation normaalipainoisilla esiintyvät uroteeliin potilailta virtsarakon syöpä [28], mikä osoittaa epigeneettisestä kenttään vika ”. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA-metylaatio biomarkkerit voidaan havaita virtsassa vuotta resektio virtsarakon kasvain puutteesta huolimatta toistumisen [29,30]. Epigeneettiseltä muuttunut laikkuja uroteeliin fenotyypiltään erottaa normaalista uroteeliin voi edustaa esiasteleesioita virtsarakon syövän ja saattaa selittää suuren toistumisen määrä. Siksi on mahdollista, että potilaalla on DNA-metylaatio markkereita havaittavissa virtsassa saattaa olla suurentunut riski sairastua virtsarakon syöpään myöhemmin elämässä. Toisin kuin korkea esiintyvyys

FGFR3

mutaatioita virtsaa potilaalla on vahvistettu virtsarakon kasvain (67%), vain yksi, joilla on hyvänlaatuinen histopatologia oli

FGFR3

mutaatio havaittavissa virtsassa. Kiinnostavaa kyllä, tämä potilas oli diagnosoitu virtsarakkokasvain puolen vuoden kuluttua, mikä viittaa siihen, että virtsa DNA-testillä voidaan havaita joitakin rakkokasvaimista aikaisemmassa vaiheessa kuin TURB menettely.

suodatuslaite tehokkaasti kaappaa soluja suurten virtsa ja tiivisteet ja tallentaa ne kätevästi kuljetusta ja loppupään testaus.