Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisääntynyt lipogeneesiin on tunnusmerkki erilaisia ​​syöpiä ja on erityisen tutkimuksen mahdollisina antineoplastisia kohde. Vaikka reipas lipogeneesiä havaitaan läsnäollessa eksogeenisen lipidien, todisteet asennus että nämä lipidit voivat vaikuttaa haitallisesti tehoon estäjiä lipogeeniset polkuja. Siksi hyödyntää täysimääräisesti mahdollisesta terapeuttisesta lipidisynteesiin estäjien, ymmärtää paremmin keskinäisistä suhteista

de novo

lipidisynteesiin ja eksogeeniset lipidejä ja niiden roolia syöpäsolujen lisääntymistä ja terapeuttinen vaste lipogeneesiin estäjiä on kriittisen merkitys. Tässä osoitamme, että leviämisen eri syöpäsolulinjoissa (PC3M, HepG2, HOP62 ja T24) vaimennetaan, kun viljellään lipidi-vähennetty olosuhteissa cell line-riippuvaisella tavalla, ja PC3M on vähiten vaikutusta. Mielenkiintoista, kaikki solulinjat – lipogeeniset (PC3M, HepG2, HOP62) sekä ei-lipogeeniset (T24) – kohottivat lipogeeniset aktiivisuutta näissä olosuhteissa, vaikkakin eri asteisesti. Solut, jotka saavuttaneet korkeimmat lipogeeniset aktiivisuutta näissä olosuhteissa oli parasta selviytyy lipidien vähentämisen aikavälillä proliferatiivisen kapasiteetin. Lisävakuutta väliaineen erittäin alhainen lipoproteiinien, vapaita rasvahappoja ja kolesterolia päinvastaiseksi tämän aktivoinnin, mikä osoittaa, että pelkkä puute lipidien riittää aktivoimaan

de novo

lipogeneesiä syöpäsoluja. Niinpä syöpäsolut kasvatettu lipidien vähennetty muuttuivat riippuvaisempia

de novo

lipidisynteesiin reittejä ja olivat herkempiä estäjiä lipogeeniset polkuja, kuten Soraphen A ja simvastatiini. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että pääsyrajoitukset ulkoisille lipidejä, kuten voi tapahtua ehjä kasvaimissa aktivoi

de novo

lipogeneesiin on syöpäsoluja, auttaa heitä menestyä näissä olosuhteissa ja tekee niistä alttiimpia rasvanmuodostukseen estäjiä. Nämä havainnot ovat merkittäviä vaikutuksia suunnitella uusia antineoplastisen strategioita kohdistaminen syöpäsolun n rasva-aineenvaihduntaan.

Citation: Daniëls VW, Smans K, Royaux I Chypre M, Swinnen JV Zaidi N (2014) Cancer Cells Differentially Aktivoi ja Viihtyy

De Novo

lipidisynteesiin Pathways in Low-Lipid Environment. PLoS ONE 9 (9): e106913. doi: 10,1371 /journal.pone.0106913

Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Ranska

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 03 elokuu 2014; Julkaistu: 12 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Daniëls et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia: Scientific Research Foundation-Flanders (FWO, https://www.fwo.be/en/) G.0691.12 (JVS), KU Leuven koordinoivan Research Actions (GOA, https://www.kuleuven.be/onderzoek/kernprojecten/goa.htm) GOA /11/2009 (JVS), ja Interuniversity Attraction Sauvat – Belgian liittovaltion Science Policy Office (IAP Belspo, https://www.belspo.be/belspo/index_en.stm) IAP7-32 (JVS). VWD on tutkimusavustajana tieteellisen Research Foundation-Flanders (FWO) ja Flanderin League syöpää vastaan ​​(VLK, https://www.tegenkanker.be/home). Tekijäkumppaneita KS, IR, MC, ja NZ työskentelee Janssen Pharmaceutica NV. Janssen Pharmaceutica NV tuettiin muodossa palkkojen tekijöille KS, IR, MC ja NZ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Muut tekijät Karine Smans, Ines Royaux, Melanie Chypre ja Nousheen Zaidi työskentelee Janssen Pharmaceutica NV. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

nopeasti lisääntyviä syöpäsolut tarvitsevat jatkuvaa tarjontaa lipidien kalvon biogeneesiä ja proteiinia muutoksia. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että jotta selviytyä näistä yhä kasvaviin, syöpäsolut joko lisätä imeytymistä lipidien tai aktivoida

de novo

lipidisynteesiin [1] – [5]. Parannettu rasvahappojen synteesi on löydetty 20%: sta 90% kasvainten monentyyppisiä ja heijastuu ylössäätöä keskeisten osallistuvien entsyymien tämän reitin [1]. Näitä ovat rasvahappojen nopaliinisyntaasin (FASN), asetyyli-CoA-karboksy- alfa (ACACA) ja ATP-sitraattilyaasi (ACLY). Lukuisat raportit osoittavat, että aktivoituminen näiden entsyymien tapahtuu alavirtaan kasvutekijän signalointi ja muita onkogeenisten tapahtumien, riippumatta siitä, sisältääkö ekstrasellulaarisen lipidien [1], [6] – [12]. Myös kolesterolin synteesiä, kautta mevalonaatin reitissä on aktiivinen monissa syöpäsoluja. Tärkeää on, esto rasvahappojen synteesi tai kolesterolin synteesiä väyliä RNA häiriöitä tai kemiallisia estäjiä johtaa kasvun pidättämiseen lipogeeniset kasvainsolujen, sekä

in vitro

ja

in vivo

, tekee näistä entsyymeistä kiinnostaviksi antineoplastisten terapiassa [1], [13] – [19]. Valitettavasti sytotoksisia vaikutuksia aiheuttama inhibitio

de novo

lipidisynteesiin reittiä näyttää voidaan torjua läsnäolo eksogeenisen lipidien tai välituotteen aineenvaihduntatuotteiden [13], [20], [21]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että se on riippuvuus

de novo

lipidisynteesiin, joka määrittää vastauksen syöpäsolujen inhibition Näitä reittejä ja että solunulkoinen lipidejä saattaa vaarantaa terapeuttisia hyötyjä näiden estäjien.

täällä, jotta saat paremman käsityksen monimutkainen vuorovaikutus eksogeenisia lipidien ja

de novo

lipidisynteesiin reittejä syöpäsoluissa ja tutkia, miten tämä vuorovaikutus voi vaikuttaa tehokkuuteen lipidejä kohdistaminen antineoplastiset hoitoja, tutkimme vaikutus lipidien puute soluproliferaatioon ja vastaus lipogeeniset esto eri vakiintunut lipogeeniset ja vähemmän lipogeeniset tasyöpäsolulinja malleja. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että lipidejä vähennetty kasvuympäristön differentiaalisesti vaikuttaa syöpäsolujen kasvun solulinjoissa ja on riittävä kytkemään

de novo

lipogeneesiä reittejä jopa syöpäsolulinjoissa, joita pidetään ei-lipogeeniset. Tämä aktivointi auttaa syöpäsoluja säilyttää proliferaationopeus alhaisen lipidejä ympäristössä ja tekee ne herkempiä rasvanmuodostukseen estäjiä. Nämä tiedot korostaa uudelleen heterogeenisuus syöpäsolujen suhteen niiden aineenvaihdunnan vaatimuksiin, ne korostavat solunulkoisen olosuhteet ja on merkittäviä vaikutuksia parannettu muotoilu terapeuttisia strategioita, jotka perustuvat manipulointiin rasva vaatimusten syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoitoja

Kaikki solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Soluviljelmässä reagenssit hankittiin yhtiöltä Invitrogen, ellei toisin mainita. PC3M solulinja viljeltiin HyClone MEM /EBSS väliaineessa (Thermo Scientific), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 mM natriumpyruvaattia, 10 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, 2 mM L-glutamiinia, 50 ug /ml Gentamysiini ja 1X BME vitamiinit (Sigma). HOP62-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. HepG2-soluja viljeltiin MEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 50 ug /ml gentamysiiniä, 100 mM natriumpyruvaattia, 0,37 g /l natriumbikarbonaattia, 10 mM ei-välttämättömiä aminohappoja. T24-solulinja, viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 50 ug /ml gentamysiiniä. Kaikki solulinjat kasvatettiin ilmakehässä 5% CO

2 ja 37 ° C. Lipidien-pelkistävissä olosuhteissa media oli täydennetty 10%: HyClone lipidi-vähennetty FBS (Thermo tieteellinen). Erot lipidejä ja niihin liittyvät osat normaalissa verrattuna lipidien vähennetty FBS luetellaan Täydentävä taulukossa S1. Simvastatiini ostettiin Merck Sharp. Soraphen A saatu Dr. R. Jansen, Helmholtz-Zentrum f. Infektionsforschung, Mikrobielle Wirkstoffe, Braunschweig, Saksa [22], [23]. Vesiliukoinen kolesteroli, glyseryylimonostearaatti trilinoleate ja glyseryylimonostearaattia trilinolenate hankittiin Sigmalta. Erittäin alhaisen tiheyden lipoproteiinien (VLDL) saatiin Merck Millipore. Sillä viljelemällä soluja kun läsnä on eri rasvahappojen seoksia, palmitiini- (16:0), öljyhappo (18:1), linolihappo (18:2), α-linoleenihappo (18:3), arakidonihapon (20:4) ja dokosaheksaeenihappo (22:6) happo (Sigma) kompleksoitu rasvahappo-vapaata BSA: ta (Sigma), kuten aiemmin on kuvattu [18], ennen lisäystä viljelyalustaan. Triglyseridit inkuboitiin normaalissa tai lipidejä vähentää FBS: ää 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ennen lisäämistä viljelyväliaineeseen.

immunoblottaus-analyysi

Yhtä suuret määrät proteiineja ladattiin esivalettuja geelejä (NuPAGE, Invitrogen), siirrettiin PVDF-kalvoille ja inkuboitiin vasta-aineiden ACLY (monoklonaalinen kani, ab40793, Abcam), FASN (monoklonaalinen kani, 3180, Cell Signaling) ja β-aktiini (monoklonaalinen hiiren, Sigma). Membraanit pestiin ja tutkittiin vuohen anti-kani-konjugoitu Alexa Fluor 680 (Invitrogen) sekundäärisiä vasta-aineita. Fluoresoiva signaali mitattiin sitten käyttäen Licor Odyssey-järjestelmä (LI-COR Biosciences).

Proliferaatiomääritys

PC3M ja HOP62 solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solut ml

-1 24-kuoppaisille kudosviljelymaljoille (Nunc). T24 soluja ympättiin 2 x 10

4 solut ml

-1 24-kuoppaisella kudosviljelylevyllä. HepG2-solut ympättiin 2,5 x 10

4 solut ml

-1 Poly-D-lysiini 96 kuopan mikrotiitterilevyt, musta /kirkas (BD Bioscience). Solut siirrostettiin normaalissa tai lipidejä vähentää väliaineessa. Kasvukäyrät konstruoitiin kuvalevyille käyttämällä

Incucyte järjestelmä

(Essen Instruments), jossa kasvukäyrät rakennettiin yhtymäkohta mittausten aikana hankitut ympäri vuorokauden kineettisen kuvantaminen. Määrittämiseksi solut numero solut kelluvat elatusaineessa yhdistettiin yhdessä kiinnittyneet solut jälkeen trypsinoinnilla. Cell värjättiin trypaanisinisellä ja laskettiin käyttäen Countess automatisoitua solulaskijalla (Invitrogen).

RNA: n eristys ja Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

kokonais-RNA viljellyistä soluista uutettiin ja DNaseI käsiteltiin käyttäen RNeasy Mini kit (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 3 ug kokonais-RNA toimi templaattina cDNA-synteesi käyttäen Oligo-dT-alukkeita ja Superscript III käänteistranskriptaasia tilavuudessa 20 ui 1 tunnin ajan 50 ° C: ssa. Tätä seurasi entsyymin inaktivoitumisen 70 ° C: ssa 15 minuuttia, suositusten mukaisesti valmistajan (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin ABI Prism 7900-HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) käyttäen qPCR core kit w /o dUTP (Eurogentec). Lämpötilasyklit olosuhteet olivat 10 min 95 ° C: ssa, jota seurasi 45 sykliä 15 s 95 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C: ssa. Validoitu ennalta suunniteltu Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems), joka vastaa siivous geenien TFRC (Hs00951083_m1) ja PGK1 (Hs00943178_g1) käytettiin tuottamaan standardi käyrät sarjalaimennoksia cDNA. Suhteellinen Standardikäyrä menetelmää käytettiin laskemiseen ilmaisua arvoja. Sen jälkeen normalisointi by TFRC tai PGK1- suhteellinen ilmaisu arvot laskettiin. Muut Taqman Gene Expression määrityksissä käytettiin tässä tutkimuksessa ovat: ACLY (Hs00982738_m1), ACSS2 (Hs00218766_m1), FASN (Hs01005622_m1), ACACA (Hs01046047_m1), HMGCR (Hs00168352_m1).

Kokonais-RNA T24-soluja valmistettiin käyttämällä PureLink RNA Mini Kit (Ambion). Puhtaus ja pitoisuus RNA arvioitiin käyttämällä NanoDrop DM-1000 spektrofotometrillä (Nanodrop Technologies). 3 ug RNA: ta kustakin näytteestä käytettiin templaattina cDNA-synteesiä varten käyttämällä satunnaisia ​​heksameerialukkeita ja Superscript II käänteistranskriptaasilla, mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen). Alukkeet suunniteltiin Primer-BLAST-ohjelmistoa NCBI, mikäli mahdollista alukkeet kattavat eksonin eksonin liitos valittiin. Spesifisyys Alukkeiden tarkistettiin sekvenssianalyysillä siinä Primer-BLAST-ohjelmiston ja sulaa käyräanalyysi. Kvantitatiivinen PCR kokeet suoritettiin 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) käyttäen Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Lämpötilasyklit olosuhteet olivat 20 sekuntia 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä, 3 sekuntia 95 ° C: ssa ja 30 sekuntia 60 ° C: ssa. Saatu Ct-arvot normalisoitiin käyttäen 18S kuin taloudenhoito geeni.

apoptoosimäärityksessä

Solut ympättiin normaalissa tai lipidejä vähennetty kasvuolosuhteet ja inkuboitiin ja käsiteltiin 72 tunnin ajan Soraphen tai simvastatiini. Apoptoosi arvioitiin käyttäen

Guava neksiini

kit ja

Guava PCA järjestelmä

(Guava Techinnologies). Guava neksiini määrityksessä käytetään kahta tahrat (anneksiini V ja 7-amino aktinomysiini D: [7-AAD]) määrittää prosenttiosuus apoptoottisten solujen. Solut, jotka värjäytyvät positiivisiksi sekä väriaineet ovat myöhemmissä vaiheissa apoptoosin, ennen solukuolemaan. Neksiini määritys suoritettiin valmistajan protokollan. Tiedot kerättiin ja analysoitiin Guava henkilökohtainen solun analyysi (PCA) -virtaussytometrissä käytön yhteydessä CytoSoft ohjelmisto (Guava Technologies). Noin 2000 solua analysoitiin.

3D soluviljelmässä

HepG2-soluja siirrostettiin ultra-low kiinnitys 96-kuoppaisille levyille (Corning Costar) tiheydellä 750 solua /kuoppa /200 ui väliaineessa . Solut ympättiin ja pidettiin normaaleissa tai lipidejä vähentää kasvua keskipitkällä ja tarkkailtiin 20 päivää. Sen jälkeen sferoidi muodostumista, 50% keskimääräisen tilavuuden korvattiin 3-4 päivän välein. Pallojen analysoitiin

IN Cell Analyzer

(GE Healthcare).

ATP määritys

solujen elinkelpoisuus käsittää pallojen määritettiin mittaamalla solun ATP sisältöä käyttämällä CellTiter- Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega) valmistajan protokollan. Lyhyesti, 100 ui ”CellTiterGlo-reagenssi” lisättiin kuoppiin, jotka sisältävät sferoidit. Ennen lisäämällä CellTiterGlo-reagenssi 100 ui väliaine poistettiin jokaisesta kuopasta. Pallojen hajotetaan ravistelemalla 10 minuuttia, minkä jälkeen pipetoimalla. 100 ui solususpensiota kustakin kaivosta siirretään valkoinen Optiplatella 96 (Perkin Elmer). Luminesenssi mitataan.

Lipid synteesi

Soluja viljeltiin 24-kuoppaisilla levyillä normaaleissa tai lipidejä vähentää väliaineessa. 72 tunnin jälkeen [

14C] -leimalla asetaattia (56 mCi /mmol, 0,2 uCi /kuoppa, Amersham Biosciences) lisättiin soluihin. 4 tunnin inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen trypsinoimalla ja pelletoitiin sentrifugoimalla. Lipidit uutettiin käyttäen modifioitua Bligh Dyer menetelmä, kuten aikaisemmin on kuvattu [19].

14C-sisällyttämisestä solulipideistä kvantitoitiin nestetuikelaskennalla käyttäen Packard 1600CA

Tri-Carb nestetuikelaskimella

(Packard Instrument Company). Saatu laskee normalisoitiin näytteen DNA-pitoisuus, ottaa huomioon erot solujen määrä 72 tunnin kuluttua lipidien vähennetty väliaineessa olosuhteissa.

Nanofluidic proteomiikka-analyysi

ilmentymistä esiaste ja aktiivinen muoto SREBP1 ja SREBP2 tutkittiin koko perustuva Yksinkertainen Western immunomääritys käyttäen Peggy NanoPro laite (Protein Simple). Proteiinin kokonaismäärän konsentraatio näytteistä määritettiin käyttäen BCA Protein Assay (Pierce). Yhtä suuri määrä näytettä valmistettiin Simple Western laimennospuskurilla, vähennetään ja denaturoitu ennen lastausta levylle. Levyt valmistettiin valmistuksen n menettelyä, käyttämällä kaikkia reagensseja Protein Simple. SREBP1 ja SREBP2 vasta-aineita (Active Motif, # 39939 ja # 39941), käytettiin 1:25 laimennus, α-tubuliinin-vasta-ainetta (Cell Signaling, # 2125): tä käytettiin 1:500 laimennus. Tiedot analysoitiin käyttäen Simple Länsi kompassi ohjelmisto. Proteiinin ilmentyminen (käyrän alapuolinen alue, AUC) korjattiin alfa-tubuliinin lastaus ohjaus (AUC SREBP /AUC alfa-tubuliinin).

Tilastollinen

Tulokset analysoitiin Students’t -testi (Excel) tai yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutesti (GraphPad Prism Software), tarvittaessa. P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvo ± S.D. kuten on osoitettu vastaava luku legendoja.

Tulokset

Lipid-vähennetty kasvuolosuhteista differentiaalisesti vaimentavat leviämisen nopeus Tuumorisolulinjojen

vaikutuksen tutkimiseksi rasva vähentämisen leviämisen ja eloonjäämisen syöpäsolujen valitsimme PC3M, HOP62, HepG2 ja T24 solulinjoissa. Kolme ensimmäistä solulinjat on raportoitu olevan lipogeeniset fenotyypin standardeissa soluviljelyolosuhteissa täysin seerumia. Havaitsimme edellisessä tutkimuksessa, että nämä solulinjat vaikuttivat ympäristön lipidejä [24]. Tämä oli odottamatonta, koska lipogeeniset solulinjoja pidetään pääosin riippuvaisia ​​

de novo

lipogeneesiin täyttämiseen niiden rasvahappojen vaatimus. T24-soluissa näyttää matalan lipogeeniset fenotyyppi näissä olosuhteissa ja sisällytettiin kontrollina solulinja [14], [24] – [26]. Kaikki nämä solulinjat kasvatettiin normaaleissa olosuhteissa väliaineessa, jossa oli 10% täydellinen seerumia tai 10% lipidejä see-. Incucyte reaaliaikaisen kuvantamisen ja trypaanisinieksluusiolla määritykset paljastivat, että viljelyn lipidien vähennetty olosuhteissa heikennetty solujen lisääntymistä eri solulinjojen eri määrin. HOP62 osoitti dramaattinen väheneminen kasvuvauhdin viljeltynä lipidejä vähennetty kasvuolosuhteet, jonka jälkeen HepG2 (kuva 1a-b). T24-solut olivat paljon vähemmän vaikutusta ja PC3M soluja ei vaikuttanut lainkaan (kuvio 1 a-b). Kuitenkin alhaisen lipidejä ympäristö ei indusoinut apoptoosia PC3M ja HepG2 solulinjoissa (Täydennyskuvio S1).

(a) leviämisen käyrät PC3M, HOP62, HepG2 ja T24-soluissa. Solut ympättiin ja viljeltiin normaalissa tai lipidejä pienentää keskipitkällä ja soluproliferaatiota seurattiin

Incucyte reaaliaikaisen kuvantamisen.

Paneelit oikealla puolella jokaisen leviämisen kaaviosta käy ilmi faasikontrastikuvassa vastaavan solulinjan molemmissa olosuhteissa. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) elävien solujen lukumäärä laskettiin käyttäen trypaanisinivärin sulkemismenetelmällä, 72 tunnin jälkeen viljelyn normaalissa (N) tai LR väliaineessa. * Merkittävästi erilainen (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), ei riittävä ei merkitsevä (p 0,05).

HepG2, joita on aiemmin osoitettu muodostavan kompakti 3D rakeita 3D soluviljelmämallissa järjestelmät [27] – [30], myös tutkineet vaikutukset rasva-vähentää olosuhteissa 3-ulotteinen (3D) soluviljelmässä, joka jäljittelee luonnollista kudosten ja elinten paremmin kuin 2-ulotteinen (2D) soluviljelmässä. Tavanomaisissa kasvuolosuhteissa ajasta riippuva kasvu koko pallosia havaittiin (kuvio 2a). Kuitenkin lipidi-vähennetty olosuhteissa HepG2-pallomainen kasvu oli täysin pidätettiin (kuva 2a). Päivänä 20, 5-kertainen suurempi sferoidit havaittiin normaaleissa kasvuolosuhteissa verrattuna lipidi-vähennetty kasvuolosuhteissa (kuvio 2a). Tämä heijastui myös elävien solujen lukumäärä, joka käy ilmi ATP mittaukset [31] (kuva 2b).

(a) faasikontrastimikroskopiaa esittää HepG2-pallomainen muodostumista. HepG2-soluja siirrostettiin normaalin ja LR väliaineen ultra-low kiinnityslevyt tiheydellä 750 solua /kuoppa, ja klusterin muodostumista seurattiin yli kaksikymmentä päivää ilmoitettu. Pallojen analysoitiin käyttämällä

IN Cell Analyzer 2000

väline. Ympärysmitta pallosia mitattiin käyttämällä

IN Cell Analyzer 2000 ohjelmisto.

(B) solujen elinkelpoisuus, joka käsittää pallojen määritettiin mittaamalla solujen ATP-sisältöä käyttämällä luminesenssin määritystä.

Syöpäsolut päälle

de novo

lipidisynteesiin väyliä lipidien vähennetty kasvuolosuhteet

soluproliferaation rasva vähennetty olosuhteissa odotetaan riippuu kyvystä syöpäsolujen tiivistetään tarvittava lipidien

de novo

. Kuitenkin meidän edellä mainittu leviämisen tiedot eivät vastaa lipogeeniset aktiivisuutta syöpäsolujen linjojen kasvatettu vakio-olosuhteissa, kuten kasvuvauhti matalan lipogeeniset T24-soluissa oli vähemmän vaikutusta kuin ne on lipogeeniset HOP62 ja HepG2-soluissa. Siksi arvioimme kyky solulinjojen aktivoida tämän reitin lipidi-vähennetty olosuhteissa. Ensin tarkistetaan vaikutus normaalin ja lipidi-vähennetty kasvun edellytykset, mRNA: n ekspression profiileja suurten geenien

de novo

lipogeneesiin reittejä: ATP-sitraattilyaasi (ACLY), sytosolinen entsyymi, joka katalysoi sukupolven asetyyli -CoA sekä rasvahappojen ja kolesterolin synteesiä, asyyli-CoA lyhytketjuisia perheenjäsen 2 (ACSS2), joka katalysoi synteesiä asetyyli-CoA asetaatista, rasvahappojen syntaasia (FASN), avain entsyymi osallistuu rasvahapposynteesissä ja hydroksimetyyli glutaryyli-reduktaasin (HMGCR), nopeutta rajoittava entsyymi kolesterolin synteesiä. Ct-arvot testattujen geenien osoitetaan Täydentävä taulukossa S2. Mielenkiintoista, näiden entsyymien ilmentymää nostettiin kaikissa solulinjoissa, mukaan lukien ei-lipogeeniset solulinjan T24, vaikkakin hieman eri määrin, jossa HepG2 on vähiten reagoiva (kuva 3a-d). Western blot-analyysi FASN ja ACLY osoittivat, että nämä entsyymit olivat eniten dramaattisesti säädellään ylöspäin lipidien vähennetty väliaineen PC3M ja vähiten HepG2 (kuvio 3e). Mukaisesti Näiden havaintojen steroli sääntely sitova proteiini 1 (SREBP1) ja SREBP2, jotka ovat tärkeimpiä säätelijöitä geenien ilmentymisen rasvahapon synteesiä ja mevalonaatin polku vastaavasti osoitti myös lisääntynyttä ilmentymistä (Täydennyskuvio S2) ja olivat edelleen aktivoitu proteiini tasolla lipidien vähennetty olosuhteet HOP62, PC3M ja T24-soluissa, mutta ei HepG2 (kuva 4 ilmoitus ja Täydennyskuvio S3). Hiilihydraatti-reagoivan elementin sitovan proteiinin (ChREBP), toinen tärkeä säätelijä ilmentymisen lipogeeniset geenien [32], on vain ilmaistu havaittavissa HepG2-soluissa (maksasyöpä solulinja) (Täydentävä kuvio S4a) ja tässä solulinjassa emme voineet havaita aktivointi ja tumaansiirtymiseen transkriptiotekijän, kun viljeltiin matalan lipidien olosuhteissa (Täydennyskuvio S4b). Vuonna PC3M The HOP62 ja T24 solulinjoissa, eturauhasen, keuhkojen ja munuaisten syöpäsolulinjoissa vastaavasti, emme voineet havaita ChREBP yhteensä solu-uutteiden tai ydin- jakeet, kun soluja viljeltiin lipidi-vähennetty kasvuolosuhteissa (Täydennyskuvio S4b). Nämä havainnot viittaavat siihen, että ChREBP ei keskeinen rooli lisääntymisessä lipogeeniset geeniekspression lipidejä vähennetty olosuhteissa.

Gene ilmentymä FASN, ACLY, ACSS2 ja HMGCR analysoitiin qPCR analyysi (a) HOP62 ( b) HepG2 (c) PC3M (d) T24-soluissa. Soluja viljeltiin normaalissa tai LR väliaine 48 tuntia. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D kolmesta näytteestä, normalisoitu TFRC varten HOP62, HepG2 ja PC3M tai 18S ja T24. * Merkittävästi erilainen (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), ei riittävä ei merkitsevä (p 0,05). (E) FASN ja ACLY ekspressiota proteiinin tasolla analysoitiin Western blot analyysi HOP62, HepG2, PC3M ja T24-solujen viljellään tavanomaisissa (N) tai LR väliaineessa 72 tunnin ajan. Beta-aktiini käytettiin latauskontrollina.

(a) edustaja virtuaalinen blot Simple Western-analyysi esiasteen ja aktiivisen SREBP1 ilmaisun HepG2, PC3M, HOP62 ja T24-solujen 72 tunnin kuluttua viljelyn normaalissa (N) tai LR väliaineessa olosuhteissa. Alfa-tubuliinin käytetään latauskontrollina. Eri altistukset esiasteen ja aktiivisen SREBP1 näkyvät jotta olla tarkka altistuminen molemmissa muodoissa. Alkuperäisen datan katso Täydennyskuvio S3a-d. (B) kvantitatiivinen analyysi Yksinkertainen Länsi. tiedot, ilmaistuna pinta-ala käyrän alla (AUC). Expression of SREBP1 korjattiin latauskontrollina alfa-tubuliinia. Kaavio edustaa keskiarvo ± S.D. (N = 2-3). (C) edustaja virtuaalinen blot Simple Western-analyysi esiasteen ja aktiivisen SREBP2 ilmaisun HepG2, PC3M, HOP62 ja T24-solujen 72 tunnin kuluttua viljelyn normaalissa (N) tai LR väliaineessa olosuhteissa. Alfa-tubuliinin käytetään latauskontrollina. Eri altistukset esiasteen ja aktiivisen SREBP2 näkyvät jotta olla tarkka altistuminen molemmissa muodoissa. Alkuperäisen datan katso Täydennyskuvio S3e-h. (D) Quantificative analyysi Yksinkertainen Länsi. tiedot, ilmaistuna pinta-ala käyrän alla (AUC). Expression of SREBP2 korjattiin latauskontrollina alfa-tubuliinia. Kaavio edustaa keskiarvo ± S.D. (N = 2-3).

vahvistavat meidän havainnot lisääntyneen ilmentymisen lipogeeniset geenien lipidien vähennetty olosuhteissa lipidisynteesiin määritettiin mittaamalla radioleimattujen asetaatti osaksi solulipideistä. Mukaisesti meidän muiden havaintojen

14C-acetetate inkorporaatio merkittävästi lisääntynyt PC3M, HOP62 ja T24 soluja, kun ne viljeltiin matalan lipidejä ympäristössä (kuva 5). HepG2-solut, jotka osoittavat jo korkea pohjapinta lipogeeniset aktiivisuutta, eivät näytä merkittävästi lisäävä säätely niiden lipidisynteesiin kun kasvatetaan lipidien vähennetty kasvualustasta. Vaikka HOP62 ja T24 voisi ajan säädellä

de novo

lipogeneesiin, he eivät voi nousta vain samantasoisen lipogeeniset toimintaa kuin HepG2-soluissa. Sitä vastoin PC3M solut voitaisiin säätää ylös heidän lipogeeniset aktiivisuus on paljon korkeampi kuin muihin soluihin linjat. Tämä antaa viitteitä, miksi nämä myöhemmin solut voitaisiin pitää normaali kasvu lipidejä vähensi olosuhteet ja kolme muuta solulinjat voinut. Nämä havainnot osoittavat, että lipidien riistää olosuhteissa syöpäsoluja, riippumatta siitä, ovatko ne lipogeeniset tai ei-lipogeeniset vakio viljelyolosuhteissa, on kyky säätää ylös

de novo

lipogeneesiin polkuja, olla se toiseen laajuus. Se, missä määrin solut ajan säädellä lipogeeniset väylän lipidejä vähennetty ympäristö määrittää niiden kyky pitää jakautuviin näissä olosuhteissa.

HepG2, PC3M, HOP62 ja T24-solujen kasvavat normaalissa tai LR väliaine 72 tuntia, inkuboitiin viimeiset 4 tuntia

14C-asetaatti. Cellular lipidit uutetaan ja sisällyttäminen

14C solu lipidien määritettiin tuikelaskennalla. Scintillation laskee normalisoitiin näytteen DNA-pitoisuus. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. * Merkittävästi erilainen (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), ei riittävä ei merkitsevä (p 0,05).

Up-regulation

de novo

lipidisynteesiin matalapaineen aiheuttamat lipidejä ympäristössä voidaan kumota VLDL ja voidaan katsoa johtuvan pula rasvahappojen ja kolesterolin

Seuraavaksi pyrki vahvistamaan, että induktio

de novo

lipogeneesiin alle lipidi-pelkistävissä olosuhteissa johtui erityisistä ehtyminen lipidien kasvualustasta. Lipidejä vähennetty seerumi valmistetaan poistamalla lipoproteiinien kuten hyvin matalan tiheyden lipoproteiinien (VLDL) [33], jotka ovat runsaasti triglyseridejä ja kolesterolia, selittää voimakas väheneminen näiden kahden lipidien meidän lipidien vähennetty FBS ( Täydentävät Taulukko S1), T24-soluja viljeltiin lipidi-pelkistävissä olosuhteissa, ja alustaan ​​lisättiin VLDL. Lisääminen VLDL vähentynyt ilmentymisen SREBP1a, SREBP1c ja SREBP2 (Täydennyskuvio S5a). Näin ollen ilmaus FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 ja HMGCR väheni myös merkittävästi (kuvio 6a). Tämä lasku ilmentymisen lipogeeniset geenien liitteenä oli alentunut aktiivisuus lipogeeniset reitin, joka määritetään

14C-asetaatti sisällyttäminen määritys (kuva 6d). Jos haluat määrittää, triglyseridien tai kolesterolin läsnä VLDL partikkeli aiheuttaa tämän lipogeneesiin estävä vaikutus, täydensimme solut triglyseridit tai kolesteroli yksin. Lisäksi triglyseridien ei kumonnut koholla lipogeneesiä havaittu T24 viljeltiin matalan lipidien kasvuolosuhteissa (Täydennyskuvio S6). Vapaat rasvahapot eivät kuitenkaan olleet johtaa merkittävään pelastus. Eri seokset tyydyttyneiden, mono- ja poly-tyydyttymättömiä rasvahappoja vähentynyt ilmentyminen SREBP1a, SREBP1c ja SREBP2 (Täydennyskuvio S5b). Näin ollen ilmaus FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 ja HMGCR väheni myös merkittävästi jälkeen rasvahapon lisäys (kuva 6b) ja sen mukana on alentunut aktiivisuus lipogeeniset reitin, joka määritetään

14C-asetaatti sisällyttäminen määritys ( Kuva 6e). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että eksogeeninen rasvahapot voivat vaikuttaa sääntelyyn

de novo

lipogeneesiä myös syöpäsoluja. Toisin rasvahappojen lisäksi täydentämistä lipidi-vähennetty kasvualustaan ​​kolesteroli ei johtaa alentuneeseen mRNA tasoilla SREBP1a, SREBP1c tai SREBP2 (Täydennyskuvio S5c), mutta silti vaikuttaa mRNA-tasoja loppupään lipogeeniset geenit, FASN, ACLY, ACSS2 ja HMGCR (kuva 6c). Tämä on sopusoinnussa aiempien raporttien osoittavat kolesteroli säännellä SREBP aktiivisuutta posttranslationaalinen tason sijasta translaatiotutkimukseen tasolla [34]. Kolesterolia aiheuttama lasku ilmentymistä lipogeeniset entsyymien liitteenä oli alentunut aktiivisuus lipogeeniset reitin (kuvio 6f), mikä osoittaa, että myös eksogeeninen kolesteroli vaikuttaa aktiivisuuteen lipogeneesiä reitin syöpäsoluissa.

Geenien ilmentyminen ja FASN, ACLY, HMGCR ja ACSS2 analysoitiin qPCR in T24-soluja viljeltiin 48 tunnin ajan normaalissa (N) tai LR kasvun olosuhteiden läsnä ollessa tai ilman VLDL (a), eri rasvahappojen seoksia (b) ja eri pitoisuuksilla kolesteroli (c). VLDL lisättiin pitoisuutena 607 ug triglyseridien /ml seerumia (vastaava pitoisuus triglyseridien normaalissa FBS). Rasvahapon (FA) seokset olivat seuraavat, FA Mix 1: 20 uM linolihappoa (18:2), 20 uM α-linoleenihappo (18:3), 5 uM arakidonihappoa (20:4), 5 uM dokosaheksaeenihappo (22: 6), FA Mix 2: 10 uM 18:2, 15 uM 18:3, 10 uM 20:4, 15 uM 22:6 ja FA Mix 3: 20 uM 18:2, 20 uM 18:3, 5 uM 20 :4, 5 uM 22:6, 30 uM öljyhappoa, 30 uM palmitiinihappoa. Eri kolesteroli (Ch) pitoisuudet ovat merkitty kuvioihin (25 uM, 50 uM tai 100 uM). Tulokset on normalisoitu 18S ja edustettuina keskiarvo ± S.D. (Kolmena kappaleena per koe ja n = 3). Merkitsevyys määritettiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä. * Merkittävästi erilainen (* p≤0,05; ** p≤0,01, *** p≤0,001; **** p≤0,0001) normaalista väliaine ohjaus.

#Significantly eri (

# p≤0,05;

## p≤0,01;

### p≤0,001;

#### p≤0,0001 ) LR ohjaus. (D, e, f)

14C-sisällyttämisestä solulipideistä määritettiin T24-soluissa, viljeltiin 48 tunnin ajan normaalissa (N) tai LR kasvuolosuhteet läsnä ollessa tai poissa ollessa VLDL (d), eri rasvahappojen seoksia