Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä on merkittävä kansanterveydellinen ongelma maailmanlaajuisesti. Yhdysvalloissa yksin, 1 4 kuolemia johtuu syövästä ja 2013 yhteensä 1.660.290 uutta syöpätapausta ja 580350 syöpään liittyvien kuolemien ennustetaan. Kattava profilointi useiden syövän genomien on paljastanut erittäin monimutkainen geneettinen maiseman, jossa on suuri määrä muuttunut geenejä, jotka vaihtelevat kasvaimen kasvain, vaikuttaa ydin biologisia polkuja ja prosesseja. Tämä vaikuttaa terapeuttiseen kohdentaminen signaloinnin verkkojen kehittämisessä hoitoja tiettyjen syöpien. NFKB transkriptiotekijä on konstitutiivisesti aktiivinen useissa hematologisen ja kiinteitä kasvaimia, ja monet signalointireittien osallisina syövän todennäköisesti kytketty NFKB aktivaatioon. Kriittinen välittäjänä NFKB toiminta on TGFli-aktivoitu kinaasi 1 (TAK1). Täällä tunnistaa TAK1 uutena vuorovaikutuksessa proteiini ja kohde fibroblastikasvutekijäreseptori 3 (FGFR3) tyrosiinikinaasiaktiivisuutta. Me osoittavat lisäksi, että aktivoivat mutaatiot FGFR3 liittyvät sekä useita myelooma ja virtsarakon syöpä voi moduloida geenien ilmentymisen, jotka säätelevät NFKB signalointi, ja edistää sekä NFKB transkriptionaalisen aktiivisuuden ja soluadheesiota tavalla riippuvaisia ​​TAK1 ilmaisun molemmissa syöpäsolutyyppien. Tulosten perusteella näyttää TAK1 mahdollisena terapeuttisena kohteena FGFR3 liittyvien syöpien ja muiden maligniteettien, jossa TAK1 edistää konstitutiivisen NFKB aktivaatioon.

Citation: Salazar L, Kashiwada T, Krejci P, Meyer AN, Casale M, Hallowell M, et al. (2014) fibroblastikasvutekijäreseptori 3 vuorovaikutuksessa ja Aktivoi TGFp-Activated Kinase 1 tyrosiinifosforylaatiolle ja NFKB Signaling multippelia myeloomaa ja virtsarakon syövän. PLoS ONE 9 (1): e86470. doi: 10,1371 /journal.pone.0086470

Toimittaja: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences keskus, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 elokuu 2013; Hyväksytty: 9. joulukuuta 2013. Julkaistu: 23 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Salazar ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Multippeli myelooma Research Foundation, Chao Family Kattava Cancer Center UCI, Elsa U. Pardee Foundation, opetus-, nuoriso- ja urheiluministeri Tsekin tasavalta (KONTAKT LH12004), Czech Science Foundation (P305 /11/0752). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on monimutkainen sairaus hankinnasta syntyneet somaattisten mutaatioiden että dysregulate signaalinvälitysreittien keskeinen solujen lisääntymisen ja eloonjäämisessä, angiogeneesissä, ja etäpesäke. Dysregulaatio FGFR3 signalointi on osallisena useissa syöpätyypeissä, erityisesti uroteelisyövässä (UC) ja multippelin myelooman (MM). Urothelial solukarsinoomat osuus on yli 90% virtsarakon syöpiä, joilla on maailmanlaajuinen esiintyvyys on yli 350.000 uuden vuotuisen diagnoosit ja sijoitus kolmanneksi yleisin maligniteetti miesten ja kymmenes yleisintä naisilla Yhdysvalloissa [1]. Yliekspressio tai aktivoimalla mutaatio FGFR3 on yleisin geneettinen muutos UC (katsaus esitetty [2]). Multippeli myelooma, syöpä terminaalisesti erilaistuneita B-solujen, on toiseksi yleisin hematologinen syöpä, jonka American Cancer Society arvio 22350 uutta tapausta vuonna 2013. Niistä tapauksista MM köyhimpien ennuste ovat ne 15% kanssa t (4; 14) translokaatio, joka on tarkoitettu sekä FGFR3 ja MMSET (katsaus esitetty [3] – [5]). Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että tämä kulkeutuminen voi olla suuri klooni diagnoosin tai päinvastoin, havaitaan vain silloin, kun uusiutumisen [6]. Kuitenkin taustalla oleva mekanismi aggressiivisuus t (4; 14) myelooma- jää epäselväksi ja suhteellinen osuus FGFR3 ja MMSET koska otaksuttu onkogeenien on kiistanalainen, koska 25% t (4; 14) kasvaimet puuttuu FGFR3 ilme. Hankinta FGFR3 aktivoivia mutaatioita (5-10% t (4; 14) tapausta) sairauden eteneminen osoittaa rooli FGFR3 MM synnyssä, ja varhainen tutkimukset osoittavat kasvaimia synnyttävän potentiaalin aktivoitua mutantti FGFR3 [4]. Lisäksi äskettäin osoitti, että villityyppinen FGFR3, kuten ilmaistaan ​​useimmissa FGFR3-positiivisten t (4; 14) kasvaimet, voi edistää B-solujen kasvaimien [7]. Lisäksi runsaasti prekliinisiin tehokkuuden osoittamiseksi reseptori tyrosiinikinaasin estäjät ja neutraloivan vasta-aineen vastaan ​​MM soluja, jotka ilmentävät FGFR3-aktivoivia mutaatioita ja villin tyypin reseptorin (tarkistetaan [3] – [5]). Samoin esto FGFR3 voi aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen ja /tai apoptoosin UC [8], [9] sekä

in vitro

ja

in vivo

tarjoaa validointi että FGFR3 ja loppupään signalointireittien edustavat mahdollisesti merkitystä terapeuttisina kohteina hoidettaessa FGFR3 liittyvien syöpien.

FGFR3 on yksi neljästä tyrosiinikinaasin reseptorit, jotka välittävät vaikutukset FGF: ien perustana erilaisia ​​solun prosessit, myös proliferaatiota, erilaistumista, ja muuttoliike. Reseptorin aktivointi laukaisee signaalintransduktioreitteihin osallisena kasvaimen synnyssä, mukaan lukien Ras /ERK /MAPK, PLCγ /PKC, PI3K, ja STAT reitit [10]. Uudemmat tiedot osoittavat, että FGF-reseptori signalointi voi myös aktivoida NFKB [11], [12] poikkeavaan aktivointi, joka havaitaan usein ihmisen syöpään [13], [14] ja läheisesti korreloi syöpä tunnusmerkkejä [15]. Keskeinen välituote NFKB signalointi, TGFli-aktivoitu kinaasi 1 (TAK1), tehtävät alavirtaan useista signalointireittien, säätelevät solujen eloonjäämistä, erilaistumista, ja tulehdusreaktioita [16], ja on kuin avain IKK-kinaasi kanonisen NFKB polku [ ,,,0],17]. Kemialliset ja geneettiset inhibitio TAK1 edistää apoptoosia ihotuumoreissa [18] ja osajoukko paksusuolen syövistä [19], sekä vähentää chemoresistance rinta- ja paksusuolen syövän soluja [20] ja chemoresistance ja NFKB aktiivisuus haimasyövän viljelmässä [ ,,,0],21]. Lisäksi tukahduttaminen TAK1 signaloinnin vähentää NFKB aktivoitumista ihmisen pään ja kaulan okasolusyöpä solulinjat [22], munasarjakarsinoomasolut [23], ja rintasyövän solulinjat [24], ja estää rintasyövän soluadheesiota, invaasio ja metastaasi in vitro [25]. TAK1 ei ole tutkittu yhteydessä MM tai virtsarakon syöpä; mutta se on alavirran kohde, NFKB, on tullut yksi voimakkaimmista kuljettajat tumorigeneesin MM, peräti 82% MM näytteistä ilmentävien allekirjoitus aktivointi molekyylejä [26], [27]. Tämän mukaisesti keskeinen kasvaimia synnyttävän roolin, useita lääkkeitä, jotka tehoavat MM, kuten bortetsomibi, talidomidi, ja lenalidomidi, lohko aktivoituminen NFKB (tarkistetaan [28]). UC, tukahduttaminen NFKB toiminnan voimistaa apoptoottista vaikutusta kemoterapia-aineiden ja sytokiinien [29], [30].

Käyttämällä yhdistelmää hiivan kahden hybridin ja mikrosirujen geeniseulonta yhdistettynä järjestelmien polku analyysi, tunnistamme TAK1 uutena Interactor ja tavoite FGFR3 tyrosiinikinaasiaktiivisuuden. Olemme edelleen osoittaa rooli TAK1 positiivisena säätelijänä NFKB aktiivisuuden alavirtaan FGFR3 sekä multippelin myelooman ja uroteelisyövässä, kaksi syöpiä osoittivat FGFR3 osallistuminen [10], [31], jossa moduloivia vaikutuksia soluadheesiota.

Methods

Soluviljely ja transfektio

FGFR3-negatiivinen (RPMI-8226) ja villin tyypin (LP1) ihmisen MM solulinjat saatiin Saksan kerääminen mikro-organismien ja Cell Cultures [DSMZ; Braunschweig, Saksa]; FGFR3 mutantti MM soluja (KMS-11; Y373C) johdettu MM potilaan ja perustettiin Kawasaki Medical School [32], oli jalomielinen lahjoitus tohtori P Leif Bergsagel. Mutantti FGFR3 virtsarakon syövän solulinja, MGHU3 (Y375C), ystävällinen lahjoitus tri Margaret Knowles (University of Leeds, Leeds, Yhdistynyt kuningaskunta), oli peräisin grade 1 kasvain [33]. MM ja UC-soluja ylläpidettiin RPMI 1640 (Hyclone, Thermo Scientific, Rockford, IL) ja HeLa ja HEK293-solut (ATCC) DMEM: ssa (Hyclone), sekä johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen). Ohimenevä transfektio HeLa ja HEK293 saavutettiin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY) mukaan valmistajan protokollaa ja MM ja UC transfektoituja linjoja käyttäen Neon-järjestelmän (Life Technologies). Sen jälkeen valmistajan menettelyä, 1 x 10

6 UC tai 2 x 10

6 MM solut suspendoitiin 100 ul suspension, joka sisälsi 5 ug siRNA (Dharmacon) tai plasmidi ja pulssi alle ohjelma 3 UC ja ohjelmaa 15 ( KMS-11) tai 20 (RPMI-8226) MM soluja.

vasta-aineet ja reagenssit

FGFR3 vasta-aine (B-9, C-15) ja FGFR1 /2 /4- vasta-aineet olivat peräisin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet TAK1, ERK, fosfo-ERK, fosfo-tyrosiini (4G10), p65: n ja P84 olivat Milliporelta (Bedford, MA), kuten oli normaali kanin IgG. Rekombinantti ihmisen FGF1 saatiin R Abnova, Taipei, Taiwan) substraattina. Rekombinantti aktiivinen FGFR3 solunsisäistä domeenia (397-End, SignalChem, Richmond, CA) käytettiin 300 ng per reaktio.

Microarray Menettelyt ja analyysi

transfektoitiin 5 ug ei-kohdistaminen tai TAK1 erityisiä siRNA ja annettiin toipua yön yli. Seuraavana päivänä solut jätettiin käsittelemättä tai saatu 100 nM PD173074 48 tunnin ajan ennen RNA: n eristämistä. Kukin käsittely valmistettiin kolmena kappaleena näytteitä. Kokonais-RNA käsiteltiin suosittelema Affymetrix, Inc. Lyhyesti, RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Life Technologies) ja johdetaan RNeasy spin sarakkeet (Qiagen, Valencia, CA) edelleen siivota. UCI DNA Microarray Core Facility kvantitoidaan sitten kokonais-RNA: NanoDrop (Thermo Scientific) ja testattiin puhtauden käyttäen Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Ambion WT ilmaisu kit (Life Technologies) käytettiin RNA: n valmistukseen näytteiden koko transcriptome mikrosiruanalyysillä. Kaksi ug leimatun, hajanainen yksijuosteinen cDNA hybridisoidaan sitten koetin sarjat Human AffymetrixGeneChip 1.0ST array. Arrays skannattiin käyttäen GeneChip- Scanner 3000 7 G ja komentokonsoli Software v. 3.2.3. Tulokset ovat saatavina Gene Expression Omnibus (GEO) arkistoon (hakunumero GSE52452).

Data tuotiin Partek Genomics Suite Version 6.6 ohjelmisto seuraavia toimenpiteitä tehdään valmistautua data tilastollisiin analyyseihin: 1) RMA taustakorjaus, 2) rikvantiilin Normalisointi, 3) Log pohja 2 muutosta, ja 4) Yhteenveto Probe asettaa käyttämällä keskiarvoa. Tilastollinen analyysi tehtiin yksisuuntainen ANOVA yhdellä kategorinen muuttuja ja geenin luettelot tuotettiin niille geenien kertamuutosta suuruus 2 ja p-arvo on väärä löytö määrä (FDR) 0,05.

Gene luetteloista sitten tuotu Ingenuity Systems Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto, joka on toiminnot tuottavan geenin verkkoja, lajittelu geenejä erilaiset toiminnalliset ja muut luokat, sekä päällekkäin geenien päälle tiedossa signalointireittien, väritys jonka kertainen muutos tai jonkin muu arvo.

kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä RNA eristettiin MGHU3 ja KMS-11-soluissa käyttämällä TRIzol (Life Technologies) ja johdetaan RNeasy spin pylväät (Qiagen) edelleen siivota. Random-alustettu cDNA-synteesi suoritettiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen Superscript III RT Kit (Life Technologies). Kaikki Alukepareja introni-kattavat ja RT-kontrolli oli mukana. Alukeparia olivat seuraavat: Actin käänteinen AGGTGTGGTGCCAGATTTTC ja eteenpäin GGCATGGGTCAGAAGGATT, GAPDH kääntää GCCAGTGGACTCCACGAC ja eteenpäin CAACTACATGGTTTACATG, DFNA5

kääntää

CAGGTTCAGCTTGACCTTCC ja

eteenpäin

ACCAATTTCCGAGTCCAGTG, GSTA1 kääntää CCGTGCATTGAAGTAGTGGA ja eteenpäin ACGGTGACAGCGTTTAACAA, PSCA kääntää GTTCTTCTTGCCCACGTAGT ja eteenpäin CAGGTGAGCAACGAGGAC, BAMBI kääntää GAAGTCAGCTCCTGCACCTT ja välittämään TGCACGATGTTCTCTCTCCT, TNFAIP3 kääntää CGCTGTTTTCCTGCCATTTC ja välittämään GATAGAAATCCCCGTCCAAGG, SGK1 kääntää TGTCAGCAGTCTGGAAAGAGAAGT ja välittämään CGGAATGTTCTGTTGAAGAATGTG.

NFKB Luciferase Assay

Solut transfektoitiin 5 ug ei-kohdistuksen tai TAK1 erityisiä siRNA. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut transfektoitiin NF-KB-Luc ja PRL-TK-ohjaus

Renilla

suhteessa 3:01 ja annettiin toipua 24 tuntia. Milloin on osoitettu, soluja samanaikaisesti transfektoitiin ilmoitetuilla FGFR3 plasmidit. Sitten solut seerumia yli yön, jonka jälkeen 8 tunnin hoito 40 ng /ml FGF1. Havaittu lusiferaasiaktiivisuutta käyttäen dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega Madison, WI). Erot NFKB seuranneesta TAK1 hiljentäminen samoilla hoito-olosuhteilla analysoitiin tilastollisesti käyttämällä paritonta kaksisuuntainen t-testi.

solufraktioinnin

MGHU3 solut transfektoitiin 5 ug ei-kohdistuksen tai TAK1 erityisiä siRNA. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut seerumia yli yön, sitten sitä käsiteltiin 40 ng /ml FGF1 0, 5 tai 60 minuuttia. Solut kerättiin sitten fraktioitiin, käyttämällä protokollaa, joka on sovitettu päässä [41].

Soluadheesiokoe

-solut transfektoitiin 5 ug ei-kohdistamista tai TAK1-spesifisiä siRNA ja annettiin toipua yön yli. Seuraavana päivänä solut jätettiin käsittelemättä tai sai 50 nM PD173074 48 tuntia, ennen kuin pinnoitus tartunnan määrityksessä. Solut, jotka käsitelty FGF1 olivat ilman seerumia yli yön ja käsiteltiin ligandin 1 tunti ennen pinnoitus- ja koko määrityksen keston ajan. Tarttuvuus määritykset suoritettiin 72 tuntia transfektion jälkeen. Lyhyesti, yhdeksänkymmentäkuusi-kuoppalevyt päällystettiin yön yli 4 ° C: ssa 1 ug /ml kollageeni IV, salvattiin 1% BSA: lla 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja pestiin kahdesti PBS: llä ja kerran seerumittomassa elatusaineessa. Solut otettiin talteen ja siirrostettiin 5 x 10

4 ennalta päällystetyillä levyillä, kun läsnä on hoidon ilmoitettu. Solujen annettiin kiinnittyä 3 tuntia 37 ° C: ssa, kuopat pestiin 3 kertaa PBS: llä poistamaan tarttumattomat solut, ja sitoutuminen määritettiin sen jälkeen 4 tunnin inkubaation Calcein-AM (Life Technologies) mittaamalla fluoresenssi-intensiteetti Ex /Em 490 /520 nm. Tilastollinen analyysi eroista soluadheesion seuraavissa TAK1 hiljentäminen samoilla hoito-olosuhteilla suoritettiin käyttäen paritonta kaksisuuntainen t-testi.

Tulokset

FGFR3 vuorovaikutuksessa TAK1

tunnistaminen proteiinivuorovaikutussuhteiden voidaan luoda kriittistä tietoa erityisistä signalointireittejä ja tunnistaa uusia potentiaalisia terapeuttisia kohteita. MM, erityinen rooli ektooppisesti ilmaistu FGFR3 alaryhmässä tapauksissa edelleen kiistanalainen, kun taas virtsarakon syöpä, FGFR3 on äskettäin liitetty tärkeänä kuljettaja leviämisen [42]. Otimme järjestelmällistä lähestymistapaa saada parempi käsitys FGFR3 signaloinnin liittyvien syöpien kautta tunnistaminen uuden FGFR3 proteiinivuorovaikutussuhteiden käyttäen Hiivakaksihybridijärjestelmässä (Y2H) määritys. Sytoplasminen domeeni ihmisen FGFR3 (aminohapot 399-806), joka sisälsi villin tyypin sekvenssin tai voimakkaasti aktivoivan K650E-mutaation, käytettiin syöttinä seulomaan ihmisen primaaristen kondrosyyttien cDNA-kirjastosta (Fig. 1A), kuten on kuvattu [37]. Tämä kirjasto valittiin FGFR3 ilmentyy voimakkaasti kondrosyyteissä, ja voimakkaasti aktivoivan K650E mutaatio, läsnä osajoukko sekä MM ja UC [43], on läsnä solunsisäinen tyrosiinikinaasidomeeni. Mahdollinen vuorovaikutus tunnistettiin suodattimen hissillä β-galaktosidaasi määrityksessä sekvensoitiin, ja uudelleen testattiin vuorovaikutuksen hiivaa. Niistä vuorovaikutukset olivat esimerkiksi signaalitransduktion proteiineja, mukaan lukien p85 sääntelyn alayksikön PI3-kinaasi [37], ja TAK1. Hiivan saalista plasmidi käsitti C-pään 138 aminohappoa TAK1 (aminohapot 441-579), mikä osoittaa, että tämä alue on TAK1 on mukana sitova FGFR3. Olemme edelleen määritetään Y2H käyttämällä FGFR3 verkkotunnuksen konstruktioita (Fig. 1A), että alue, joka käsittää toisen puoliskon tyrosiinikinaasidomeeniin of FGFR3, joka sisältää aktivointi silmukan reseptorin ja C-terminaalisen hännän FGFR3 (aminohapot 589-806) , riittää FGFR3-TAK1 vuorovaikutus. Vahvista FGFR3-TAK1 vuorovaikutus nisäkässoluissa ja erityisesti FGFR3 liittyvä syöpäsolun linjat, ihmisen FGFR3 konstruktioita, kuten villityypin, kinaasi-kuollut ja konstitutiivisesti aktiivinen (K650E) sekvenssit, ilmennettiin tilapäisesti HeLa-soluissa. TAK1 yhteistyössä immunosaostettiin kaikki FGFR3 testattujen sekvenssien; osoittavat, että FGFR3 ja TAK1 vuorovaikutuksessa nisäkässoluissa ja reseptorin aktivoituminen ei ole tarpeen (kuvio 1 B). Endogeeninen FGFR3 kaksi t (4; 14), MM-solulinjat, LP-1 (paino-osaa) ja KMS-11 (Y373C) [44], [45], on myös vuorovaikutuksessa TAK1 co-immunosaostus (kuvio 1C). Kuten havaitsimme FGFR3 tasot olivat huomattavasti pienemmät MGHU3 kuin MM riviä, FGFR3

WT yliekspressoitui riittävän havaitsemisen TAK1-FGFR3 vuorovaikutuksen MGHU3 (kuvio 1 D). Huomaa, että MGHU3 UC solut kantavat samaa FGFR3 mutaatio kuin KMS-11 MM soluissa. FGFR3-TAK1 vuorovaikutus arvioitiin myös RT-112 UC-solut, jotka ilmentävät katkaistua villityypin FGFR3 (aminohapot 1-758) fuusiossa muuttamassa hapolla kiertynyt kierre 3 (TACC3) sekvenssit (tähteet 433-838) [46 ]. Emme kyenneet vakuuttavasti havaita vuorovaikutus tätä linjaa, mikä edelleen tukee tärkeyttä FGFR3 C-terminaalinen sekvenssit vuorovaikutus TAK1 (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi myös hyödyntää massaspektrometriaa luonnehtia proteiinien talteen TAK1 immunopresipitaatit. Sen jälkeen ilmaus molempien aktivoitu FGFR3-K650E ja TAK1 HEK293-soluissa, TAK1 immunopresipitaatit analysoitiin immobilisoituun metalli affiniteettikromatografialla /nano-nestekromatografia /sähkösumutus ionisaatiomassaspektrofotometrisesti (IMAC /nano-LC /ESI-MS) [38], [39 ]. Vuonna kolme riippumatonta näytettä, lisäksi merkittävä kattavuus TAKI odotetusti, FGFR3 peptidejä, jotka edustavat 48% kattavuus yleistä oli yksiselitteisesti, kuten esitetään taulukossa 1. Yhdessä nämä tulokset tarjoavat todisteita uudenlainen vuorovaikutuksen FGFR3 ja TAK1 joka tekee vaadi reseptorin aktivoitumista. On ensisijaisia ​​tähän kanssa FRS2 sovittimen, joka on vuorovaikutuksessa FGF-reseptorien konstitutiivisesti, mutta vain aktivoi alavirran signalointia (ERK /MAPK) upon reseptorin aktivoitumisen [47]. Me osoittavat lisäksi, että FGFR1, 2 ja 4 ekspressoida ohimenevästi HEK293, myös vuorovaikutuksessa TAK1 (kuvio 1 E), mikä viittaa siihen, että vuorovaikutus on laajalti merkitystä FGF reseptoriin signalointi.

FGFR3 voi Tyrosiini fosfory- TAK1

in vitro

TAK1 aktivaatio vaatii Ser /Thr fosforylaatiota useilla jäämiä aktivointi silmukka (tarkistetaan [48], [49]). Vaikka tyrosiinifosforylaation TAK1 ei ole aiemmin raportoitu, FGFR3 toimii tyrosiinikinaasin; Siksi arvioimme sen mahdollisuuden, että FGFR3 voisi tyrosiinimäärän fosfory- TAK1. Itse asiassa huomasimme, että TAK1 on tyrosiinifosforyloituu HEK293-soluissa, jotka ekspressoivat väliaikaisesti konstitutiivisesti aktiivinen FGFR3 (K650E), mutta ei kinaasi-dead-reseptori (K508M), mikä osoittaa, että aktivoitu FGFR3 voi joko suoraan tai epäsuorasti tyrosiinin fosfory- TAK1 (kuvio 2A). TAK1 tyrosiinifosforylaation edelleen havaittu soluttomassa kinaasimääritys käyttäen yhdistelmä TAK1 ja kinaasi-aktiivisen solunsisäisen domeenin FGFR3, mikä osoittaa, että TAK1 voi olla suora kohde FGFR3 tyrosiinikinaasiaktiivisuutta (kuvio 2B).

(A) HEK293-solut transfektoitu FGFR3

K508M tai FGFR3

K650E. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin ja TAK1 immunosaostettiin 1 mg yhteensä lysaattia. Immunosaostumat erotettiin SDS-PAGE: lla, blotattiin ja koetettiin 4G10-vasta-aineen. Nuoli osoittaa TAK1. Edustaja kuusi koetta. (B) Solu-free-kinaasimääritys suoritettiin käyttäen ihmisen rekombinantti-TAK1 on alusta ihmisen rekombinantti-FGFR3 (tyrosiinikinaasidomeeni). Tyrosiinifosforylaatio visualisoitiin immunoblottaus 4G10-vasta. Edustavia neljä kokeiluja.

Gene Expression analyysi jakautuu NFKB merkinantolaitteena Hub FGFR3 ja TAK1 Integration

TAK1 on keskeinen välittäjäaine signa- johtaa aktivoitumiseen NFKB ja AP -1 transkriptiotekijöitä, jotka kukin moduloivat liittyvien geenien ekspressiota kasvaimen synnyssä ja apoptoosin (katsaus esitetty [16], [50]). Alkaa tutkia integrointi TAK1 ja FGFR3 signalointi syöpäsoluissa, teimme vertaileva microarray-analyysi geenin ilmentymisen MGHU3 virtsarakon syövän solulinja, joka ekspressoi FGFR3 Y375C aktivoiva mutaatio ja esittelee vahva vastauksia FGF-reseptori-spesifisen PD173074 estäjä arvioituna ERK fosforylaatio [9]. Niiden geenien tunnistamiseksi, jotka ovat riippuvaisia ​​sekä FGFR3 ja TAK1 signaaleja, MGHU3 solut transfektoitiin ei-kohdistamista tai TAK1-spesifinen siRNA, ja kukin osajoukko käsitellään edelleen PD173074, tai ajoneuvon ohjaus. Yksisuuntainen ANOVA kertaluokkamuutos suuruus 2 ja p-arvo FDR 0,05 tuotettiin geenin luetteloihin. TAK1 siRNA versus ei-suunnattu siRNA näytteistä saatiin 39-geenin muutoksia, jotka heijastavat TAK1 geenien läsnä ollessa FGFR3 signalointia. TAK1 siRNA plus PD173074 vs. ei-suunnattu siRNA plus PD173074 näytteet saatiin 105 geenin muutoksia, jotka heijastavat TAK1 geenien puuttuessa FGFR3 signalointia. Havaita muutoksia, jotka ovat riippuvaisia ​​sekä FGFR3 ja TAK1, geenit, jotka osoittavat tilastollisesti merkittäviä geeni aiheutuvat muutokset TAK1 pudotus vain, kun läsnä on FGFR3 signalointi, mutta ei sen puuttuessa valittiin. Päällekkäisiä geenit joukko 105 TAK1 geenin muutosten puuttuessa FGFR3 signaloinnin poistettiin 39 TAK1 geenin muutokset läsnä FGFR3 toimintaa. 13 Ainutlaatuinen geenit säilyivät merkittävästi muuttunut näissä olosuhteissa edustavat geenejä, jotka heijastavat sekä TAK1 ja FGFR3 signalointia (taulukko 2).

Valitsimme 6 geenejä luettelosta 13 validointitarkoituksiin perustuu niiden merkityksestä syövän, ja totesi, että havaitut muutokset olivat toistettavissa qPCR, sekä MGHU3 ja KMS-11 MM line käsiteltiin TAK1 pudotus ja /tai FGF-reseptorin inhibition, kuten edellä on kuvattu microarray-analyysi (taulukko 2). Ainoa poikkeus on GSTA1, joka on hyvin alhainen ilmaisun MM soluissa. Lopuksi panos luettelon 13 geenejä Ingenuity Systems Pathway Analysis Tool (IPA) johti yhden geenin verkkoon (pisteet 40), jossa on merkittävä keskus noin NFKB (kuva 3). Nämä tulokset viittaavat siihen, kriittisen leikkauspisteessä FGFR3 ja TAK1 signalointi, jotka voivat vaikuttaa NFicB aktivointia ja täten syövän synnyssä in FGFR3 liittyviä syöpiä. Toinen napa keskittyi PI3K on yhdenmukainen aiempien tulokset osoittavat vuorovaikutusta FGFR3 ja p85 sääntelyn alayksikön PI3K [37].

13 ainutlaatuinen FGFR3 ja TAK1 riippuvaisia ​​geenejä (taulukko 1) arvioitiin Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto, joka tuottaa yhden verkkoon (pisteet 40), joka sisältää suuria keskusasemista NFKB ja PI3K. IPA molekyyli muotoja ovat: monimutkaisia ​​/ryhmä (NFKB, PI3K), sytokiini /kasvutekijä (IKBKG, SGK1), entsyymi (ACSL1, GSTA1, MGAT4A, PDXP, TNFAIP3, UBC), ionikanavan (SCNNIG), transkription säädin (TEAD1, VGLL1), kuljettajan (SLC6A8, SLC15A1, SLC15A2, SLC38A3), ja muut (ARRB1, BAMBI, DFNA5, FSH, GST-luokan, HDGFRP2, Ins1, insuliini, MT2A, PKC (s), PSCA, RPAIN, TRIM31, ZFAND5) . IPA Relationships: solid viivat osoittavat suoraa vuorovaikutusta; katkoviivat osoittavat epäsuoraa vuorovaikutusta; täytetty nuolet osoittavat ”vaikuttaa”; open nuolet osoittavat ”translokoituu”; –