Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huono paikallisen ohjauksen ja kasvain paeta ovat merkittävä huolenaihe pään ja kaulan syöpiä hoidetaan tavanomaisilla sädehoitoa tai hadrontherapy. Pelkistettyä glutationia (GSH) epäillään pelaa tärkeä rooli johtavien mekanismien radioresistance, ja sen ehtyminen tulisi mahdollistaa oksidatiivisen stressin loukkaus ja siten muuttamalla luonne DNA vaurioiden ja myöhemmät kromosomi muutoksia, jotka mahdollisesti johtavat kasvaimen paeta.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli korostaa vaikutus on GSH-ehtyminen strategia (dimetyylifumaraatti, ja L-butioniinisulfoksimiini yhdistys) yhdistettynä hiilen ioni tai röntgensäteilytysjakso tyypeistä DNA vaurioita (harva tai klusteroitu) ja myöhemmin lähettäminen kromosomaalisten muutokset jälkeläisiin on säteilyresistenteille solulinjassa (SQ20B) ilmentävät korkea endogeeninen GSH sisältöä. Tuloksia verrataan jonkin säteilylle solulinjan (SCC61) näytetään alhaisen endogeenisen GSH tasolla.

DNA-vaurioita mittaukset (γH2AX /comet) osoittivat, että ohimenevää GSH ehtyminen resistenttien SQ20B soluissa voimisti vaikutukset säteilytys aluksi lisäämällä harva DNA taukoja ja oksidatiivisen vaurioita jälkeen röntgensäteilyn, kun taas hiilen ionisäteilyn tehostettu monimutkaisuus ryhmittyneet hapettumista. Lisäksi jäljellä oleva DNA double-säikeen katkoksia mitattiin riippumatta säteilyn ominaisuuksia. Luonne alkuperäisen DNA vauriot ja jäljellä oleva määrä, DNA-vaurion olivat samanlaisia ​​kuin herkillä SCC61 soluissa sen jälkeen, kun molemmat säteilytys. Misrepaired tai korjaamatta vauriot voivat aiheuttaa kromosomimuutoksia, arvioitu solujen jälkeläisiin jonka cytome määrityksessä. Molemmat säteilytys aiheuttamat poikkeavuudet in nondepleted kestävä SQ20B ja herkkä SCC61 soluja. GSH-ehtyminen strategia esti lähetyksen poikkeamia (monimutkaisten uudelleenjärjestelyjä ja kromosomi tauko tai häviämiseen) säteilyresistenteille SQ20B vain yhdistyessään hiiltä ionisäteilyn. GSH heikentävien strategia yhdistettynä hadrontherapy voi siis olla huomattava etu potilaiden hoitoa, minimoimalla genomin epästabiilisuuden ja parantaa paikallisen ohjauksen.

Citation: Hanot M, Boivin A, MALESYS C, Beuve M, Colliaux A, Foray N, et al. (2012) Glutathione väheneminen ja Carbon Ion säteily voimistaa Clustered DNA Vauriot, Cell Death and Prevent kromosomimuutoksia syöpäsoluissa Progeny. PLoS One 7 (11): e44367. doi: 10,1371 /journal.pone.0044367

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 syyskuu 2011; Hyväksytty: 06 elokuu 2012; Julkaistu: 20 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Hanot et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat ETOILE n tutkimusohjelma kautta alueellisen ohjelman Research in Hadrontherapy /Lyon University, alle CPER 2007-13 rahoitus ja Fondation Synergie Lyon syöpä ja Ligue contre le syöpä (Ain). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Carbon ioni hadrontherapy on erittäin tehokas syövän hoitamiseksi lähellä kriittisten elinten vaarassa, joka on vastustuskykyinen tavanomaisille sädehoidon, kuten pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC), koska tarkempi ja tehokas annos voidaan soveltaa, johtava korkea suhteellinen biologinen tehokkuus [1]. Carbon ioneja aiheuttaa haitallisia ryhmittyneet vahinko koostuu yhdistelmästä DNA kaksi- ja yk- säikeen katkoksia (DSB ja SSB), ja emäksetön sivustoja läheisyydessä hapettuneen emäksiä. Vastakohtana näille hiili-ion-induced klusteroitu vaurioita, röntgenkuvat aiheuttaa melko harva vahinkoa [2]. Molemmissa tapauksissa misrepaired tai korjaamattomat vauriot voivat johtaa kromosomimuutokset [3] – [5]. Jotkut kromosomimuutoksia lähetetään solun jälkeläisiin voi siten aiheuttaa syöpäsolujen adaptaatio [6] ja kasvaimen paeta, suurin syy sädehoitoon vika. Kasvava kiinnostus hadrontherapy hoitoon kestävät hyvin syöpien vaatii selkeytetään mutkikkaita DNA vaurioita suurempi ilmaantuvuus kromosomimuutoksia (CCS). Tunnistaminen näitä prosesseja olisi siten merkittävä edistysaskel ymmärrystä syövän uusiutumiseen, tunnettu ominaisuus säteilyresistenteille HNSCC [7] – [10].

DNA vaurioita ja sertiä vaikuttavat sisäiset tekijät, kuten reaktiivinen happiradikaaleja puhdistusjärjestelmä järjestelmiä. Korkea endogeenisen pelkistettyä glutationia (GSH) usein edistää syöpäsolujen selviytymisen ja kestävyys [11], ja sen ehtyminen, tutkitaan vuosikymmeniä yhdessä sädehoidon, on mainittu tänään uusia terapeuttisia näkökohtia erityisesti syöpien hoitoon resistenttejä tavanomaisille tai hiili ion sädehoito [12] – [15]. Muiden strategiat, eli GSH-ehtyminen strategiaa voidaan käyttää välineenä muuntamaan luontoa, numero tai korjaukseen DNA-vaurion välityksellä hapettavasti syntyy monimutkainen DNA-vaurioita [16]. Kuitenkin vain rajoitettu ja ristiriitaisia ​​tietoja on saatavilla suhteesta GSH tason ja korkean energiansiirtokyvyn (LET) ja alhaisen LET säteilyn aiheuttamien DNA-vaurioita. Esimerkiksi Mansour et al. [17] kertoi, että

N

-acetylcysteine, eli GSH esiaste, suojaa maksan kudoksia säteilyn aiheuttamista DNA vaurioita, kun taas muut tutkimukset viittasivat heikon suojelija roolin eksogeenisen GSH DNA vaurioita lymfosyyteissä tai CHO-soluissa [18 ], [19].

Tutkimukset sytogeneettisen vaikutuksista korkean LET säteilylle ovat hyödyllisiä analysoitaessa mekanismit kasvainsolujen radioresistance koska ne heijastavat erityispiirteet, kapasiteetti ja uskollisuus korjauksen tai misrepair prosessit tapahtuvat säteilytettyjä soluja . Hankeryhmien DNA vaurioita aiheuttama hiiltä ionisäteilyn tiedetään johtavan hyvin monimutkaisia ​​kromosomipoikkeavuuksia metafaasissa [3], [5], mutta tiedetään vain vähän riski niiden toimittamista syöpäsolun jälkeläisten, joka on mahdollinen syy kasvaimen paeta. Vaikka suhde yhdistää oksidatiivisen stressin ja perimän epävakaisuuden on raportoitu [20], [21], liittyviä tietoja modulaatioon antioksidanttipuolustusta (kuten GSH) ovat edelleen ristiriitaisia. Esimerkiksi riippumatta säteilyn laatu, kasvu endogeeninen GSH allas voi estää sisarkromatidin vaihto [22], lisätä vaihtoa poikkeamia [19], tai harventaa poikkeavien metafaasien [18]. Poistaminen on ainoa yhteinen tyyppi CC raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa, jotka osoittavat, että määrä poistot korreloi käänteisesti GSH tasolla [18], [19], [23], [24]. Vaikka yhä useammat tiedot ovat saatavilla, selityksiä tai hypoteesien avulla nämä havainnot alkuperäiseen radioinduced DNA vaurioita, tiedot korjauskapasiteettia tai riski CC lähetyksen soluun jälkeläisten ei vielä ole. Vain Pujari et ai. [19] ovat osoittaneet, että korkea-LET säteilylle yhdistettynä GSH täydentämistä niukasti vaikutti kromosomi vaihto taajuus verrattuna röntgensäteilyä, mikä osoittaa, että GSH onnistunut suojaamaan soluja DNA-vaurioita näissä koeolosuhteissa.

Sytogeneettiset tutkimukset ovat usein johtaneet ristiriitaisia ​​tietoja, luultavasti siksi, että menetelmien moninaisuuden, joka arvioidaan joko tuloksia (aikana metafaasissa tai ennenaikainen kromosomi kondensaatiomenetelmät) [4], [18], [25] tai myöhään vaikutuksia (jälkeläisiin) [26], [27]. Mittaus varhaisvaikutuksista on ongelmallista, solusyklin muutos aiheuttamia säteilytys, joka johtaa aliarviointiin sertiä kun tiedot kerätään vain kerran pisteen ja puutteeseen osoitus aiheutuvista vaikutuksista tarttuvia tapahtumat [3], [4 ]. Lisäksi syöpäsolut näyttää erittäin muunnettu genomin, joka rajoittaa havaintoja ja mittauksia kromosomipoikkeavuuksien käyttämällä FISH-maalaustekniikoita [4]. Mittaus myöhään vaikutuksista saadaan tietoa muutosta tai erilaistumista jälkeläisiä, mutta ei tapahtumia, jotka aiheutuvat aikaan ensimmäisen mitoosin [26], [27]. Näin on ollut tähän saakka, ei selvää yksimielisyyttä siitä, mikä on enemmän merkitystä menetelmän tutkimiseen riskin kromosomipoikkeavuustestissä lähetyksen eloonjääneiden solujen.

Vaihtoehtoinen menetelmä voi antaa linkin koskien kromosomi epävakautta näiden erilaisia ​​tietoja ja viittaa sytokineesiin-lohkon mikrotumatutkimuksessa että kehittyy ”cytome määritys” [28] – [31]. Tämä määritys perustuu morfologisiin havaintoja ydinten jälkeen sytokineesi tukos, eli solut, jotka ovat suorittaneet yhden ydinvoiman jako tunnistetaan niiden binucleated ulkonäköä. Se tarjoaa tietoa joistakin sertiä lähetetään tytär soluihin [32], [33] kautta mikronukleus ja nucleoplasmic sillan muodostumista. Tämä hyvin kuvattu määritys on nyt katsottava viittaukseksi testi seurantaan ihmisen sertiä ja mahdollistaa solujen tunnistamisen kulkee ensimmäisen myöhässä mitoosin. Tällaiset tarttuvat poikkeavuudet aiheuttaa genomista epävakauden eloonjääneiden solujen, mikä johtaa kasvaimen paeta.

tavoitteena tässä tutkimuksessa oli ensimmäinen laadun määrittämiseksi ja määrän DNA vaurioita suhteessa endogeeniseen GSH tason ja säteilyn laatu, ja toiseksi määrittää peräkkäisten CCS elossa syöpäsoluissa jälkeen röntgen- ja hiili ionisäteilyn arvioidakseen riski radioinduced epävakauden ja sitten kasvain paeta. Vastustuskykyisen HNSCC solulinja (SQ20B) esitetään korkea endogeeninen GSH (-70 nmol /mg proteiinia) taso valittiin tutkimuksessa malli. Ohimenevä GSH-ehtyminen strategiaa sovellettiin ennen säteilytystä, joka perustuu käyttöön dimetyylifumaraatti (DMF), glutationi-heikentävien aine, ja butioniinisulfoksimiini (BSO), glutationi biosynteesin estäjän. Tätä strategiaa on aiemmin testattu [14] suhteen in vitro myrkyllisyyden ja aktivoitu johtavia reittejä SQ20B solujen kuolemaan säteilytyksen jälkeen olivat selvästi. Se annettiin SQ20B soluja osoittamaan samaa herkkyyttä kuin SCC61 soluja, säteilylle HNSCC solulinja, joka näyttää alhaisen endogeenisen GSH pitoisuus [14], [34]. Tässä asiakirjassa, saadut tiedot säteilyresistenteille SQ20B soluista ja GSH-köyhdytettyä SQ20B solut siis verrattiin herkkä SCC61 soluihin. Verrata johtaneet tapahtumat samantasoisen solukuoleman, röntgen- ja 75 MeV /n hiili ionisäteilyn käytettiin biologisesti vastaavia annoksia, olettaen suhteellinen biologinen tehokkuus noin 2 10% eloonjääneitä sekä solulinjoilla [34].

Yhteenvetona tuloksemme johtaa uuteen tulkita laatua ja määrää DNA vaurioita suhteessa GSH tason ja säteilyn laatua ja siten selventää joitakin erilaisia ​​tuloksia raportoitu kirjallisuudessa. Tältä osin cytome määritys antoi selkeän yleiskuvan kromosomipoikkeavuuksien lähetetään elossa syöpäsoluja. Se mahdollisti väitettä, että lisäys DNA- vaurion monimutkaisuus saadaan GSH-ehtyminen adjuvanttihoito yhdistettynä hadrontherapy voi minimoida perimän epävakaisuuden resistenttien syöpäsolujen ja vähentää näin ilmiö kasvaimen paeta sädehoidon jälkeen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmä ja hoidot

SCC61 (SF2 = 0,36) ja SQ20B (SF = 0,72) solulinjoja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [34]. Soluja viljeltiin enintään 12 kohtia. Dimetyylifumaraatti (DMF, 100 uM), joka on GSH-heikentävien ainetta, ja l-butioniinisulfoksimiini (BSO, 100 uM), estäjä GSH biosynteesin, lisättiin SQ20B elatusaineeseen 4 h ennen säteilytystä heikentävistä GSH, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Joissakin kokeissa

N

asetyyli kysteiini (NAC 5 uM) lisättiin myös elatusaineeseen 4 tuntia ennen säteilytystä ja yhdessä DMF /BSO hoitoon.

Kemikaalit

Ensisijainen γH2AX ja sentromeerisen proteiini A (CENPA) hiiren vasta-aineet on saatu Upstate ja Abcam, vastaavasti, ja toisen vasta-aineen AlexaFluor 488 vuohen anti-hiiri-IgG saatiin Invitrogen. Mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää kiinnitysväliaine hankittiin Dako. Alhaisen sulamispisteen agaroosia ja SYBR Green liuos olivat Sigma, ja formamidopyrimi- diini glykosylaasi (FPG) saatiin Trevigen.

Säteilytys Menettelyt

Yksisolukerroksiset viljellyt solut säteilytettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [35 ]: X-ray säteilytys 6 MV tehtiin Lyon-Sud Hospital (sädehoito osasto), Ranska, on Clinac CD säteilyttäjällä annoksella nopeudella 2 Gy /min. Säteilytys 72 MeV /u hiili-ioneja (LET 33,6 keV /μ) suoritettiin GANIL, Caen, Ranska.

Analyysi klonogeeninen Cell Survival

klonogeeninen solujen eloonjäämistä tarkkailtiin jälkeen X-ray ja hiili ioni altistumisen annosalueella 1-5 Gy. Solut ympättiin ennen säteilytystä ja siirrostettiin uudelleen välittömästi altistuksen jälkeen pulloihin 25 cm

2 eri pitoisuuksina. Solujen eloonjäänti arvioitiin standardin pesäkemuodostusta kuvattua [35].

HPLC-analyysi

Yhteensä glutationin kvantifioitiin HPLC-analyysillä. Lyhyesti, proteiinit saostettiin solujen homogenaatti, jossa sulfosalisyylihapolla ja sentrifugoitiin 13,000 x

g

. Sitten supernatantti derivatisoitu

o

-phthalaldehyde. Kromatografinen erotus saavutettiin 5 um Spherisorb-C18-kolonnilla, jossa on liikkuva faasi, joka koostuu metanoli-0,15 M asetaattipuskuria, pH 7 (7.5:92.5). Fluoresenssi glutathione-

o

-phthalaldehyde johdannaisten havaitaan emissioaallonpituudella 420 nm ja eksitaatio 340 nm: ssä [36].

Immunofluoresenssi

havaitseminen γH2AX pesäkkeitä tai CENPA tutkittiin immunohistokemiallisesti. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 3% paraformaldehydillä 20 min ajan, ja immunologinen suoritettiin, kuten on kuvattu [37]. CENPA tunnistus suoritettiin cytome alla kuvatussa määrityksessä. Digitaaliset kuvat saatiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Axio Imager Z1 Zeiss mikroskooppi, 400-kertainen suurennus). Vähintään 100 tumat sai kulloinkin laskea keskimäärin γH2AX pesäkkeitä avulla ImageJ ohjelmistoa.

Yhden DNA Vaurion Detection käyttäen Alkali yksisoluiset geelielektroforeesi (SCGE) B

Soluja trypsinoitiin, sentrifugoitiin 1000 rpm 4 ° C: ssa, ja pelletti suspendoitiin jäädyttämistä väliaineessa (10% DMSO, 40% DMEM, 50% SVF) ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Sulatuksen jälkeen näytteitä sentrifugoitiin (1000 rpm, 4 ° C), ja pelletti suspendoitiin kylmässä PBS: ssä, ja sekoitetaan 0,6% alhaisen sulamispisteen agaroosia. Geelit levitettiin mikroskoopin ja SCGE tekniikkaa käytettiin kuvanneet Tice et al. [38]. Dioja tarkoitettu hapetetaan DNA base mittaukset pestiin entsyymin (0,1 M KCI, 10 mM EDTA, 10 mM HEPES-KOH, 0,02 mg /ml BSA: ta, pH 7,4) ja inkuboitiin 20 min (37 ° C), jossa FPG in entsyymiä puskurin tai pelkästään puskurilla. Kaikki objektilasit inkuboitiin sitten 40 minuutin ajan alkalisessa elektroforeesin (pH 13), joilla DNA: n purkautumisen. Elektroforeesi suoritettiin samassa puskurissa 35 minuutin ajan 25 V /300 mA 4 ° C: ssa. Objektilasit huuhdeltiin 400 mM Tris-emäksellä (pH 7,5) neutraloimaan ylimäärä alkalia. Värjäyksen jälkeen SYBR Green ratkaisu, ytimet ”komeettoja” katsomiskertojen Zeiss mikroskoopilla. Yhteensä 100 komeettoja havaittiin visuaalisesti ja sai jokaisesta dian vapaalla Casp ohjelmistoa. Hännän intensiteetti, joka määritellään prosenttiosuutena DNA siirtyessä pään komeetta hännän, mitattiin kunkin sijoitettiin ydintä.

Cell Cycle Analysis

propidiumjodidilla (PI) värjäytymistä käytetään analysoida solusyklin jakautumisen, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 70% etanolilla, inkuboitiin 5 ug /ml PI (Sigma-Aldrich) ja 0,5 mg /ml RNaasi A: ta (Sigma-Aldrich), ja sitten analysoitiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä.

Cytome määritys: Mikrotumat (MN) ja kromosomi Rearrangements

multiendpoint sytokineesiin-estetty mikrotumatutkimuksessa käytettiin arvioimaan kromosomipoikkeavuuksiin [32]. Sytokalasiini B (5 ug /ml) lisättiin viljelyalustaan, sulkeaksesi sytokineesiin ja kerätä solut, jotka oli suorittanut ensimmäisen ydinvoiman jako. Ei binucleated solut numeroitu 5 h lisäyksen jälkeen sytokalasiini B pitoisuus valitaan kuten edellä osoitti korkeimman taajuudet binucleated soluja (95%, 28 h lisäyksen jälkeen sytokalasiini B) ja ei ollut vaikutusta tasoon spontaanisti esiintyviä MN tai nucleoplasmic siltoja. Sytokalasiini B lisättiin 4 h ennen säteilyttämistä, jotta kumuloida edustavimmat solupopulaation klo binucleated vaiheessa 24 tuntia myöhemmin. Solut kiinnitettiin 3% paraformaldehydillä ja värjättiin DAPI (5 ug /ml). Näissä kokeissa eri päätepisteet harkittiin: binucleated solujen MN, sentromeeriantigeenin-positiivinen MN, nucleoplasmic sillat (NPB), ja solujen samanaikainen NPB ja MN (NPB + MN) [28], [39], [30]. Näitä markkereita on kuvattu tässä nousevassa järjestyksessä monimutkaisuus.

Solut kanssa MN. Nämä solut on tunnusomaista läsnäolo sekä tärkeimpien tumaan ja yksi tai useampia pienempiä ytimiä kutsutaan MN. Taajuus MN solupopulaatio on saanto MN (YMN), joka lasketaan seuraavasti: missä MN1 on solujen määrä yhdellä mikrotuma, MN2 solujen lukumäärä on kaksi MN, MNN solujen lukumäärä n MN , ja BN on kokonaismäärä binucleated soluja. Läsnäolo MN on osoitus menetys kromosomissa fragmentteja, jotka vastaavat acentric kromosomiin /kromatidin johtuvat korjaamatta DNA rikkoutuminen tapahtumia. Sitä vastoin, MN, jotka sisältävät yhden tai useamman sentromeerien (immunologisesti kuten CENPA) osoittaa kromatidin /kromosomin menetyksen. Suhde sentromeeriantigeenin-positiivisten mikrotumia (c + MN) arvioitiin prosenttiosuutena binucleated solujen c + MN.

Solut kanssa NPB. NPB ovat jatkuvia DNA sisältäviä rakenteita yhdistävät ytimet on binucleated solussa. NPB peräisin disentristen kromosomien jossa sentromeerien vedetään vastakkaisiin pylväät aikana Anaphase ja ovat siksi edustavat misrepaired DNA, kromosomi uudelleenjärjestely tai telomeerivasta loppuun fuusio.

Solut samanaikaisesti ilmaus NPB ja MN. Ilmentyminen NPB + MN jaettu soluissa syntyy break-fuusio-break syklit ja edustaa erittäin monimutkainen uudelleenjärjestely.

Kaikki pisteytyksen perusteita käytettiin mukaisesti morfologisiin parametreihin kuvannut Fenech [33].

tilastollinen analyysi

tiedot vähintään kolmen erillisen kokeen esitetään keskiarvo ja keskihajonta. Aineisto analysoitiin Studentin

t

testiä.

P

0,05 kontrolliin verrattuna ehto katsottiin merkitseväksi.

Tulokset

Effects of DMF /BSO Yhdistettynä Säteilytyksen Endogeeniset GSH-tasot SQ20B Cells

Ensimmäisessä koesarjassa (taulukko 1A), olemme määrällisesti koko GSH pitoisuus SQ20B käsitellyissä soluissa eri olosuhteissa. Kun käytetään yhdessä, DMF ja BSO hoito johti yhteensä GSH ehtyminen 4 h inkuboinnin hitaalla palauttaminen GSH tasolla 24 tuntia. A4 h DMF /BSO esikäsittely yhdistettynä röntgen- tai hiili ioni altistuksen mahdollisti vakauttaminen GSH ehtymisen ja eston glutationi resynthesis aiheuttamaa säteilytyksen jälkeen (taulukko 1 B). Mitään merkittäviä vaihteluita hapettuneen glutationin havaittiin alle meidän koeolosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Tämä protokolla on siis pidettävä optimaalisen tehokkaasti ja ohimenevästi heikentävistä SQ20B GSH myymälöissä.

klonogeeninen Cell Survival

tulokset klonogeeniset solujen hengissä säteilylle SCC61 ja säteilyresistenteille SQ20B solulinjoja kun X-ray tai hiili ionisäteilyn on esitetty kuviossa. 1. Altistuminen hiili-ioneja johti alhaisempiin eloonjääntifraktio verrattuna röntgenkuvat molemmissa solulinjoissa. Hengissäsäilymisosuus 2 Gy (SF2) oli 0,81 (röntgenkuvat) ja 0,33 (hiili-ionit) ja SQ20B soluja ja 0,34 (röntgenkuvat) ja 0,12 (hiili-ionit) varten SCC61 soluja. SQ20B solut olivat järjestelmällisesti kestävämpi SCC61 soluja, jopa vastauksena hiili-ioneja. Suhteellinen biologinen tehokkuus on 10% eloonjääneitä taso oli 2.1 SQ20B solujen ja 1.9 varten SCC61 soluja. Läsnä ollessa DMF /BSO, säteilylle herkäksi resistenttien SQ20B solujen tapahtunut ja saatu SF2 (0,28 X-säteitä ja 0,19 hiilen ionit) havaittiin olevan samanlainen, joka on mitattu käsittelemättömän herkkä SCC61 solulinjassa. Tällainen säteilylle herkäksi purettiin, kun läsnä oli 5 uM NaCl, erittäin voimakas antioksidantti, on osoituksena SF2-arvon (0,84) käsiteltyä SQ20B soluissa, sen jälkeen X-ray säteilytys.

SQ20B, DMF /BSO ( TTT) hoidetun SQ20B, ja SCC61 solut altistettiin röntgensäteilytykseen (A) tai hiiltä ioni säteilylle (B). Päinvastainen vaikutus NAC yli glutationi ehtymisen hoito arvioitiin inkuboimalla DMF /BSO (TTT) -käsitellyssä SQ20B 5 mM

N

asetyyli kysteiini (NAC) (SQ20B + TTT + NaCl) ennen X- ray säteilylle.

DNA: n DSB Analyysi γH2AX Pitoisuus

ensin arvioitiin tehokkuuden DSB korjaus mukaan kinetiikkaan γH2AX pesäkkeitä. Kuten on esitetty kuviossa. 2

, alkuperäisen huippu γH2AX pesäkkeitä per solu jälkeen röntgensäteilyn oli samankaltainen sekä säteilyresistenteille SQ20B (31,3 ± 1,0) solulinjaa, joka näyttää korkeimman endogeenisen GSH ja säteilylle SCC61 (30,8 ± 2,4) solulinjaa, mikä viittaa siihen, että GSH pitoisuus ei ollut vaikutusta saantoa DSB jälkeen X-ray säteilytys. Kuitenkin kinetiikka korjaus erosivat: korjaus oli hitaampaa arkojen SCC61 solut ja johti kertymistä jäljellä DSB (8 polttopistettä /nucleus) 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. Sen jälkeen kun hiili ioni altistuksen (Fig. 2

B

), enimmäismäärä γH2AX pesäkkeitä solua kohden oli pienempi kuin sen jälkeen röntgensäteilyn (19 ± 0,7 ja 22,2 ± 0,3 SQ20B ja SCC61 solulinjoissa, vastaavasti) . Toisin kuin röntgensäteilytys- vaste, korjaus kinetiikka oli samanlainen näiden kahden solulinjojen. Lopuksi jäännösleukosyyttimäärä γH2AX pesäkkeitä mitattuna herkkien solujen 24 tunnin kuluttua hiilen ioni altistus oli vastaava kuin havaittu jälkeen biologinen isodose röntgensäteitä (7,7 ± 0,6 pesäkkeitä /ydin), kun taas mitään jäljellä DSB mitattiin resistenttien solujen jälkeen joko tyyppi säteilytys.

Soluja säteilytettiin 2 Gy röntgensäteitä (A, C) tai 1 Gy hiiltä ioneja (B, D). ▴ SQ20B solut, ▵ SQ20B + säteilytys, • SQ20B + GSH väheneminen, • SQ20B + GSH ehtyminen + säteilytys, □ SCC61 + säteilytys. Paneeleissa C ja D, päinvastainen vaikutus

N

asetyyli kysteiinin läsnä ollessa DMF /BSO hoitoon tutkittiin. Sata soluja teki joka kerta, ja mittaukset tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa. *

P

0,05.

Depleting solunsisäinen GSH tason SQ20B soluissa DMF /BSO hoito ei aiheuttanut merkittävää vaihtelua spontaani DSB määrä verrattuna ohjaus soluihin ( 0-5 pesäkkeitä) aikana kurssin tutkittu, kun taas yhdessä röntgen- tai hiili ionisäteilyn vaikutti merkittävästi soluvasteen. Määrä γH2AX pesäkkeitä kasvoi merkittävästi (

P

0,05) 30 min sen jälkeen, kun röntgensäteilyn (42,3 ± 2,3 pesäkkeitä verrattuna 31,3 ± 1,0 säteilytettyyn SQ20B solut) ja korjaus kinetiikka oli sitten hitaampi kuin mitä havaittiin säteilytettyyn, mutta käsittelemätön SQ20B soluja. Kasvu määrän alkuperäisen DNA vaurioiden johti jäljellä DSB (9,7 ± 1,5 pesäkkeitä) 24 h, samalle tasolle, joka mitataan herkillä SCC61 soluissa. Mielenkiintoista, kun hiili ioni altistuksen vaste GSH-köyhdytettyä SQ20B solujen täsmäsi täydellisesti, että säteilytettyjen SCC61 solujen suhteen alkuperäisen DNA vaurioita, korjaus- kinetiikka, ja jäljellä DSB. Nämä tulokset osoittavat, että ehtyminen endogeenisen GSH altaan resistenttien solujen yhdistettynä röntgen- tai hiili ioni altistus biologisesti ekvivalenttiannos johti pysyvyys DNA vaurioita tasolle samanlainen kuin herkällä SCC61 soluja.

vahvista roolin redox muutoksia DNA-vaurioita, inkuboimme SQ20B soluja NaCl. Näissä koeolosuhteissa, NaCl ei aiheuttanut γH2AX pesäkkeitä kontrollikokeissa (Fig. 2 C ja D). Läsnäollessa DMF /BSO hoitoa ja NaCl lisättiin 4 h ennen säteilytystä γH2AX mittaukset osoittivat, että taso DSB ja kinetiikan korjaus ottelu säteilytetty, mutta hoitamattomana SQ20B soluja, joko tyypin säteilytys. NaCl voi siis kääntää päinvastaiseksi GSH ehtyminen.

Single Strand Tauot ja Oksidatiivinen DNA Vaurioita mitattuna SCGE Pitoisuus

taso alkali-labiili sivustoja ja SSB DNA tutkittiin käyttäen SCGE määritys. Kuten on esitetty kuviossa. 3

, herkkä SCC61 ja kestävä SQ20B solulinjoissa selvästi näkyvissä selvä vasteita mitattuna radioinduced SSB. Mitään signaalia ei saatu SQ20B solujen aikana tutkittu joko tyypin säteilytys. Sitä vastoin, SCC61 solut olivat erittäin herkkä ja osoittivat korkean tason katkeaa lyhyessä aikoina säteilytyksen jälkeen. Rapid korjaus jälkeistä röntgensädealtistusta, mikä näkyy määrän väheneminen taukojen ajan. Vaikka hiili ionisäteilyn indusoi aluksi samanlainen prosenttiosuus hännän DNA verrattuna röntgensäteilyn, korjaus kinetiikka SCC61 soluissa oli huomattavasti hitaampaa ja osoitti jatkuvaa lisäämistä jopa 2 tuntia, minkä jälkeen se laski pidempään. Mielenkiintoista, GSH-köyhdytettyä SQ20B solut osoittivat samanlaista mallia kuin mikä todettiin SCC61 soluja ja oli samanlainen altistumisen jälkeen joko tyyppisen säteilyn. Tämä viittaa siihen, että korkea endogeeninen GSH tasoilla suojella DNA vastaan ​​säteilyn SQ20B soluissa. Toisessa koesarjassa prosenttiosuus hännän DNA tunnistettiin SCGE yksin vähennettiin saadusta käsittelyn jälkeen FPG entsyymin tutkia tasaisempaa jakautumista hapettuneen emäksiä. Tulokset on esitetty kuviossa. 3

B

osoittavat, että SQ20B soluissa, röntgen- tai hiili ionisäteilyn ei muuttanut hapettumisen DNA perustaa verrattuna kontrolleihin. Kuitenkin GSH-köyhdytettyä SQ20B soluilla haja hapettumista lyhyin ajan kuluttua röntgensäteilyn, kun taas vähemmän vaihteleva kuvio vaurioita altistumisen jälkeen hiili-ionit ehdotti paikallisen tuotannon vapaiden radikaalien.

Keskimääräiset DNA vaurioita SCC61, SQ20B, ja DMF /BSO (TTT) hoidetun SQ20B solulinjat jälkeen 10 Gy röntgen- tai 5 Gy hiiltä ioni altistumista. Comet määritykset suoritettiin alkalisissa olosuhteissa ilman (A) tai, kun läsnä on FPG entsyymin (B). ▵ SQ20B solut, ▴SQ20B + säteilytys, • SQ20B + GSH ehtyminen, ○ SQ20B + GSH ehtyminen + säteilytys, ▪ SCC61, □ SCC61 + säteilytys. *

P

0,05.

Radioinduced G2 /M-vaiheen pidätys ja kerääminen Solut Sub-G1-vaiheen jälkeen Cell Cycle Analysis

määrittää, missä määrin GSH ehtymisen ja jäljellä DSB voi vaikuttaa soluvasteen röntgen- tai hiili ionisäteilyn läpi solusyklin uudelleenjaon, suhteellinen määrä SCC61, SQ20B ja GSH-köyhdytettyä SQ20B solujen sub-G1 (Fig. 4

) ja G2 /M (Fig. 4

B

) vaiheessa analysoitiin virtaussytometrialla. Herkkä SCC61 solut nopeasti kävi apoptoosin (noin 32% osa-G1 solut 48 tuntia, kasvaen 68% 120 h). Sitä vastoin ei ole merkittävää apoptoosin taso mitattiin SQ20B soluissa sen jälkeen, kun kumman tahansa säteilytys. Sen sijaan, jopa 55% of SQ20B soluja pidätettiin G2 /M tarkastuspiste kuluttua 24 h seuraavan molempia säteilytys, ja nämä solut pyyhkiytyvät solusykliä jälkeen 48 h. GSH ehtyminen SQ20B solujen lisääntynyt G2 /M-vaiheen pysähtymisen, minkä jälkeen solut vapautettiin ja palautettiin pohjapinta n tasolla vain 72 tuntia säteilytyksen jälkeen. Uusiutumisen G2 /M-pidätys korreloi kasvu prosentteina apoptoottisten solujen jälkeen röntgensäteilyn (55% enintään). Tämä kasvu oli hieman myöhässä (96 h) jälkeen hiilidioksidipäästöille mutta oli samalla tasolla 120 tuntia. Nämä tiedot osoittavat, että ehtyminen endogeenisen altaan GSH vaikuttaa solujen osuus pidätettiin G2 /M tarkastuspiste kulttuuriin ja sen kesto suhteessa säteilyn laatu.

SCC61, SQ20B, ja DMF /BSO ( TTT) -käsitellyssä SQ20B solut altistettiin röntgensäteilyä tai hiili ionisäteilyä. (A) solujen prosenttiosuus osa-G1 vaiheeseen. (B) prosenttiosuus soluja G2 /M-vaiheessa. ▴ SQ20B soluja, ▵ SQ20B + 5 Gy hiiltä ioni säteilylle, ▵ SQ20B + 10 Gy röntgenkuvat, • SQ20B + GSH ehtyminen, ○ SQ20B + GSH ehtyminen + 5 Gy hiiltä ioni säteilylle, ○ SQ20B + GSH-ehtyminen + 10 Gy X säteitä, ▪ SCC61, □ SCC61 + 5 Gy hiiltä ioni säteilylle, □ SCC61 + 10 Gy röntgenkuvat. *

P

0,05.

Mikrotumat Mittaukset havaittu käyttäen Cytome Pitoisuus

Korjaamattomat tai misrepaired DNA-vaurioita voivat aiheuttaa kromosomin muutoksiin elossa syöpäsoluja. Muodostuminen MN, jotka sisältävät fragmentti kromosomiin /kromatidin voidaan liittää korjaamatta DSB, mikä osoittaa vian korjaus. Saanto MN arvioitiin laskemalla YMN arvo. Kuten on esitetty kuviossa. 5

The YMN arvot altistumisen jälkeen röntgen- ja hiili ionisäteilyn korreloivat solujen radioherkkyyttä. Enemmän MN tuotettiin herkillä SCC61 verrattuna SQ20B solujen jälkeen molemmat säteilytys. Suurin saanto SCC61 solut eivät eroa merkittävästi kahden tyyppisiä säteilytys (2,1 ± 0,3 jälkeen röntgensäteilyn ja 1,68 ± 0,3, kun hiili ionisäteilyn). Suurin arvo on hieman viivästynyt jälkeen hiili ionisäteilyn (96 h), joka on aika, joka vastaa liipaisu apoptoosin, kuten edellä on kuvattu. Sitä vastoin, saanto MN indusoitiin resistenttien SQ20B solut eivät ylitä 0,75, ja se oli samanlainen molemmille säteilytys. Vaikka säteilylle herkäksi SQ20B solujen kautta GSH ehtymisestä johti jäljellä DSB identtisiä havaittiin SCC61 soluissa säteilytyksen jälkeen, se ei aiheuttanut sama kuvio MN. YMN arvot mitattiin GSH-köyhdytettyä SQ20B olivat pienemmät kuin köyhdyttämätöntä SQ20B soluissa jälkeen X-säteilytys (poislukien 120 h jälkisäteilyttämiseksi), mutta laskivat sen jälkeen hiili ioni altistuksen suurimman osan kineettisen ajankohtina. Lopuksi, vain hiiltä ionisäteilyn aiheuttama selvä lasku määrän radioinduced MN GSH-köyhdytettyä SQ20B soluissa.

Tuotto mikrotumien (A) ja sentromeeriantigeenin-positiivisten mikrotumia (B) SCC61, SQ20B ja DMF /BSO (TTT) hoidetun SQ20B solulinjat jälkeen 10 Gy röntgen- tai 5 Gy hiiltä ionisäteilyn. *

P

0,05.

Toisessa koesarjassa, kromosomi /kromatidipoikkeavuuksiin tappio (tunnistettu centromere-positiivisten MN, c + MN) arvioitiin (kuvio. 5

B

). Prosenttiosuus solujen c + MN oli alhainen jälkeen röntgensäteilyn ja eivät eronneet herkkiä ja resistenttejä soluja (korkeintaan ~ 4%: sta 5%). Kuten on esitetty kuviossa.